CN104849439B - 一种高效检测纳米颗粒肾毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种高效检测纳米颗粒肾毒性的方法，该方法包括如下步骤：1）制备图案化纤维电纺接收板，利用光刻蚀技术和直流磁控溅射技术，制备具有图案化金属银层的接收板；2）制备图案化电纺纤维，利用步骤1）所得物进行静电纺丝；3）制备PDMS腔体；4）将步骤2）和步骤3）所得物用等离子处理进行连接；5）将原代小鼠肾小管上皮细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，再将纳米颗粒泵入,于纳米颗粒泵入后20天内记录各种毒毒性指标。本发明可以实现高效、高精度的纳米颗粒肾毒性检测，检测效果与体内动物实验一致；相对于体内动物实验更加快捷。
Description
技术领域
本发明属于纳米颗粒毒性检测领域，具体涉及一种高效检测纳米颗粒肾毒性的方法。
技术背景
随着纳米技术产业化进程，许多纳米材料已经大规模生产并应用于涂料、化妆品、催化剂、新型材料、医学等领域，人们在不知不觉中暴露在有纳米物质存在的环境中。特别是近年来，纳米材料在直接关系到人身安全和健康的医药领域的快速发展，使纳米材料的安全性引起了各方面的格外关注。
纳米材料具有的独特理化性质决定了其独特的生物学效应，诸多研究已表明纳米物质可能具有与常规尺寸物质不同的毒性。
尤其在生物医药领域，纳米颗粒常常用作药物输送的载体，全面快速的检测所用纳米颗粒的毒性，尤其是细胞毒性，显得十分重要。
肾是人体的重要器官，能否精确高效的评价纳米颗粒的肾毒性是判断所用纳米颗粒是否适用于生物医用的重要内容。
在现有技术中，评价纳米细胞的肾毒性的常用方法为进行纳米颗粒毒性的动物实验。然而进行动物实验，所需检测周期长，同时常会由于实验动物的个体差异造成检测误差。现有技术中用于替代动物实验的体外实验，步骤繁琐，容易由于操作失误造成误差，精确度难以保证。
因此，如何实现高效、快捷、高精度的对纳米颗粒肾毒性的检测，成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高效检测纳米颗粒肾毒性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状包括圆形阵列、椭圆形的一种，圆形半径为100 μm-500μm，椭圆长轴为200 μm-600μm，短轴为100 μm-300μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备圆形或椭圆形的图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为300-500 nm；
所述医用高分子聚合物包括聚乳酸、聚己内酯、聚氨酯、聚丙烯腈中的一种，所述有机溶剂包括丙酮、二甲基甲酰胺中的至少一种；
3）将负性环氧树脂型近紫外线光刻胶SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，保留宽为40-550μm、高为30-80μm的SU-8长方体作为模具，去掉其余的SU-8，；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4）将步骤2）和步骤3）所得物在O2 或N2的氛围下，用等离子体处理30秒，使得步骤2）和步骤3）所得物紧密连接；
5）将0.5×106-1.5×106个原代肾小管上皮细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.2-0.5 ml/h；再将纳米颗粒悬浮于PBS后泵入,于纳米颗粒泵入后，记录原代肾小管上皮细胞的存活率、细胞形态学、乳酸脱氢酶、谷胱甘肽、丙二醛、超氧化物歧化酶的测定结果、细胞凋亡和周期的变化、细胞内氧自由基、酶活力、特征基因表达水平，得出纳米颗粒的毒性；
所述纳米颗粒包括纳米四氧化三铁、纳米二氧化钛、纳米氧化锌、纳米二氧化硅、纳米银颗粒中的一种。
本发明通过大量的实验摸索发现，当选用直径为300 nm的电纺纤维，并将纤维膜的图案设置为圆形或椭圆形，以及设置PDMS腔体的尺寸为宽为40-550μm、高为30-80μm时，可使得小鼠原代肾小管上皮细胞在腔体内很好的生长，并对纳米颗粒产生几乎与动物实验相同的毒性反应。
本发明可以使得图案化纤维和PDMS腔体和玻璃基底无缝紧密贴合，保证了纳米颗粒完全的与细胞接触，确保了检测的精确度。同时，由于图案化纤维膜紧密的与基底和腔体贴合，使得本发明可以具有很好的重复操作性，节省了检测的成本。
重要的是，任何根据本发明作出的可预计的改变，如微调图案形状和PDMS大小，均属于本发明的保护范围。
特别需要指出的是，本发明适用于检测纳米颗粒的肾毒性。根据本领域的常识，应理解本发明适用于任何纳米颗粒的肾毒性检测。应理解本发明所列举的几种纳米颗粒仅仅用于证明本发明适用于纳米颗粒的肾毒性检测，不应理解为对本发明的限定。
本发明中，步骤1）沉积的金属银可以制备成任何形式的阵列，只需阵列中的图形为本发明所述的圆形或椭圆形即可。
优选的，所述步骤1）中沉积的金属银的形状为椭圆形，椭圆长轴为200 μm-600μm，短轴为100 μm-300μm。当所沉积的金属银的形状为椭圆形阵列时，原代肾小管上皮细胞具有更好的生长状态，更有利于纳米颗粒的肾毒性的检测。
所述步骤2）中，进行电纺时，电压为15-25 KV，流速为0.5-1.0 ml/h。
优选的，所述步骤2）中，纤维的直径为300 nm。当所用纤维的直径为300 nm时，原代肾小管上皮细胞具有更好的生长状态，更有利于纳米颗粒的肾毒性的检测。
所述步骤2）中的医用高分子聚合物为聚乳酸，所述有机溶剂为丙酮与二甲基甲酰胺的混合溶液，丙酮与二甲基甲酰胺的体积比为9:1。当纤维为聚乳酸纤维时，原代肾小管上皮细胞具有更好的生长状态，更有利于纳米颗粒的肾毒性的检测。
优选的，所述步骤3）中的模具的宽为200μm，高为50μm。
更优选的，所述步骤3）中的模具的宽为50μm，高为80μm。检测腔道越小，越集成化，可以实现一个检测装置具有多个腔道，实现更多组平行实验的进行，更加确保检测的精确度。在现有技术中，尚未发现可以制备如此小的、基于电纺纤维膜进行肾毒性检测的腔体。
所述步骤5）中，用于接种的原代肾小管上皮细胞的数目为1×106个。
所述步骤5）中，培养基的流速为0.3 ml/h。
本发明的有益效果：
1、本发明可以实现高效、高精度的纳米颗粒肾毒性检测，检测效果与体内动物实验一致；相对于体内动物实验更加快捷；
2、本发明所用原料易得，成本低，所用的技术成熟易实施，具有巨大的市场应用前景。
附图说明
图1为本发明所得图案化纤维。
具体实施方式
以下通过实施例的具体实施方式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。
实施例1
1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状为圆形阵列，圆形的半径为100 μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为500nm；
所述医用高分子聚合物为聚乳酸，所述有机溶剂为丙酮；
3）将SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，去掉其余的SU-8，保留宽为200μm、高为50μm的SU-8长方体作为模具；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4）将步骤2）和步骤3）所得物在O2 的氛围下，用等离子体处理30秒，使得步骤2）和步骤3）所得物紧密连接；
5）将0.5×106个原代肾小管上皮细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.2 ml/h；再将纳米颗粒悬浮于PBS后泵入,于纳米颗粒泵入记录原代肾小管上皮细胞的超氧化物歧化酶的酶活、谷胱甘肽过氧化物酶的活性、丙二醛含量、细胞DNA的损伤、细胞凋亡率的变化，得出纳米颗粒的毒性；
所述纳米颗粒为纳米四氧化三铁。
实施例2
1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状为椭圆形阵列，椭圆长轴为200 μm，短轴为100 μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为200nm；
所述医用高分子聚合物为聚己内酯，所述有机溶剂为丙酮；
3）将SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，去掉其余的SU-8，保留宽为40 μm、高为30 μm的SU-8长方体作为模具；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4）将步骤2）和步骤3）所得物在N2的氛围下，用等离子体处理30秒，使得步骤2）和步骤3）所得物紧密连接；
5）将1.5×106个原代肾小管上皮细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.5 ml/h；再将纳米颗粒悬浮于PBS后泵入,于纳米颗粒泵入记录原代肾小管上皮细胞的超氧化物歧化酶的酶活、谷胱甘肽过氧化物酶的活性、丙二醛含量、细胞DNA的损伤、细胞凋亡率的变化，得出纳米颗粒的毒性；
所述纳米颗粒为纳米二氧化钛。
实施例3
1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状为圆形阵列，圆形半径为200 μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为300nm；
所述医用高分子聚合物包括聚乳酸，所述有机溶剂为丙酮和二甲基甲酰胺的混合溶液，丙酮与二甲基甲酰胺的体积比为9:1；
3）将SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，去掉其余的SU-8，保留宽为500 μm、高为50 μm的SU-8长方体作为模具；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4）将步骤2）和步骤3）所得物在N2的氛围下，用等离子体处理30秒，使得步骤2）和步骤3）所得物紧密连接；
5）将1.0×106个原代肾小管上皮细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.3 ml/h；再将纳米颗粒悬浮于PBS后泵入,于纳米颗粒泵入记录原代肾小管上皮细胞的谷胱甘肽、丙二醛的含量、超氧化物歧化酶的测定、细胞DNA的损伤、细胞凋亡率的变化，得出纳米颗粒的毒性；
所述纳米颗粒为纳米氧化锌。
实施例4
1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状为椭圆形阵列，椭圆长轴为400 μm，短轴为200 μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为400nm；
所述医用高分子聚合物为聚氨酯，所述有机溶剂为丙酮；
3）将SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，去掉其余的SU-8，保留宽为550 μm、高为80 μm的SU-8长方体作为模具；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4）将步骤2）和步骤3）所得物在O2 的氛围下，用等离子体处理30秒，使得步骤2）和步骤3）所得物紧密连接；
5）将1.5×106个原代肾小管上皮细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.5 ml/h；再将纳米颗粒悬浮于PBS后泵入,于纳米颗粒泵入记录原代肾小管上皮细胞的超氧化物歧化酶的酶活、谷胱甘肽过氧化物酶的活性、丙二醛含量、细胞DNA的损伤、细胞凋亡率的变化，得出纳米颗粒的毒性；
所述纳米颗粒为纳米二氧化硅。
实施例5
1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状为圆形阵列，圆形半径为150 μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为500nm；
所述医用高分子聚合物为聚丙烯腈，所述有机溶剂为丙酮；
3）将SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，去掉其余的SU-8，保留宽为200 μm、高为50 μm的SU-8长方体作为模具；将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4）将步骤2）和步骤3）所得物在N2的氛围下，用等离子体处理30秒，使得步骤2）和步骤3）所得物紧密连接；
5）将1.0×106个原代肾小管上皮细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.3 ml/h；再将纳米颗粒悬浮于PBS后泵入,于纳米颗粒泵入记录原代肾小管上皮细胞的超氧化物歧化酶的酶活、谷胱甘肽过氧化物酶的活性、丙二醛含量、细胞DNA的损伤、细胞凋亡率的变化，得出纳米颗粒的毒性；
所述纳米颗粒为纳米银颗粒。
实施例6
除所沉积的金属银的形状为椭圆形阵列，椭圆长轴为600 μm，短轴为300 μm以外，其余与实施例4一致。
实验例1：
用实施例1的方法进行肾毒性检测，检测结果为当原代肾小管上皮细胞在本发明体系中体外培养10天后，加入浓度为500 μg/ml, 粒径约为30 nm的纳米四氧化三铁时，作用24小时后，测得原代肾小管上皮细胞的超氧化物歧化酶（SOD）的活性为90.14 U/mgprot,谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性为87.14 U/mgprot，丙二醛（MDA）的含量为11.87nmol/mgprot，DNA的损伤率为48.13%，细胞凋亡率为15.11%。
实验例2：
用实施例2的方法进行肾毒性检测，检测结果为当原代肾小管上皮细胞在本发明体系中体外培养20天后，加入浓度为100 μg/ml, 粒径约为10 nm的纳米二氧化钛时，作用24小时后，测得原代肾小管上皮细胞的超氧化物歧化酶（SOD）的活性为52.14 U/mgprot,谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性为13.27 U/mgprot，丙二醛（MDA）的含量为4.63 nmol/mgprot，DNA的损伤率为25.64%，细胞凋亡率为7.81%。
实验例3：
用实施例3的方法进行肾毒性检测，检测结果为当原代肾小管上皮细胞在本发明体系中体外培养15天后，加入浓度为80 μg/ml, 粒径约为50 nm的纳米氧化锌时，作用24小时后，测得原代肾小管上皮细胞的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性为40.46 μmol/gprot，丙二醛（MDA）的含量为0.86 nmol/mgprot，超氧化物歧化酶（SOD）的活性为9.37 U/mgprot，DNA的损伤率为37.71%，细胞凋亡率为10.23%。
实验例4：
用实施例4的方法进行肾毒性检测，检测结果为当原代肾小管上皮细胞在本发明体系中体外培养9天后，加入浓度为90 μg/ml, 粒径约为70 nm的纳米二氧化硅时，作用24小时后，测得原代肾小管上皮细胞的超氧化物歧化酶（SOD）的活性为17.09 U/mgprot，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性为25.32 mg/gprot，丙二醛（MDA）的含量为5.27 nmol/mgprot，，DNA的损伤率为45.14%，细胞凋亡率为23.74%。
实验例5：
用实施例5的方法进行肾毒性检测，检测结果为当原代肾小管上皮细胞在本发明体系中体外培养5天后，加入浓度为50 μg/ml, 粒径约为80 nm的纳米银颗粒时，作用24小时后，测得原代肾小管上皮细胞的超氧化物歧化酶（SOD）的活性为17.09 U/mgprot，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性为35.32 mg/gprot，丙二醛（MDA）的含量为1.09 nmol/mgprot，DNA的损伤率为6.31%，细胞凋亡率为3.48%。
对比实验例1：
对小鼠的进行灌胃实验，灌入浓度为500 μg/ml, 粒径约为30 nm的纳米四氧化三铁约10 ml，作用机体24小时后，取出小鼠肾脏，进行匀浆检测，测得肾脏中的超氧化物歧化酶（SOD）的活性为92.47 U/mgprot,谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性为89.38 U/mgprot，丙二醛（MDA）的含量为13.41 nmol/mgprot，DNA的损伤率为53.41%，凋亡率为17.56%。
对比实验例2：
对小鼠的进行灌胃实验，灌入浓度为100 μg/ml, 粒径约为10 nm的纳米二氧化钛约10 ml，作用机体24小时后，取出小鼠肾脏，进行匀浆检测，测得肾脏中的超氧化物歧化酶（SOD）的活性为58.15 U/mgprot,谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性为15.44 U/mgprot，丙二醛（MDA）的含量为6.12 nmol/mgprot，DNA的损伤率为27.44%，凋亡率为9.12%。
对比实验例3：
对小鼠的进行灌胃实验，灌入浓度为80 μg/ml, 粒径为50 nm的纳米氧化锌约10ml，作用机体24小时后，取出小鼠肾脏，进行匀浆检测，测得肾脏中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性为44.13 μmol/gprot，丙二醛（MDA）的含量为1.24 nmol/mgprot，超氧化物歧化酶（SOD）的活性为12.33 U/mgprot, DNA的损伤率为39.21%，凋亡率为12.93%。
对比实验例4：
对小鼠的进行灌胃实验，灌入浓度为90 μg/ml, 粒径约为70 nm的纳米二氧化硅约10 ml，作用机体24小时后，取出小鼠肾脏，进行匀浆检测，测得肾脏中超氧化物歧化酶（SOD）的活性为20.03 U/mgprot,丙二醛（MDA）的含量为6.84 nmol/mgprot，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性为26.47 μmol/gprot，DNA的损伤率为45.71%，凋亡率为24.19%。
对比实验例5：
对小鼠的进行灌胃实验，灌入浓度为50 μg/ml, 粒径约为80 nm的纳米银颗粒约10 ml，作用机体24小时后，取出小鼠肾脏，进行匀浆检测，测得肾脏中超氧化物歧化酶（SOD）的活性为15.51 U/mgprot, 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性为36.58 μmol/gprot，丙二醛（MDA）的含量为0.75 nmol/mgprot，DNA的损伤率为4.83%，凋亡率为2.77%。
由实验例1-5和对比实验例1-5可以看出，在纳米颗粒的肾毒性的检测上，本发明的检测结果与体内动物实验结果近似，可作为体内动物实验检测的替代方案。重要的是，本发明比体内实验更易控制，且经济成本和时间成本更低，具有十分良好的市场应用前景。
Claims (9)
1.一种高效检测纳米颗粒肾毒性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）制备图案化纤维电纺接收板：先在绝缘玻璃片上涂覆正性感光胶，再覆盖一层光掩模，利用光刻机进行刻蚀；再通过直流磁控技术在刻蚀后的玻璃片上沉积一层金属银，所沉积的金属银的形状包括圆形阵列、椭圆形的一种，圆形半径为100 μm-500μm，椭圆长轴为200 μm-600μm，短轴为100 μm-300μm；最后清洗掉剩余的正性感光胶；
2）制备图案化电纺纤维：将医用高分子聚合物用有机溶剂溶解，利用步骤1）所得物作为电纺接收板，通过静电纺丝技术制备圆形或椭圆形的图案化电纺纤维；控制所得纤维的直径为300-500 nm；
所述医用高分子聚合物包括聚乳酸、聚己内酯、聚氨酯、聚丙烯腈中的一种，所述有机溶剂包括丙酮、二甲基甲酰胺中的至少一种；
3）将负性环氧树脂型近紫外线光刻胶SU-8放置在硅片上，利用光刻蚀技术，保留宽为40-550μm、高为30-80μm的SU-8长方体作为模具，去掉其余的SU-8，将熔融的PDMS置于所得模具上，待PDMS冷却后，去除模具，得到PDMS腔体；
4）将步骤2）和步骤3）所得物在O2 或N2的氛围下，用等离子体处理30秒，使得步骤2）和步骤3）所得物紧密连接；
5）将0.5×106-1.5×106个原代肾小管上皮细胞接种于步骤4）所得物中的图案化电纺纤维上，利用注射泵将培养基泵入步骤4）所得物的腔体，流速为0.2-0.5 ml/h；再将纳米颗粒悬浮于PBS后泵入,于纳米颗粒泵入后，记录原代肾小管上皮细胞的存活率、细胞形态学、乳酸脱氢酶、谷胱甘肽、丙二醛、超氧化物歧化酶的测定结果、细胞凋亡和周期的变化、细胞内氧自由基、酶活力、特征基因表达水平，得出纳米颗粒的毒性；
所述纳米颗粒包括纳米四氧化三铁、纳米二氧化钛、纳米氧化锌、纳米二氧化硅、纳米银颗粒中的一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中沉积的金属银的形状为椭圆形，椭圆长轴为200 μm-600μm，短轴为100 μm-300μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，进行电纺时，电压为15-25KV，流速为0.5-1.0 ml/h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，纤维的直径为300 nm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中的医用高分子聚合物为聚乳酸，所述有机溶剂为丙酮与二甲基甲酰胺的混合溶液，丙酮与二甲基甲酰胺的体积比为9:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中的模具的宽为200 μm，高为50 μm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中的模具的宽为50 μm，高为80μm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）中，用于接种的原代肾小管上皮细胞的数目为1×106个。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）中，培养基的流速为0.3 ml/h。
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