JP2014143960A - 分析装置 - Google Patents
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Abstract
Post-Lightシーケンサを用いた遺伝子解析では塩基配列解析自体は2時間で終了するのに対し、塩基配列解析の前処理であるEmulsion PCRには11時間を要し、この工程がDNA塩基配列解析作業の律速となっている。しかしながら、現在まで、 Emulsion PCRに依存せずに、センサ真上にDNAクラスターを配置する手法が存在しなかった。
【解決手段】
基板上に同一のプライマから構成されるプライマ群が格子状に区画化された状態で固定し、隣り合ったプライマ群は直接接触せず、各プライマ群の間にはプライマが存在せず、かつDNA断片が非特異吸着しない領域で仕切られている。各プライマ群は各微小センサの真上に、それぞれ1:1で配置され、基板上のプライマ群に対して相補的に結合するように末端処理を施したDNA断片を1分子のみ吸着させる。
【選択図】図3
Description
1) 高価な光学系(撮像素子、励起用光源、対物レンズなど)が不要
2) ヌクレオチドやプライマなどに蛍光色素の修飾が不要
3) 200塩基長以上の読み取りが可能
4) 2時間のターンアラウンドタイム(TAT)
5) 半導体プロセスの拡張性
という点を挙げることができる。
1) DNA断片のエマルジョン化 (1時間)
2) ビーズ上での DNA 増幅反応 (5時間)
3) 反応ビーズの濃縮 (5時間)
これらの時間は合わせて11時間を要する。
a) プライマ被覆部201上にプライマ202が規則的に区画化された状態で配置されている。各プライマ202が固定化されたパネル間の間隔は一定である。
b) 増幅したいDNA断片203を外部よりフローセルに注入し、基板上のプライマ202と注入したDNA断片203をハイブリダイゼーションさせる。
c) ハイブリダイズしたDNA断片203を鋳型として、基板上のプライマ202が伸長し、増幅断片204となる。
d) 伸長反応は60℃前後に保たれた状態で進行する。この温度はプライマ202とDNA断片205の結合におけるTm値に近いため、DNA断片205はプライマ上を移動し、別なプライマ202と結合する。これが別の新たなプライマ202分子に対して鋳型を提供することになり、伸長反応が継続する。また、プライマ202を起点として伸長が完成したDNA断片の3’末端側にプライマ206はハイブリダイゼーションする。プライマ206を起点にDNA断片の相補鎖の伸長反応が進行する。
e) 増幅反応が数サイクル進行する。
f) 基板上のプライマが枯渇するまで増幅反応は進行する。また、例えばDNA断片のハイブリが発生しなかったパネルでは増幅は進行しないままでパネルが残る。
g) 増幅工程が完了する。
a) 基板にはプライマ被覆部301が形成され、その上にはプライマ302が高密度で固定されている。また、ピラー303は基板上に規則正しく配置されている。ピラー上部の304においてはDNA断片が吸着しないように、パッシベーション膜の処理が施されている。
b) 2つのピラーに挟まれたウェル空間内にDNA断片305が1分子あるいは0分子供給されるように投与サンプルの濃度調整を行う。ピラー304上のプライマ302とハイブリしたDNA断片1分子は増幅反応を開始する。なお、増幅時の温度は約60℃である。
c) 第3の実施例で説明したようにDNA断片305はプライマ302と結合し、DNA断片305を鋳型として結合したプライマが伸長する。伸長反応が完了したDNA断片305は隣接するプライマ分子に移動し、隣接したプライマが伸長を始める。また、伸長反応が完了したプライマの3’末端にはプライマが結合し、基板方向に伸長を開始する。この反応を繰り返すことにより、DNA断片305を結合したウェル内壁においてプライマ302と同等の密度で増幅させることができる。また、ピラー上部にはパッシベーション膜304が施されているため、プライマ302は存在しない。このため、ピラー303を乗り越えたDNA増幅は発生しない。
002…フローセル
003…ペルチェ素子
004…ヒートシンク
005…ファン
006…プライマ被覆部
007、104…DNAクラスター
008、304、608…パシベーション膜
010、610…イオン感応型電界効果トランジスタ(ISFET)
011、611、711…試薬注入口
012、612、712…試薬排出口
013…PC
014…試薬送液機構
015…制御バルブ
016…廃液タンク
101…基板
102、104…パネル
103、305…1分子のDNA断片
201、301、606…プライマ被覆部
202、206、302…プライマ
203…DNA断片
204…プライマが伸長したDNA増幅断片
207、306、707…増幅反応が完了したDNAクラスター
303…ピラー
701…ケージド化合物で修飾されたdATP
702…ケージド化合物で修飾されたdCTP
703…ケージド化合物で修飾されたdGTP
704…ケージド化合物で修飾されたdTTP
708…薄膜
710…温度センサ
713…プリズム
715…UVレーザー
714…UVレーザー光
Claims (9)
- 基板内に規則正しく格子状に配置された2個以上のセンサと、そのセンサ真上に配置された分子群と、分子群と分子群の間に配置された非特異吸着防止膜と、基板を温度調節できる機構を持つことを特徴とする分析装置。
- 請求項第1項記載の分析装置において、基板に溶液を供給できる機構を備えることを特徴とする分析装置。
- 請求項第1または2項記載の分析装置において、前記分子群がDNAであって、前記センサと相補的な塩基配列を持つ外来DNA1分子を捕捉し、かつ温度調節による増幅反応を行うことができることを特徴とする分析装置。
- 請求項第2または3項記載の分析装置において、前記溶液に酵素、プライマおよび4種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)を含むことを特徴とする分析装置。
- 請求項第1ないし4項のいずれか記載の分析装置において、前記温度調節する機構の調節温度範囲が0℃〜100℃であり、前記基板上でPCRに必要なサーマルサイクル、あるいは等温増幅反応を行うための温度制御が可能であることを特徴とする分析装置。
- 請求項第1ないし5項のいずれか記載の分析装置において、前記センサが基板上の化学反応に伴って放出されるイオンあるいは熱を検出することができる半導体センサであることを特徴とする分析装置。
- 請求項第1項記載の分析装置において、基板が光透過性を持ち、基板に紫外線を全反射条件で入射することができる光源を備えることを特徴とした遺伝子解析装置。
- 請求項第7項記載の分析装置において、前記溶液に酵素、プライマおよびケージド化合物で修飾された4種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)を含むことを特徴とする分析装置。
- 請求項第8項記載の分析装置において、センサ真上の分子群に取り込まれたデオキシリボヌクレオチド三リン酸のケージド化合物を紫外線により分解し、反応の進行を制御することができることを特徴とする分析装置。
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