ITCA20000004A1 - Metodo e sistema per la rivelazione simultanea e multipla con quantificazione della ibridizzazione di composti molecolari quali acidi nuclei - Google Patents

Metodo e sistema per la rivelazione simultanea e multipla con quantificazione della ibridizzazione di composti molecolari quali acidi nuclei Download PDF

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Description

AMBITO SPECIFICO DELL’INVENZIONE
L’invenzione descritta copre il campo della biologia molecolare, ricerca di farmaci, analisi del genoma, chimica combinatoria, in particolare dei, noti nel campo, come “biochip-“, “microchip-" , “chip-" “arrays”, ovvero analisi di matrici di depositi di molecole in supporti di vario tipo.
L’invenzione consiste in un metodo e sistema di rivelazione della posizione di molteplici siti di ibridizzazione e non di composti molecolari tra cui acidi nucleici DNA, RNA, proteine, PNA caratterizzato dal fatto di operare tale rivelazione contemporaneamente in migliaia di siti differenti, con sistema di rivelatore a microelettrodi sensibile alla radiazione elettromagnetica incidente direttamente dalla sorgente al supporto delle molecole ibridizzate e quindi sul rivelatore dopo averlo attraversato. Il supporto contiene delle sonde depositate e dei bersagli ibridizzati, rimasti attaccati dopo il lavaggio.
BREVE DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
L’invenzione consiste nel metodo e relativo sistema di rivelazione simultanea in molteplici siti di ibridizzazione di composti molecolari. Il sistema comprende un rivelatore che identifica la posizione usando radiazione elettromagnetica o da decadimento nucleare. La prima preferibilmente nell’intervallo tra leV e 6eV. Diverse sorgenti di radiazione possono essere utilizzate a seconda della sensibilità del rivelatore accoppiato a quella sorgente.
Il sistema include:
una sorgente di radiazione;
un supporto su cui avviene l’ibridizzazzione, preferibilmente in vetro o polimero plastico o nylon con o senza vetro oppure zaffiro oppure diamante sintetico oppure quarzo con o senza un film di materiale sintetico depositato;
un rivelatore preferibilmente come un wafer, costituito da materiale, preferibilmente semiconduttore in cui avviene la reazione di ionizzazione da parte della radiazione incidente;
il wafer che alloggia micro elettrodi preferibilmente diodi ottenuti da micro-impiantazioni o giunzioni capaci di raccogliere le cariche generate dalla ionizzazione o la corrente generata su un circuito elettronico preferibilmente integrato (“VLSI” “Very Large Scale Integrated”); eventuali micro diodi piazzati ad una interdistanza pari a quella tra i centri dei siti di ibridizzazione;
un eventuale circuito integrato compatto che legge la carica o la corrente creata dalla ionizzazione e, se separato dal wafer rivelatore ha le piazzole di contatto verso eventuali diodi alla stessa interdistanza .
La sorgente di radiazione è posta sopra o sotto il supporto delle sonde, irraggiandolo completamente. Essa è seguita dal rivelatore cui poi è eventualmente attaccato o saldato il circuito integrato.
L’informazione del circuito elettronico è digitalizzata e trasferita ad un normale calcolatore elettronico di quelli più attuali.
Il metodo consiste nel’identificazione dei siti in cui è avvenuta l’ibridizzazione delle sonde attaccate al supporto con i bersagli depositati successivamente e che si vogliono studiare. Alcuni dei bersagli ibridizzano, altri no. Quelli non ibridizzati vengono rimossi con operazione di lavaggio. Il supporto è quindi irraggiato anche per meno di un secondo, il tempo esatto essendo determinato dal numero di siti di ibridizzazione e di lettura dei diodi, che possono essere anche decine di migliaia.
Tutti i siti di ibridizzazione e gli elementi di lettura (preferibilmente diodi) vengono irraggiati simultaneamente. La radiazione viene raccolta nella stessa posizione del diodo o elettrodo corrispondente alla posizione nel supporto di vetro.
Se il bersaglio non contiene sostanze marcanti, la quantità di carica dipende dall’ ammontare delle molecole che hanno ibridizzato. In particolare quanto più è piccola, tanto più è grande il numero di basi ibridizzate e viceversa. Se i bersagli sono marcati, si può determinare il grado di attaccamento dalla quantità di carica raccolta dal rivelatore su tutto il possibile intervallo di energia della radiazione riemessa. L’intensità della radiazione raccolta dipende dalle dimensioni del frammento ibridizzato. Se i bersagli contengono una sostanza fluoriscinante, la radiazione sarà ri-emessa ad una diversa energia a seconda della sostanza e della quantità di bersaglio effettivamente attaccata alla sonda. Se si vuole selezionare un intervallo di energia, si interpone, trattandosi di radiazione elettromagnetica, un opportuno monocromatore o una serie di filtri, sia tra la sorgente ed il supporto che tra il supporto ed il rivelatore.
Gli elementi elettrici di raccolta (elettrodi o diodi) sono posizionati fissi, uno per ogni sito di sonda, conoscendo quale sonda è stata messa in quale sito del supporto, confrontando quali siti vengono identificati come ibridizzati, essendo essi identificati simultaneamente come segnale elettrico, è possibile determinare, ad esempio l’espressione genica se sono state depositate sonde adeguate. Il metodo è applicabile in generale a qualsiasi tipo di sonda che aderisce su supporti di vetro, polimero o quarzo o simili, con o senza ulteriore deposito ad esempio polimerizzante. Ad esempio si possono utilizzare oligonucieotidi, DNA, per profili di mutazione genica o estratti di cellule tumorali per studi di attaccamento di sostanze base per farmaci anti-tumorali etc...
L’ interdistanza tra gli elementi di rivelazione può essere qualsiasi fino a qualche decina di micrometri in entrambe le direzioni trasversali a quella della radiazione incidente. Attualmente è la tecnologia di impiantazione nei circuiti integrati che limita tale dimensione a circa 50 micrometri o poco meno. Non vi sono limitazioni di principio alla dimensione trasversale del supporto di vetro o altro supporto in alternativa né del wafer di semiconduttore o comunque se vi sono non inficiano la validità o il campo di applicabilità del metodo. La limitazione può venire o da limitazioni costruttive meccaniche delle macchine che ibridizzano o depositano le sonde oppure ad esempio da quelle che creano i wafer di semiconduttore. Attualmente queste ultime tecnologie possono consentire di creare sistemi sino a 12 centimetri quadrati.
Nemmeno lo spessore di rivelatore e supporto costituisce fattore limitante o qualificante per l’operazione del sistema o la validità o applicabilità del metodo.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Il campo dell’invenzione
Il metodo proposto porta alla costruzione di un sistema più economico, più affidabile e più veloce di quelli attualmente usati, sia in laboratori, in modo sperimentale, sia rispetto a quelli commerciali. Il sistema porta alla più ampia diffusione ed utilizzo dei micro-sistemi “biochip” o “DNA chip” o “biochip array”, differentemente noti nel campo, senza accezione più definita. Si intendono qui supporti in materiale plastico o vetroso o comunque cristallino, con o senza film depositato (vedi rivendicazioni). Su tali supporti, solitamente in vetro, viene depositato materiale biologico, naturale o sintetico, specificatamente trattato o no (vedi rivendicazioni). Per essi da qui in poi viene anche utilizzato il termine di uso comune “vetrino”. Tale materiale biologico, solitamente DNA, cDNA, mRNA, PNA, proteina o oligonucleotide sintetico, è depositato in disposizione geometrica a matrice (si parla di “micro-array” o “macroarray”). Le dimensioni del supporto sono di qualche centimetro di lato, in forma rettangolare o quadrata. Lo spessore è di qualche millimetro. I depositi vengono solitamente effettuati con sistemi adatti alla micro- o nano- deposizione, che consentono depositi dell’ordine del micrometro, in dimensione trasversale parallela al piano del supporto. L’interdistanza tra le posizioni (nel seguito dette anche “siti” ) dei depositi può essere qualsiasi sino a qualche decina di micrometri, da centro a centro (vedi rivendicazioni). Nei sistemi correnti, le dimensioni più usate sono intorno a 100micrometri. I depositi di materiale biologico, vengono chiamate sonde (“probe” riferimento 1 “Nature”) dovrebbero essere complementari a quelli che vengono successivamente depositati detti bersagli (“target”). L’analisi consiste nel verificare se tale complementarietà effettivamente sussiste, e in quale misura, sia per singolo sito, che per ognuno rispetto agli altri. Se tale complementarietà esiste si definisce avvenuto il processo di “ibridizzazione”. Questo termine è di uso comune in molti altri campi ma in tale contesto ha solo il significato, per quanto ampio, descritto.
L’ibridizzazione può avvenire o meno ed in diversa misura. Se ad esempio si effettua lo studio di geni, si dice allora che viene “espresso” un gene in maniera maggiore o minore da un organismo o un individuo. Non per tutte le applicazioni si va a dedurre una espressione genica.
Al fine di misurare tale ibridizzazione, in senso lato, si interviene sul trattamento dei bersagli. Nella preparazione essi vengono marcati con sostanze coloranti, fluoriscinanti, ovvero che emettono luce su uno spettro definito di lunghezze d’onda, oppure con sostanze che emettono particelle da decadimento radioattivo. I composti così marcati vengono depositati sul vetrino. In esso i bersagli ibridizzano con le sonde e rimangono adesi. Procedendo ad opportuno lavaggio del vetrino, resteranno su esso solo i bersagli -sonde ibridizzati. L’analisi per la localizzazione e la quantificazione di tale ibridizzazione inizia qui ed è l’oggetto della presente invenzione. Essa viene fatta solitamente attraverso la rivelazione delle particelle emesse nei siti ibridizzati dalle molecole dei bersagli . Queste possono essere ad esempio o i fotoni o altre da decadimento nucleare, ad esempio gli elettroni. Perché le molecole marcate emettano ad esempio fotoni, se sono state marcate con composti fluoricinanti come Cye5, devono essere stimolate alle lunghezze d’onda opportune, da sorgenti di radiazione, laser o lampade adeguate.
L’uso che si fa della lettura dei siti di ibridizzazione è sia di valutazione dell’espressione di certi geni che direttamente di determinazione della sequenza, inserendo frammenti opportuni di geni. La presente invenzione copre comunque queste applicazioni e tutte quelle che sfruttano l’uso della rivelazione dei siti di ibridizzazione.
I metodi correnti per la rivelazione dei siti di ibridizzazione
Per rivelazione dei siti di ibridizzazione si intende qui l’identificazione della posizione attraverso la quantificazione delle molecole ibridizzate. II metodo più diffuso per la rivelazione dei siti di ibridizzazione si basa sulla fluorescenza. Nella maggior parte dei sistemi attuali un sistema meccanico effettua una scansione di tutti i siti di ibridizzazione irraggiandoli con un laser per eccitare la lunghezza d’onda di emissione più probabile del colorante. Il rivelatore che raccoglie la luce da questa successiva emissione è solitamente un fotomoltiplicatore. Questa è la configurazione più diffusa. Nella gran parte dei casi vengono usati sistemi con laser a gas e fotomoltiplicatori ingombranti che necessitano anche di raffreddamento. Nei sistemi più avanzati si utilizzano dei laser più compatti a semiconduttore ed un numero di sostanze fluoriscinanti fino a quattro. Tra i sistemi più recenti in fase dimostrativa, ne esistono che sfruttano la rivelazione con rivelatore CCD (Charge Coupled Device), sempre accoppiato ad un sistema laser con lenti e filtri relativi ed adeguato sistema di raffreddamento.
Il tempo necessario per analizzare un vetrino dipende fortemente dal numero di siti, dal numero di fluoriscinati e dal costo degli equipaggiamenti. Nella gran parte dei casi, pur essendo quella descritta la tendenza del mercato e dell’attività di ricerca, il sistema di lettura più diffuso è quello della Affymetrix. Tale sistema consente un limitato uso di oligonucleotidi, quelli specifici che possono essere depositati solo con altro sistema Affymetrix di deposizione.
I tempi di scansione, lettura ed analisi arrivano sino a diverse ore, con un minimo di qualche decina di minuti. Lo stesso si può dire per tutti i sistemi sviluppati in laboratorio (tipo “Pat Brown”, P.O.Brown et al. “Exploring thè new world of thè genome with DNA microarrays” Nature Genetics suppl. voi.21 33-37 (1999)). Tutti questi sistemi sono lenti, molto costosi anche a causa della complessa fabbricazione e per l’impiego di sostanze marcanti. Inoltre in molti laboratori nella fase sperimentale, i vetrini vengono ancora riutilizzati. Per questo devono essere lavati e non sempre è possibile ottenere una pulizia completa, soprattutto delle sostanze fluorescenti la cui presenza in successive analisi falsa i risultati.
Ad esempio le sostanze fluoriscinanti come i diffusi Cye3 o Cye5 tra i più usati, non mostrano sempre lo stesso attaccamento al bersaglio, dipendendo da molti fattori fisico-chimici quali le condizioni termodinamiche etc... . Anche l’occupazione stechiometrica delle molecole influenza la capacità di ibridizzazione. Questo, oltre ad influenzare la quantità di materiale necessaria, influenza anche la capacità di espressione.
L’uso dei “biochip” si estende, anche se non attualmente ma decisamente in futuro, all’analisi di organismi più complessi, come le proteine. La conoscenza delle interazioni con i marcatori di tali organismi, non è altrettanto nota.
Inoltre lo scopo principale dell ’utilizzo dei “biochip arrays” è la possibilità di analisi in larga scala e rapida di un grande numero di composti per la verifica dell’ espressione. Gli attuali sistemi di lettura costituiscono una limitazione di questo. La presente invenzione consente il pieno sfruttamento delle capacità intrinseche del “biochip array”.
E’ opinione diffusa nella comunità internazionale che utilizza tali sistemi che essi non siano ancora perfettamente a punto. Questo è particolarmente vero nel campo dell’analisi funzionale delle cellule tumorali e della loro espressione. I sistemi attuali quindi sono usati per la maggior parte a scopo sperimentale. La presente invenzione consentirebbe la loro diffusione industriale con importanti ricadute cliniche quindi sociali.
I vantaggi delia presente invenzione
I vantaggi proposti dalla presente invenzione (dettagliati nelle rivendicazioni) sono molteplici e si basano sostanzialmente, ma non solo, su due innovazioni:
la rivelazione simultanea di tutti i siti di ibridizzazione e non e la potenziale eliminazione dei marcatori.
La seconda innovazione, non esclude la prima e viceversa. I vantaggi della rivelazione simultanea si hanno anche per l’uso di marcatori Analogamente i vantaggi della rivelazione senza marcatori si hanno anche senza la rivelazione simultanea. La presente invenzione include entrambe le soluzioni perché si basa su rivelatori (vedi rivendicazioni) a semiconduttore con lettura diretta di corrente o carica, descritti in seguito.
I vantaggi della rivelazione simultanea
I vantaggi della rivelazione simultanea sono enormi in termini di tempo, semplicità di sistema, sua ingegnerizzazione, costo ed utilizzo. Per ottenerla è necessario illuminare simultaneamente tutti i siti di ibridizzazione. Il sistema proposto prevede un adeguato irraggiamento a seconda della sorgente di radiazione utilizzata. Diversi tipi di questa, con i sistemi ottici opportuni sono descritti in seguito. Un altro requisito per la rivelazione simultanea è che tutti i segnali vengano raccolti simultaneamente. Per far questo ad ogni sito di ibridizzazione deve corrispondere un singolo elemento di lettura. L’uso di un rivelatore a pixel, in cui ogni pixel corrisponde ad un sito di ibridizzazione, è tra le innovazione della presente invenzione.
Una rapida rivelazione della ibridizzazione, consente di ottenere maggiore quantità di informazioni in intervalli di tempo molto piccoli, dell’ordine del microsecondo, sulla espressione di una grande quantità di geni. Questo velocizza e facilita il compito ad un gran numero di ricercatori nel campo clinico, e nel campo dell’industria farmaceutica. La presente invenzione consente di sfruttare a pieno i vantaggi di biochip.
La rivelazione senza marcatori
Si può effettuare la rivelazione sia della radiazione trasmessa dopo assorbimento, sia dopo riemissione per fluorescenza. Naturalmente si può rivelare anche la radiazione radioattiva ma questa è sempre meno utilizzata. Altrettanto ed in fase sperimentale sono i sistemi ad emissione di singole particelle da processi nucleari, come la produzione di coppie, rivelazione di eletroni, di positroni, di frammenti nucleari, di radiazione eletromagnetica ad alte energie (oltre i 6eV sino ai GeV). La presente invenzione copre tutti questi tipi di radiazione. Per i motivi esposti, nel seguito si descrivono i vantaggi per la rivelazione in intervalli di lunghezza d’onda da c.a 700nm sino a 190nm, in quanto allo stato attuale l’ implementazione del metodo proposto è più immediata, ma non costituisce limitazione della presente invenzione.
Si può rivelare l’assorbimento delia radiazione che attraversa il biochip. Ogni sito di deposito e di ibridizzazione assorbirà differentemente la radiazione incidente. I siti in cui l' ibridizzazione è avvenuta assorbiranno di più di quelli in cui è rimasto solo la sonda attaccata. Inoltre l’assorbimento tra siti di ibridizzazione, direttamente proporzionale al numero di molecole che hanno ibridizzato, varierà tra sito e sito. Il grado di ibridizzazione sarà quindi misurato dal numero di fotoni che arrivano al rivelatore, ovvero dalla quantità di cariche che vengono generate nei semiconduttore e raccolte dal circuito elettronico che opera la digitalizzazione dopo lettura di tipo “analogico”.
Il vantaggio è che la misura è diretta e analogica. L’immagine è più netta rispetto alla riemissione di fluorescenza che invece è isotropa e quindi con maggiore distribuzione spaziale. Inoltre la probabilità di assorbimento è funzione nota di tutti i materiali usati, quindi i risultati possono essere rapidamente verificati con le previsioni dei modelli matematici. Al contrario l’assorbimento e riemissione delle sostanze fluoriscinate attaccate alle sonde o ai bersagli, sono relativamente poco noti. Molte cause possono influenzare l’attaccamento. L’occupazione stechiometrica ne è l’elemento fondamentale. Vi sono poi condizioni termodinamiche da rispettare per poter verificare i risultati con la teoria, fortemente dipendenti dall’esperimento. Oltre a ciò caratteristiche fisicochimiche ed il costo rendono meno attraente l’uso di fluori sci nanti. Queste considerazioni si applicano agli impieghi di tutti i marcatori in generale.
La misura di assorbimento si può effettuare in un ampio spettro di energia. La sorgente va opportunamente scelta, sulla base delle sonde e bersagli utilizzati. Ad esempio nel caso di ibiridizzazioni a base di DNA, si ha massimo assorbimento intorno alla lunghezza d’onda di 260nm. Quindi è più adatta una sorgente che emette il massimo dell’intensità in quell’intervallo. Ad esempio si possono usare quelle esistenti in commercio come quelle a Deuterio o Mercurio oppure opportune sorgenti laser o a plasma. Tale sorgente va ottimizzata anche in termini di sensibilità (vedi rivendicazioni). Per la presente invenzione nell’uso corrente dei biochip quella a Deuterio commerciale a bassa potenza è perfettamente adatta agli scopi. Il metodo descritto nella presente invenzione copre comunque tutte le sorgenti possibili, inclusi laser a lunghezza d’onda definita o ad ampio spettro, come pure essi accoppiati a filtri o monocromatori. L’assorbimento può essere misurato anche in intervallo di lunghezza d’onda lontano dall’assorbimento delle basi costituenti il DNA puro (picco di assorbimento a 265nm). Può risultare conveniente sia in termini di costi che di potenza necessaria o altre esigenze pratiche, utilizzare altre sorgenti, inclusa la motivazione di osservazione di diverso picco di assorbimento da ammassi molecolari più complessi quali proteine o altri organismi.
Il sistema di rivelazione
Il sistema utilizza rivelatori a semiconduttore (vedi rivendicazioni). Essi possono essere a basso o alto gap (diretto o indiretto) e possono essere puri, naturali o ottenuti sinteticamente da leghe. La loro composizione ed il loro trattamento cambia le potenzialità di rivelazione. Alcuni di questi materiali possono essere, secondo certe nomenclature, considerati “isolanti” e non propriamente “semiconduttori”. Essi sono tutti compresi nel campo di questa invenzione. Ad esempio il Diamante sintetico, comunque cresciuto, è compreso (vedi rivendicazioni). Altrettanto dicasi per i composti con Indio, Alluminio, Gallio e Silicio, con o senza Azoto. Tali materiali possono essere drogati volontariamente o involontariamente e quindi contenere altri atomi di diversa natura. 11 loro grado di purezza dipende da molti requisiti: costo, disponibilità e facilità di fabbricazione industriale. Nell' ambito della presente invenzione i vantaggi di questi materiali risiedono nella loro capacità di essere ionizzati dalla radiazione incidente e lasciare che le cariche prodotte possano in buona parte essere trasferite all’interno di essi senza venire riassorbite. Questo è possibile grazie ad un campo elettrico applicato da un’estremità all’altra.
Nelle applicazioni più comuni, il materiale viene prodotto in sottili dischi di diametro variabile a seconda della tecnologia, tra 3cm sino 10cm, o oltre. Lo spessore è dell’ordine dei micron, da uno a oltre mille (diversi millimetri).
Per poter rivelare la radiazione, si usano diversi metodi, i più comuni sono il semplice deposito di films che costituiscono gli elettrodi a cui applicare il campo elettrico, oppure il deposito di composti più complessi per ottenere dei contatti adeguati al fine di raccogliere sufficiente carica e non avere una carica da rumore di fondo troppo elevata. Nel caso del Diamante ad esempio si può usare il primo metodo , mentre con il Silicio drogato (tipo “n” o “p”) si usano le giunzioni, ovvero configurazioni elettriche tipo “diodo”.
Questi costituiscono comunque degli elettrodi ed il rivelatore è detto a ionizzazione. Gli elettrodi possono essere di diversa forma, ad esempio lunghe strisce o rettangoli o quadrati, con dimensioni comprese tra i dieci e diverse centinaia di micron (vedi rivendicazioni). Possono essere strutture ripetute sino a coprire un’intera superficie del disco.
Tutto ciò è di dominio comune. I vantaggi della presente invenzione risiedono nell ’utilizzo di tali materiali per la rivelazione della radiazione che attraversano il biochip.
Quindi il campo della presente invenzione riguarda l’utilizzo di questi rivelatori con i biochip. In particolare l’adeguamento del materiale per l’ottimizzazione del segnale. L’adeguamento delle dimensioni dell’elettrodo (o nel seguito “pixel”), a quelle dell’interdistanza tra i siti di presunta o avvenuta ibridizzazione. L’adeguamento delle dimensioni del disco, successivamente tagliato a dimensioni utili a quelle utilizzate nel biochipe per il deposito delle sonde. Tali rivelatori a pixel su semiconduttore sono relativamente poco utilizzati e la loro commercializzazione è ristretta. Correntemente vengono anche chiamati rivelatori CMOS (Combined Metal Oxide Silicon) ma non vi è nell’uso corrente del temine una definizione univoca di essi. Questa terminologia è impropria e non viene adottata qui. La presente invenzione include comunque questi ultimi nella accezione di più largo uso, essendovi tra i rivelatori più volte descritti qui combinazioni di metalli ed ossidi su silicio.
Tutti questi rivelatori possono essere letti con comuni strumenti di laboratorio che misurano nei siti ibridizzati una variazione di quantità di carica o di corrente (quantità di carica nel tempo) rispetto a quella dei siti non ibridizzati. Non solo si misura che vi è la variazione ma viene anche misurato quanto vale. Questa rivelazione è parte integrante di questa invenzione (vedi rivendicazioni). Questo consente di valutare in quale posizione e quante sono le molecole che hanno ibridizzato. Quanto ed in quali siti fornisce la valutazione dell’espressione.
Il sistema di digitalizzazione dell’avvenuta rivelazione
Il campo della presente invenzione copre anche, ma non ne fa un requisito essenziale, il sistema di lettura basato su un circuito elettronico integrato (VLSI) (vedi rivendicazioni) per la digitalizzazione dell’ informazione dell’ibridizzazione. Questo viene descritto in dettaglio nel paragrafo seguente ma deve essere tenuto da conto che è incluso nelle rivendicazioni ma non costituisce l' unico sistema possibile per la digitalizzazione dei segnali per la rivelazione simultanea dei siti di ibridizzazione.
Le caratteristiche funzionali del circuito dipendono dalle caratteristiche del sistema. In particolare dal tipo di sonde e bersagli utilizzati, quindi dal tipo di radiazione e da quale potenza la sorgente di radiazione ha. Il circuito avrà diverse caratteristiche anche a seconda dell’ applicazione se i marcatori sono inclusi o meno e quali sono.
Il circuito può raccogliere la carica per un intervallo che varia tra le decine di nanoecondi ed i millisecondi.
Può trasferire la variazione di corrente o di carica e consente di contare quanti fotoni hanno effettivamente raggiunto il rivelatore. Il valore dell’energia di ognuno di essi (ovvero della sua lunghezza d’onda) viene dedotto attraverso una disposizione di transistor opportuna e già diffusa. La sua applicazione alla radiazione che ha attraversato il biochip costituisce uno dei campi di innovazione della presente invenzione (vedi rivendicazioni).
Il circuito, realizzato dall’industria su qualsiasi tecnologia si ritenga adatta (le attuali vengono definite come 0,6 micron sino a 0,13 micron), dipende soprattutto dalle proprietà geometriche del biochip in esame. Dopo essere stato prodotto anch’esso su disco di semiconduttore (può avere la stessa dimensione o più grande o più piccolo, in tal caso viene disposto a tasselli) viene tagliato ed assemblato al rivelatore attraverso tecniche di saldatura industriali. Metodi disponibili in commercio di trasferimento ad un sistema ulteriore di processamento dell’informazione, sino alla sua visualizzazione su uno schermo, come ad esempio un personal computer, possono essere adottati. Queste soluzioni sono da intendersi esempi e non usi esclusivi per i quali vale l’invenzione (vedi rivendicazioni).
Precedenti lavori scientifici nel campo e confronto con brevetti, pubblicazioni e sistemi in commercio
I sistemi in commercio.
I sistemi attualmente commercializzati per la lettura dell’espressione e sperimentalmente per la lettura della sequenza, sono quasi tutti basati su marcatori a parte alcuni che sfruttano la spettrometria di massa, un sistema molto costoso e poco flessibile, comunque non adatto alla rivelazione simultanea. Esempi sono quelli delle società che utilizzano sostanze fluorisicinanti come Affymetrix, Molecular Dymanics, Nanogen, Protogene, Synteni, o anche radioattive, come Hyseq, Incyte od anche con spettrometri di massa, Brax, Sequenom. Tutti questi sistemi sono molto costosi e richiedono tempo per la preparazione e per la scansione. I sistemi più avanzati e rapidi sono quelli della Virtek e Asper. Quest’ultimo, ancora in fase sperimentale utilizza un rivelatore a CCD (Charge Coupled Device) lento in risposta di almeno 1000 volte quello qui proposto, costoso, e che necessita di raffreddamento. Nessuno di questi effettua la rivelazione simultanea di tutti i siti per dimensioni standard di vetrino tali che si possa parlare di “biochip array” come inteso in tecnologia corrente, ovvero di 1 o 2 cm di lato e con migliaia di sonde attaccate. Ovvero nessuno copre il campo di questa invenzione che si indirizza alla rivelazione simultanea e multipla. Dove per multipla, per esempio e tecnica corrente, ma non per limitazione, si intendono appunto migliaia di siti. L’attuale tecnologia del rivelatore proposto qui consentirebbe anche 5 Milioni di siti di rivelazione o oltre. Resta inoltre valido il già discusso altro vantaggio della possibilità della rivelazione senza marcatori.
Brevetti in campi affini.
I precedenti brevetti in campi affini a quello della presente invenzione sono stati registrati ma non tutti ancora approvati o non ne è stata data comunicazione pubblica. Vengono qui comunque citati i più significativi e la differenziazione della presente invenzione rispetto alle rivendicazioni in essi contenuti.
In WO9607917 depositato per Montgomery et al da Nanogen e pubblicato il 14/3/96 si rivendica un sistema elettronico con pluralità di elettrodi per la rivelazione di processi molecolari ma la rivelazione avviene per induzione elettrica, ovvero trasporto di cariche o corrente da una posizione in corrispondenza del sito di ibridizzazione ad una di circuito di raccolta (figura 2.b) e non simultaneamente. In particolare il circuito di raccolta previsto non segue la geometria a pixel come nel caso di questa invenzione. Inoltre il brevetto presentato è finalizzato ad un sistema (figura 6) che include anche la preparazione del campione in analisi tra cui la PCR. La presente invenzione include anche l’analisi di campioni biologici in cui la PCR non è stata effettuata.
In W09932877 depositato per Li et al da Spectrumedix e pubblicato il 1/7/99 si rivendica un sistema di rivelazione che comprende un separatore di fascio a gradini (TGBS “Transmission Grating Beam Splitter”) (figura 1) che raccoglie e riemette il fascio verso un rivelatore capace di distinguere i siti di ibridizzazione dall’analisi delle figure di interferenza raccolte da una camera CCD. La presente invenzione si differenzia da quella di Li et al in quanto la rivelazione è per radiazione di qualsiasi tipo, non solo ottica (rivelazione per fotoni in intervalli di lunghezza d’onda intorno ai 500-1000nm). Inoltre Li et al effettuano tale rivelazione solo su sostanze fluoriscinanti.
In US5571410 depositato per F.Bek et al da Hewlett Packard e pubblicato il 24/4/96, il sistema di rivelazione non è specificatamente incluso nelle rivendicazioni che riguardano un metodo e sistema di analisi per separazione di molecole biologiche e non. E’ previsto che tra i metodi di rivelazione vi siano quelli basati su assorbimento diretto e con marcatori ma non per siti di ibridizzazione, né per molecole attaccate a supporti, bensì esse sono in moto. Bek et al rivendicano il sistema “Micro-Tas” in generale nelle sue configurazioni e metodi di costruzione ed implementazione non la rivelazione.
Un altro esempio di brevetto sulla rivelazione in sistemi a “biochip array” o “array biochimici” come citato, è US5633724 depositato per D.King et al da Hewlett Packard e pubblicato il 27/5/97. Si basa su scansione e metodo di rivelazione della luce per variazioni di fase della radiazione elettromagnetica dopo attraversamento di materiali. Rispetto alla presente invenzione il sistema di rivelazione non è di irraggiamento del campione, né effettua la rivelazione simultaneamente, né in contemporanea all’irraggiamento. In King et al rirraggiamento può anche avvenire simultaneamente ma la rivelazione è a scansione e comunque non diretta. Si effettua la rivelazione della parte di radiazione successiva alla riflessione interna (TIR “Total Internai Reflection”) sulla superficie interna del substrato su cui sono depositate le molecole. Al contrario nella presente invenzione la radiazione raggiunge il rivelatore dopo aver attraversato il supporto (o substrato).
In S.Hassard et al US6017435 depositato da Imperiai College e pubblicato il 14/11/96, la rivelazione è finalizzata all’elettroforesi ed a molecole in movimento. Essa avviene per assorbimento e prevede la lettura della risposta si/no alla presenza delle molecole. S.Hassard et al non prevedono la possibilità di usare rivelatori a pixel con lettura di carica o corrente integrata. Ovvero il rivelatore a pixel è “digitale” non “analogico”. Non prevede la possibilità di misurare l’assorbimento ma solo di affermare che è avvenuto ovvero rivelarne la presenza identificando zone d’ombra o luce attraverso la quale le molecole sono passate. Può indicare tale evento come variazione di corrente rispetto ad un livello definito ma non quantifica la massa molecolare. Non prevede inoltre l’applicazione a “biochip arrays” né l’estensione può essere considerata ovvia mancando la capacità di concepire un sistema come quello della presente invenzione in cui non solo la posizione per l' identificazione nello spazio è rivendicata, ma la quantificazione quanta massa molecolare è presente in quella posizione. Questo è possibile nella presente invenzione grazie alla lettura analogica della carica del rivelatore attraverso il circuito elettronico ed è comunque rivendicata in quanto misura che non è ovviamente concepibile da persone anche esperte della materia. Inoltre in S.Hassard et al la rivelazione è finalizzata e presuppone lo spostamento delle molecole in analisi. Comunque l’invenzione di S.Hassard et al, è largamente coperta da precedenti pubblicazioni sull’”imaging” molecolare riportate sotto.
Vari brevetti delle società citate prima coprono i metodi di deposizione di molecole in geometria di matrice e relativa lettura. Essi, come detto, sono molto specializzati. Il sistema di lettura o rivelazione è specifico per quello di deposizione. Un esempio sono i brevetti registrati dalla Affymetrix che riguardano tali sistemi molti dei quali collegati tra loro come continuazione l’uno dell’altro. Ad esempio US5968740 di S.Fodor et al depositato da Affymetrix, descrive un metodo di identificazione dei siti e dell’uso del grado di espressione. La lettura viene descritta come da figura 13, un sistema a scansione con marcatori. Nessuno di questa serie di brevetti Affymetrix si sovrappone con la presente invenzione che non riguarda strettamente la lettura di informazioni di carattere biologico (ad esempio una mutazione dal confronto di diversa espressione tra diversi siti di ibridizzazione), bensì quella della identificazione dei siti e quantificazione della ibridizzazione.
L’informazione da elaborare per considerazioni di carattere genetico o altro, non è rivendicata nella presente invenzione.
La presente invenzione è invece intesa di carattere generale ed applicabile ad una vasta gamma di composti biologici, comunque depositati e su qualsiasi delle superfici attualmente in uso (polimeri, vetri, cristalli etc... tutti rivestiti e/o trattati e non) (vedi rivendicazioni).
Pubblicazioni in campi affini:
vengono qui citate le più significative tra le pubblicazioni in campi affini precedenti alla presente invenzione di cui è stata data comunicazione pubblica nonché la differenziazione della presente invenzione rispetto alle rivendicazioni in esse contenute.
La rivelazione mediante irraggiamento con radiazione elettromagnetica di sostanze molecolari è nota sin dagli albori della biologia molecolare. La radiazione descritta in un campo limitato di applicazione della presente invenzione neH’intervallo tra c.a 190nm e 300nm (EUV) descritto prima e quello tra c.a 300nm e c.a 700nm (UV) è correntemente utilizzata. In particolare va sotto il nome di “imaging” molecolare o semplicemente imaging in UV intendendo spesso l’intervallo più propriamente indicato qui come EUV.
Tali metodi sfruttano il principio fisico dell’assorbimento delle molecole marcate o meno con marcatori più o meno dannosi (EtBr, P etc..). Ad esempio P.Clarke et al (Analytical Biochemistry 124, 88-91 (1982)) “Ultraviolet Imaging: a simple method for detecting nucleic acids in preparative gels”, lo descrivono per i gel elettroforetici. Si basano comunque su lavori di misure di assorbimento effettuate tra gli altri da M.N.Kiseleva et al (Biofizika 20: No. 4, 561-565, 1975) “Absorption spectra of nucleic acids and related compounds in thè spectral region 120-280nm”. Ovvero su un fenomeno fisico ben noto e misurato su cui si basa una parte della presente invenzione. Analogamente S.M.Hassur et al (Analitycal Biochemistry 59, 162-164 (1974)) “UV shadowing- a new and convenient method for thè location of ultraviolet-absorbing species in polyacrylamide gels”.
Queste pubblicazioni si riferiscono alla identificazione di frammenti di molecole di diverse natura (acidi nucleici e composti analoghi) in gel. La pubblicazione di M.N.Kiseleva et al fornisce una misura più generale ma non presenta alcun sistema o idea. D’altronde all’epoca nemmeno si poteva concepire la possibilità di depositare sonde molecolari in spazi di qualche micrometro. Quindi non vi è alcuna ovvia estensione che si sia potuta fare prima della presente invenzione.
In A.Mahon (IEEE NSS Conf. Ree. 3, 1462 (1996)) il metodo di S.Hassard et al è presentato con esempio di rivelazione delle molecole grazie al loro movimento. Quindi non si sovrappone affatto alla presente invenzione.
In A.Mahon et al (Phys. Med. Biol. 44 (1999) 1529-1541) sono presentati i risultati della rivelazione dell’ avvenuto assorbimento di frammenti di DNA in elettroforesi mediante rivelatori a CCD, come in S.Hassard et al. Il sistema non è abbastanza sensibile per rivelare la differenza di una coppia di basi, differenza necessaria alla determinazione della sequenza. Questi risultati sono un’ulteriore conferma della validità del sistema con rivelatori a lettura analogica diretta a pixel, parte integrante della presente invenzione. Inoltre A.Mahon et al presentano un limite di rivelabilità dipendente dalla massa, di c.a lng. Tale limite non costituisce pregiudizio alla presente invenzione. Il sistema di rivelazione presentato qui può rivelare frammenti di dimensioni più piccole ed il limite, di ordini di grandezza inferiore, dipende dal sistema nel suo complesso, non solo dal rivelatore.
Si conclude quindi che è documentata la novità della presente invenzione, esposta in dettaglio nelle rivendicazioni e testo sopra, quando riferita allo stato dell’arte, per quanto siano date le informazioni accessibili all’autore.
Esempio di sensibilità misurata
Come esempio della sensibilità del sistema, non limitante, del campo di validità della presente invenzione (vedi rivendicazioni) si riportano misure di corrente in rivelatori a silicio ad alta resistività con giunzioni a semiconduttore impiantate e polarizzando il rivelatore con una tensione di alimentazione inversa. Per un frammento di DNA di 70 paia di basi si rivela una variazione di corrente tra illuminazione con e senza dell’ordine di InA e di 20nA per 250 paia di basi a 260nm c.a. Per frammenti di oligonucleotidi ibridizzati in vetro tipo “Corning glass”, si è rivelata una variazione di corrente di c.a 100nA.
FIGURE
DESCRIZIONE DEI DISEGNI
Nell’esempio numero la:
Lo schema 1001 a sinistra è di un rivelatore a matrice di pixel 1002 che include o meno linee di alimentazione 1003 per raccogliere i segnali e portarli all 'esterno nel circuito elettronico; dove i pixel hanno una interdistanza 1004 qualsiasi entro qualche micron da lato a lato e tra le decine e centinaia di micron da centro a centro 1005. I pixel rappresentano elettrodi o più complesse impiantazioni 1006 (vedi rivendicazioni e descrizione) su disco o wafer quadrato o rettangolare di materiale semiconduttore.
Nell’esempio numero 1b:
Lo schema a destra è un esempio di disegno di matrice (“biochip array”) 2001 dove i siti di adesione di sonde da sole 2002 e quelli di adesione tra sonda e bersaglio 2003 hanno posizione differente. Le inter-distanze 2004 sono pari a quelle tra pixel del rivelatore. Le dimensioni di ogni lato 2005 seguono quelle del rivelatore ma non necessariamente sono pari, essendo tali da alloggiare abbastanza siti almeno quanti sono i pixel del rivelatore. I bordi 2006 del biochip e del rivelatore 2007 dipendono da semplici vincoli costruttivi e sono tali da consentire la sovrapposizione del rivelatore e del biochip. Il disegno non è in scala. Le dimensioni dei lati 2005 risiedono nell’intervallo tra qualche millimetro a decine di centimetri.
Nell’esempio numero 2a:
la figura superiore descrive il sistema senza l’uso dei marcatori, dove la sorgente 3001 è una lampada a scarica, elettrodi o a plasma oppure è un laser a gas, a semiconduttore o a plasma (vedi descrizione e rivendicazioni), comunque emettente in una o più delle lunghezze d’onda di assorbimento massimo per l’organismo di cui le molecole irraggiate sono composte. Nell’esempio sonde 3002 soltanto oppure sonde e bersagli ibridizzati 3003 sono irraggiati. La radiazione 3004 attraversa prima queste, poi i biochip poi raggiunge il rivelatore. II rivelatore 3005 consiste di semiconduttore ionizzato in cui le cariche vengono raccolte e trasferite al circuito integrato 3006 di digitalizzazione in grado di quantificare la quantità di energia di radiazione assorbita.
Nell’esempio numero 2b:
la figura inferiore descrive il sistema senza l’uso dei marcatori, dove la sorgente 4001 è una lampada a scarica, elettrodi o a plasma oppure è un laser a gas, a semiconduttore o a plasma (vedi descrizione e rivendicazioni), comunque emettente in una o più delle lunghezze d’onda di assorbimento e riemissione massimi per il marcatore con cui le molecole dell’organismo o composto irraggiato sono miscelate. Nell’esempio sonde 4002 soltanto oppure sonde e bersagli ibridizzati 4003 sono irraggiati. La radiazione 4004 attraversa prima queste, poi i biochip poi raggiunge il rivelatore. Il rivelatore 4005 consiste di semiconduttore ionizzato in cui le cariche vengono raccolte e trasferite circuito integrato 4006 di digitalizzazione in grado di quantificare la quantità di energia di radiazione per lunghezza d’onda..
Nell’esempio numero 3a:
il circuito 5001 è un circuito elettronico VLSI , gli elementi sferici 5002 sono saldature al rivelatore 5003, disposto superiormente al circuito, sotto il biochip 5004 rappresentato in trasparenza con oligonucleotidi 5005. In corrispondenza di ogni quadrato 5006 vi sono sonde con o senza bersagli.
La scheda 5007 di ulteriore digitilizzazione trasferisce i dati ad un elaboratore incluso o meno nella circuiteria. Nell’esempio numero 3b sono mostrati gli stessi elementi, ora assemblati, descritti nell’esempio 3a. Le dimensioni seguono quelle degli esempi la e lb. La vista in 3a è esplosa.
Nell’esempio numero 4:
Visualizzazione schematica del sistema finale, come esempio, non univoco. E’ indicata la sorgente UV descritta 6001, i siti di ibridizzazione 6002, su (esempio) vetro 6003 i circuiti assemblati al rivelatore 6004.

Claims (8)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo di rivelazione della posizione di molteplici siti di ibridi zzazione di composti molecolari caratterizzato dal fatto di operare tale rivelazione contemporaneamente in migliaia di siti differenti, con sistema di rivelatore a microelettrodi sensibile alla radiazione elettromagnetica incidente direttamente dalla sorgente al supporto delle molecole ibridizzate e quindi sul rivelatore dopo averlo attraversato. Il supporto contiene delle sonde depositate e dei bersagli ibridizzati, rimasti attaccati dopo il lavaggio.
  2. 2. Metodo e sistema che rivela la posizione simultanea di sonde soltanto e/o sonde più bersagli e ne quantifica la composizione molecolare.
  3. 3. Il metodo di cui 1 e 2, in cui i composti molecolari sono frammenti di DNA.
  4. 4. Il metodo di cui 1 e 2, in cui i composti molecolari sono frammenti di RNA.
  5. 5. Il metodo di cui 1 e 2, in cui i composti molecolari sono sistemi ibridi tipo PNA (Peptide Nucleic Acid).
  6. 6. II metodo di cui 1 e 2, in cui i composti molecolari sono frammenti di proteina.
  7. 7. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2, con circuito elettronico integrato (VLSI, “Very Large Scale Integrated”) di amplificazione e trasformazione per lettura digitale direttamente saldato sul rivelatore 8. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 con circuito elettronico di lettura direttamente cresciuto insieme al rivelatore. 9. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 con circuito elettronico di lettura VLSI direttamente incollato con materiali conduttivi al rivelatore. 10. Il metodo ed il sistema di rivelazione di cui 1 e 2, con sorgente di radiazione elettromagnetica nell 'intervallo di energia da leV a 6 eV. 11. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 con sorgente di radiazione da processo nucleare. 12. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 con sorgente di radiazione da laser. 13. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 con sorgente di radiazione da lampada con scarica a gas. 14. Il metodo ed il sistema di cui 1,2 e 12 in cui il laser è a semiconduttore. 15. Il metodo ed il sistema di cui 1,2 e 12 in cui il laser è a gas 16. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 in cui i microelettrodi del rivelatore sono costituti da giunzioni su materiale semiconduttore 17. E metodo ed il sistema di cui 1 e 2 e 16, in cui il materiale semiconduttore è Silicio ad alta resistività. 18. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 e 16, in cui il materiale semiconduttore è Diamante sintetico 19. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 e 16, in cui il materiale semiconduttore è composto a base di Gallio. 20. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 e 16, in cui il materiale semiconduttore è composto contenente Gallio ed Alluminio. 21. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 e 16, in cui nel semiconduttore sono impiantate dei contatti tali da formare giunzioni in configurazione di tipo diodo. 22. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 in cui i microelettrodi hanno una inter-distanza pari a quella dei siti di ibridizzazione da centro a centro. 23. Il metodo ed il sistema di cui 1, 2 e 22, in cui l’inter-distanza tra i siti e/o i microelettrodi è nell’intervallo tra 10 micrometri a 1 centimetro. 24. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 e 7 in cui il circuito elettronico di lettura trasforma la carica in corrente elettrica 25. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 e 7 in cui il circuito elettronico di lettura trasporta la carica direttamente al sistema di amplificazione con o senza un filtro capacitivo e/o resistivo. 26. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 in cui i bersagli contengono sostanze fluoriscinanti adatte alla sorgente. 27. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2, in cui i bersagli contengono sostanze radio-stimolabili (esempio Fosforo) adatte alla sorgente 28. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2, i bersagli non contengono sostanze fluoriscinanti né radiostimolabili né sono marcate in altro modo. 29. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 ed il supporto per le sonde è vetro con film sottili di altro materiale. 30. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 e 25 ed il supporto per le sonde è polimero plastico. 31. Il metodo di cui 1 e 2, in cui i composti molecolari sono oligonucleotidi sintetici. 32. Il metodo di cui 1 e 2, in cui i composti molecolari sono oligopeptidi sintetici. 33. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 in cui i bersagli sono molecole purificate ma non amplificate con “PCR” (“Polymerase Chain Reaction”). 34. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 in cui i bersagli sono molecole purificate ed amplificate con “PCR” (“Polymerase Chain Reaction”). 35. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 in cui i bersagli sono molecole senza trattamento come semplici estratti di lisato cellulare. 36. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 in cui prima, tra e dopo il supporto sia interposta una lente od un sistema di più di esse. 37. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 in cui prima, tra e dopo il supporto sia interposto un sistema di micro-lenti in materiale adatto a far passare il massimo della intensità della radiazione incidente.
  8. 8. Il metodo ed il sistema di cui 1 e 2 in cui prima, tra e dopo il supporto sia interposto un sistema a monocromatore o filtri per la selezione della energia passante, in materiale adatto a far passare il massimo della intensità della radiazione incidente.
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