KR20100036224A - 통합된 핵산 분석 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핵산 분석을 수행하기 위한 완전히 통합된 미세유체 시스템을 제공한다. 본 발명의 공정은 샘플 수집, 핵산 추출 및 정제, 증폭, 시퀀싱, 및 분리와 검출을 포함한다. 본 발명은 또한 광학 검출 시스템 및 생물학적 분자의 분리 및 검출 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 다양한 양상은 하나 또는 복수의 미세유체 챔버 또는 채널내부의, 복수의 생물학적 분자, 전형적으로 형광 염료-표지된 핵산의 동시 분리 및 검출을 가능케 할 수 있다. 핵산은 6가지 이상의 염료로 표지될 수 있고, 각각의 염료는 독특한 피크 방출 파장을 갖는다. 본 발명의 시스템 및 방법은 특히 DNA 단편 사이징 적용, 예컨대, 유전자 핑거프린팅 및 DNA 시퀀싱 적용, 예컨대, 임상 진단학에 유용하다.

Description

통합된 핵산 분석{INTEGRATED NUCLEIC ACID ANALYIS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은, 35 U.S.C. §119(e) 규정하에서, 2007년 4월 4일에 출원된 미국 가특허 출원 제60/921,802호; 2007년 8월 13일에 출원된 미국 가특허 출원 제60/964,502호; 및 2008년 2월 12일에 출원된 미국 가특허 출원 제 61/028,073호의 출원일의 이익을 주장하며, 상기 특허출원 각각은 이의 전체로서 참고문헌으로 본 명세서에 통합된다. 본원은 또한 같은 날에 출원된 하기 2개의 미국 특허 출원을, 이들의 전체로, 참고문헌으로 포함한다; 첫 번째는 대리인 문서관리번호 08-318-US호의, "표적 핵산의 급속 다중화 증폭 방법{METHOD FOR RAPID MULTIPLEXED AMPLIFICATION OF TARGET NUCLEIC ACIDS}"이라는 제목의 출원이고; 두 번째는 대리인 문서관리번호 07-865-US호의, "플라스틱 미세유체 분리 및 검출 플랫폼{PLASTIC MICROFLUIDIC SEPERATION AND DETECTION PLATFORMS}"이라는 제목의 출원임.
발명의 분야
본 발명은 핵산 분석을 위한 미세유체학(microfluics) 분야에 속한다.
발명의 배경
주어진 인간, 동물, 식물, 또는 병원균 게놈의 서브세트의 (핵산 시퀀싱 또 는 단편 사이징(sizing)에 의한) 급속한 식별(identification)로 규정된, 완전히 통합된 (즉, 샘플주입(sample-in)에서 결과산출(results-out)까지) 집중된 핵산 분석을 가능케 할 기구 및 기술의 개발에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다. 집중된 핵산 시퀀싱은 실수요자들에게 실시간 임상, 법의, 또는 기타 결정을 내리게 할 수 있을 것이다. 예를 들어, 많은 흔한 인간 질병이, 완전한 인간 게놈을 생성시키는데 요구되는 것 보다 더 적은 측정단위(orders of magnitude)인, 1000개 미만의 염기쌍의 DNA 서열에 기초하여 진단될 수 있다. 유사하게, 단길이 탠덤 반복부(short tandem repeat) 분석에 의해 생성된 20개 미만의 특이 DNA 단편 세트들의 크기의 정밀한 측정은 주어진 개체를 식별하는데 충분하다. 적용에 따라, 집중된 핵산 분석은 병원 실험실, 내과의사의 사무실, 임상, 또는 상기 분야에서의, 법의학 또는 환경적 적용의 경우를 포함하는, 다양한 세팅에서 수행될 수 있다.
개선된 DNA 시퀀싱 및 단편 사이징 시스템에 대한 다수의 충족되지 못한 요구가 존재한다. 첫째, 고도로 훈련된 조작자를 요구하지 않고 사용하기 쉬운 DNA 시퀀싱 및 단편 사이징 기구에 대한 충족되지 못한 요구가 존재한다. 둘째, 모든 수동 프로세싱을 없앤 시스템에 대한 충족되지 못한 요구가 존재한다. 그 결과, 단지 최소의 조작자 훈력이 요구될 것이고 해당 시스템은, 예를 들어, 방호복(haz-mat suit)를 입은 첫번째 반응자에 의해 조우하게 될 그러한 도전적인 환경에 의해 구속된 개체들에 의해 용이하게 조작될 수 있다:
셋째, 완전하고, 정확하고, 신뢰가능한 데이터에 대한 요구를 희생시키지 않는 초고속 분석에 대한 충족되지 못한 요구가 존재한다. 인간 식별 적용의 경우, 결과를 내기 위한 적절한 시간은, 관용적인 기술을 사용하여 요구되는 수일 내지 수주에 훨씬 못미치는, 45분 이하이다. 적절한 치료 섭생을 결정하기 위한 감염성 제제를 시퀀싱하는 것과 같은 임상적 적용의 경우, 90분 이하가 답을 얻기 위한 합리적인 시간이고, 이러한 시간은 항박테리아 및 항바이러스 약물(medications)이 환장의 응급실 도착후 단기간에 개시되도록 한다. 적용에 관계없이, 실시간으로 활용가능한(actionable) 데이터를 생성시키기 위한 충족되지 못한 요구가 존재한다. 답을 내기 위한 짧은 시간은 또한 샘플 처리량(throughput)에서 부수적인 증가를 초래한다.
넷째, 소형화에 대한 충족되지 못한 요구가 존재한다. 많은 DNA 분석 시스템은 전체 실험실 보조 및 관련 보조를 필요로 한다. 예를 들어, 고 처리 Genome Sequencer FLX(Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, IN) DNA 시퀀싱 시스템은 설치용 벤치톱(benchtop)만을 필요로 하나 요구되는 라이브러리 구축을 실행하기 위해 거대한 실험실을 필요로 한다. 소형화는 실험실 용도 및 현장의료(point-of-care) 용도 둘 모두를 비롯한 현장 작동(field operation)에 중요하다. 소형화는 또한 샘플당 비용 절감에 중요하다.
다섯째, 튼튼함(ruggedization)에 대한 충족되지 못한 요구가 존재한다. 많은 적용의 경우, 특히, 법의학, 군대 및 향토 방위(homeland defense)에서의 적용의 경우, DNA 분석 기구는 해당 분야에서 조작될 수 있어야 한다. 따라서, 상기 장치는 병사의 등으로 운반되거나, 경찰차로 운반되거나, 헬리콥터에서 전장으로 투하되거나 여하간에 운송될 수 있어야 한다. 유사하게, 상기 기구는 온도, 습도 및 공기로 운반되는 미립자(에를 들어, 모래)를 포함하는, 극한 환경 조건하에서 견디고 기능을 발휘할 수 있어야 한다.
여섯째, 다수의 샘플 유형을 수용할 수 있고 고도로 다중화된 분석을 병렬적으로 수행할 수 있는 시스템에 대한 충족되지 못한 요구가 존재한다. 대부분의 적용의 경우, 싱글플렉스(singleplex) 반응으로 단일 샘플 유형으로부터의 DNA 분석 능력은 의미있는 DNA 분석을 수행하기 위해 용인될 수 없다.
바이오칩상에서 복잡한 일련의 실험실 조작을 간략화하는 것을 추구하는 미세유체학(미세 총괄 분석 시스템(micro total analysis systems, μTAS) 또는 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip) 기술[Manz et al, Sens. Actuators B 1990, 1, 244-248 참조]로도 불리움)의 개발자들은 이러한 특별한 충족되지 못한 요구를 인지하고 있으나, 현재까지, 미세유체 핵산 분석으로 이러한 요구들을 처리하도록 하기 위해 필요하거나 요망될 수 있는 생화학 및 물리적 과정 전부를 수행하는 통합된 바이오칩과 장치를 설계할 수 없었다. 그 결과, 집중된 핵산 분석은 오늘날 사회적으로 폭넓게 사용되지 못하고 있다.
미세유체 시스템의 개발은 미세가공(microfabricated) 성분들, 예컨대, 마이크로스케일 분리, 반응, 마이크로밸브와 펌프 및 다양한 검출 기구(scheme)의 완전하게 작동하는 장치내로의 통합을 포함한다(예를 들어, 문헌[Pal et al, Lab Chip 2005, 5, 1024- 1032]을 참조바람). 만츠 등[Manz et al.(supra)]은 1990년대 초에 칩상의 모세관 전기영동을 입증하였고, 다른 연구자들은 이것을 개량하여 왔다. 몇몇 연구그룹은 바이오칩 분리 및 검출과 DNA 가공 기능성의 통합을 입증하였다. 유리-PDMS(폴리디메틸실옥산) 혼성 구조내 통합된 장치가 보고되었다(Blazej et al, Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103, 7240-5; Easley et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 19272-7; 및 Liu et al, Anal. Chem. 2007, 79, 1881-9). 리우(Liu)는 다중 중합효소 연쇄 반응(PCR), 분리 및 단길이 탠덤 반복부(short tandem repeat, STR) 사이징에 의한 인간 식별용 4 염료 검출을 커플링시켰다. 블라제(Blazej)는 생어 시퀀싱 반응, 생어 반응 세정, 전기영동 분리 및 pUC18 앰플리콘의 DNA 시퀀싱용 4 염료 검출을 커플링시켰다. 에슬리(Easley)는 혈액중의 박테리아 감염의 존재를 확인하기 위하여 DNA의 고체상 추출, PCR, 전기영동 분리 및 단색 검출을 커플링시켰다. PCR, 전기영동 분리 및 단색 검출을 커플링시키는 통합된 실리콘-유리 장치가 번스(Burns)(Pal, 2005, Id.)에 의해 입증되었다. PCR을 위한 유리-PDMS 부분을 박테리아 DNA의 존재를 확인하기 위한 전기영동 분리 및 단색 검출용 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 부분에 커플링시키는 혼성 장치는 후앙(Huang et al, Electrophoresis 2006, 27, 3297-305)에 의해 보고되었다.
고 등(Koh et al)은 PCR과 박테리아 DNA의 존재를 확인하기 위한 바이오칩 전기영동 분리 및 단색 검출을 커플링시킨 플라스틱 장치를 보고하였다(Koh et al, Anal. Chem. 2003, 75, 4591-8). DNA 추출, PCR 증폭, 바이오칩 전기영동 분리 및 단색 검출을 커플링시킨 실리콘 기반 장치는 아소가와에 의해 보고되었다(Asogowa M, Development of portable and rapid human DNA Analysis System Aiming on-site Screening, 18th International Symposium on Human Identification, Poster, Oct, 1-4, 2007, Hollywood, CA, USA). 미국 특허 제7,332,126호(Tooke et al.)는 핵산 분리 및 순환주기 시퀀싱을 위해 요구되는 미세유체 조작을 실행하기 위한 원심력의 사용을 기술하고 있다. 그러나, 이러한 접근법은 적은 샘플 부피(1 내지 몇 μL 단위의 부피)에 기반한다. 그 결과로, 상기 장치는 핵산의 분리 및 분석을 위한 대규모 샘플의 처리에 유용하지 못하며, 특히 고도의 병렬적 방식으로의 처리에 유용하지 못한데, 그 이유는 유체 샘플이 정지기 동안 해당 장치에 적용되어야 하기 때문이며, 즉, 디스크가 원심분리에 앞서 조작을 위해 요구되는 모든 유체를 함유할 수 있어야 하기 때문이다(유력하게는, 고도-병렬 장치의 경우 mL 당 최대 수백초). 둘째로, 상기 장치는 박테리아 클론(예를 들어, 플라스미드 DNA)의, 샘플 제조 및 순환주기 시퀀싱에 국한된다.
바이오칩 전기영동 분리와 DNA 가공을 통합시키기 위해 시도된 그러한 장치들에 몇몇 결함이 존재한다. 첫째, 검출은 검정당 정보 함량(일부는 최대 4컬러 검출 시스템을 가지지만 대부분은 단색 검출기를 사용함) 또는 처리량(단일 샘플 또는 2개의 샘플 처리능력)에 의해 제한된다. 둘째, 이들 장치들은 완전한 샘플-에서-해답(sample-to-answer) 통합을 나타내지 못하는데, 예를 들어, 블라제(Blazej)의 장치는 순환주기 시퀀싱에 앞서 주형 DNA의 오프-보드(off-board) 증폭을 요하나, 다른 장치들은 몇몇 종류의 전처리를 요하는 샘플을 사용한다(예를 들어, 에슬리 및 투크는 첨가 전에 샘플의 용해를 요한다). 셋째, 이러한 장치들을 위해 이루어지는 일부 처리 선택 중 일부는 시간에 대한 해답(time-to-answer)에 부정적인 영향을 미친다: 예를 들어, 블라제의 혼성화-기반 방법은 순환주기 시퀀싱 생성물의 세정을 위해 20분 이상이 필요로 하다. 넷째, 이들 장치들 중 다수 는 부분적으로 또는 전체적으로 유리 또는 실리콘으로 제작된다. 이러한 기질 및 상응하는 제작 기술의 사용은 이들 장치들을 태생적으로 고가로 만든다(Gardeniers et al, Lab-on-a-Chip (Oosterbroeck RE, van den Berg A, Eds.). Elsevier: London, pp 37-64 (2003)). 해당 장치의 재사용이 실행되어야 하는 적용에 이들을 국한시킨다; 많은 적용의 경우(예컨대, 인간 ID), 이것은 샘플 오염의 위험을 초래한다. 마지막으로, 설명된 기술은 2가지 적용, STR 분석 및 시퀀싱을 통한 인간 확인에 부적절하다. 예를 들어, 에슬리 및 팔 장치는 둘 모두 열악한 해상도(resolution)--단일 염기 보다 훨씬 더 나쁨--로 곤란을 겪는다. 단편 사이징 적용(예를 들어, 단길이 탠덤 반복부 프로파일의 분석에 의한 인간 확인) 및 시퀀싱 둘 모두 단일 염기 해상도을 요한다.
미세유체 통합과 관련하여 종래 기술의 한계와 더불어, 형광 검출과 관련한 문제점들이 또한 통상적인 실험실 작업을 벗어나서 핵산 분석의 폭넓은 적용을 제한한다. 가장 폭넓게 사용되는 시판 시퀀싱 키트(BigDye™ v3.1 [Applied Biosystems] 및 DYEnamic™ ET[GE Healthcare Biosciences Corp, Piscataway, NJ])는 4컬러를 위한 20년전 구식 검출 방법에 기초하고 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,855,225호; 5,332,666호; 5,800,996호; 5,847162호; 5,847,162호를 참조바람). 이 방법은 염료-표지된 뉴클레오티드의 4가지 상이한 컬러로의 방출 신호의 해상도에 기초하고 있는데, 상기 컬러는 4개 염기들 각각을 대표한다. 이러한 4-컬러 염료 시스템은 형광 염료의 비효율적 여기, 유의미한 스펙트럼 중첩 및 비효율적인 방출 신호의 수집을 포함하는, 몇가지 결점을 지닌다. 4컬러 염료 시스템은 시퀀 싱된 생성물의 주어진 전기영동(또는 다른 것) 분리로부터 획득될 수 있는 정보의 양이 제한되기 때문에 특히 문제된다.
단편 크기 및 색(염료 파장) 둘 모두에 의한 DNA 단편의 분리 및 검출에 기초한 전기영동 시스템에서 높은 정보 함량 검정을 달성할 수 있는 시스템에 대한 충족되지 못한 요구가 존재한다. 전기영동에 의해 구별될 수 있는 DNA 단편의 최대 갯수는 분리의 판독길이(readlength) 및 해당 장치의 해상도에 의해 결정된다. 검출될 수 있는 컬러의 최대 갯수는 형광 염료의 유효성 및 검출 시스템의 파장 식별력에 의해 부분적으로 결정된다. 현재의 바이오칩 검출 시스템은, 최대 4컬러 검출이 보고되어 있으나, 전형적으로 단일 컬러에 제한된다.
인간 식별용 STR 분석은 컬러 다중화(color multiplexing)에 기초한 DNA 단편 사이징의 일예이고 최대 16개 유전자좌의 동시 분석을 가능케 한다[AmpFISTR Identifiler kit(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 PowerPlex16 키트(Promega Corporation, Madison, WI)]. 4개 또는 5개 형광 염료를 사용할 때, 단일 분리 채널이 각각의 유전자좌의 다수의 대립유전자 변이체의 크기를 구별할 수 있다. 일부 단편 사이징 적용은 단일 레인상에서 분리 및 검출되도록 하기 위해 16개 이상의 단편을 필요로 할 것이다. 예를 들어, 핑거프린팅(즉, 많은 수의 특징적인 DNA 단편의 분리 및 검출)에 의한 병원균의 확인 및 전체 인간 게놈을 조명함으로써 이수성(aneuploidy)의 진단이, 각각, 수십개 또는 수백개 유전자좌를 살펴봄으로써 달성될 수 있다.
단일 분리 채널내에서 검출될 수 있는 유전자좌의 갯수를 증가시키기 위한 한가지 접근법은, 부분적으로 추가 유전자좌의 단편 크기를 증가시킴으로써, 생성된 단편 크기의 범위를 넓히는 것이다. 추가 유전자좌를 위한 더 긴 단편의 사용은, 더 큰 단편의 증폭이 억제자 및 DNA 분해에 더 민감할 수 있으나, 더 짧은 단편에 비해 더 긴 단편의 생산량 저하를 야기시키기 때문에, 이상적이지 않다. 더욱이, 더 긴 단편의 생성은 또한 신장 시간에서의 증가 및, 그로 인한, 총 검정 시간에서의 증가를 요한다. 동시적으로 검출될 수 있는 염료 컬러의 갯수를 증가시킴으로써 주어진 분리 채널내에서 검출될 수 있는 유전자좌의 갯수를 증가시키는 것에 대한 충족되지 못한 요구가 존재한다.
단일 분리 채널내에서 분석될 수 있는 DNA 서열의 갯수를 증가시킴으로써 생어 시퀀싱 분리의 능력의 증가 (및 그에 따라, 공정의 비용, 노동력, 및 공간에서의 감소)에 대한 충족되지 못한 요구가 존재한다. 또한, 몇몇 적용에서, 시퀀싱된 다수의 DNA 단편은 "혼합된 서열" 데이터를 판독하는데 어려움을 발생시킨다; 혼합된 서열이 정확하게 해석될 수 있다는 점에서 접근법을 개발할 필요가 있다.
생어 분리 채널의 용량을 증가시키고 혼합된 서열을 해석하는 능력을 개발하기 위한 한가지 접근법은 시퀀싱 반응에 사용되는 염료 컬러의 갯수를 증가시키는 것이다. DNA 시퀀싱 및 단편 사이징 둘 모두에서, 상이한 염료로 표지된 다수의 단편은 동시에 검출될 수 있다. 일반적으로, 인접 염료들의 피크 방출 파장들 간의 분리는 염료의 피크 폭과 대비하여 충분히 커야한다. 따라서, 각각의 분리 채널의 처리량은, 예를 들어, 2개의 독립적인 시퀀싱 반응에서 2세트의 4 염료를 사용하고 생성물을 취합하고, 이들을 단일 채널상에서 분리시킴으로써 2배가 될 수 있다. 이러한 방법학은 디데옥시뉴클레오티드 터미네이터를 표지하기위해 적용된 한 세트의 4 염료 컬러를 사용하는 제 1 서열 반응, 및 상기 터미네이트를 표지하기 위해 적용된 또 다른 세트의 4 염료 컬러를 사용하는 제 2 반응과 함께, 총 8 염료 컬러의 사용을 요한다; 염료 컬러의 각각의 세트는 독립적이고 그리하여 2개의 서열의 해석에서의 중복은 불가능하다. 동일한 접근법을 사용할 때, 한 세트의 12 염료가 사용되어 단일 채널내의 3개의 DNA 단편의 서열의 동시 분석을 가능케 할 수 있고, 한 세트의 16 염료는 4개 서열의 분석을 가능케 하며, 그 외의 분석도 가능하며, 이는 생어 분리의 정보 용량을 급격하게 증가시킬 수 있다.
본원의 신규한 기구 및 바이오칩은 위에서 개략적으로 기술된 것들을 포함하는, 수많은 충족되지 못한 요구들을 만족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 핵산 분석을 수행하기 위한 완전히 통합된 미세유체 시스템을 제공한다. 이러한 공정은 샘플 수집, DNA 추출 및 정제, 증폭(고도로 다중화될 수 있음), 시퀀싱, 및 DNA 생성물의 분리 및 검출을 포함한다.
본 발명의 분리 및 검출 모듈은 내구화되고 단일 염기 해상도을 능가할 수 있다. 상기 모듈은 6가지 이상의 컬러를 검출할 수 있고 시퀀싱 및 단편 사이징 적용으로부터의 높은 정보 함량을 생성시키는데 유용하다.
바이오칩상에서의 고도로 다중화된 급속 PCR은 대리인 문서관리번호 MBHB 08-318-US호를 가지며, "표적 핵산의 급속 다중화 증폭 방법"이라는 제목으로 본원과 동일자에 출원된, 미국 특허 출원의 주제이며, 상기 특허 출원은 이의 전체로 참고문헌으로 본 명세서에 의도적으로 포함된다. 또한, PCR 생성물은 대리인 문서관리번호 07-865-US호의, "플라스틱 미세유체 분리 및 검출 플랫폼"이라는 제목의 미국 특허 출원에 기재된 것과 같이 바이오칩 내부에서 분리되고 검출될 수 있으며, 상기 특허 출원은 이의 전체로 참고문헌으로 의도적으로 본 명세서에 포함된다.
따라서, 제 1 양상에서, 본 발명은 기판(substrate)상의 하나 또는 복수의 검출 지점을 조명하기 위하여 위치된 하나 이상의 광 공급원; 상기 기판상의 상기 검출 지점으로부터 방출된 광을 수집하고 유도하기 위해 위치된 하나 또는 복수의 제 1 광학 소자(optical elements); 및 상기 제 1 광학 소자로부터의 광을 수용하도록 위치된 광 검출기(light detector)를 포함하는 광학 검출기(optical detectors)를 제공하는데, 여기서 상기 광 검출기는 광 파장에 따라서 상기 제 1 광학 소자로부터의 광을 분리시키며 검출 소자에 상기 분리된 광의 일부를 제공하기 위해 위치된 파장 분산 소자를 포함하며, 여기서 상기 검출 소자 각각은 상기 검출 소자 각각으로부터의 검출 정보를 동시적으로 수집하기 위한 제 1 조절 소자와 소통하며, 여기서 상기 광 검출기가 하나 이상의 생물학적 분자에 표지된 6가지 이상의 염료로부터의 형광을 검출하며, 각각의 염료는 독특한 피크의 방출 파장을 지닌다.
제 2 양상에서, 본 발명은 각각의 채널이 한 검출 지점을 포함하는, 기판상의 하나 또는 복수의 채널내 복수의 생물학적 분자를 동시적으로 분리시키기 위한 구성요소(component); 상기 기판상의 상기 검출 지점들을 조명하기 위해 위치된 하나 이상의 광 공급원; 상기 검출 지점들로부터 방출된 광을 수집 및 유도하기 위하여 위치된 하나 또는 복수의 제 1 광학 소자; 및 상기 제 1 광학 소자로부터 유도된 광을 수용하기 위해 위치된 광 검출기를 포함하는, 생물학적 분자의 분리 및 검출을 위한 시스템을 제공하는데, 여기서 상기 광 검출기는 광 파장에 따라 상기 제 1 광학 소자로부터 상기 광을 분리시키고 상기 분리된 광의 일부를 검출 소자에 제공하기 위해 위치된 파장 분산 소자를 포함하며, 여기서 상기 검출 소자 각각은 검출 소자 각각으로부터의 검출 정보를 동시적으로 수집하기 위한 제 1 조절 소자와 소통하며, 상기 광 검출기가 하나 이상의 생물학적 분자에 표지된 6가지 이상의 염료로부터의 형광을 검출하며, 각각의 염료는 독특한 피크 파장을 지닌다.
제 3 양상에서, 본 발명은 복수의 생물학적 분자를 검출 및 분리하는 방법을 제공하는데, 당해 방법은 기판상의 하나 또는 복수의 미세유체 채널내로 하나 또는 복수의 분석 샘플을 제공하는 단계로서, 여기서 각각의 미세유체 채널은 한 검출 지점을 포함하고, 각각의 분석 샘플은 독립적으로 복수의 생물학적 분자를 포함하며, 각각의 분자는 6가지 이상의 염료중 하나의 염료로 독립적으로 표지되며, 각각의 염료는 독특한 피크 파장을 지니는, 단계; 각각의 미세유체 채널내의 상기 복수의 표지된 생물학적 분자를 동시적으로 분리시키는 단계; 및 광 공급원으로 각각의 검출 지점을 조명하고; 각각의 검출 지점으로부터 방출된 광을 수집하고; 광 검출기에 상기 수집된 광을 유도하고; (i) 광 파장에 의해 수집된 광을 분리시키고; (ii) 하나 이상의 생물학적 분자에 표지된 6가지 이상의 염료로부터의 형광을 동시적으로 검출함으로써(각각의 염료가 독특한 피크 파장을 가짐), 각각의 미세유체 채널내의 상기 복수의 분리된 표적 분석대상체를 검출하는 단계를 포함한다.
제 4 양상에서, 본 발명은 통합된 바이오칩 시스템을 제공하는데, 상기 시스템은 (a) 하나 또는 복수의 미세유체 시스템을 포함하는 바이오칩[여기서 각각의 미세유체 시스템은 분리 챔버와 미세유체적으로 소통하는 제 1 반응 챔버를 포함하며, 여기서 상기 제 1 반응 챔버는 핵산 추출; 핵산 정제; 핵산 증폭전 세정(cleanup); 핵산 증폭; 핵산 증폭후 세정; 핵산 시퀀싱전 세정; 핵산 시퀀싱; 핵산 시퀀싱후 세정; 역 전사; 역 전사전 세정; 역 전사후 세정; 핵산 라이게이션; 핵산 혼성화; 또는 정량에 대해 적합화되며; 상기 분리 챔버는 검출 지점을 포함함]; 및 (b) (i) 상기 분리 챔버내의 복수의 표적 분석대상체를 동시적으로 분리하기 위한 분리 소자; (ii) 상기 바이오칩상의 상기 검출 지점을 조명하기 위해 위치된 하나 이상의 광 공급원; (iii) 상기 검출 지점으로부터 방출된 광을 수집 및 유도하기 위해 위치된 하나 또는 복수의 제 1 광학 소자; 및 (iv) 상기 제 1 광학 소자로부터 유도된 광을 수용하기 위해 위치된 광 검출기를 포함하는 분리 및 검출 시스템으로서, 여기서 상기 광 검출기는 광 파장에 따라 상기 제 1 광학 소자로부터의 광을 분리시키고 6개 이상의 검출 소자에 상기 분리된 광의 일부를 제공하기 위해 위치된 파장 분산 소자를 포함하며, 여기서 각각의 상기 검출 소자는 상기 검출 소자 각각으로부터의 검출 정보를 동시적으로 수집하기 위한 제 1 조절 소자와 소통하며; 상기 광 검출기는 하나 이상의 생물학적 분자에 표지된 6개 이상의 염료로부터의 형광을 검출하며, 각각의 염료는 독특한 피크 파장을 지니는, 분리 및 검출 시스템을 포함한다.
제 5 양상에서, 본 발명은 통합된 바이오칩 시스템을 제공하는데, 상기 시스템은 (a) 하나 또는 복수의 미세유체 시스템을 포함하는 바이오칩[여기서, 각각의 미세유체 시스템은 분리 챔버와 미세유체적으로 소통하는 제 1 반응 챔버를 포함하며, 여기서 상기 제 1 반응 챔버는 핵산 추출; 핵산 정제; 핵산 증폭전 세정; 핵산 증폭; 핵산 증폭후 세정; 핵산 시퀀싱전 세정; 핵산 시퀀싱; 핵산 시퀀싱후 세정; 역 전사; 역 전사전 세정; 역 전사후 세정; 핵산 라이게이션; 핵산 혼성화; 또는 정량에 대해 적합화되며; 상기 분리 챔버는 검출 지점을 포함함]; 및 (b) (i) 상기 분리 챔버내에서, DNA 서열을 포함하는 복수의 생물학적 분자를 동시적으로 분리하기 위한 분리 소자; (ii) 상기 바이오칩상의 상기 검출 지점을 조명하기 위해 위치된 하나 이상의 광 공급원; (iii) 상기 검출 지점으로부터 방출된 광을 수집 및 유도하기 위해 위치된 하나 또는 복수의 제 1 광학 소자; 및 (iv) 상기 제 1 광학 소자로부터 유도된 광을 수용하기 위해 위치된 광 검출기를 포함하는 분리 및 검출 시스템으로서, 여기서 상기 검출기가 광 파장에 따라 상기 제 1 광학 소자로부터의 광을 분리시키고 6개 이상의 검출 소자에 상기 분리된 광의 일부를 제공하기 위해 위치된 파장 분산 소자를 포함하며, 여기서 상기 검출 소자 각각은 검출 소자 각각으로부터의 검출 정보를 동시적으로 수집하기 위하여 제 1 조절 소자와 소통하며; 상기 광 검출기가 하나 이상의 DNA 서열에 표지된 8개 이상의 염료로부터의 형광을 검출하며, 각각의 염로가 독특한 피크 파장을 지니고, 상기 염료가 2개 이상의 4-염료 함유 서브세트의 일원이고, 그리하여 상기 염료 세트가 단일 채널내의 2개 이상의 DNA 서열을 검출할 수 있으며, 여기서 상기 염료의 수는 4의 배수이고, 검출되는 상기 DNA 서열의 수는 상기 배수와 동일하며, 그리하여 상이한 염료 각각이 오직 한 서브세트내에 존재하는, 분리 및 검출 시스템을 포함한다.
도면의 설명
도 1은 4개의 개별 샘플에 대한 용해 및 주형 증폭을 위한 통합된 바이오칩의 구현예에 대한 도면이다.
도 2는 도 1의 바이오칩의 제 1 층의 구현예에 대한 도면이다.
도 3은 도 1의 바이오칩의 제 2 층의 구현예에 대한 도면이다.
도 4는 도 1의 바이오칩의 제 3 층의 구현예에 대한 도면이다.
도 5는 도 1의 바이오칩의 제 4 층의 구현예에 대한 도면이다.
도 6은 도 1의 바이오칩의 조립 및 결합의 구현예에 대한 도면이다.
도 7은 2가지 밸브 유형, 인-플레인(in-plane) 및 쓰루-홀(through-hole) 밸브에 관한 탈이온수 및 순환주기 시퀀싱 시약용 밸브의 수력적 직경의 역수(inverse hydraulic diameter)의 함수로 모세관 밸브 압력을 나타낸 그래프이다.
도 8은 PCR에 의한 주형 증폭에 관한 도 1의 바이오칩의 유체(flui 단계들의 구현예를 보여주는 도면이다.
도 8a는 샘플 및 PCT 시약이 본 발명의 바이오칩 상에 로딩되어 있음을 보여주는 도면이다.
도 8b는 채널을 통한 샘플 챔버로의 샘플 전달을 보여주는 도면이다(채널은 유체 경로를 도시하기 위해 샘플 채널을 따라 상이한 위치에서 도시되어 있다.)
도 8c는 샘플 챔버내 샘플을 보여주는 도면이다.
도 8d는 시약 챔버로의 PCR 시약의 전달을 보여주는 도면이다.
도 8e는 과량의 PCR 시약의 배출(withdrawal)을 보여주는 도면이다.
도 8f 및 8g는 모세관 밸브의 제 1 세트에 의한 액체의 초기 혼합 단계 및 체류를 보여주는 도면이다.
도 8h 내지 8j는 열적 순환이 개시되는 시점에서, PCR 챔버로 전달되는 혼합된 액체를 보여주는 도면이다.
도 9는 통합된 바이오칩의 유체 단계의 구현예를 보여주는 도면이다.
도 9a 내지 9e는 층 1내 정량 챔버로 순환주기 시퀀싱 시약의 전달 및 상기 챔버의 부근으로부터의 과량의 시약의 제거를 보여주는 도면이다.
도 9f 및 9g는 생어 반응 챔버내로 PCR 생성물의 도입을 보여주는 도면이다.
도 9h-9j는 역 동작에 의한 PCR 생성물과 생어 시약의 혼합을 보여주는 도면이다.
도 9l은 분석을 위해 제거될 수 있는 주기순환된 생성물을 보여주는 도면이다.
도 10은 도 1의 바이오칩내에서 생성된 시퀀싱 생성물에 대한 시퀀싱 자취(일렉트로페로그램(electropherograms))이다.
도 11은 순환주기 시퀀싱 생성물의 한외여과의 성능에 관한 통합된 바이오칩의 구현예를 보여주는 도면이다. 칩 조립은 층 3과 4 사이에 한외여과(UF) 필 터(1116)의 추가를 제외하고는 바이오칩 1에서의 것과 유사하다.
도 12는 시퀀싱 생성물의 정제 동안의 도 11의 바이오칩의 유체 단계들을 보여주는 도면이다.
도 12a 및 12b는 UF 인풋 챔버로의 생어 생성물의 전달을 보여주는 도면이다.
도 12c는 여과 챔버로 전달된 시퀀싱 생성물을 보여주는 도면이다.
도 12d는 시퀀싱 생성물의 거의 완벽한 여과를 보여주는 도면이다.
도 12e 내지 12g는 UF 인풋 챔버로의 세척물의 전달 및 전달 채널로부터의 과량의 세척물의 연이은 제거를 보여주는 도면이다.
도 12h는 제 1 세척 순환주기의 개시를 보여주는 도면이다; 제 1 세척 순환주기 다음에 도 12d에 도시된 것과 타은 여과 및 후속 세척 순환주기가 뒤따른다.
도 12i 및 12j는 용리 액체(세척물과 동일한 액체)가 UF 인풋 챔버로 전달되는 것을 보여주는 도면이다.
도 12k 내지 12m은 폐쇄된 아웃풋 포트를 지니는 UF 인풋 챔버를 가압하고, 이후 역 동작을 초래하기 위해 상기 압력을 방출시키는 단일 순환주기를 보여주는 도면이다.
도 12n은 추가의 가공 또는 제거를 위해 준비된 정제된 생성물을 보여주는 도면이다.
도 13은 주형 증폭, 순환주기 시퀀싱, 시퀀싱 생성물 세정, 전기영동에 의한 분리 및 레이저-유도된 형광에 의한 검출의 성능에 관한 통합된 바이오칩의 구현예 를 보여주는 도면이다.
도 14는 카운터 전극에 의한 표지된 핵산 단편의 농축 및 분리 채널내로의 주입을 보여주는 도면이다.
도 15는 여기 및 검출 시스템의 구현예를 보여주는 도면이다.
도 16은 여기 및 검출 시스템의 구현예를 보여주는 도면이다.
도 17은 6가지 염료 샘플의 분리 및 검출에 관해 생성된 일렉트로페로그램이다. 그래프내의 각각의 자취는 32-음극 PMT의 32개 소자 각각으로부터의 신호를 나타낸다. 각각의 자취는 데이터의 쉬운 보기를 가능케 하기 위해 각자 서로에 대해 오프세트이다.
도 18은 일렉트로페로그램으로부터 추출된, 6가지 염료 각각의 염료 스펙트럼을 보여주는 그래프이다; 또한 백그라운드 형광 스펙트럼이 도시되어 있다.
도 19는 6-FAM, VIC, NED, PET 및 LIZ 염료의 염료 방출 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 20은 5-FAM, JOE, NED, 및 ROX 염료의 염료 방출 스펙트럼을 보여주는 그래프이다.
도 21은 4가지 염료 샘플의 분리 및 검출에 관해 생성된 일렉트로페로그램이다. 그래프내의 각각의 자취는 32-음극 PMT의 32개 소자 각각으로부터의 신호를 나타낸다. 각각의 자취는 데이터의 쉬운 보기를 가능케 하기 위해 각자 서로에 대해 오프세트이다.
도 22는 시퀀싱 자취이다.
바람직한 구현예들에 대한 상세한 설명
I. 통합 및 통합된 시스템
A. 통합에 대한 일반적인 설명
미세유체를 사용하는 것은 조립된 특징부들이 단일 바이오칩 상에서 하나 이상의 기능을 수행하도록 한다. 이러한 기능들 중 2가지 이상이 미세유체적으로 연결되어 샘플의 순차적인 처리를 가능케 할 수 있다; 이러한 커플링은 통합으로 칭해진다.
모든 과정들이 임의의 주어진 적용을 위해 실행되지 않아야 하지만, 임의의 주어진 적용을 달성하기 위해 통합되어야 하는 소정 범위의 가능한 기능들 또는 구성 과정들이 존재한다. 그 결과로, 선택된 통합 방법은 상이한 순서로 다수의 상이한 구성 과정들을 효과적으로 연결시키기 위해 적절하여야 한다. 통합될 수 있는 과정들은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 하기를 포함한다:
1. 샘플 삽입;
2. 외래 물질의 제거(예를 들어, 먼지, 섬유와 같은 거대 미립자)
3. 세포 분리(즉, 분석되어야 할 미생물 핵산을 함유하는 임상 샘플로부터의 분석되어야 할 핵산을 함유하는 세포 이외의 세포의 제거, 예컨대, 인간 세포(및 그에 따라, 인간 게노믹 DNA)의 제거);
4. 관심있는 핵산을 함유한 세포의 농축;
5. 세포의 용해 및 핵산의 추출;
6. 용해물로부터의 핵산의 정제; 더 적은 부피로의 상기 핵산의 가능한 농 축;
7. 증폭전 핵산 세정;
8. 증폭후 세정;
9. 시퀀싱전 세정;
10. 시퀀싱;
11. 시퀀싱후 세정(예를 들어, 전기영동을 방해하는 비통합된 염료-표지딘 터미네이터 및 이온을 제거하기 위함);
12. 핵산 분리;
13. 핵산 검출;
14. RNA의 역전사;
15. 역전사전 세정;
16. 역전사후 세정;
17. 핵산 라이게이션;
18. 핵산 정량;
19. 핵산 혼성화; 및
20. 핵산 증폭(예를 들어, PCR, 롤링 서클 증폭, 사슬 치환 증폭, 및 다중 치환 증폭).
이들 공정들중 일부가 조합될 수 있는 다수의 방법들 중 한가지는 STR 분석에 의한 인간 확인을 위한 통합된 시스템에 있다. 그러한 시스템은 DNA 추출, 인간 특이적 DNA 정량, PCR 반응에 규정된 양의 DNA의 첨가, 다중화된 PCR 증폭, 및 분리 및 검출의 커플링(임의로, 반응 성분들 또는 프라이머를 제거하기 위한 세정 단계들이 또한 통합될 수 있음)을 요할 수 있다. 하나 이상의 샘플이 전혈, 건혈, 볼의 안쪽 표면, 지문, 강간, 접촉, 또는 기타 법의학적으로 적절한 샘플의 채집봉법(swabbing)과 같은 기술에 의해 수집될 수 있다(문헌[Sweet et al, J. Forensic Sci. 1997 . 42. 320-2]을 참조). 용해물에 대한 노출(임의로 진탕의 존재하에)은 채집봉으로부터의 DNA를 튜브내로 방출시킨다.
B. 통합 성분들 및 이들의 용도에 대한 일반적 설명
1. 샘플 수집 및 초기 가공
많은 적용의 경우, 하기 별개 성분들이 바이오칩내로 유익하게 통합된다: 샘플 삽입; 외래 물질의 제거; 간섭 핵산의 제거; 및 관심있는 세포의 농축. 일반적으로, 바이오칩의 사전-가공 성분은 샘플을 수용하고, 미립자와 외래 핵산 함유 세포의 초기 제거를 수행하며, 관심있는 세포를 적은 부피로 농축시킨다. 한가지 접근법은 채집봉(예를 들어, "Q-팁"을 닮은 채집봉)을 수용할 수 있고 용해 및 추출 단계를 수행하기 이한 용해액으로 채워진 샘플 튜브를 사용하는 것이다. 채집봉은 혈흔, 지문, 물, 공기 필터, 또는 임상 부위(예를 들어, 구강점막세포 채집봉(buccal swab), 상처 채집봉, 비강 채집봉)을 포함하는 다수의 세포-함유 부위로 접촉되어 놓여질 수 있다.
바이오칩의 다른 구성요소들과 이들 튜브들의 인터페이스는 외래 물질의 제거를 위한 필터를 포함할 수 있다. 또 다른 접근법은 거대-부피 혈액 또는 환경적 샘플 획득 카트리지를 사용하는 것인데, 상기 카트리지는 1-100 mL의 샘플을 처리 한다. 혈액의 경우, 백혈구 감소 배지는 관심있는 핵산 함유 미생물을 계대(passing)시키면서 인간 백혈구 세포 및 간섭 DNA를 제거할 수 있다. 환경적 샘플의 경우, 거대-메쉬 필터가 먼지와 흙을 제거하는데 사용될 수 있으며, 한편, 소-메쉬 필터(예를 들어, < 20 μm, < 10 μm, < 5 μm, < 2.5 μm, < 1 μm, < 0.5 μm, < 0.2 μm, < 0.1 μm의 필터)가 미생물들을 작은 부피로 농축시키면서 상기 미생물들을 포집하는데 사용될 수 있다. 이러한 전처리 구성요소들은 별개의 소모품일 수 있거나 제조시에 통합된 바이오칩에 부착될 수 있다. 대안적으로, 바이오칩은 유형에 의해 세포들(예를 들어, 질상피세포로부터의 정액 또는 박테리아로부터의 적혈구 세포)을 분리시키기 위해 차별적 용해를 수행하도록 설계될 수 있다.
2. 용해 및 추출
다양한 용해 및 추출 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 전형적인 절차는 세포벽을 파괴하고 핵산을 방출시키는, 단백질분해효소-K와 같은 분해 효소 소량과 샘플을 혼합한 후 열의 적용을 포함한다. 다른 유용한 방법은 음파분해 및 초음파분해인데, 하나 또는 둘 모두가 때때로 비드의 존재하에 수행된다.
예를 들어, 용해 및 추출은 106 개 이하의 세포를 함유하는 샘플에 대해 수행될 수 있다. 적용에 따라서, 더 적은 수의 출발 세포들이 본 발명의 바이오칩과 방법들에 사용될 수 있는데, 105개 이하, 104개 이하, 103개 이하, 102개 이하, 10개 이하, 및 멀티-카피 서열이 분석되어지는 경우, 1개 이하가 사용될 수 있다.
3. 핵산의 정제
핵산 정제의 한 형태는 인풋 및 아웃풋 채널 사이에 정제 매질(medium)을 삽입함으로써 달성될 수 있다. 이 정제 매질은 실리카 섬유에 기반할 수 있으며 생물학적 샘플을 용해시키고, DNA(및 RNA)를 노출시키고 DNA(및 RNA)를 정제 매질에 결합시키기 위해 카오트로픽(chaotropic)-염 시약을 사용할 수 있다. 이후 용해물은 인풋 채널을 통해 정제 매질을 거쳐 운송되어 핵산에 결합된다. 결합된 핵산은 오염물질을 제거하기 위해 에탄올 기반 버퍼로 세척된다. 이것은 세척 시약을 인풋 채널을 통해 정제 멤브레인을 거쳐 흘려줌으로써 달성될 수 있다. 이후 결합된 핵산은 적절한 저 염 버퍼(예를 들어, Boom, 미국 특허 제 5,234,809호)를 흘려줌으로써 상기 멤브레인으로부터 용리된다. 이 방법의 변형은 상이하게-배열된 고체상의 사용을 포함한다. 예를 들어, 실리카 겔이 핵산을 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 상자성 실리카 비드가 사용될 수 있고, 이들의 자성이 결합, 세척, 및 용리 단계가 진행되는 동안 채널 또는 챔버 벽에 대해 이들을 고정시키는데 사용된다. 비자화된 실리카 비드가 또한 사용될 수 있고, 상기 비드는 프리츠(frits)(전형적으로 해당 장치의 플라스틱으로 제조되나, 이들은 또한 조립이 진행되는 동안 삽입될 수 있음)에 의해 유지되는 타이트한 '컬럼'내부에 패킹되거나 이들의 조작의 특정 시기(phases) 동안 "유리"되어 있다: 유리 비드는 핵산과 혼합될 수 있고 이후 해당 장치내의 프리츠 또는 웨어(weir)에 대해 흘려져 포회될 수 있고 그리하여 이들은 다운스트림 과정들을 방해하지 않는다. 다른 형식은 겔 매질내에 분배되는 실리카 입자를 지니는 졸-겔 및 실리카 입자 함유물(inclusions)을 지니는 중합체 단일체(monoliths)를 포함하는데, 상기 담체는 더 우수한 기계적 안정성을 위 해 가교된다. 본질적으로, 관용적 세팅에서 기능을 발휘하는 임의의 핵산 정제 방법은 본 발명의 통합된 바이오칩에 적합화될 수 있다.
4. 핵산 증폭
다양한 핵산 증폭 방법이 사용될 수 있는데, 예컨대, 2개 이상, 및 더 전형적으로 3개 온도 사이에서 열적 순환을 요하는, PCR 및 역전사 PCR이 사용될 수 있다. 등온 방법, 예컨대 사슬 치환 증폭이 사용될 수 있으며, 다중 치환 증폭이 전체 게놈 증폭을 위해 사용될 수 있다. "표적 핵산의 급속 다중화 증폭 방법{방법 FOR RAPID MULTIPLEXED 증폭 OF TARGET NUCLEIC ACIDS}"(대리인 문서관리번호 08-318-US호) 이라는 제목으로 본원과 동일자로 출원된 미국 특허 출원의 교시가 이의 전체로 참고문헌으로 본 명세서에 통합된다(전게서).
5. 핵산 정량
미세유체 형식에서 정량을 위한 한가지 접근법은 실시간 PCR에 기반한다. 이 정량 방법에서, 반응 챔버은 인풋과 아웃풋 채널 사이에 조립된다. 반응 챔버는 열 순환기에 커플링되고 광학 여기 및 검출 시스템은 반응 챔버에 커플링되어 반응 용액으로부터의 형광이 측정되게 한다. 샘플내 DNA의 양은 순환주기 당 반응 챔버로부터의 형광의 강도와 상관관계가 있다. 예를 들어, 문헌[Heid et al, Genome Research 1996, 6, 986-994]을 참조하라. 다른 정량 방법은 증폭 이전 또는 이후에 picoGreen, SYBR, 또는 에티디움 브로마이드와 같은 삽입(intercalating) 염료의 사용을 포함하며, 이후 형광 또는 흡광도를 사용하여 검출될 수 있다.
6. 2차 정제
STR 분석의 경우, 다중-증폭된(multiplex-amplified) PCR 생성물 및 표지된 PCR 생성물은 분석을 위해 직접적으로 사용될 수 있다. 그러나, 전기영동 분리 성능은 분리 또는 다른 후속 단계들을 방해하는 PCR에 요구되는 이온을 제거하기 위하여 생성물의 정제에 의해 현저하게 개선될 수 있다. 유사하게, 정제 후 순환주기 시퀀싱 또는 다른 핵산 조작이 유용할 수 있다. 총괄적으로, 임의의 정제 단계 후 핵산의 초기 추출 또는 정제가 2차 정제로 고려될 수 있다. 한외여과를 포함하는, 다양한 방법들이 사용될 수 있는데, 작은 이온/프라이머/비통합된 염료 표지가 필터를 통해 유도되고, 요망되는 생성물이 상기 필터 상에 남게되고 이후 상기 생성물은 용리되고 상기 분리 또는 후속 모듈로 직접적으로 적용될 수 있다는 점에서 그러하다. 한외여과 매질은 폴리에테르설폰 및 재생성된(regenerated) 셀룰로오스 "우븐(woven)" 필터를 비롯한, 트랙-에치(track-etch) 막을 포함하며, 고도로-균일한 크기의 세공(pores)이 극도로 얇은(1-10 μm) 막내에 형성된다. 후자는 필터 표면 아래의 일정 깊이에서 생성물을 포집하기 보다는, 상기 필터의 표면상의 세공 크기보다 더 큰 크기의 생성물을 수집하는데 이점을 지닌다. 증폭된 핵산은 또한 위에 개관된 동일한 방법들(즉, 실리카상에서의 고전적 고체상 정제)을 사용하여 정제될 수 있다. 여전히 추가 방법들은 하이드로겔, 세공 크기 변이성의 특성( 즉, 열과 pH와 같은 환경적 변수에 반응하는 세공 크기 변화)을 지니는 가교된 중합체를 포함한다. 한 상태에서, 세공은 촘촘하며(tight) PCR 생성물은 통과할 수 없다. 세공이 팽창함에 따라, 세공을 통한 생성물의 수력학적 또는 전기영동 플로 우가 가능해진다. 또 다른 방법은 생성물상의 서열 태그에 대한 보체(complement)가 상기 고체 표면상에 존재한다는 점에서, 혼성화, 표면(예컨대, 비드의 표면) 상에 고정된 무작위 DNA에 대한 생성물의 비특이적 혼성화 또는 특이적 혼성화의 사용이다. 이러한 접근법에서, 관심있는 생성물은 혼성화를 통해 고정되고 원치않는 물질은 세척에 의해 제거되며; 후속 가열은 듀플렉스를 융해시키고 정제된 생성물을 방출시킨다.
7. 순환주기 시퀀싱 반응
고전적인 순환주기 시퀀싱은 PCR에서와 같이 많은, 열적 순환을 요한다. 바람직한 방법은 염료-표지된 터미네이터를 사용하는 방법이고, 이로써 각각의 신장 생성물은 해당 신장 반응의 최종 염기에 상응하는 단일 형광 표지를 지닌다.
8. 주입, 분리, 및 검출
표지된 핵산 단편의 전기용동 채널내로의 주입, 분리 및 검출은 대리인 문서관리번호 07-865-US호가 부여되었으며 본원과 동일자로 출원된, "플라스틱 미세유체 분리 및 검출 플랫폼"이라는 제목의 미국 특허 출원에 기재된, 다양한 방식으로 수행될 수 있는데, 상기 특허 출원은 이의 전체로 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다. 첫째, 본 명세서에서 논의했던 것 같은 교차-주입은 샘플의 일부를 주입하기 위해 사용될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 전기역학적 주입("EKI(electrokinetic injection)")이 사용될 수 있다. 어느 경우에서나, 로딩 채널(교차 주입의 경우) 또는 분리 채널(EKI의 경우)의 개방 말단부 근처에서 시퀀싱 생성물의 추가 농축이 전극 근처에 정전기적으로 생성물을 농축시킴으로써 수행 될 수 있다. 칩의 전기영동 부분 상의 2-전극 샘플 웰이 도 14에 도시되어 있다. 양 전극이 DNA가 전극의 금속에 접촉하는 것을 막고 샘플 웰과 전극 사이의 이온과 물의 접근을 허용하는 침투층(permeation layer)으로 코팅된다. 그러한 침투층은 가교된 폴리아크릴아미드로 형성될 수 있다(미국 특허 공개 공보 제 2003-146145-A1호 참조). 채널 개방부로부터 가장 멀리 떨어진 전극은 분리 전극이고, 한편 채널 개방부에 가장 가까운 전극은 카운터전극이다. 분리 전극에 비해 양으로 상기 카운터전극을 충전시킴으써, DNA는 상기 카운터전극으로 당겨질 것이고 상기 분리 채널의 개방부 근처에 농축될 것이다. 상기 카운터전극을 부유시키고 상기 분리 전극과 상기 분리 채널의 원격 말단부에서 음극을 사용하여 주입함으로써, 농축된 생성물은 전기동역학적으로 주입된다.
C. 통합 방법
바이오칩은 또한 기능 모듈을 통합하기 위한 몇가지 상이한 수단들을 포함한다. 이들 수단들은 바이오칩 상의 지점에서 지점으로 액체의 운송, 유속 의존적인 과정(예를 들어, 몇몇 세척 단계, 입자 분리, 및 용리)을 위한 유속의 조절, 바이오칩 상에서 시간 및 공간적으로 유체 동작의 게이팅(예를 들어, 몇몇 형태의 밸브의 사용을 통한 게이팅), 및 유체의 혼합을 포함한다.
다양한 방법들이 유체 운송 및 조절된 유체 흐름을 위해 사용될 수 있다. 한 방법은 포지티브-디스플레이스먼트 펌핑(positive-displacement pumping)인데, 유체 또는 개입 기체(interposing gas) 또는 유체 중 어느 하나와 접촉시 플런저가 동작이 진행되는 동안 상기 플런저에 의해 배수되는 부피에 기초한 정밀한 거리로 유체를 유도한다는 점에서 그러하다. 그러한 방법의 일예는 시린지 펌프이다. 또 다른 방법은 공기압적으로, 자기적으로, 또는 달리 작동되는 통합된 앨라스토머 막의 사용이다. 단독으로, 이들 막들은 규정된 공간내에 유체를 함유하고/거나 유체의 미숙한 혼합 또는 전달을 막기 위해 밸브로서 사용될 수 있다. 그러나, 연속으로 사용되는 경우, 이들 막들은 연동(peristaltic) 펌프와 유사한 펌프를 형성할 수 있다. 동조화됨으로써, 막 유체의 순차적인 작동은 선단면(leading side) 상의 막이 움직이는 유체를 수용하기 위해(장치의 채널내의 임의의 배기딘 공기를 배출시키기 위해) 개방됨에 따라 이의 후미면(trailing side)으로부터 "추진(pushed)"될 수 있다. 이들 막의 가동을 위한 바람직한 방법은 공기압식 가동이다. 그러한 장치에서, 바이오칩은 유체층(fluidic layers)으로 구성되는데, 상기 층들중 적어도 하나는 막을 지니며, 상기 막들의 한 측면은 장치의 유체 채널 및 챔버 내부에서 노출된다. 상기 막의 다른 측면은 압력 공급원에 수직한(plumbed) 공기압식 매니폴드(manifold) 층에 노출된다. 막들은 압력 또는 진공의 적용에 의해 개방되거나 폐쇄된다. 정상적으로 개방되거나 정상적으로 폐쇄되는 밸브가 사용되는데, 압력 또는 진공의 적용하에서 상태가 변화된다. 기체는 분석이 진행되는 동안 유체와 접촉하지 않기 때문에, 임의의 기체가 작동을 위해 사용될 수 있음에 주목하라.
유체를 유도하고 유속을 조절하기 위한 아직 또 다른 방법은 유체의 선도 메니스커스(menisci), 후미 메니스커스, 또는 둘 모두의 메니스커스에 압력을 변화시킴으로써, 진공 또는 압력을 직접적으로 유체 자체에 적용하는 것이다. 적절한 압력(전형적으로, 0.05-3 psig의 범위)이 적용된다. 유속은 또한 유체역학 채널을 적절히 사이징함으로써 조절될 수 있는데, 그 이유는 유속이 유체 및 수력적 직경을 거쳐 제 4 힘으로 차분되는 압력에 비례하고 채널의 길이 또는 액체 플러그와 점도에 역 비례하기 때문이다.
유체 게이팅은 다양한 작동(active) 밸브를 사용하여 달성될 수 있다. 전자는 칩내로 직접적으로 통합될 수 있거나, 바이오칩에 적용되고 이로써 주 칩 몸체상의 포트가 밸브와 소통하여, 유체를 밸브내로 유도하고 이후 칩으로 복귀시키는, 압전 밸브 또는 솔레노이드 밸브를 포함할 수 있다. 이러한 유형의 밸브의 한가지 결점은, 많은 적용의 경우, 이들이 제조하기가 어렵고 너무 고가라서 일회용 통합된 장치내에 통합될 수 없게 될 가능성이 있다는 것이다. 바람직한 접근법은 위에서 논의된 것과 같이, 밸브로서 막을 사용하는 것이다. 예를 들어, 10 psig에 의해 가동되는 막은 PCR을 겪는 유체를 성공적으로 함유하는데 사용될 수 있다.
몇몇 적용에서, 수동 밸브인, 모세관 마이크로밸브가 바람직할 수 있다. 본질적으로, 마이크로밸브는 플로우 경로내 압축물(constrictions)이다. 마이크로밸브에서, 표면 에너지 및/또는 기하학적 특징들, 예컨대, 날카로운 모서리가, 파열압(burst pressure)으로 칭해지는, 유체에 적용된 압력이 임계 밸브 미만인 경우, 흐름을 방해하기기 위해 사용될 수 있는데, 상기 압력은 하기 관계식으로 일반적으로 주어진다:
Figure 112009067875006-PCT00001
상기 식에서 γ는 액체의 표면장력이고, dH는 밸브의 수력적 직경이고(4 * (단면적)/단면 페리미터(perimeter)로 정의됨), θc는 밸브 표면과 액체의 접촉 각도이다.
수동 밸브가 특별한 적용에 바람직하게 만드는 특성들은 다음을 포함한다: 극도로 낮은 무효-부피(전형적으로 피코리터 범위임), 및 작은 물리적 크기(extent)(각각이 밸브에 이르고 밸브로부터의 채널보다 단지 조금만 더 큼). 작은 물리적 크기는 높은 밸브 밀도를 바이오칩의 주어진 표면상에 가능케 한다. 추가적으로, 특정 모세관 밸브는 표면 처리와 함께 또는 없이, 플라스틱 시트내의 작은 구멍으로 본질적으로 이루어져서, 제조하기가 매우 단순하다. 모세관 밸브의 현명한 사용은 요구되는 막 밸브의 총 갯수를 감소시킬 수 있고, 전반적인 제조과정을 단순화시킬 수 있으며 강건한 시스템을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 장치에 포함되는 모세관 밸브는 다음 2가지 형태이다: 밸브의 작은 채널과 날까로운 코너가 한 층내에 "골(troughs)"을 생성시키고 이 층을 평범한 뚜껑(featureless lid)(전형적으로 장치의 또 다른 층)에 결함시킴으로써 형성된다는 점에서, 인-플레인 밸브; 및 작은 (전형적으로 250 μm 이하) 홀이 장치의 2개의 유체-운반층(fluidics-carrying layers) 사이에 중간층이 만들어진다는 점에서, 쓰루-홀 밸브. 두 경우에 있어서, 플루오로폴리머로의 처리가 밸브와의 접촉시 유체의 접촉 각도를 증가시키는데 사용될 수 있다.
도 7은 플루오로폴리머 처리의 경우 밸브 크기의 함수로서, 관심있는 액체, 즉, 탈이온수 및 순환주기 시퀀싱 시약을 위한 이들 밸브의 밸브 성능을 보여준다. 두 경우에서, 밸브 치수에 대한 밸브 압력의 예상된 의존도가 관찰된다(압력 ~ 1/직경). 쓰루-홀 밸브는 인-플레인 밸브를 능가하는 유의미한 이점들을 지닌다. 첫째, 이들은, 작은 쓰루-홀이 포스트 주위에 몰딩되거나, 펀칭되거나, 다이-커팅되거나, 밸브 층이 형성된 후 레이저-드릴링됨으로써, 플라스틱 시트내에 용이하게 만들어 질 수 있다는 점에서, 제조하기가 더 용이하다. 인-플레인 밸브는 상당히 정밀한 조립을 요하며, 매우 우수한 밸브(높은 밸브 압력을 지니는 밸브)는 요구되는 몰딩 또는 엠보싱 툴을 생성시키기 위해 석판 기술의 사용을 필요로 한다. 둘째, 쓰루-홀 밸브는 "모든 측면(all sides)"에 플루오로폴리머로 더 완벽하게 코팅될 수 있다. 홀에 저-표면-장력 플루오로폴리머 용액의 적용은 결과적으로 모세관 작용에 의한 상기 홀의 내부 벽의 완벽한 코팅을 야기시킨다. 인-플레인 밸브의 모든 측면의 코팅은 밸브를 비롯한 상기 밸브를 밀봉하는 접합층(mating layer)의 영역 둘 모두에 플루오로폴리머의 적용을 요한다. 그 결과, 전형적인 인-플레인 밸브가 밸브의 "루프" 상에 코팅 없이 형성된다.
틀에 맞게 제작된 원형에서, 쓰루-홀 밸브는 도 7에 도시된 것과 같이, 밸브 압력을 더 쉽게 충족시키고 더 쉽게 훨씬 큰 밸브 압력을 나타낸다.
혼합은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 첫째, 확산이 2가지 유체를 단일 채널내로 동시-주입함으로써 유체를 혼합시키는데 사용될 수 있는데, 상기 채널은 일반적으로 적은 측면 치수와 충분한 길이를 지녀 그리하여 하기 확산 시간이 주어진 유속에서 충족된다:
tD=(너비)2/(2 * 확산 상수). 불행하게도, 이러한 유형의 혼합은 전형적으로 거대 부피를 빠르게 혼합하는데 부적절한데, 그 이유는 확산 또는 혼합 시간이 채널 너피의 제곱에 비례하기 때문이다. 혼합은, 유체 기류가 분할되고 재결합된다는 점에서(Campbell and Grzybowski Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 2004, 362, 1069-1086), 라미네이션; 또는 플로우 채널내부에 무질서한 이류(chaotic advection)를 생성시키기 위해 미세한 마이크로구조의 사용을 통해(Stroock et al., Anal. Chem. 2002. 74, 5306-4312),다양한 방식으로 증강될 수 있다. 작동 펌프 및 밸브를 사용하는 시스템에서, 혼합은 장치 다중 시간상의 2개 지점 사이에 유체를 순환시킴으로써 달성될 수 있다. 마지막으로, 후자는 또한 모세관 밸브를 사용하는 시스템에서 달성될 수 있다. 2개의 채널 또는 챔버 사이에 배치된 모세관 밸브는 유체 흐름을 위한 피벗(pivot)으로 역할한다; 모세관을 통해 한 채널에서 다른 채널로 유체가 흐름에 따라, 후미 메니스커스는 유체를 펌핑하기 위해 충분히 낮은 압력이 사용되면 포획된다. 압력의 역전은 유체가 제 1 채널로 복귀되게 유도하며, 유체는 다시 모세관에 고착된다. 복수의 순환주기는 성분들을 효율적으로 혼합시키는데 사용될 수 있다.
미세유체 포맷에서 분리 및 검출에 대한 접근법은 본원과 동일자로 출원된, 대리인 문서관리번호 07-865-US호의, "플라스틱 미세유체 분리 및 검출 플랫폼"이라는 제목의 미국 특허 출원에 기재되어 있으며, 상기 특허 출원은 이의 전체로 참고문헌으로 통합된다(예를 들어, 상기 특허 출원 명세서의 단락 68-79, 94-98을 참 조하라).
도 13의 상단부는 제조시 또는 제조가 진행되는 동안에 결합되는 2가지 구성요소들로부터의 통합된 바이오칩(1301)의 구축을 보여준다. 첫째, 도 1의 바이오칩의 용해, 증폭, 및 시퀀싱 특징부들과 도 11의 바이오칩의 시퀀싱 생성물 정제 특징부를 조합한 16-샘플 바이오칩(1302), 둘째, 16-레인 플라스틱 분리 바이오칩(1303). 정제된 시퀀싱 생성물은 또한 분리에 앞서 전자동역학적으로 주입될 수 있다.
D. 조립 방법
본 발명의 장치는 주로 플라스틱으로 구성될 수 있다. 유용한 유형의 플라스틱은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 하기한 것들을 포함한다: 시클릭 올레핀 폴리머(COP); 시클릭 올레핀 코폴리머(COC); (상기 둘 모두는 탁월한 광학적 특질, 낮은 흡습성, 및 분자량이 충분한 경우 높은 작동 온도를 지닌다); 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)(용이하게 기계가공될 수 있고 탁월한 광학적 특성이 획득될 수 있음); 및 폴리카보네이트(PC)(양호한 충격 내성 및 높은 작동 온도로 고도로-성형가능함). 물질 및 조립 방법에 대한 더 많은 정보는 참고문헌으로 포함된 "표적 핵산의 급속 다중화 증폭 방법"이라는 제목의 미국 특허 출원(대리인 문서관리번호 08-318-US호)(전게서)에 포함되어 있다.
다양한 방법이 바이오칩의 개개 부품들을 규격에 맞게 만들고 이들을 최종 장치로 조립시키는데 사용될 수 있다. 바이오칩이, 삽입된 구성요소들의 가능한 통합(inclusion)과 함께, 하나 이상의 유형의 플라스틱으로 구성될 수 있기 때문 에, 관심있는 방법은 개별 부품들의 제조에 후속하여 부품들의 후가공 및 조립과 관련있다.
플라스틱 구성요소들은 주입 몰딩, 고온 엠보싱 및 다듬질(machining)을 포함하는, 다양한 방식으로 규격에 맞게 제작될 수 있다. 주입 몰딩된 부품들은 거대(gross) 특징부들(예컨대, 유체 저장소)을 비롯한 미세한 특징부들(예컨대, 모세관 밸브) 둘 모두로 구성될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 미세한 특징부들을 한 세트의 부품들로 생성시키고 더 큰 특징부들을 또 다른 세트로 생성시키는 것이 바람직할 수 있는데, 그 이유는 이러한 상이하게-사이징된 특징부들의 주입 몰딩에 관한 접근법들이 달라질 수 있기 때문이다. 거대 저장소의 경우(측면상의 수 (약 1 -50 mm) mm를 측정하며 수 mm(약 1-10 mm)의 심도를 지니며 수백 μL를 수용함), 기계가공된 주입 몰딩 툴, 또는 툴의 음각(negative)이 되도록 기계가공된 흑연 전극을 사용하여 강철 또는 다른 금속을 불태움으로써 생성된 툴을 사용하는 관용적인 몰딩이 채용될 수 있다.
미세한 특징부들의 경우, 툴 제작 및 몰딩 과정 둘 모두가 달라질 수 있다. 툴은 전형적으로 관심있는 기판상에서 석판 공정(예를 들어, 유리의 등방성 식각, 또는 심도 반응성 이온 에칭 또는 실리콘상의 기타 공정)을 사용하여 제작된다. 이후 기재는 니켈로 전기도금될 수 있으며(일반적으로 접착을 막기 위해 크롬 층의 층착 후) 기판은, 예를 들어, 산에서의 에칭으로 제거될 수 있다. 이 니켈 "딸(daughter)" 플레이트는 주입 몰딩 툴이 된다. 몰딩 과정은, 또한, 상기한 것과 다소 다를 수 있다: 미세한, 얕은 특징부들의 경우, 압축-주입 몰딩(몰드가 플라스 틱이 공동내로 주입된 후 물리적으로 조금 압축됨)은 충실도, 정밀도, 및 재생산성의 측면에서 표준 주입 몰딩 보다 우수한 것으로 밝혀졌다.
고온 엠보싱의 경우, 위에서 논의된 것과 같은 거대 및 미세 특징부들과 관련한 유사한 논쟁거리들이 유지되며, 툴은 상기한 바와 같이 생성될 수 있다. 고온 엠보싱에서, 펠렛형, 또는 몰딩 또는 엠보싱을 통해 생성된 물질의 사전-성형 블랭크(blank)로서, 플라스틱 레진은 툴 표면 또는 평평한 기판에 적용될 수 있다. 제 2 툴은 이후 상기 플라스틱을 이의 유리 전이 온도로 올리기 위해 또한 툴(들)의 공동을 채우기 위해 물질 흐름을 초래하기 위해 정밀하게 조절된 온도와 압력에 접촉될 수 있다. 진공속에서의 엠보싱은 공기가 툴과 플라스틱 사이에 포획되는 문제점을 회피할 수 있다.
기계가공은 또한 부품들을 생성시키는데 사용될 수 있다. 고속 컴퓨터 수치 제어(computer numerical controlled, CNC) 기계가 몰딩되거나, 사출되거나, 용매-캐스팅된 플라스틱으로부터 1일당 다수의 개별 부품들을 생성시키는데 사용될 수 있다. 밀링 기계, 작동 파라미터, 및 커팅 툴의 적당한 선택은 높은 표면 품질을 달성시킬 수 있다(50 nm의 표면 거칠기(roughnesses)가 COC의 고속 밀링에서 달성될 수 있다(Bundgaard et al, Proceedings of IMechE Part C: J. Mech. Eng.Sci. 2006, 220, 1625-1632). 밀링은 또한 몰딩 또는 엠보싱에서 달성되기 어려울 수 있고 단일 부품상에 특징부 크기를 용이하게 믹싱하는 것이 어려울 수 있는 기학구조를 생성시키는데 사용될 수 있다(예를 들어, 거대 저장부 및 미세 모세관 밸브는 동일한 기재내로 기계가공될 수 있다). 몰딩 또는 엠보싱을 능가하는 밀링의 또 다른 이점은 몰드-방출 제제가 몰딩 툴로부터 규격에 맞게 제조된 부품을 방출시키기 위해 필요하지 않다는 것이다.
개별 부품들의 후처리는 광학적 검사(자공화될 수 있음), 부르(burrs) 또는 튀어나온 플라스틱과 같은 결함을 제거하기 위한 세정 작업, 및 표면 처리를 포함한다. 광학-품질 표면이 기계가공된 플라스틱에 요구되는 경우, 플라스틱을 위한 용매의 증기를 사용한 연마가 사용될 수 있다. 예를 들어, PMMA의 경우, 디클로로메탄이 사용될 수 있으며, 한편 COC 및 COP의 경우, 시클로헥산 또는 톨루엔이 사용될 수 있다.
조립에 앞서, 표면 처리가 적용될 수 있다. 표면 처리는 젖음(wetting)을 촉진하거나 이를 감소시키기 위해(즉, 부품의 친수성/소수성을 변화시키기 위해); 미세유체 구조내부에서 기포 형성을 억제하기 위해; 모세관 밸브의 밸브 압력을 증가시키기 위해; 및/또는 표면에 단백질 흡수를 억제시키기 위해 수행될 수 있다. 젖음도(wettability)를 감소시키는 코팅은 플루오로폴리머 및/또는 장치의 표면에 흡착되거나 결합될 때 유체에 노출되는 플루오린 모이어티를 지니는 분자를 포함한다. 코팅은 흡착되거나 달리 증착될 수 있거나, 이들은 공유적으로 표면에 연결될 수 있다. 그러한 코팅을 제조하는데 사용될 수 있는 방법은 딥 코팅, 조립된 장치의 채널을 통한 코팅 시약의 통과, 잉킹(inking), 화학 증착, 및 잉크젯 증착을 포함한다. 코팅 분자와 표면 간의 공유결합은, 표면 상의 표면 처리 분자의 후속 증착 또는 동시-증착으로, 활성화된 표면을 생성시키기 위한 산소 또는 기타 플라즈마 또는 UV-오존으로의 처리에 의해 형성될 수 있다(문헌[Lee et al. Electrophoresis 2005, 26, 1800-1806; 및 Cheng et al., Sensors and Actuators B 2004, 99, 186- 196.]를 참조하라).
구성 부품들의 최종 장치로의 조립은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 삽입된 장치, 예컨대, 필터는 다이-컷팅될 수 있으며 이후 자동조립(pick-and-place) 기계에 놓여질 수 있다.
열 확산 결합이, 예를 들어, 동일한 물질의 2개 이상의 층들의 결합을 위해 사용될 수 있는데, 상기 층들 각각은 균일한 두께이다. 일반적으로, 부품들은 적층되고(stacked) 적층은, 온도가 부품들을 포함하는 물질의 유래 전이 온도의 근처까지 상승될 수 있는, 고온 프레스에 놓여 지고, 부품들 사이의 인터페이스에서 융합이 초래된다. 이 방법의 이점은 결합이 "전면적(general)"인데, 즉, 대충 동일한 치수의 층들의 임의의 2개 적층이, 상기 층들의 내부 구조에 관계없이 결합될 수 있는데, 그 이유는 열과 압력이 상기 층들에 걸쳐 균일하게 적용되기 때문이다.
열 확산 결합은 또한 특이적으로-생성되는 결합 크래들(cradles)을 사용함으로써, 더 복잡한 부품들, 예컨대, 이들의 결합 표면 또는 반대 표면이 평평하지 않은 부품들을 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 그러한 크래들은 결합될 층들의 외부 표면에 따른다.
다른 결합 변이는, 용매, 예컨대, 메탄올은 부분적으로 플라스틱 표면을 용매화시킨다는 점에서, 용매-보조 열 결합을 포함하며, 더 낮은 결합 온도에서 결합 강도를 증강시킨다. 추가 변이는 더 낮은 분자량을 갖는 물질의 스핀-코팅된 층들의 사용이다. 예를 들어, 기질 성분들보다 더 적은 분자량을 가지나 동일한 화학 적 구조의 폴리머가 결합될 하나 이상의 층에 도포되고(spun onto), 성분들이 조립되고, 그 결과 획득된 적층이 확산 결합에 의해 결합된다. 열 확산 결합이 진행되는 동안, 저-분자량 성분들이 해당 성분들 보다 더 낮은 온도에서 이들의 유래 전이 온도를 통과할 수 있고 기재 플라스틱내로 확산될 수 있다.
접착제와 에폭시드가 비유사한 물질을 결합시키는데 사용될 수 있고 결합 성분들이 다른 방식으로 틀에 맞추어 제작되는 경우 사용되기 쉽다. 접착 필름이 다이-컷팅될 수 있고 성분들 상에 놓여질 수 있다. 액체 접착제가 또한 스핀-코팅을 통해 적용될 수 있다. 구조화된 부품들에 대한 접착제의 잉킹(예컨대, 나노접촉 프린팅에서)은 특별한 영역에 접착제를 "유도(direct)"할 필요 없이 구조화된 표면에 접착제를 성공적으로 적용될 수 있다.
일예로, 본 발명의 바이오칩은 도 6에 도시된 것과 같이 조립될 수 있다. 층 1 및 2는 포하된 특징부들(예를 들어, 핀과 소켓)에 의해 정렬될 수 있다; 별개로, 층 3 및 4는 포합된 특징부들에 의해 유사하게 정렬될 수 있다. 층 1 + 층 2 적층은 전도될 수 있으며 층 3 + 층 4 적층에 적용될 수 있고 이후 전체 적층이 결합될 수 있다.
E. 실시예
실시예 1
핵산 추출 및 증폭을 위한 통합된 바이오칩
DNA 추출 및 PCR에 의한 증폭을 위한 통합된 바이오칩이 도 1에 도시되어 있 다. 이 4-샘플 장치는 시약 분배 및 계량(metering); 시약과 샘플의 혼합; 샘플의 칩의 열 순환 부분으로이 전달; 및 열 순환의 기능을 통합한다. 동일한 바이오칩이 하기 실시예 2에 사용되며 순환주기 시퀀싱의 실행을 위한 추가 구조들을 지닌다.
바이오칩은 도 2-5에 도시된 바와 같이 4개의 써모플라스틱 층들로 구축되었다. 상기 4개 층들은 기계가공된 PMMA이며 상기 층들의 두께는 각각 0.76 mm, 1.9 mm, 0.38 mm, 및 0.76 mm이고, 바이오칩의 측면 크기는 124 mm X 60 mm이었다. 일반적으로, 3개 이상의 층들로 이루어진 바이오칩은 복수의 검정들(assays) 중에 분할되는 무한한 수의 공통적인 시약들의 사용을 허용한다: 2개의 유체층 및 적어도 쓰루-홀을 포함하는 한 층, 외부 층들내의 유체역학 채널들이 서로 '교차(cross-over)' 될 수 있다. (3-층 구축을 요하지 않는 특별한 경우--예컨대, 복수의 샘플들 중 단지 하나의 공통된 시약을 사용하는 경우-가 존재한다는 것이 인지될 것이다.) 4 층의 선택은 다른 기능(예컨대, 한외여과, 실시예 3) 및 완전한 통합(실시예 4)을 위한 칩의 구축과의 호환성을 위해 이루어졌다.
바이오칩의 채널들은 127 μm X 127 μm 내지 400 μm X 400 μm 범위의 단면 치수를 지녔으며, 반면 저장부는 단면으로 400 μm X 400 μm 내지 1.9 X 1.6 mm 범위에 존재하였다; 두 채널과 저장부는 0.5 mm 내지 수십 mm 정도로 짧은 거리까지 신장된다. 바이오칩에 사용되는 모세관 밸브는 "인-플레인" 밸브의 경우 127 μm X 127 μm 크기이었고 쓰루-홀 모세관 밸브의 경우 직경이 100 μm이었다.
4개의 기계가공된 층들의 특정 채널, 저장부, 및 모세관 밸브는 소수성/소유 성(olephobic) 물질, PFC 502A (Cytonix, Beltsville, MD)로 처리되엇다. 표면 처리는 젖은 Q-팁을 사용한 코팅에 후속하여 실온에서 공기-건조시킴으로써 수행되었다. 건조된 플루오로폴리머 층은 광학 현미경으로 측정하였을 때 10 μm 이하의 두께를 지녔다. 표면 처리는 하기 2가지 목적을 제공한다: 액체, 특히 낮은 표면 장력 액체, 예컨대, 순환주기 시퀀싱 시약 내부에 기포 형성의 방지(기포 형성은 액체가 채널 또는 챔버의 벽을 급속하게 적실 때 일어날 수 있음)(기포 형성은 공기가 배기될 수 있기 이전에 기포를 "폐쇄(closes off)"시킬 때 일어날 수 있음), 및 모세관 밸브가 액체 흐름에 저항하는 모세관 파열 압력 증강. 비처리된체 남겨진 영역들은 PCR 및 순환주기 시퀀싱을 위한 열 순환 챔버이었다.
표면 처리 후, 층들은 도 6에 도시된 바와 같이 결합되었다. 결합은, 구성성분들의 적층이 압력하에서 플라스틱의 유리 전이 온도(Tg) 근처의 온도까지 가열되었다는 점에서, 열 순환 결합을 사용하여 수행되었다. 45 파운드(lbs)의 힘이 7.5분 동안의 주위 온도에서 130℃까지의 램프, 7.5분 동안 130℃에서 유지, 및 실온으로 급속 냉각으로 이루어진 열 결합 프로파일이 진행되는 동안 15분 동안 전체 11.5 입방 인치의 바이오칩에 적용되었다.
공기압식 기구사용은 본 발명의 바이오칩 내부에 유체를 유도하기 위해 개발되었다. 2개의 작은 액체이송 펌프가 압력과 진공을 제공하였다. 포지티브 압력 아웃풋은 대략 0.05 - 3 psig의 범위를 갖는 3개의 레귤레이터 사이에 분할되었다. 진공은 대략 (-0.1) - (-3) psig의 아웃풋 진공을 지니는 레귤레이터에 포트되었 다. 제 4의, 더 높은 압력이 N2의 실린더로부터 받아 들여져서 추가의 레귤레이터에 옮겨졌거나 달리 고-용량 펌프로부터 받아 들여졌다. 포지티브 및 네거티브 압력은 일련의 8 압력-셀렉터 모듈에 적용되었다. 각각의 모듈은 5개 인풋들 사이에서 바이오칩에 전송될 아웃풋 압력을 선택할 수 있는 솔레노이드 밸브로 설비된다. 아웃풋 압력 라인은 적어도 하나의 공기압식 인터페이스에 종결되었다. 이 인터페이스는 칩의 인풋 측면상의 칩 포트(도면의 상단을 따라 도시된 포트들)에 걸쳐 위치된 O-링으로 칩을 클랭핑시켰다.
바로 위에 바이오칩 포트들은 압력-셀렉터 모듈로부터의 아웃풋 압력 라인을 수용하는 추가의 솔레노이드 밸브(즉, 게이트 밸브; 인터페이스당 8개)이었다. 칩에, 바로 인접된, 이들 밸브는 압력 라인과 칩 사이에 적은 무효-부피 인터페이스(대략 13 μL)를 제공한다. 적은 무효-부피 인터페이스는 압력이 다른 액체를 이동시키기 위해 적용되는 경우 바이오칩 상의 특정 액체의 의도되지 않은 동작을 막을 수 있다(액체 플러그와 폐쇄된 밸브 사이의 적은 기체 부피는, 예를 들어, 압력이 적용됨에 따른 기체의 압축으로 인한, 플러그가 움직일 수 있는 최대 양을 결정시킨다). 모든 압력-셀렉터 밸브 및 게이트 밸브는 스크립트-기반 Lab View™ 프로그램을 사용하는 컴퓨터 조절하에서 작동되었다. 이 시스템의 중요한 특징은 짧은 압력 순환주기가 가능하다는 것이다. 30 msec 정도의 단시간 동안의 압력/또는 복잡한 압력 프로파일의 요구되는 펄스가 압력이 한 밸브로부터 다른 밸브로(즉, 한 레귤레이터로부터 다른 레귤레이터로) 급속하게 (즉, 단지 10-20 msec의 타임래 그로) 스위칭될 수 있는 곳에서 사용될 수 있는 몇몇 유체 조절 사건들이 수행될 수 있다.
샘플은 pGΕM 시퀀싱 플라스미드 삽입물(pUC18 시퀀싱 표적)으로 형질변환된 대략 106 세포/mL의 E. coli DH5의 박테리아 현탁액으로 이루어졌다. PCR 시약은 0.1 μM의 농도에서 dNTP KOD Taq 폴리머라제(Novagen, Madison, WI)로 이루어져 있다.
박테리아 현탁액 1.23 μL 샘플을 각각의 포트가 각각, 층 1과 2에 쓰루 홀 202와 336을 포함하는, 4개의 포트 104 각각에 첨가하였다. 이후 샘플을 층 2내의 샘플 채널 303에 존재하였다. 그 다음에, 10 μL의 PCR 시약을 층 1과 2내에 쓰루 홀 217과 306을 포함하는, 포트 105에 첨가하였다. 이후 PCR 시약은 층 2내의 챔버 307에 존재하였다(도 8a 참조). PCR 시약을 위한 배기된 공기의 배기용 포트는 109 및 쓰루-홀 203+305를 포함하는 포트 107이었다.
작동시, 샘플과 다운스트림 과정에 의해 배기된 공기(예컨대, 시약의 계량, 유체의 혼합)는 쓰루-홀 227로 구성된, 칩의 아웃풋 말단부상의 쓰루 홀, 108을 통해 배기되었다. PCR 반응의 최종 부피는 원하는대로 증가 또는 감소될 수 있다.
바이오칩을 상기한 공기압식 매니폴드에 위치시켰다. 하기 자동화된 압력 프로파일을 단계들 사이에 지연 없이 수행하였다. 달리 언급되지 않은 경우, 칩의 인풋 측면을 따라 있는 포트에 상응하는, 공기압식 인터페이스 밸브는 모든 단계들이 진행되는 동안 폐쇄되었다.
0.12 psig의 압력을 15초 동안 포트 104에 적용하여 샘플 다운 채널 303을 쓰루-홀 304로 유도하였다. 샘플은 쓰루-홀 304를 통과하였고 층 1의 샘플 챔버 204내 층 2의 다른 측면 상에 나타났으며 제 1 혼합 합류부(junction) 205로 유도되었다. 제 1 혼합 합류부에서, 샘플은 모세관 밸브 210에 의해 유지되었다(도 8b-c 참조).
0.12 psig의 압력을 15초 동안 포트 105에 적용하여 쓰루-홀 320을 통해 PCR 시약을 유도하였다. PCR 시약은 분배 채널 208내 층 2의 다른 측면상에 나타났으며, 계량 챔버 209로 이동되었는데, 상기 계량 챔버는 샘플 부피와 동일한 시약의 부피를 규정하며, 여기서 시약은 혼합 합류부 205에서 모세관 밸브 211에 의해 유지되었다. (도 8d 참조).
0.12 psig의 압력을 채널 208을 비우기 위해 대기에서 개방되는 포트 105를 지니는 포트 107(쓰루-홀 203과 305로 구성됨)에 3초 동안 적용하였다. (도 8e 참조).
0.8 psig의 압력을 0.03초 동안 포트 107과 105에 적용하였고, 0.7 psig의 압력을 모세관 밸브 210과 211을 지난 액체를 버스팅시킴으로써 샘플과 PCR 시약의 혼합을 개시시키기 위해 동시적으로 포트 104에 0.03초 동안 적용하였다. (도 8f 참조).
0.12 psig의 압력을, 모세관 밸브 210과 211에서 체류와 함께, 샘플과 PCR 시약을 혼합 채널 214내로 펌핑시키기 위해 10초 동안 포트 104와 107에 적용하였다. 혼합 벌브(bulbs) 212를 통한 압축부 213내로의 통과는 이전의 높은 압력 펄 스에 의해 부여된 높은 속도를 감소시키면서, 흐름에 대한 부가된 수력적 저항성을 생성시켰다.
0.7 psig의 압력을 모세관 밸브 210과 211로부터 액체를 분리해내기 위해 0.03초 동안 포트 104와 107에 적용하였다(도 8g 참조).
0.12 psig의 압력을 혼합 채널 214를 통해 모세관 밸브 219로 액체를 펌핑시키기 위해 3초 동안 포트 104와 107에 적용하였고, 여기서 상기 포트들은 유지되었다(도 8h 참조).
0.7의 압력을 쓰루-홀 315와 402를 통해 그리고 층 2와 3의 바디를 통해 샘플과 PCR 시약의 혼합물을 PCR 챔버 502내로 유도하기 위해 0.1초 동안 포트 104와 107에 적용하였다(도 8i 참조).
0.12 psig의 압력을 챔버 502내로 샘플과 PCR 시약의 혼합물의 펌핑을 완료시키기 위해 3초 동안 포트 104와 107에 적용하였다. 샘플과 PCR 시약의 혼합물의 선도 모서리는 이후 쓰루-홀 403과 316을 통과하였고, 층 1내에 나타났으며, 모세관 밸브 220에 고정(pin)되었다(도 8j 참조).
이후 바이오칩에 30 psig N2를 가압시켰고, 본원과 동시에 출원된, 대리인 문서관리번호 08-318-US호의, "표적 핵산의 급속 다중화 증폭 방법"이라는 제목의 미국 특허 출원에 기재되어 있고; 2008년 2월 6일에 출원된, 대리인 문서관리번호 07-084-WO호의, "소형화된 시험관내 검정의 실행을 위한 장치 및 방법{DEVICES AND METHOD FOR THE PERFORMANCE OF MINIATURIZED IN VITRO ASSAYS}"이라는 제목의, 국 제 특허 출원 번호 PCT/US08/53234호에 기재된 것과 같이, 기체 기포 압축 메카니즘을 사용하여 펠티어(Peltier)를 통해 PCR 증폭을 위해 열적으로 순환되었으며, 상기 특허 출원은 이들의 전체로서 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.
샘플, 시약 부피, 및 PCR 챔버 크기를 액체가 밸브 219와 밸브 220 사이의 영역에 채워지도록 선택하였다. 그 결과, 적은 단면적의 액체/증기 인터페이스(전형적으로 127 μm X 127 μm)가 층 4의 열적으로 순환되는 바닥면으로부터 대략 3 mm 이격되어 위치하였다. 열 순환이 진행되는 동안 압력의 적용은 샘플내 용해된 산소에 의해 탈기(outgassing)를 억제하였다. 액체/증기 인터페이스의 적은 단면적 및 펠티어 표면으로부터의 거리 둘 모두가 증발을 억제하였다.
순환이 진행되는 동안 바이오칩의 상단부에서 관찰된 온도는 결고 60℃를 초과하지 않았으며, 그 결과, 액체/증기 인터페이스에서 증기압은, 이들이 PCR 챔버내부에 존재한다면, 그러한 인터페이스에 대한 압력 보다 충분히 더 낮았다. 2 μL 샘플의 경우, 이중 1.4 μL는 챔버 502 내부에 존재하고 나머지는 쓰루-홀과 모세관 밸브에 존재하며, 과찰된 증발은 PCR 40순환에 걸쳐 0.2 μL 미만이었다. 비순환된 유체의 부피-이 경우에서 0.6 μL-는 쓰루-홀을 위한 더 작은 직경의 선택에 의해 감소될 수 있다.
PCR을 하기 온도 프로파일을 사용하여 수행하였다:
● 98℃에서 3분 동안 박테리아의 열 용해.
● 하기한 것들의 40 순환주기
o 5초 동안 98℃에서 변성
o 15초 동안 65℃에서 어닐링
o 72℃에서 4초 동안 신장
o 72℃/2분에서 최종 신장
~ 5 μL 탈이온수로 챔버 502를 씻어내림으로써 PCR 생성물을 회수하였고 슬라브 겔 전기영동으로 분석하였다. PCR 수율은 반응당 최대 40 ng이었는데, 이는 후속 시퀀싱 반응에 요구되는 수율보다 훨씬 더 많았다. 이 적용에서, 박테리아 핵산을 박테리아를 단순히 용해시킴으로써 생성시켰다. 핵산은 필요에 따라, 증폭, 시퀀싱, 및 다른 반응의 효능을 개선시킬 수 있는 공정인, 정제를 거칠 수 있다.
실시예 2
순환주기 시퀀싱 시약의 분배, PCR 생성물과의 혼합, 및 순환주기 시퀀싱을 위한 통합된 바이오칩
실시예 1에 기재된 바이오칩을 사용하였다. 실시예 1에 개관된 프로토콜을 사용하여 튜브내에서 생성된 PCR 생성물을 상기한 바와 같이 바이오칩의 샘플 및 PCR 시약 포트 둘 모두에 첨가하였다. 50 μL의 순환주기 시퀀싱 시약(BigDye™3.1/BDX64, MCLab, San Francisco)을 포트 106(쓰루-홀 215와 308로 구성됨) 및 챔버 309에 첨가하였다. 2개의 공기압식 인터페이스의 설치후(인풋을 위한 하나 및 칩의 아웃풋 말단부를 위한 하나), PCR 생성물을 PCR 챔버를 통해서, 그러나 PCR 열 순환 단계 없이, 실시예 1에 기재된 대로 가공하였다. 칩내의 유체의 배치는 도 9a에 도시된 대로 였다.
하기 압력 프로파일을 공기압식 시스템 소프트웨어를 사용하여 실행하였다; 칩 포트에 상응하는 모든 솔레노이드 밸브를 달리 언급하지 않는한 폐쇄하였다:
1. 0.1 psig의 압력을 순환주기 시퀀싱 시약을 채널 310내로 펌핑하기 위해 대기에서 개방되는 포트 109를 지니는 포트 106에 10초 동안 적용하였다(도 9b 참조).
2. 0.7 psig의 압력을 쓰루-홀 311을 통해, 층 2의 바디를 통해 채널 304로부터의 순환주기 시퀀싱 시약을 층 1상의 순환주기 시퀀싱 시약 계량 챔버 218내로 유도하기 위해 포트 106 및 108(쓰루-홀 216과 314로 구성됨)에 0.2초 동안 적용하였다(도 9c 참조).
3. 0.1 psig의 압력을 순환주기 시퀀싱 시약을 모세관 밸브 221에 유도시키면서, 대기에서 개방되는 포트 109를 지니는 포트 106에 적용하였다(상기 시약은 상기 밸브에 유지되고 있음)(도 9d 참조).
4. 0.1 psig의 압력을 과량의 순환주기 시퀀싱 시약을 챔버 101 후방으로 유도하고, 채널 310을 텅빈 상태로 남겨 두기 위해 대기에서 개방되는 포트 106과 더불어 포트 108에 1초 동안 적용하였다(도 9e 참조).
5. 0.7 psig의 압력을, 모세관 밸브 220를 통과한 PCR 생성물을 홀 317을 통과하고, 층 2의 바디 및 층 3내의 쓰루-홀 404를 통과하여, 층 4의 순환주기 시퀀싱 챔버 503내로 유도시키기 위해, 대기에서 개방되는 포트 109와 더불어 0.1초 동안 포트 104와 107에 적용하였다(도 9f 참조).
6. 0.1 psig의 압력을 PCR 샘플을 쓰루-홀로의 복귀를 유도하기 위해 대기에 서 개방되는 포트 104와 107과 더불어 포트 109에 적용하였다. 모세관 작용은, PCR 생성물과 챔버 503 사이에 포집된 공기 기포가 출현하는 것을 막으면서, 쓰루-홀의 입구에 액체를 유지하였다(도 9g 참조).
7. 0.7 psig의 압력을 순환주기 시퀀싱 시약을 챔버 503내로 유도하기 이해 대기에서 개방되는 포트 109와 더불어 포트 108에 0.2초 동안 적용하였으며, 한편 동시에 시퀀싱 시약과 PCR 생성물을 접촉시키기 위해, 0.1 psig의 압력을 포트 104와 107에 적용하였다(도 9h 참조).
8. 0.1 psig의 압력을 PCR 생성물 및 생어 시약을 챔버내로 유도하기 위해 대기에서 개방되는 포트 109와 더불어 포트 104, 108 및 108에 10초 동안 적용하였다. PCR 생성물의 후미 메니스커스 및 시퀀싱 시약의 후미 메니스커스넌 모세관 밸브 220과 221에 고정되었다(도 9i 참조).
9. 0.25 psig 진공의 5 진공 펄스 및 0.1초의 지속시간을 두 액체를 부분적으로 시약 계량 챔버 218 후방으로 끌어당기기 위해 대기에서 개방되는 포트 109와 더불어 포트 108에 적용하였다(도 9j 참조).
10. 0.1 psig의 압력을 혼합물을 챔버 503으로 복귀되게 펌핑하기 위해 10초 동안 대기에서 개방되는 포트 109와 더불어 포트 104, 107, 및 108에 적용하였는데, 후미 메니스커스는 단계 8에서와 같이 모세관 밸브에서 고정되었다. (도 9k 참조).
단계 9-10은 시퀀싱 시약 및 PCR 생성물의 혼합을 유효하도록 하기 위해 추 가 2회 반복되었다. 바이오칩은 이후 30 psig N2로 가압되었고 하기 온도 프로파일을 사용하여 열적으로 순환되었다:
● 95℃/1분 초기 변성
o 하기 단계들의 30 순환주기
o 95℃에서 5초 동안 변성
o 50℃에서 10초 동안 어닐링
o 60℃에서 1분 동안 신장
샘플(도 9l 참조)을 회수하고 에탄올 침전으로 정제하고 전게서(파트 II, 실시예 5)에 기재된 것과 같이 전기영동 분리 및 Genebench™ 장치 상의 레이저-유도 형광 검출에 의해 분석하였다. 프레드(Phred) 품질 분석은 샘플 당 408+/-57 QV20 염기를 산출하였다.
실시예 3
4-샘플 바이오칩에서 한외여과
시퀀싱 생성물 정제의 실행을 위한 4-샘플 바이오칩을 실시예 1에 논의한 대로, 4개의 층들로 구축하였으며, 도 11에 도시되어 있다. 구축에 있어서 한 가지 추가 소자는 한외여과(UF) 필터 1116였으며, 이것은 사이징을 위해 절단되며 열 결합에 앞서 층 3과 4 사이에 놓여진다. UF 필터 주위에 양호한 결합의 생성은 층 3의 사용에 요구되었다. 층 3과 4는 필터 주위에 비간섭된 페리미터를 생성하였는데, 그 이유는 필터에 이르고 필터로부터 안내되는 모든 채널들이 층 2의 하단부에 존재하기 때문이다. (층 2와 4 간에 직접적인 결합은, 예를 들어, 채널이 필터를 가로지르는 필터에 열악한 결합을 남긴다.) 이의 일예로, 분자량 컷-오프(molecular weight cut-off, MWCO) 30 kD의 재생성된 셀룰로오스(RC) 필터가 사용되었다(Sartorius, Goettingen, Germany). 다양한 다른 MWCO(10 kD, 50 kD, 및 100 kD)가, 대안적인 물질, 폴리에테르설폰(Pall Corporation, East Hills, NY)을 지니기 때문에 시험되었다.
1. pUC18 주형 및 KOD 효소를 사용하여 튜브 반응으로 생성된 4가지 순환주기 시퀀싱 생성물 10 μL 샘플을 제 1층내의 포트 1104에 첨가하고 제 2 층내의 채널 1105를 통해 제 2 층내의 챔버 1106으로 유도시켰다. 200 μL의 탈이온수를 제 2 층내의 저장부 1121에 대한 포트 1120(제 1 층내의 쓰루-홀)에 첨가하였다. 이후 바이오칩을 2개의 공기압식 인터페이스내에 설치하였다.
하기 압력 프로파일을 공기압식 시스템 소프트웨어를 사용하여 실시하였다. 바이오칩 포트에 상응하는 모든 솔레노이드 밸브를 달리 언급하지 않는한 폐쇄되었다.
2. 0.09 psig의 압력을 층 1내의 모세관 밸브 1108로 시퀀싱 생성물을 유도하기 위해 대기에서 개방되는 포트 1110와 더불어 포트 1104에 5초 동안 적용하였다(상기 생성물은 상기 밸브에 유지되어 있음).
3. 0.6 psig의 압력을 층 1 내의 모세관 밸브 1108을 통해 샘플을 버스팅시키고 이들을 층 2내의 쓰루-홀 1111을 통해 층 2내의 UF 인풋 챔버 1112내로 전달하기 위해 대기하에서 개방되는 포트 1119와 더불어 포트 1104에 0.1초 동안 적용 하였다.
4. 0.09 psig의 압력을 챔버 1112로의 시퀀싱 생성물의 전달을 완료시키기 위해 대기하에서 개방되는 포트 1119와 더불어 포트 1104에 10-30초(상이한 시간이 상이한 실험에서 사용되었음) 동안 적용하였다.
5. 0.8 psig의 압력을 밸브 113을 통해 시퀀싱 생성물을 여과 챔버 1115내로 유도하기 위해 대기하에서 개방되는 포트 1119 및 1104와 더불어 포트 1124에 0.5초 동안 적용하였다. 이러한 압력 적용은 또한 유지된 액체의 인풋 모세관 밸브 1108를 세정시켰다.
6. 0.09 psig의 압력을 챔버 1115로의 시퀀싱 생성물의 전달을 완성시키기 이해 대기에서 개방되는 포트 1119와 더불어 포트 1124에 10-30초 동안 적용하였다. 시퀀싱 생성물은 밸브 1113에 체류되었다(도 12c 참조).
7. 7.5 psig의 압력을 한외여과를 위해 칩의 모든 포트에 천천히 적용하였다. 한외여과가 진행되는 동안, 시퀀싱 생성물 메니스커스는 1113에 고정되어 남아 있으며 한편 액체로서 "끌어들이는(retracts)" 액체의 선도 모서리는 필터 1116을 통해 유도되었다. 10 μL의 시퀀싱 생성물은 여과를 위해 ~ 120초를 요하였다. 압력을 여과후 해소시켰다(도 12c 및 12d 참조).
8. 0.09 psig의 압력을 채널 1122(층 4내)내로 물을 유도하고 오버플로우 챔버 1123을 부분적으로 채우기 위해 대기에서 개방되는 포트 1124와 더불어 포트 1120에 3초 동안 적용하였다(도 12e 참조).
9. 0.8 psig의 압력을 채널 1122내의 쓰루-홀 모세관 밸브 1110를 통해 챔버 1112내로 물을 유도하기 위해 대기에서 개방되는 포트 1119와 더불어 포트 1120과 1124에 적용하였다.
10. 0.09 psig의 압력을 챔버 1112로 액체의 전달을 완료시키기 위해 대기에서 개방되는 포트 1119와 더불어 포트 1120에 10-30초 동안 적용하였으며, 이것은 밸브 1113에 의해 유지되었다. (도 12f 참조).
11. 0.09 psig의 압력을 챔버 1123 및 채널 1122내의 물을 챔버 1121로의 복귀를 유도하기 위해 개방되는 포트 1120과 더불어 포트 1124에 적용하였다(도 12g 참조).
12. 0.8 psig의 압력을 밸브 113을 통해 여과 챔버 1115내로 물을 유도하기 위해 대기에서 개방되는 포트 1119 및 1104와 더불어 포트 1124에 0.5초 동안 적용하였다. 이러한 압력 적용은 유지된 액체의 인풋 모세관 밸브 1108을 세정시켰다.
13. 0.09 psig의 압력을 챔버 1115로의 물의 전달을 완료시키기 위해 대기에서 개방되는 포트 1119와 더불어 포트 1124에 10-30초 동안 적용하였다. 시퀀싱 생성물은 밸브 1113에 체류되었다(도 12h 참조).
물은, 제 1 세척 단계 8-13이 추가의 한 시간 동안 반복되어 완료되면서, 상기 단계 6에서와 같이 UF 필터를 통해 유도되었다.
단계 8-12는 용리를 위해 사용된 최종 부피의 물로 챔버 1115를 부분적으로 채우기 위해 반복되었다(도 12k 참조).
1.6 psig의 진공을 1초 동안 폐쇄된 모든 다른 포트들과 함께 포트 1104에 적용하였는데, 이는 챔버 1112내로 챔버 1115로부터의 일부 물을 끌어 당겼다(최대 작동은 액체의 메니스커스와 포트 1119에 상응하는 솔레노이드 밸브 사이의 무효-공간내 동일한 크기의 진공의 생성에 의해 결정(dictation)되었음)(도 12l 참조).
포트 1104를 1초 동안 대기에서 개방되었는데, 이는 액체가 액체와 포트 1119에 상응하는 밸브 사이에 생성된 부분 진공으로 인한 액체가 챔버 1115내로 역이동 하도록 만들었다(도 12m 참조).
16-17은 50회 용리 순환주기를 야기시키기 위해 50회(X) 반복되었다.
0.09 psig의 압력을 액체의 후미 메니스커스가 1113에 고정되도록 액체를 유도하기 위해 대기에서 개방되는 포트 1119와 더불어 10초 동안 포트 1124에 적용하였다.
0.05초당 0.7 psig의 압력을 용리액을 분리시키기 위해 대기에서 개방되는 포트 1119와 더불어 포트 1124에 적용하였다(도 12n 참조).
샘플을 회수하고 기재한 바와 같이 Genebench™ 상에서 직접적으로 러닝(running)시켜, 최대 479개 QV20 염기를 수득하였다.
실시예 4
핵산 추출, 주형 증폭, 순환주기 시퀀싱, 시퀀싱 생성물의 정제, 및 정제된 생성물의 전기영동 분리과 검출을 위한 완전히 통합된 바이오칩
도 13은 도 1의 바이오칩의 용해와 추출, 주형 증폭, 및 순환주기 시퀀싱 기능; 도 11의 한외여과 기능; 및 전기영동 분리와 검출을 조합한, 16-샘플 바이오칩, 1301의 구현예를 도시한다. 한외여과를 거치는 공정은 서브-콤포넌트 1302에 의해 수행되며 실시예 1, 2, 및 3에 기재된 바와 같이 실행될 수 있다; 1302의 바 닥면상의 전이점(transfer points) 1304는 분리 서브-콤포넌트 1303상의 인풋 웰 1305와 함께 정렬되어 있다.
주입은 카운터전극을 사용하여 사전-농축 단계로 동전기적으로 실행된다. 도 14에 도시된, 인풋 웰 1305는 액체 수용 웰 1401; 주 분리 전극 1402; 및 카운터전극 1403으로 구성된다. 분리 채널 1306은 웰 저장소 1401의 바닥쪽으로 통해 있다. 분리 전극은 전형적으로 백금 또는 금으로 코팅되어 있으며, 바람직하게는 1401의 내부면의 1, 3, 또는 4를 실질적으로 커버하는 평평한 금-코팅된 전극이다. 카운터전극은 교차-연결된 폴리아크릴아미드의 박층(-10 μm)으로 코팅된 얇은 금, 강철, 또는 백금 와이어(전형적으로 0.25 mm의 직경)이다. 이것은 전극상에 히드로겔 보호층을 형성한다. 패널 d에서, 정제된 시퀀싱 생성물(1401내부의 검은 도트)은 웰로 전달된다. 1402와 1403 사이에 포지티브 전위를 적용함으로써, 음으로 하전된 시퀀싱 생성물은 패널 c-d에서와 같이, 1403 쪽으로 당겨진다. 1403 상의 히드로겔 층은 시퀀싱 생성물이 금속 전극과 접촉하는 것을 막고 그에 따라 시퀀싱 생성물의 전기화학 및 손상을 막는다. 카운터전극 1403은 이후 1402와 관련하여 부유(floating)되게 된다. 포지티브 전위는 이후 분리 채널 1306의 원위 말단부(far end)에서 주 분리 전극 1402와 음극(미도시) 사이에 적용된다. 이것은 생성물이 주입되게 하며(패널 e) 분리 및 검출을 위한 1306 아래로 전기영동되도록 한다(패널 f). 도 14에 도시된 바와 같이, 이러한 설계(scheme)는 채널 1306의 말단부 근처에서 시퀀싱 생성물의 농축을 가능케하여 한외여과로부터 전달된 농축에 비해 유의미하게 증가시킨다. 그러한 농축이 몇몇 적용의 경우 요망될 수 있으나, 모든 경우에 있어서 요구되지 않는다. 그러한 경우에 있어서, 카운터전극 1403 없이 도 14의 웰은 직접적으로 EKI를 수행하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 로딩 웰에서 단일 전극이 크로스-T 또는 더블-T 인젝터의 절반일 수 있다( 예를 들어, 본원과 동시에 출원된, 대리인 문서관리번호 07-865-US호의, "플라스틱 미세유체 분리 및 검출 플랫폼"이라는 제목의 미국 특허 출원 참조).
분리는 분리 채널 1306에서 일어나며, 검출은 검출 영역 1307에서 레이저-유도 형광을 통해 일어난다. 이 바이오칩에서, 리세스(recess) 1308은, 열 순환을 PCR 및 순환주기 시퀀싱에 제공하기 위해, 예를 들어, 펠티어 블록(미도시)을 1301의 더 낮은 표면과 메이팅되도록 하기 위해 제공된다. 장치 내부의 공기압식 인터페이스(미도시)는 미세유체 조절을 제공하기 위해 칩의 말단부에 클램핑된다.
II. 분리(DEPARATION) 및 검출 시스템
A. 분리 및 검출 구성요소 및 이들의 용도에 대한 상세한 설명
1. 분리 기구
DNA 분리는 미국 공개 특허 제 US2006-0260941-A1호에 기재된 것과 같이 바이오칩 상에서 수행되고 기구사용이 수행된다. 분리 칩은 유리(미국 공개 특허 제 US2006-0260941-A1호 참조) 또는 플라스틱(본원과 동시에 출원된, 대리인 문서관리번호 제 07-865-US호의, "플라스틱 미세유체 분리 및 검출 플랫폼"이라는 제목의 미국 특허 출원)일 수 있는데, 상기 각각의 특허 출원은 이들의 전체로 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.
2. 여기 및 검출 기구사용
기구는 샘플과의 반응 및 샘플을 심문(interrogation)하기 위한 여기 및 검출 서브시스템을 포함한다. 샘플은 전형적으로 염료(예를 들어, 형광 염료)로 표지된 하나 이상의 생물학적 분자(DNA, RNA, 및 단백질을 포함하나, 이로만 국한되지 않음)를 포함한다. 여기 서브시스템은, 여기/검출 윈도우내 여기 공급원을 조절(condition) 및 집중시키기 위해, 렌즈, 핀홀, 거울 및 물체(objectives)를 포함하는 광학 소자와 함께 여기 공급원 또는 공급원들 및 여기 빔 통로(path)를 포함한다. 샘플의 광학적 여기는, 400 내지 650 nm 사이의 가시광선 영역에서 방출 파장을 지니는, 일련의 레이저 유형에 의해 달성될 수 있다. 고체 상태 레이저는 대략 460 nm, 488 nm, 및 532 nm의 방출 파장을 제공할 수 있다. 이들 레이저는, 예를 들어, 코헤렌트(Coherent)(Santa Clara, CA)로부터의 콤파스(Compass), 사피어(Sapphire), 및 베르디(Verdi) 제품을 포함한다. 기체 레이저는 대략 488 nm, 514 nm, 543 nm, 595 nm, 및 632 nm에서 가시광선 파장으로 방출을 지니는 아르곤-이온 및 헬륨 네온을 포함한다. 가시광선 영역에서 방출 파장을 지니는 다른 레이저는 크리스타레이저(CrystaLaser)(Reno, NV)로부터 가용하다. 한 구체예에서, 488 nm 고체 상태 레이저 사피어 488-200(Coherent, Santa Clara, CA)가 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 가시광선 영역을 넘어선 파장을 지니는 광 공급원은 가시관선 영역을 넘어서 흡수 및/또는 방출 스펙트럼을 지니는 염료(예를 들어, 적외선 또는 자외선 방출 염료)를 여기시키기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 광학적 여기는 광 방출 다이오드를 포함하는, 염료 여기에 적절한 방출 파장을 지니는 비-레이저 광공급원, 및 램프의 사용에 의해 달성될 수 있다.
검출 서브시스템은 하나 이상의 광학 검출기, 파장 분산 장치(파장 분리를 수행함), 및 이로만 국한되는 것은 아니나, 여기/검출 윈도우에 존재하는 형광단-표지 DNA 단편으로부터 방출된 형광을 수집하기 위한, 렌즈, 핀홀, 거울과 대물렌즈를 포함하는, 하나 또는 일련의 광학 소자를 포함한다. 방출된 형광은 단일 염료 또는 염료의 조합물로부터 나올 수 있다. 방출 염료로부터의 신호의 기여를 결정하기 위해 신호를 분별시키기 위해, 형광의 파장 분리가 활용될 수 있다. 이것은 이색성 거울 및 대역통과 필터 소자(크로마(Chroma, Rockingham, VT); 및 오메가 옵티컬(Omega Optical, Brattleboro, VT)를 포함하는 다수의 판매상으로부터 구매가능함)의 사용에 의해 달성될 수 있다. 이 배열에서, 방출된 형광은 일련의 이색성 거울을 통과하는데, 여기서 파장의 한 부분은 통로 아래로 계속해서 이동하기 위해 상기 거울에 의해 반사될 것이고, 다른 부분은 통과하게 될 것이다. 일련의 분리된 광검출기, 이색성 거울의 말단부에 위치된 각각 광검출기는 특정 파장 범위를 넘는 광을 검출할 것이다. 대역통과 필터는 검출에 앞서 파장 범위를 더 좁히기 위해 이색성 거울과 광검출기 사이에 위치될 수 있다. 파장-분리(wavelength-separated) 신호를 검출하는데 활용될 수 있는 광학 검출기는 광다이오드, 애벌랜치(avalanche) 광다이오드, 광전자증배관(photomultiplier) 모듈, 및 CCD 카메라를 포함한다. 이들 광학 검출기는 하마마쓰(Hamamatsu)(Bridgewater, NJ)와 같은 공급자로부터 구매가능하다.
일 구체예에서, 파장 콤포넌트는 이색성 거울 및 대역통과 필터의 사용에 의해 분리되며 이들 파장 콤포넌트는 광전자증배관(PMT) 검출기(H7732-10, Hamamatsu)로 검출된다. 이색성 거울과 대역통과 콤포넌트는 PMT 각각에 대한 입사광(incident light)이 형광 염료의 방출 파장에 상응하는 좁은 파장 대역으로 이루어지도록 선택될 수 있다. 대역통과는 전형적으로 1과 50 nm 사이의 파장 범위의 대역 통과를 지니는 형광 방출 피크 주위에 중심을 두도록 선택된다. 시스템은 8가지 컬러를 검출할 수 있으며 8개의 독특한 컬러으로 방출된 형광을 나누기 위하여 8개의 PMT 및 상응하는 세트의 이색성 거울 및 대역통과 필터로 설계될 수 있다. 8개 이상의 염료는 추가의 이색성 거울, 대역통과 필터 및 PMT를 적용함으로써 검출될 수 있다. 도 15는 분리된 대역통과 필터 및 이색성 필터 기계사용을 위한 빔 통로를 보여준다. 이 파장 분별 및 검출 배열의 통합된 버전은 H9797R(Hamamatsu, Bridgewater, NJ)이다.
형광 신호를 형성하는 염료를 분별하는 또 다른 방법은 프리즘, 회절 격자, 투과 격자[토르랩(ThorLabs, Newton, NJ); 및 뉴 포트(Newport, Irvine, CA)를 포함하는 다수의 판매상으로부터 구매가능함]; 및 분광기[호리바 조빈-이본(Horiba Jobin-Yvon, Edison, NJ)을 포함하는 다수의 판매상으로부터 구매가능함]와 같은 파장 분산 소자 및 시스템의 사용을 포함한다. 이러한 작동 모드에서, 형광의 파장 콤포넌트는 물리적 공간에 걸쳐 분산된다. 이 물리적 공간을 따라서 위치된 검출기 소자는 광을 검출하며 검출기 소자의 물리적 위치와 파장의 상관관계가 허여된다. 이러한 기능에 적합한 검출기는 어레이에 기반하며 복수-소자 광다이오드, CCD 카메라, 후면박형(back-side thinned) CCD 카메라, 복수-음극 PMT를 포함한다. 당업계의 통상의 기술자는 해당 시스템에 사용되는 염료로부터의 파장을 분별할 수 있는 시스템을 양산하기 위하여 파장 분산 소자 및 광학 검출기 소자의 조합을 적용할 수 있을 것이다.
또 다른 구현예에서, 분광기(spectrograph)가 여기된 형광으로부터의 파장 콤포넌트를 분리시키기 위해 이색성 및 대역통과 필터 대신에 사용된다. 분광기 설계에 관한 세부내용은 문헌[John James, Spectrograph Design Fundamental. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 2007]에서 획득가능하다. 505-670 nm(P/N 532.00.570)의 스펙트럼 범위를 지니는 오목 홀로그래픽 그레이팅을 갖는 분광기 P/N MF-34(HORIBA Jobin Yvon Inc, Edison, NJ)가 이 적용에 사용된다. 검출은 선형 32-엘리먼트 PMT 검출기 어레이(H7260-20, Hamamatsu, Bridgewater, NJ)로 달성될 수 있다. 모아진 형광은 핀홀상에 이미지화되고, 반사되고, 분산되고, 분광기의 아웃풋 포트에 마운팅된 선형 PMT 검출기 상의 오목 홀로그래픽 그레이팅에 의해 이미지화된다. PMT-기반 검출기의 사용은 PMT 검출기의 낮은 다크 노이즈, 높은 민감도, 높은 동적 범위, 및 빠른 반응 특성을 이용한다. 여기된 형광의 검출을 위한 분광기 및 복수-소자 PMT 검출기의 사용은, 기구의 검출 시스템(이색성, 대역통과 및 검출기)을 물리적으로 재배열할 필요없이, 시스템 내부와 레인 내부에 적용될 수 있는 염료의 수 및 염료의 방출 파장에서의 유연성(flexibility)을 허여한다. 이러한 배열로부터 수집된 데이터는 각각의 레인에 대한 각각의 스캔을 위한 가시광선 파장 범위에 걸쳐 파장 의존적 스펙트럼이다. 스캔당 완전한 스펙트럼 생성은 샘플 내부에 존재할 수 이는 염료 방출 파장 및 염료의 갯수 둘 모두의 측면에서 염료 유연성을 제공한다. 또한, 스펙트로미터 및 선형 복수-소자 PMT 검출기의 사용은 또한 어레이내 모든 PMT 소자가 병렬적으로 판독됨에 따라 극도로 빠른 판독 속도를 허여한다. 도 16은 복수-소자 PMT 및 분광기 실행을 위한 빔 통로를 보여준다.
기구는 복수의 레인을 동시에 검출하고 다수의 파장을 동시에 검출하기 위해, 작동 응시 모드(staring mode)를 채용할 수 있다. 한 배열에서, 여기 빔은 동시에 모든 레인 상에 동시적으로 작용하게 된다. 이로부터의 형광은 CCD 카메라 또는 어레이와 같은 2차원 검출기에 의해 모아진다. 이러한 수집의 응시 모드에서, 파장 분산 소자가 사용된다. 검출기의 1 차원은 물리적 파장 분리를 나타내며, 한편, 다른 차원은 공간적 또는 레인-레인 분리를 나타낸다.
복수 샘플의 동시 여기 및 검출의 경우, 스캐닝 거울 시스템(62)(P/N 6240H A, 67124-H-O 및 6M2420X40S100S1, Cambridge technology, Cambridge MA)이 바이오칩의 각각의 레인을 이미지화하기 위해 여기 및 검출 빔 진로(paths) 둘 모두를 조정하는데 활용된다. 이러한 작동 모드에서, 스캐닝 거울은, 제 1 레인으로부터 마지막 레인까지 레인에서 레인을 순차적으로 스캐닝하고, 제 1 레인으로부터 마지막 레인까지 재차 상기 과정을 반복하면서, 빔 진로를 조정한다. 미국 공개 특허 US2006-0260941-Al호에 기재된 것과 같은 레인-발견 알고리즘이 레인의 위치를 확인하는데 사용된다.
동시 복수 레인 및 복수 염료 검출을 위한 광학 검출 시스템의 구현예는 도 16에 도시되어 있다. 형광 여기 및 검출 시스템 40은 기록(recordation), 및 궁극적으로 분석을 위해 염료로부터의 유도된 형광을 모으고 상기 형광을 하나 이상의 광 검출기에 전달하면서 마이크로채널 각각의 소정 부분을 통해 에너지 공급원(예를 들어, 레이저 빔)을 스캐닝함으로써 DNA 샘플(예를 들어, STR 유전좌 세트의 증폭후 DNA 단편을 함유하는 샘플)의 전기영동에 의해 분리된 콤포넌트를 여기시킨다.
한 구체예에서, 형광 여기 및 검출 조립체 40은 레이저 60, 스캐너 62, 하나 이상의 광 검출기 64, 및 다양한 거울 68, 분광기, 및 레이저 60으로부터 방출된 레이저 빔을 개구(opening) 42를 통해 시험 모듈 55에 전달시키고 광 검출기 64로 복귀시키기 위한 렌즈 72를 포함한다. 스캐너 62는 진입(incoming) 레이저 빔을 시험 모듈 55와 관련하여 다양한 스캐닝 위치로 이동시킨다. 특히, 스캐너 62는 각각의 별개 콤포넌트를 검출하기 위해 레이저 빔을 시험 모듈 55 내부의 각각의 마이크로채널의 관련된 부분으로 이동시킨다. 복수 소자 PMT 64는 시험 모듈 55로부터의 데이터(예를 들어, 다양한 길이의 DNA 단편으로부터의 형광 신호)를 모으고 상기 데이터를 포트 75에 부착된 케이블을 통해 전기적으로 보호 커버 50 외부에 위치한 데이터 획득 및 저장 시스템에 제공한다. 한 구체예에서, 상기 데이터 획득 및 저장 시스템은 옵션 인더스트리얼 컴퓨터스(Option Industrial Computers)(13 audreuil-Dorion, Quebec, Canada)로부터 구매가능한 내구성을 높인 컴퓨터를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서("응시 모드"), 여기 공급원은 모든 검출 스폿 상에 동시적으로 입사되고, 모든 검출 스폿으로부터의 형광은 동시적으로 모아진다. 동시적 스펙트럼 분산(검출된 형광의 파장 스펙트럼) 및 공간적 분산(검출 스폿)은 2차원 검출기 어레이로 수행될 수 있다. 이러한 배열에서, 2-차원 검출기 어레이는 스펙트럼 구성요소가 어레이 검출기(로우(row))의 한 차원을 거쳐 이미지화되고 검출되며, 한편 공간 구성요소가 어레이 검출기의 다른 차원을 거쳐 이미지화되고 검출되도록 시스템내에 위치된다.
바람직한 기구는 "응시" 모드 보다, 작동의 스캐닝 모드를 이용한다. 스캐닝 모드에서, 각각의 채널을 위한 신호가 수집되고, 통합되고, 스캐너가 심문되는 레인과 일치되면서 판독될 필요가 있으며 그전에 다음 채널에 입사된다. 빠른 판독을 수반하는 검출기는 최적의 광 수집 및 통합, 더 높은 신호 대 잡음 성과로의 번역을 가능케 한다. 이상적으로, 검출기의 판독 시간은 스캐너가 채널과 일치되는 총 시간 보다 유의미하게 더 적어야 한다. 복수-소자 PMT는 0.7 ms 미만으로 판독될 수 있으며 이러한 판독 시간은 각각의 개별 채널에 관한 검출을 위한 통합 시간 보다 훨씬 더 적다.
핀홀에 입사된 형광은 이의 파장 조성에 따른 그레이팅에 의해 분산되고 선형 복수-음극 PMT 검출기 어레이 상에 집중될 수 있다. 검출기는 32개 전류 아웃풋을 제공하는데, 상기 아웃풋은 소자에 입사된 광전자 갯수에 합치하는 어레이내 소자들 각각에 대한 아웃풋이다. 복수 샘플(또는 레인) 검출이 진행되는 동안, 레이저가 선택된 레인을 여기시키는 위치에 존재할 때, 통합 회로(integrator circuitry)는 통합된 PMT 전류에 비례하여 아웃풋 전압을 생성시키기 위해 PMT 아웃풋 전류를 통합할 것이다. 동시에, 단일 종결 아웃풋 전압(single ended output voltage)은 아날로그 디바이시즈(Analog Devices, Norwood, MA) 디퍼렌셜 드라이버 IC(P/N SSM2142)를 사용하여 미분 모드로 전환된다. (스캔 속도 및 레이의 갯수에의해 규정된) 통합 시간의 말기에, 데이터 획득 시스템은 미분 신호를 읽을 것이고 이의 버퍼내에 데이터를 저장할 것이다. 데이터가 저장된 후, 데이터 획득 시스템은 다음 선택 레인으로 레이저 빔을 이동시키기 위해 스캐너를 움직일 것이며, 동시에 통합 회로를 리셋팅시킬 것이다.
각각의 단일 소자 PMT 모듈은 그 자신의 통합 회로를 갖는다. 8 컬러 검출 시스템의 경우, 8 PMT 모듈과 8 통합 회로가 존재한다. 추가 컬러는 상응하는 갯수의 PMT 모듈과 통합 회로를 사용하여 추가될 수 있다.
PMT 소자(H77260-20, Hamamatsu, Japan) 각각이 단일 PMT 튜브(H7732-10, Hamamatsu, Japan)로서 유사하거나 더 빠른 신호 반응을 가지고, 판독이 병렬로 이루어지기 때문에, 이 검출기는 매우 빠르게 작동될 수 있다. 스펙트로미터와 커플링될 때, 이 스펙트로미터와 복수-음극 검출기 시스템은 0.1 ms 미만의 판독-시간과 함께 가시광선 스펙트럼(450 nm 내지 650 nm)에 걸쳐 완전한 스펙트럼 스캔을 제공할 수 있다.
빠른 회복(refresh) 속도를 제공하는 능력은 이 스펙트로미터/검출기 시스템이 단일 구동(single run)내에서 순차적으로 복수의 레인의 스캐닝 모드 실행에 적용되는 것을 가능케 한다. PMT 기반 검출기의 사용은 적은 노이즈, 높은 민감도 및 높은 동적 범위, 및 빠른 반응을 제공한다. 오목 홀로그래픽 그레이팅(Horiba Jobin-Yvon)을 지니는 140 mm 스펙트로미터와 복수음극 PMT 검출기는 H7260-20 검출기(Hamamatsu, Japan)이다. 다른 스펙트로미터 배열 및 복수-음극 PMT 검출기가 또한 이러한 적용에 사용될 수 있다.
일렉트로포레그램으로부터의 뉴클레오티드 염기의 결정은 데이터를 수정하고, 여과하고, 분석하기 위해 신호 가공 알고리즘을 사용하여 달성되었다. 이 과정은 호출가능한 신호를 위치시키는 단계, 상기 신호 기준선(signal baseline)을 수정하는 단계, 노이즈을 여과시키는 단계, 컬러 크로스-톡(cross-talk)을 제거(removing)하는 단계, 신호 피크를 식별하는 단계, 및 연결된(associated) 염기들을 결정하는 단계로 이루어져 있다. 호출가능한 신호를 위치시키는 단계는 신호의 처음과 끝으로부터의 외래 데이터를 제거시키기 위해 수행되었으며 한계치(threshold)를 채용함으로써 달성되었다. 다음으로, 백그라운드가 상기 신호로부터 제거되었으며, 그리하여 상기 신호는 모든 검출된 컬러에 대하여 공통된 기준선을 지니게 되었다. 마지막으로, 로우패스 필터가 상기 신호로부터의 고 주파수 노이즈를 제거하기 위해 적용되었다.
검출된 컬러를 명확하게 하기 위해, 가중 행렬(weighted matrix)이 계산되었고 뉴클레오티드-염료 스펙트럼의 컬러-공간을 증폭시키기 위해 해당 신호에 적용되었다. 이 컬러 분리 행렬의 계산은 문헌[Li et al. Electrophoresis 1999, 20, 1433-1442]의 방법을 사용하여 이루어졌다. 이 적응에서, "m x n" 컬러 분리 행렬은 해당 검정에 사용된 염료의 갯수 "m"과 검출기 소자의 갯수 "n"을 상관연산(correlation)함으로써 계산된다. 검출기 공간(PMT 소자)으로부터, 염료 공간으로의 신호의 전환은 아래와 같은 행렬 조작에 의해 수행된다: D = CSM x PMT, 여기서 D는 m개 염료 각각에 대한 염료 공간에서의 신호이고, CSM은 컬러 분리 행렬이 고, PMT은 검출기의 n개 소자 각각으로부터의 신호를 지니는 행렬이다.
그 다음으로, 컬러가 분리된 신호에서 피크가 제로-크로싱 필러 및 주파수 분석의 조합을 사용하여 식별되었다. 마지막으로, 단편 사이징 적용의 경우, 수정된 자취가 각각의 단편을 식별시키고 사이징 표준에 기초한 단편 크기를 할당하기 위해 대립유전자(allele)로 호칭되었다. DNA 시퀀싱 적용의 경우, 수정된 자취는 4개의 뉴클레오티드 중 하나와 해당 자취내 각각의 피크를 연관시키기 위해 염기(base)로 호칭되었다. 염기 호칭(base calling)에 관한 상세한 설명은 문헌[Ewing et al. Genome Research, 1998, 8, 175-185], 및 문헌[Ewing et al, Genome Research, 1998, 8, 186-194]에서 찾아 볼 수 있는데, 상기 문헌들의 교시내용은 이들의 전체로서 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.
3. 염료 표지
올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드에 부착된 염료 표지는 합성되거나 상업적으로 획득될 수 있다(예를 들어, Operon Biotechnologies, Huntsville, Alabama). 많은 수의 염료(50개 이상)가 형광 여기 적용에 적용을 위해 활용될 수 있다. 이들 염료는 플루오레세인(fluorescein), 로다민 알렉사플루오르(rhodamine AlexaFluor), 바이오디피(Biodipy), 코우마린(Coumarin), 및 시아닌(Cyanine) 염료 계열로부터의 염료를 포함한다. 더욱이, 켄처(quenchers)가 또한 백드라운드 형광을 최소화하기 위해 올리고 서열을 표지하는데 활용가능하다. 410 nm(Cascade Blue)로부터 775 nm(Alexa Fluor 750)까지의 최대 방출파장을 지니는 염료가 활용가능하며 사용될 수 있다. 500 nm 내지 700 nm 사이의 파장 범위를 갖는 염료는 가시광선 스펙트럼내에 존재하는데 유리함을 가지며 통상적인 광전자증배관을 사용하여 검출될 수 있다. 활용가능한 염료의 광범위한 범위는 상기 검출 범위에 걸쳐 전개되는 방출 파장을 갖는 염료 세트의 선택을 가능케 한다. 다수의 염료를 구별할 수 있는 검출 시스템이 유세포분석기 적용에 대해 보고되었다(하기 문헌 참조: Perfetto et al, Nat. Rev. Immunol. 2004 . 4, 648-55; 및 Robinson et al, Proc of SPIE 2005, 5692, 359-365).
형광 염료는 이들의 피크 방출 파장으로부터 전형적으로 20 내지 50 nm 청색-편이되는 피크 여기 파장을 갖는다. 그 결과, 넓은 범위의 방출 파장에 걸친 염료의 사용은 상기 방출 파장 범위에 걸쳐 염료의 효율적인 여기를 달성하기 위하여 여기 파장과 함께, 다수의 여기 공급뭔의 사용을 필요로 할 수 있다. 대안적으로, 에너지 전달 염료가, 단일 방출 파장을 지니는, 단일 레이저가 관심있는 모든 염료를 여기시키기 위해 사용될 수 있도록 활용될 수 있다. 이것은 에너지 전달 모이어티를 염료 표지에 부착시킴으로써 달성된다. 이러한 모이어티는 전형적으로 광 공급원(예를 들어, 레이저)의 여기 파장과 호환가능한 흡수 파장을 지니는 또 다른 형광 염료이다. 방출기(emitter)와 근접하여 이 흡수기(absorber)의 배치는 흡수된 에너지를 상기 흡수기로부터 상기 방출기로 전달되게 하며, 이는 더 긴 파장의 염료의 더 효유적인 여기를 가능케 한다(Ju et al., Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92, 4347-51).
염료 표지된 디데옥시뉴클레오티드는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer, Waltham, MA)로부터 구매가능하다.
B. 실시예
실시예 5. 핵산의 6-컬러 분리 및 검출
하기 실시예는 6 형광 염료로 표지된 핵산 단편의 분리 및 검출을 설명하며, 스펙트로미터/복수 소자 여기/검출 시스템의 컬러 분해 능력을 입증한다. DNA 단편은 다중체화된 PCR 증폭 반응에 형광적으로 표지된 프라이머를 적용함으로써 6-FAM, VIC, NED, PET 염료로 표지되었다. 이 반응에서, 1 ng의 인간 게노믹 DNA(9947A)가 제조업자의 권장 조건에 따라 25 μL 반응물로 증폭되었다(AmpFISTR Identifiler, Applied Biosystems). 2.7 μL의 PCR 생성물은 옮겨지고 0.3 μL의 GS500-LIZ 사이징 표준물질(standard)(Applied Biosystems) 및 0.3 μL의 HD400-ROX 사이징 표준물질과 혼합되었다. HiDi(Applied Biosystems)은 총 13 μL에 첨가되었고 샘플은 분리 바이오칩의 샘플 웰에 삽입되었고 전기영동에 적용되었다.
진벤치(Genebench)를 사용한 DNA의 전기영동 분리는 일련의 4가지 동작으로 이루어진다: 사전-전기영동, 로딩, 주입 및 분리. 이러한 동작은 미세유체 바이오칩 상에서 수행되는데, 상기 바이오칩은 50°C의 균일 온도로 가열된다. 바이오칩은 다수의 분리 및 검출을 위한 16 채널 시스템을 포함하는데, 각각은 인젝터 채널 및 분리 채널로 이루어진다. 분석을 위한 DNA는 분리 채널을 따라 분자체(sieving matrix)를 통해 상기 DNA의 전기영동 전달에 의해 분리된다. 바이오칩의 분리 길이는 160 내지 180 mm의 범위이다.
제 1 단계는 사전-전기영동인데, 6분 동안 채널의 길이를 따라 필드(cm) 당 160 V를 적용함으로써 달성된다. 분리 버퍼(TTElX)는 음극, 양극 및 폐기 물(waste) 웰내로 피펫팅된다. 분석을 위한 샘플은 샘플 웰내로 피펫팅되고 175 V가 18초 동안 상기 샘플 웰로부터 상기 폐기물 웰로 적용되고, 그 이후에 상기 샘플 및 폐기물 웰에 걸쳐 적용되고 상극 양극에 72초 동안 390 V가 적용되어, 상기 샘플이 상기 분리 채널내로 로딩된다. 샘플의 주입은 분리 채널 길이를 따라 필드(cm) 당 160 V가 적용됨으로써 달성되며 한편 필드(cm) 당 50 V 및 필드(cm) 당 40 V가 각각 상기 샘플 웰과 폐기물 웰에 걸쳐 적용된다. 분리는 30분 동안 주입 전압 파라미터로 지속되며 그 동안 광학 시스템은 DNA의 분리 밴드를 검출한다. 데이터 수집 속도는 5 Hz이고 PMT 이득(gains)은 -800 V로 설정된다.
증폭된 DNA를 함유한 16개 샘플이 동시 분리 및 검출을 위해 로딩되었다. PMT의 32-소자 각각으로부터의 신호가 일렉트로포레그램을 생성시키기 위해 시간의 함수로서 수집되었다. 그 결과 얻어진 일렉트로포레그램(도 17)은 16개 레인 중 하나에 대한 여기/검출 윈도우에서 DNA 단편의 존재에 상응하는 피크를 나타낸다. 더욱이, 각각의 피크를 위한 32-소자 PMT의 각각의 소자의 상대적 신호 강도는 DNA 단편과 연결된 염료(또는 하나 이상의 염료가 검출 윈도우에 존재한다면 염료들)의 스펙트럼 내용물에 상응한다. 도 18은 검출된 염료의 방출 스펙트럼, 및 기질이ㅡ 백그라운드 스펙트럼을 보여준다. 기질 백그라운드 스펙트럼은 각각의 피크로부터의 스펙트럼으로부터 공제된다. 이러한 실행(exercise)을 수행하는 것은 6개의 독특한 염료 스펙트럼의 식별로 귀결된다. 6-염료의 스펙트럼은 동일한 플롯상에 포개진다. 실제 공개된 염료 스펙트럼과 이 데이터의 비교는 염료의 상대적존재(relative)가 공개된 데이터와 유사함을 보여준다. 이러한 실시예는 당해 시스 템이 반응 용액중의 6개 염료를 검출 및 구별할 수 있다는 것을 입증한다. 이 시스템의 스펙트럼 아웃풋은 컬러 보정 행렬을 생성시키고 검출기 공간으로부터의 신호를 염료 스페이스 대표신호(representation)로 전환시키기 위해 사용된다(도 19 및 20).
실시예 6. 핵산의 8 컬러 분리 및 검출
이 실시예에서, 형광 염료로 표지된 산의 8개 염료 분리 및 검출이 제시된다. 8개 유전자좌에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 쌍 서열이 공개된 서열로부터 선택된다(Butler et al., J Forensic Sci 2003, 48, 1054-64).
선택된 유전자좌는 CSF1PO, FGA, THO1, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818 및 D7S820이나, 상기 유전자좌 중 임의의 유전자좌 및 그에 따라 상기 논문에 기재된 프라이머 쌍이 또한 이 실시예에서 사용될 수 있다. 상기 프라이머 쌍을 위한 정방향 프라이머 각각은 별개의 형광 염료(Operon Biotechnologies, Huntsville, Alabama)로 표지된다. 프라이머에 대한 부착을 위해 선택된 염료는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 염료 488, 430, 555, 568, 594, 633, 647, 및 탐라(Tamra)를 포함한다. 다수의 다른 염료가 구매가능하며 또한 표지로서 사용될 수 있다. 각각의 유전자좌는 (Butler, 2003, Id.)의 PCR 반응 프로토콜에 따라 별개로 증폭되어 이들 각각의 염료로 표지된 단편을 지니는 반응 용액을 산출시킨다. PCR 반응을 위한 주형은 1 ng의 인간 게노믹 DNA(프로메가(Promega, Madison WI)로부터의 타입 9947A)이다.
각각의 PCR 반응물은 PCR 세정 컬럼을 통해 세정됨으로써 정제되었는데, 여 기서 프라이머(표지된 프라이머 및 염료-표지된 프라이머) 및 효소가 제거되고, PCR 버퍼는 DI 용리액으로 교체된다. 세정 결과 얻어진 생성물은 DI 수(water) 중의 표지된 DNA 단편 용액이다. 염료 표지된 생성물의 세정은 MinElute™ 컬럼(Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 스미스의 프로토콜을 따른다. 총 8개의 반응이 수행된다. 8개의 세정 PCR 반응물은 소정 비율로 함께 혼합되어 등가의 신호 강도의 피크들을 생성시켰으며, 이는 8개의 상이한 염료로 표지된 단편을 함유하는 혼합물을 생성시켰다. 대안적으로, 8개 유전자좌를 위한 프라이머들이 함께 혼합되어 다중체화된 증폭을 위한 마스터 프라이머 믹스를 형성시킬 수 있다.
이 용액은 실시예 1에 기재된 것과 같은 기구 및 프로토콜로 분리 및 검출된다. 분공기의 그레이팅은 8개 염료의 방출이 검출기 소자의 32 픽셀에 걸쳐 속하도록 조정된다. 분석을 위해 로딩된 샘플의 양은 검출 신호가 검출 시스템의 동적 범위 내에 속하도록 조정되어야 한다
실시예 7. 스펙트로미터/복수-소자 PMT 시스템
하기 실시예는 도 16의 스펙트로미터/복수-소자 PMT 시스템으로 표지된 DNA 단편의 분리/검출, 특히 DNA 주형의 서열을 식별하기 위한 분리/검출을 설명한다. 이 반응에서, 0.1 pmol의 DNA 주형 M13 및 M13 시퀀싱 프라이머는 권장된 반응 조건에 따라, GE Amersham BigDye™ 시퀀싱 키트로 증폭되었다. 이 반응 믹스는 에탄올 침전에 의해 세정되었고 13 μL의 DI 수에 재현탁되었다. 샘플은 실시예 5에 기재된 것과 같은 전기영동 분리 조건에 따라 분리되었다. 샘플 로딩 조건이 변경되었고 샘플 웰을 거쳐 폐기물 웰에 105초 동안 175 V를 적용함으로써 수행되었다. 도 21은, 사용된 4개 염료 각각에 대한 최대 스펙트럼에 상응하는 검출기 소자를 나타내는 채색된 자취와 함께, DNA 서열에 대한 일렉트로포레그램을 보여준다. 획득된 서열은 519개 염기 및 435개 염기의 QV30의 경우 > 20의 프레드 품질 스코어를 지니는 염기로 호칭되었다(도 22).
실시예 8. 2개의 시퀀싱 반응의 생성물의 동시 분리 및 검출
이 실시예에서, 2개 DNA 주형의 순환주기 시퀀싱으로부터의 단편의 분리 및 검출은 단일 분리 채널에서 동시적으로 수행된다. 순환주기 시퀀싱 반응은 하기와 같은 염료 표지된 터미네이터 반응 또는 염료 표지된 프라이머 반응에 의해 제조될 수 있다:
염료 표지된 터미네이터 반응물의 경우:
관심있는 주형 서열에 적절한 시퀀싱 프라이머, 및 순환주기 시퀀싱 버퍼, 폴리머라제, 올리고뉴클레오티드, 디데옥시뉴클레오티드 및 표지된 디데옥시뉴클레오티드를 포함하는 DNA 시퀀싱을 수행하기 위한 시약으로 이루어진 각각의 주형 단편을 위한 순환주기 시퀀싱 반응물이 제조된다. 8개의 상이한 염료가 상기 표지를 위해 활용된다. 제 1 순환주기 시퀀싱 반응에서, 한 세트의 4 염료 표지된 디데옥시 뉴클레오티드가 사용된다. 제 2 순환주기 시퀀싱 반응에서, 또 다른 세트의 4 염료 표지된 디데옥시 뉴클레오티드(상기 제 1 순환주기 시퀀싱 반응에서 사용된 상기 4 염료 표지된 디데옥시 뉴클레오티드의 방출 파장과 다른 방출 파장을 지님)가 사용된다. 각각의 순환주기 시퀀싱 반응이 각각의 반응 복수회를 열적으로 순환시키는 프로토콜을 별개로 준수하여 수행된다. 각각의 열 순환주기는 생어의 프 로토콜을 준수하여 열과 시간으로 변성, 어닐링 및 신장 단계를 포함한다(하기 문헌 참조: Sanger et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1977, 74, 5463-7). 상기 2개의 반응물로부터의 순환주기 시퀀싱 생성물은, 2개의 DNA 주형 각각으로부터의, 총 8개의 독특한 염료와 함께, 표지된 DNA 단편으로 이루어진 샘플을 형성하도록 결합된다.
염료 표지된 프라이머 반응물의 경우:
대안적으로, 분리 및 검출을 위한 샘플은 프라이머 표지된 순환주기 시퀀싱을 사용함으로써 제조될 수 있다. 4개의 순환주기 시퀀싱 반응은 각각의 DNA 주형에 대해 수행된다. 각각의 반응은 표지된 시퀀싱 프라이머, 및 DNA 시퀀싱 including 순환주기 시퀀싱 버퍼, 폴리머라제, 올리고뉴클레오티드 를 포함하는 DNA 시퀀싱을 수행하기 위한 시약으로 이루어진 순환주기 시퀀싱 반응이다. 또한, 각각의 반응은 디데옥시뉴클레오티드(ddATP, ddTTP, ddCTP, 또는 ddGTP) 중 하나 및 하나의 표지된 프라이머를 포함할 것이다. 프라이머와 결합된 각각의 염료는 방출 파장에 있어서 독특하며 순환주기 시퀀싱 용액 중의 디데옥시 뉴클레오티드의 유형(ddATP, ddTTP, ddCTP, 또는 ddGTP)과 연관되어 있다. 각각의 순환주기 시퀀싱 반응이 각각의 반응 복수회를 열적으로 순환시키는 프로토콜을 별개로 준수하여 수행된다. 각각의 열 순환주기는 생어의 프로토콜을 준수하여 열과 시간으로 변성, 어닐링 및 신장 단계를 포함한다(하기 문헌 참조: Sanger, 1977, Id.). 제 2 DNA 주형을 시퀀싱하는 순환주기의 경우, (상기 제 1 순환주기 시퀀싱 반응에서 사용된 상기 4개이 염료의 방출 파장과 상이한 방출 파장을 지니는) 또 다른 세트의 4개의 염료가 적용된다. 모두 8개 반응의 생성물(각각은 상이한 염료를 지님)은 2개의 DNA 주형 각각으로부터의 DNA 단편으로 이루어진 샘플을 형성하기 위해 함께 혼합된다.
분리 및 검출을 위한 샘플:
시퀀싱 반응물 각각은 에탄올 침전법에 의해 세정된다. 샘플의 분리 및 검출은 실시예 8의 프로토콜을 준수한다. 분리 및 검출의 결과는, 2개의 주형 DNA 단편 각각에 상응하는, 2개의 독특한 DNA 서열의 생성이다.
이 실시예의 방법은 단일 분리 채널내 DNA 서열의 그러한 다중체의 검출을 가능케 하기 위해 4개의 다중체내 염료(예를 들어, 3개의 서열을 동시적으로 검출하기 위한 12개의 염료, 4개의 서열을 동시적으로 검출하기 위한 16개 염료, 5개의 서열을 동시적으로 검출하기 위한 20개의 염료, 기타 등등)의 사용을 가능케하기 위해 변형될 수 있다. 마지막으로, 표지된 단편의 분리는 전기영동으로만 국한될 필요는 없다.
실시예 9
단일 채널내 500개 이상의 유전자좌의 분리 및 검출
DNA 및 RNA 시퀀싱 및 단편 크기 결정을 포함하는, 임상적 진단학에 적용될 수 있는 핵산 분석의 몇몇 적용이 존재한다. 이 실시예에서, 10개 컬러의 동시 검출의 사용은 최대 500개 유전자좌의 심문을 가능케 한다. 많은 수의 단편의 크기의 분석은, 예를 들어, 병원균을 확인하거나 개체의 게놈내부의 다수의 유전자좌를 특성결정하기 위해 활용될 수 있다. 태아기 및 착상전 유전자 진단의 세팅시에, 이수성이 핵형결정(karyotyping) 및 형광 인 시츄 혼성화(FISH)에 의해 현재 진단된다. FISH 연구에서, 세포 당 2개의 신호의 존재는 주어진 유전자좌의 2개의 복사본이 상기 세포내에 존재한다는 것을 나타내며, 1개의 신호는 단염색체(monosomy) 또는 부분적 단염색체를 나타내고, 3개의 신호는 삼염색체(trisomy) 또는 부분적 삼염색체를 나타낸다. FISH는 전형적으로 세포가 정상 염색체 보체를 함유하는지 여부를 평가하기 위해 대략 10개의 프로브를 활용한다. 이 접근법은 전체 게놈의 상세한 조망(view)을 가능하게 못하나, FISH에 의해 정상으로 나타난 세포는 이 기술에 의해 검출되지 않은 주요한 비정상성을 잘 지닐 수 있다.
본 발명의 기술은 염색체 구조의 훨씬 더 상세한 분석을 가능케 하기 위해 모든 염색체에 걸쳐 광범위하게 분산된 대략 500개의 염색체 유전자좌가 평가되도록 하기 위해 멀티컬러 분리 및 검출을 이용한다. 이 실시예에서, 대략 500개 유전자좌에 대한 프라이머 쌍 서열은, 반수체 게놈 당 단일 복사본으로써 존재하는 각각의 유전자좌와 함께, 공개된 서열로부터 선택된다. 또한, 50개 프라이어 쌍의 10개 세트는 모든 단편이 동일한 크기가 되지 않도록 각각의 세트가 DNA 단편의 상응하는 세트를 규정하도록 선택된다. 각각의 세트의 경우, 프라이머 쌍에 대한 정방향 프라이머는 하나의 형광 염료로 표지되고, 2개의 세트는 동일한 염료를 공유하지 않는다. 프라이머에 부착을 위해 선택된 염료는 알렉사 플루오르 염료 488, 430, 555, 568, 594, 633, 647, 680, 700, 및 탐라이다. 다수의 다른 염료가 구매가능하며 또한 표지로서 사용될 수 있다. 유전자좌는 "표적 핵산의 급속 다중체화된 증폭 방법"(전게서)에 기재된 것과 같이 하나 또는 수개의 병렬 PCR 반응에서 증폭될 수 있다. 증폭된 프라이머는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 분리 및 검출된다. 단일 분리 채널에서, 500개 단편 모두가 크기(10개 염료 각각에 대해 50개)에 의해 정밀하게 식별될 수 있다.
유전자좌, 염료, 및 분리 채널의 갯수는 요망되는 적용에 기초하여 달라질 수 있다. 더 적은 수의 단편은 요망되는 경우 더 적은 수의 염료 표지를 활용하거나 표지 당 더 적은 수의 DNA 단편을 생성시킴으로써 검출될 수 있다: 이 방식에서, 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 100개 이하, 75개 이하, 50개 이하, 40개 이하, 30개 이하, 또는 20개 이하의 단편이 원하는 대로 검출될 수 있다. 레인 당 식별될 수 있는 유전자좌의 최개 갯수는 검출될 수 있는 독특한 염료의 갯수(전게서에서 언급한 바와 같이, 수십개가 활용가능함)에 의해 증가되는(multiplied) 분리 시스템의 판독 거리 및 해상도에 기초한다(예를 들어, 20 내지 1500개 염기 쌍 범위에 이르는 DNA 단편의 단일 염기 쌍 해상도은 수백개의 단편으로 귀결됨). 따라서, 수천개의 유전자좌가 단일 분리 채널에서 식별될 수 있고 갯수는 추가 염료가 개발됨에 따라 증가될 것이다.

Claims (46)

  1. 기판상의 하나 또는 복수의 검출 지점을 조명하기 위하여 위치된 하나 이상의 광 공급원; 상기 기판상의 상기 검출 지점으로부터 방출된 광을 수집하고 유도하기 위해 위치된 하나 또는 복수의 제 1 광학 소자(optical elements); 및 상기 제 1 광학 소자로부터의 광을 수용하도록 위치된 광 검출기를 포함하는 광학 검출기로서, 여기서 상기 광 검출기가 광 파장에 따라서 상기 제 1 광학 소자로부터의 광을 분리시키며 검출 소자에 상기 분리된 광의 일부를 제공하기 위해 위치된 파장 분산 소자를 포함하며, 여기서 상기 검출 소자 각각은 검출 소자 각각으로부터의 검출 정보를 동시적으로 수집하기 위한 제 1 조절 소자와 소통하며, 여기서 상기 광 검출기가 하나 이상의 생물학적 분자에 표지된 6가지 이상의 염료로부터의 형광을 검출하며, 각각의 염료는 독특한 피크의 방출 파장을 지니는, 광학 검출기.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 분자가 핵산인, 광학 검출기.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 핵산이 DNA인, 광학 검출기.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 광 검출기가 8가지 이상의 다른 염료로부터의 형광을 검출하며, 각각의 염료는 2개 이상의 4-염료(4-dye) 함유 서브세트의 일원이고, 이로써 상기 서브세트는 상기 기판상의 단일 검출 지점에서 2개 이상의 DNA 서열을 구별할 수 있으며, 여기서 상기 염료의 수는 4의 배수이며, 상기 검출되는 DNA 서열의 수는 상기 배수와 동등하며, 이로써 상기 상이한 염료 각각이 오직 하나의 서브세트로 존재하는, 광학 검출기.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 분자가 단백질인 광학 검출기.
  6. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 광 공급원이 레이저인 광학 검출기.
  7. 제 1항에 있어서, 각각의 검출 소자가 자외선, 가시광선, 적외선, 또는 이들의 조합을 검출할 수 있는 광학 검출기.
  8. 제 1항에 있어서, 복수의 검출 지점들 사이에서 순차적으로 상기 광 공급원을 스캔하기 위한 거울을 추가로 포함하는 광학 검출기.
  9. 제 1항에 있어서, 2차원 광학 검출기 소자를 추가로 포함하는 광학 검출기로서, 상기 소자가 광학 스펙트럼의 검출을 위한 2개 이상의 로우(rows)를 포함하며, 여기서 제 1 로우는 제 1 독립 레인(lane)의 광학 스펙트럼을 검출하며 상기 제 2 로우는 제 2 독립 레인의 광학 스펙트럼을 검출하는 광학 검출기.
  10. 제 1항에 있어서, 각각의 검출 소자가 단일-음극 광전자증배 관(photomultiplier tube)이고 상기 파장 분산 소자가 상기 제 1 광학 소자로부터의 상기 광의 일부를 각각의 상기 검출 소자에 제공하기 위해 위치된 하나 또는 복수의 이색성 거울을 포함하며, 여기서 각각의 이색성 거울은 독립적으로 사전결정된 파장의 광을 반사하는 광학 검출기.
  11. 제 10항에 있어서, 대역통과 필터를 추가로 포함하는 광학 검출기로서, 여기서 상기 독립적으로 사전결정된 파장의 광이 상기 검출 지점들 중 하나 이상에 존재하는 형광 염료의 형광 방출 최대값(fluoresce emission maximum)에 본질적으로 상응하는 광학 검출기.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 파장 분산 소자가 프리즘, 회절 격자, 투과 격자, 분광기 또는 홀로그래픽 회절 격자인 광학 검출기.
  13. 각각의 채널이 한 검출 지점을 포함하는, 기판상의 하나 또는 복수의 채널내 복수의 생물학적 분자를 동시적으로 분리시키기 위한 구성요소(component);
    상기 기판상의 상기 검출 지점들로 조명하기 위해 위치된 하나 이상의 광 공급원;
    상기 검출 지점들로부터 방출된 광을 수집 및 유도하기 위하여 위치된 하나 또는 복수의 제 1 광학 소자; 및
    상기 제 1 광학 소자로부터 유도된 광을 수용하기 위해 위치된 광 검출기를 포함하는, 생물학적 분자의 분리 및 검출을 위한 시스템으로서, 여기서 상기 광 검출기는 광 파장에 따라 상기 제 1 광학 소자로부터 상기 광을 분리시키고 상기 분리된 광의 일부를 검출 소자에 제공하기 위해 위치된 파장 분산 소자를 포함하며, 여기서 상기 검출 소자 각각은 검출 소자 각각으로부터의 검출 정보를 동시적으로 수집하기 위한 제 1 조절 소자와 소통하며, 상기 광 검출기가 하나 이상의 생물학적 분자에 표지된 6가지 이상의 염료로부터의 형광을 검출하며, 각각의 염료는 독특한 피크 파장을 지니는, 시스템.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 생물학적 분자가 핵산인 시스템.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 핵산이 DNA인 시스템.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 광 검출기가 8가지 이상의 염료로부터의 형광을 검출하며, 상기 염료는 2개 이상의 4-염료 함유 서브세트의 일원이고, 이로써 상기 염료 세트는 단일 채널내의 2개 이상의 DNA 서열을 검출할 수 있으며, 여기서 상기 염료의 수는 4의 배수이며, 상기 검출되는 DNA 서열의 수는 상기 배수와 동등하며, 이로써 상이한 상기 염료 각각이 오직 하나의 서브세트로 존재하는, 시스템.
  17. 제 13항에 있어서, 상기 생물학적 분자가 단백질인 시스템.
  18. 제 13항에 있어서, 각각의 생물학적 분자가 형광 염료를 독립적으로 포함하며 각각의 독특한 광학 스펙트럼이 독특한 형광 최대값을 포함하는 시스템.
  19. 제 13항에 있어서, 상기 구성요소가 전기영동장치인 시스템.
  20. 제 13항에 있어서, 상기 광 공급원이 레이저인 시스템.
  21. 제 13항에 있어서, 각각의 검출 소자가 자외선, 가시광선, 적외선, 또는 이들의 조합을 검출할 수 있는 시스템.
  22. 제 13항에 있어서, 복수의 검출 지점들 사이에서 순차적으로 상기 광 공급원을 스캔하기 위한 거울을 추가로 포함하는 시스템.
  23. 제 13항에 있어서, 각각의 검출 소자가 단일-음극 광전자증배관이고, 상기 파장 분산 소자가 상기 제 1 광학 소자로부터의 상기 광의 일부를 각각의 상기 검출 소자에 제공하기 위해 위치된 하나 또는 복수의 이색성 거울을 포함하며, 여기서 각각의 이색성 거울은 독립적으로 사전결정된 파장의 광을 반사하는, 시스템.
  24. 제 23항에 있어서, 대역통과 필터를 추가로 포함하는 시스템으로서, 여기서 각각의 독립적으로 사전결정된 파장의 광이 하나 이상의 상기 검출 지점들내에 존 재하는 형광 염료의 형광 방출 최대값에 본질적으로 상응하는 시스템.
  25. 제 23항에 있어서, 선형 복수-음극(multi-anode) 광전자증배관이 상기 검출 소자를 포함하는 시스템.
  26. 제 23항에 있어서, 상기 파장 분산 소자가 프리즘, 회절 격자, 투과 격자, 분광기 또는 홀로그래픽 회절 격자인 시스템.
  27. 복수의 생물학적 분자를 분리 및 검출하는 방법으로서,
    기판상의 하나 또는 복수의 미세유체 채널로 하나 또는 복수의 분석 샘플을 제공하는 단계로서, 여기서 각각의 미세유체 채널은 한 검출 지점을 포함하고, 각각의 분석 샘플은 복수의 생물학적 분자를 독립적으로 포함하며, 각각의 분자는 6가지 이상의 염료중 하나로 독립적으로 표지되며, 각각의 염료는 독특한 피크 파장을 지니는, 단계;
    각각의 미세유체 채널내의 복수의 상기 표지된 생물학적 분자를 동시적으로 분리하는 단계; 및
    (i) 광 공급원으로 각각의 검출 지점을 조명하는 단계;
    (ii) 각각의 검출 지점으로부터 방출된 광을 수집하는 단계;
    (iii) 광 검출기로 상기 수집된 광을 유도하는 단계; 및
    (iv) 광 파장에 의해 상기 수집된 광을 분리하는 단계; 및
    (v) 하나 이상의 생물학적 분자에 표지된 6개 이상의 염료(각각의 염료는 독특한 피크 파장을 지님)로부터의 형광을 동시적으로 검출하는 단계에 의해, 각각의 미세유체 채널내에서 상기 복수의 분리된 표적 분석대상체(analytes)를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 분리가 상기 복수의 미세유체 채널을 가로질러 전위를 적용(applying)함으로써 실행되는 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 각각의 검출 지점이 순차적으로 조명되는 방법.
  30. 제 27항에 있어서, 각각의 검출 지점이 동시적으로 조명되는 방법.
  31. 제 27항에 있어서, 상기 염료 각각이 독립적으로 약 450 nm 내지 약 1500 nm 범위의 파장에서 형광 최대값을 가지는 방법.
  32. 제 27항에 있어서, 상기 표적 분석대상체가 핵산 단편을 포함하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 핵산 단편이 하나 이상의 핵산 증폭 반응의 생성물이고 상기 형광 염료가 프라이머에 부착되는 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 상기 핵산 단편이 하나 이상의 생어 시퀀싱 반응의 생성물이고 상기 형광 염료가 디데옥시뉴클레오티드 터미네이터에 부착되는 방법.
  35. 제 27항에 있어서, 각각의 검출기 소자가 상기 형광 염료중 하나를 검출하도록 적합화되는 방법.
  36. (a) 하나 또는 복수의 미세유체 시스템을 포함하는 바이오칩[여기서 각각의 미세유체 시스템은 분리 챔버와 미세유체적으로 소통하는 제 1 반응 챔버를 포함하며, 여기서 상기 제 1 반응 챔버는
    (i) 핵산 추출;
    (ii) 핵산 정제;
    (iii) 핵산 증폭전 세정(cleanup);
    (iv) 핵산 증폭
    (v) 핵산 증폭후 세정;
    (vi) 핵산 시퀀싱전 세정;
    (vii) 핵산 시퀀싱;
    (viii) 핵산 시퀀싱후 세정;
    (ix) 역 전사;
    (x) 역 전사전 세정;
    (xi) 역 전사후 세정;
    (xii) 핵산 라이게이션;
    (xiii) 핵산 혼성화; 또는
    (xiv) 정량에 대해 적합화되며;
    상기 분리 챔버는 검출 지점을 포함함]; 및
    (b) (i) 상기 분리 챔버내의 복수의 표적 분석대상체를 동시적으로 분리하기 위한 분리 소자;
    (ii) 상기 바이오칩상의 상기 검출 지점을 조명하기 위해 위치된 하나 이상의 광 공급원;
    (iii) 상기 검출 지점으로부터 방출된 광을 수집 및 유도하기 위해 위치된 하나 또는 복수의 제 1 광학 소자; 및
    (iv) 상기 제 1 광학 소자로부터 유도된 광을 수용하기 위해 위치된 광 검출기를 포함하는 분리 및 검출 시스템으로서, 여기서 상기 광 검출기는 광 파장에 따라 상기 제 1 광학 소자로부터의 광을 분리시키고 6개 이상의 검출 소자에 상기 분리된 광의 일부를 제공하기 위해 위치된 파장 분산 소자를 포함하며, 여기서 각각의 상기 검출 소자는 검출 소자 각각으로부터의 검출 정보를 동시적으로 수집하기 위한 제 1 조절 소자와 소통하며; 상기 광 검출기는 하나 이상의 생물학적 분자에 표지된 6개 이상의 염료로부터의 형광을 검출하며, 각각의 염료는 독특한 피크 파장을 지니는, 분리 및 검출 시스템
    을 포함하는, 통합된 바이오칩 시스템.
  37. (a) 하나 또는 복수의 미세유체 시스템을 포함하는 바이오칩[여기서, 각각의 미세유체 시스템은 분리 챔버와 미세유체적으로 소통하는 제 1 반응 챔버를 포함하며, 여기서 상기 제 1 반응 챔버는
    (i) 핵산 추출;
    (ii) 핵산 정제;
    (iii) 핵산 증폭전 세정;
    (iv) 핵산 증폭;
    (v) 핵산 증폭후 세정;
    (vi) 핵산 시퀀싱전 세정;
    (vii) 핵산 시퀀싱;
    (viii) 핵산 시퀀싱후 세정;
    (ix) 역 전사;
    (x) 역 전사전 세정;
    (xi) 역 전사후 세정;
    (xii) 핵산 라이게이션;
    (xiii) 핵산 혼성화; 또는
    (xiv) 정량에 대해 적합화되며;
    상기 분리 챔버는 검출 지점을 포함함]; 및
    (b) (i) 상기 분리 챔버내에서, DNA 서열을 포함하는 복수의 생물학적 분자를 동시적으로 분리하기 위한 분리 소자;
    (ii) 상기 바이오칩상의 상기 검출 지점을 조명하기 위해 위치된 하나 이상의 광 공급원;
    (iii) 상기 검출 지점으로부터 방출된 광을 수집 및 유도하기 위해 위치된 하나 또는 복수의 제 1 광학 소자; 및
    (iv) 상기 제 1 광학 소자로부터 유도된 광을 수용하기 위해 위치된 광 검출기를 포함하는 분리 및 검출 시스템으로서, 여기서 상기 검출기가 광 파장에 따라 상기 제 1 광학 조명로부터의 광을 분리시키고 6개 이상의 검출 소자에 상기 분리된 광의 일부를 제공하기 위해 위치된 파장 분산 소자를 포함하며, 여기서 상기 각각의 검출 소자는 검출 소자 각각으로부터의 검출 정보를 동시적으로 수집하기 위하여 제 1 조절 소자와 소통하며; 상기 광 검출기가 하나 이상의 DNA 서열에 표지된 8개 이상의 염료로부터의 형광을 검출하며, 각각의 염료가 독특한 피크 파장을 지니고, 상기 염료가 2개 이상의 4-염료 함유 서브세트의 일원이고, 이로써 상기 염료 세트가 단일 채널내의 2개 이상의 DNA 서열을 검출할 수 있으며, 여기서 상기 염료의 수는 4의 배수이고, 검출되는 상기 DNA 서열의 수는 상기 배수와 동일하며, 이로써 상이한 염료 각각이 오직 한 서브세트내에 존재하는, 분리 및 검출 시스템
    을 포함하는, 통합된 바이오칩 시스템.
  38. 제 36항에 있어서, 상기 제 1 반응 챔버가 핵산 추출을 위해 적합화된 시스템.
  39. 제 36항에 있어서, 상기 제 1 반응 챔버가 핵산 정제를 위해 적합화된 시스템.
  40. 제 36항에 있어서, 상기 제 1 반응 챔버가 핵산 증폭을 위해 적합화된 시스템.
  41. 제 36항에 있어서, 상기 제 1 반응 챔버가 세정을 위해 적합화된 시스템.
  42. 제 36항에 있어서, 상기 제 1 반응 챔버가 핵산 시퀀싱을 위해 적합화된 시스템.
  43. 제 36항에 있어서, 상기 제 1 반응 챔버가 역전사를 위해 적합화된 시스템.
  44. 제 36항에 있어서, 상기 제 1 반응 챔버가 핵산 라이게이션을 위해 적합화된 시스템.
  45. 제 36항에 있어서, 상기 제 1 반응 챔버가 핵산 혼성화를 위해 적합화된 시스템.
  46. 제 36항에 있어서, 상기 제 1 반응 챔버가 정량을 위해 적합화된 시스템.
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