CN111621471A - 一种软组织胞外囊泡的提取方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种软组织胞外囊泡的提取方法及应用，包括从生物体内获取适量目标软组织、保存、培养和层析步骤等。本发明中所述方法中的软组织外泌体或微囊泡提取简单，避免了分离、纯化细胞的过程，省时省力、节约成本；而且还能够真实反映体内软组织的生理特征，可作为有效的生理检测标志用于疾病诊断，弥补了体液、或细胞培养上清来源外泌体或微囊泡存在的不足。

Description

一种软组织胞外囊泡的提取方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种软组织胞外囊泡的提取方法及应用。
背景技术
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs),简称EV，是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，这些囊泡的直径可以从30、40nm到8、9um。从细胞膜上脱落或细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，携带有供体细胞来源的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA及其它非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)。细胞外囊泡是细胞之间进行信息传递的工具(细胞通讯)，起到调节细胞增殖、分化、免疫调节、肿瘤杀伤、细胞迁移、血管新生等过程；此外组织细胞分泌到血液中的细胞外囊泡还可作为生理特征的标志。
细胞外囊泡是一群异质性的纳米级囊泡状小体，主要从直径和生成途径分成三类：外泌体、微囊泡及凋亡小体。外泌体(Exosomes，Exs)由细胞内的多泡小体(multivesicularbodies，MVBs)与细胞膜融合后以外泌体的形式释放到细胞外，直径约为30～100nm。微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100～1000nm；凋亡小体(apoptotic bodies)是细胞发生凋亡后从细胞膜上脱落而来，直径约为500～4000nm。细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中。在多种疾病如癌症、心血管疾病、慢性疾病中都发现细胞外囊泡水平的升高；因此，细胞外囊泡有可能作为疾病筛查或预后的标志物；也是目前研究和产业转化的热点。
目前，外泌体或微囊泡的提取主要来自于细胞培养上清、体液。细胞培养上清来源的外泌体或微囊泡，首先需要从组织中分离细胞，然后再进行培养才能获得细胞培养上清中的外泌体或微囊泡；这不仅费时费力、增加成本，而且还有可能在分离细胞的过程中改变细胞在组织中的生物学特性，影响结果判断或影响治疗效果。体液来源的外泌体或微囊泡，虽然获取相对容易，但数量相对较少，而且诊断结果也常常出现假阳性或假阴性。软组织器官作为一个多种细胞组成的特定整体，其分泌的外泌体或微囊泡具有组织特异性，如在健康状态下分泌的外泌体或微囊泡对于组织器官功能的维持是必需的，而载病变状态下分泌的外泌体或微囊泡可作为组织病变的生物标志。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种软组织胞外囊泡的提取方法，针对上述细胞培养上清来源的外泌体或微囊泡提取存在的不足，在诊断过程中提取的量少、结果的不准确性的技术问题，提供直接从软组织培养上清中提取外泌体或微囊泡的方法；本发明将软组织(如胎盘、脐带、脂肪、肌肉等)在健康状态或病变进行组织培养，提取外泌体或微囊泡，应用于疾病治疗、疾病诊断、医学保健等。
解决以上技术问题的本发明中的一种软组织胞外囊泡的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)获取目标软组织，清洗后剪碎成小块；
(2)将剪碎后的组织块转移至悬浮培养瓶中，加入基础培养基，放在培养箱中培养，磁力搅拌器速度为50～500rpm，培养温度36～38℃，培养时间为1～96h；
(3)将组织培养上清转移至离心管中或EP管中，温度3～5℃，500～3000g离心5～30min；
(4)将离心后组织培养上清转移至超滤管中，温度3～5℃，2000～10000g离心20～50min，得截留液；
(5)加入截留液至层析柱中层析，收集组分；加入截留液至层析柱中，以生理盐水作为流动相，收集第5～11个组分(每个组分1min)，层析的目的是为了提取组织胞外囊泡。
(6)收集步骤(5)中层析后的截留液，置于低温中保存，优化方案中低温为-196～-20℃，进一步优化方案中低温为-82～-78℃，即得。
优化方案中，所述组织块与基础培养基质量体积比例为1:1～30；所述基础培养基为α-MEM基础培养基。
进一步优化方案中，所述步骤(1)中清洗前将软组织放入组织保存液中保存，保存温度2～8℃，72h内处理；所述步骤(3)离心后将组织培养上清用40～100μm筛网过滤，然后再用0.40～0.5μm滤器进行过滤后上清转移至步骤(4)中的超滤管中。
所述组织保存液为1～5mL青霉素/链霉素溶液加入100mL生理盐水或α-MEM基础培养基中混合而得。
优化方案中，所述步骤(5)中将收集的组分转移至100KDa的超滤管中，温度3～5℃，优化方案中温度4℃；再2000～10000g离心20～50min，离心后分装、置于-82～-78℃保存。
所述步骤(2)中在培养温度37℃、质量浓度4-6％的CO2培养箱中培养，优化方案中质量浓度为5％的CO2培养箱中培养；优化方案所述步骤(3)和步骤(4)中温度为4℃。
所述步骤(6)中用0.45μm滤器进行过滤；所述步骤(10)中置于-80℃保存。
所述方法中提取的软组织胞外囊泡直径介于10～250nm之间，平均直径为114±8nm。
所述软组织为小鼠肌肉组织、猪肌肉组织、人脐带组织或人脐带胎盘组织。
本发明一种软组织胞外囊泡的应用，所述胞外囊泡中提取的外泌体或微囊泡所述胞外囊泡中提取的外泌体或微囊泡在制备疾病治疗的药物上应用，和在检测疾病诊断上的应用，以及在制备医学保健与美容用物质上的应用。对胞外囊泡液进行蛋白浓度、粒径大小、粒径浓度、表面标志物分析，所得外泌体或微囊泡可应用于疾病诊断、药物治疗、医学保健与美容产品的制备。
本发明所述的软组织来源不仅包括哺乳动物类，如鼠、犬、牛、羊、人等，而且包括非哺乳动物类，如鱼等。也不仅包括健康组织，而且包括非健康组织，如良性肿瘤、癌变组织等。且不仅包括个体出生前的组织，而且包括个体出生后的组织。
本发明中所述方法的软组织外泌体或微囊泡提取简单，避免了分离、纯化细胞的过程，省时省力、节约成本，于沉淀法相比，杂蛋白少；而且还能够真实反映体内软组织的生理特征，可作为有效的生理检测标志用于疾病诊断，弥补了体液、或细胞培养上清来源外泌体或微囊泡存在的不足。同时，从健康组织培养上清中提取的外泌体或微囊泡还可以作为疾病治疗、医学保健与美容等方面的应用。此方法采用的是物理分离法，避免了外源试剂引入的问题。
附图说明
下面结合附图及具体实施方式对本发明做更进一步详细说明：
图1层析法所得各组分蛋白浓度和胞外囊泡含量图
图2试剂盒法和层析法提取的肌肉组织胞外囊泡蛋白含量比较图
(其中图中：Marker为预染的蛋白，NC：阴性对照，小鼠骨髓间充质干细胞全蛋白，PC：阳性对照，小鼠脂肪组织胞外囊泡，Reagent：代表试剂盒法提取肌肉组织胞外囊泡，CXZ：代表层析法提取肌肉组织胞外囊泡，M-EV：肌肉组织胞外囊泡)
图3试剂盒法和层析法提取的肌肉组织胞外囊泡效率比较图
图4层析法提取的各种组织来源的胞外囊泡透射电镜图
图5层析法提取的各种组织来源的胞外囊泡粒度分析图
(其中图中：Mice-muscle：小鼠肌肉组织，Pig-muscle：猪肌肉组织；Placenta：人胎盘组织，Umbilical cord：人脐带组织)
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明：
实施例1
一种软组织胞外囊泡的提取方法，具体步骤如下：
(1)获取目标软组织，清洗后剪碎成小块；
(2)将剪碎后的组织块转移至悬浮培养瓶中，加入α-MEM(hyclone)基础培养基，组织块与基础培养基质量体积比例为1:15，放在培养箱中培养，磁力搅拌器速度为100rpm，培养温度37℃，培养时间为40h；
(3)将α-MEM组织培养上清转移至离心管中或EP管中，温度4℃，1000g离心10min；
(4)将离心后组织培养上清转移至超滤管中，温度4℃，3000g离心30min，得截留液；
(5)加入截留液至层析柱中层析，收集组分；
(6)收集步骤(5)中层析后的截留液，置于-81℃保存，即得。
实施例2
一种软组织胞外囊泡的提取方法，具体步骤如下：
(1)获取目标软组织，将组织放入含1％(vol/vol)青霉素/链霉素的组织保存液中；组织保存液为1mL青霉素/链霉素溶液(hyclone)加入100mL生理盐水或α-MEM基础培养基中混合而成；将组织保存在-196℃条件下；使用时清洗、剪碎成小块；
(2)将剪碎后的组织块转移至悬浮培养瓶中，加入α-MEM基础培养基，组织块与基础培养基质量体积比例为1:25，放在培养箱中培养，磁力搅拌器速度为200rpm，培养温度36℃，培养时间为60h；
(3)将α-MEM组织培养上清转移至离心管中或EP管中，温度5℃，2000g离心8min；
(4)将离心后组织培养上清转移至超滤管中，温度5℃，5000g离心40min，得截留液；
(5)加入截留液至层析柱中层析，收集组分；
(6)收集步骤(5)中层析后的截留液，置于-79℃保存，即得。
实施例3
一种软组织胞外囊泡的提取方法，具体步骤如下：
(1)获取目标软组织，将组织放入含1％(vol/vol)青霉素/链霉素的组织保存液中；组织保存液为1mL青霉素/链霉素溶液(hyclone)加入100mLα-MEM中混合而成；将组织保存在-20℃条件下，并尽快送到处理实验室(72h内)；使用时清洗后剪碎成小块；
(2)将剪碎后的组织块转移至悬浮培养瓶中，加入α-MEM基础培养基，组织块与基础培养基质量体积比例为1:10，放在培养箱中培养，磁力搅拌器速度为300rpm，培养温度38℃，培养时间为70h；
(3)将α-MEM组织培养上清转移至离心管中或EP管中，温度4℃，1500g离心25min；
(4)离心后将组织培养上清用40μm筛网过滤以除去组织，然后用0.40μm滤器进行过滤，过滤后的上清转移至超滤管中，温度3℃，6000g离心35min，得截留液；
(5)加入截留液至层析柱中层析，收集组分；
(6)收集步骤(5)中层析后的截留液，置于-80℃保存，即得。
实施例4层析法从人胎盘组织提取组织胞外囊泡
(1)通过无菌技术从足月生产后的人脐带胎盘组织获取适量(≥1mg)目标组织；
无菌技术是指在组织取材、处理、培养、产品包装等过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；常规无菌方法适用。
(2)将组织放入含1％(vol/vol)青霉素/链霉素的组织保存液中；组织保存液为1mL青霉素/链霉素溶液(hyclone)加入100mL生理盐水(0.9％氯化钠注射液，科伦药业)中混合而成；将组织保存在2℃条件下，并尽快送到处理实验室(72h内)。
(3)在生物安全柜内的组织保存液中取出组织，用生理盐水清洗2次，并分离组织，将组织剪碎成1mm3的小块。
(4)将剪碎后的组织块转移至悬浮培养瓶(whaton)中，以组织块(重量/g)：基础培养基(α-MEM，Hyclone，体积/mL)为1:1的比例，将组织块加入基础培养基(不含有血清)中。
(5)将组织块放入36℃、4％CO2培养箱中，或同等条件下培养，设置磁力搅拌器的速度为50～500rpm，组织培养的时间为1h。
(6)将组织培养上清转移至离心管中(体积为15或50mL)或EP管中(体积为1.5或2mL)，4℃、500g离心5min。
(7)离心后将组织培养上清用40μm筛网过滤以除去组织，然后用0.40μm滤器进行过滤；
(8)将上清转移至100KDa超滤管(millipore)中，温度4℃、2000g离心50min，此时，100KDa超滤管内管中含有部分液体，称之为截留液。
(9)加入适量体积截留液至层析柱中(Thermo scientific，内部填充适量sephacrylTMS-1000)，以生理盐水作为流动相，收集5个组分，每个组分1分钟。并将各个组分用于蛋白浓度和粒度分析。
实施例5
层析法从猪肌肉组织提取组织胞外囊泡
(2)通过无菌技术从刚屠宰的生猪后腿获取适量(≥1mg)目标组织；
无菌技术是指在组织取材、处理、培养、产品包装等过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；常规无菌方法适用。
(2)将组织放入含5％(vol/vol)青霉素/链霉素的组织保存液中；组织保存液为5mL青霉素/链霉素溶液(hyclone)加入100mLα-MEM基础培养基中混合而成；将组织保存在4℃条件下，并尽快送到处理实验室(72h内)。
(3)在生物安全柜内的组织保存液中取出组织，用生理盐水清洗2～5次，并分离组织，将组织剪碎成5mm3的小块。
(4)将剪碎后的组织块转移至悬浮培养瓶(whaton)中，以组织块(重量/g)：基础培养基(α-MEM，Hyclone，体积/mL)为1:30的比例，将组织块加入基础培养基(不含有血清)中。
(5)将组织块放入38℃、6％CO2培养箱中，或同等条件下培养，设置磁力搅拌器的速度为500rpm，组织培养的时间为96h。
(6)将组织培养上清转移至离心管中(体积为15或50mL)或EP管中(体积为1.5或2mL)，4℃、3000g离心5min。
(7)离心后将组织培养上清用100μm筛网过滤以除去组织，然后用0.5μm滤器进行过滤；
(8)将上清转移至100KDa超滤管(millipore)中，温度5℃、10000g离心20min，此时，100KDa超滤管内管中含有部分液体，称之为截留液。
(9)加入适量体积截留液至层析柱中(Thermo scientific，内部填充适量sephacrylTMS-1000)，以生理盐水作为流动相，收集10个组分，每个组分1分钟。并将各个组分用于蛋白浓度和粒度分析。
肌肉组织与脂肪组织的区别在于肌肉、胎盘脐带等软组织的密度大于生理盐水和基础培养基中，沉于液体底部；而脂肪组织的密度小于生理盐水或基础培养基，浮于液体表面。
实施例6
层析法从小鼠肌肉提取组织胞外囊泡
(3)通过无菌技术从小鼠后腿(8周龄SPF级C57BL/6N)获取适量(≥1mg)目标组织；
无菌技术是指在组织取材、处理、培养、产品包装等过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；常规无菌方法适用。
(2)将组织放入含4％(vol/vol)青霉素/链霉素的组织保存液中；组织保存液为4mL青霉素/链霉素溶液(hyclone)加入100mL基础培养基(α-MEM，Hyclone)中混合而成；将组织保存在4℃条件下，并尽快送到处理实验室(72h内)。
(3)在生物安全柜内的组织保存液中取出组织，用生理盐水清洗3次，并分离组织，将组织剪碎成4mm3的小块。
(4)将剪碎后的组织块转移至悬浮培养瓶(whaton)中，以组织块(重量/g)：基础培养基(α-MEM，Hyclone，体积/mL)为1:20的比例，将组织块加入基础培养基(不含有血清)中。
(5)将组织块放入37℃、5％CO2培养箱中，或同等条件下培养，设置磁力搅拌器的速度为200rpm，组织培养的时间为50h。
(6)将组织培养上清转移至离心管中(体积为15或50mL)或EP管中(体积为1.5或2mL)，4℃、2000g离心15min。
(7)离心后将组织培养上清用70μm筛网过滤以除去组织，然后用0.45μm滤器进行过滤；
(8)将上清转移至100KDa超滤管(millipore)中，温度4℃、5000g离心30min，此时，100KDa超滤管内管中含有部分液体，称之为截留液。
(9)加入适量体积截留液至层析柱中(Thermo scientific，内部填充适量sephacrylTMS-1000)，以生理盐水作为流动相，收集第11个组分，每个组分1分钟。并将各个组分用于蛋白浓度和粒度分析。
实施例7
层析法从人脐带组织提取组织胞外囊泡
(4)通过无菌技术从足月生产后的人脐带胎盘组织获取适量(≥1mg)目标组织；
无菌技术是指在组织取材、处理、培养、产品包装等过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；常规无菌方法适用。
(2)将组织放入含3％(vol/vol)青霉素/链霉素的组织保存液中；组织保存液为3mL青霉素/链霉素溶液(hyclone)加入100mL生理盐水(0.9％氯化钠注射液，科伦药业)中混合而成；将组织保存在4℃条件下，并尽快送到处理实验室(72h内)。
(3)在生物安全柜内的组织保存液中取出组织，用生理盐水清洗4次，并分离组织，将组织剪碎成2mm3的小块。
(4)将剪碎后的组织块转移至悬浮培养瓶(whaton)中，以组织块(重量/g)：基础培养基(α-MEM，Hyclone，体积/mL)为1:15的比例，将组织块加入基础培养基(不含有血清)中。
(5)将组织块放入37℃、5％CO2培养箱中，或同等条件下培养，设置磁力搅拌器的速度为300rpm，组织培养的时间为70h。
(6)将组织培养上清转移至离心管中(体积为15或50mL)或EP管中(体积为1.5或2mL)，4℃、1500g离心20min。
(7)离心后将组织培养上清用50μm筛网过滤以除去组织，然后用0.45μm滤器进行过滤；
(8)将上清转移至100KDa超滤管(millipore)中，温度4℃、8000g离心40min，此时，100KDa超滤管内管中含有部分液体，称之为截留液。
(9)加入适量体积截留液至层析柱中(Thermo scientific，内部填充适量sephacrylTMS-1000)，以生理盐水作为流动相，收集第8个组分，每个组分1分钟。并将各个组分用于蛋白浓度和粒度分析。
对照组1试剂盒法(沉淀法)从小鼠肌肉组织提取组织胞外囊泡
(1)通过无菌技术从小鼠后腿(8周龄SPF级C57BL/6N)获取适量(≥1mg)目标组织；
(2)将组织放入含4％(vol/vol)青霉素/链霉素的组织保存液中；组织保存液为4mL青霉素/链霉素溶液(hyclone)加入100mL生理盐水(0.9％氯化钠注射液，科伦药业)或基础培养基(α-MEM，Hyclone)中；将组织保存在4℃条件下，并尽快送到处理实验室(72h内)。
(3)在生物安全柜内的组织保存液中取出组织，用生理盐水清洗3次，并分离组织，将组织剪碎成4mm3的小块。
(4)将剪碎后的组织块转移至悬浮培养瓶(whaton)中，按组织块(重量/g)：基础培养基(α-MEM，Hyclone，体积/mL)为1:20的比例加入适量基础培养基(不含有血清)。
(5)将组织块放入37℃、5％CO2培养箱中，或同等条件下培养，设置磁力搅拌器的速度为200rpm，组织培养的时间为50h。
(6)将组织培养上清转移至离心管中(体积为15或50mL)或EP管中(体积为1.5或2mL)，4℃、2000g离心15min。
(7)离心后将组织培养上清用70μm筛网过滤以除去组织，然后用0.45μm滤器进行过滤；
(8)将上清转移至100KDa超滤管(millipore)中，4℃、5000g离心30min，此时，100KDa超滤管内管中含有部分液体，称之为截留液。
(9)将截留液转移至2mL EP管中，加入1/2截留液体积的Total Exosomeisolation(#4478359，Invitrogen)。混匀后，于4℃冰箱中静置8～24h。再将EP管置于4℃、10000g条件下离心30～90min。
(10)去掉EP管中上清液，向EP管中加入300μL生理盐水，吹打溶解所得沉淀，沉淀溶解后，按照50μL每支EP管进行分装。做好标记，保存于-80℃。
试验一BCA法检测小鼠肌肉组织胞外囊泡的蛋白浓度：
将本发明中实施例6中所得小鼠肌肉组织胞外囊泡从-80℃冰箱取出，放置于冰盒上溶解，加入适量生理盐水稀释用于BCA法检测蛋白浓度(#KGPBCA，KeyGENBioTECH)。按照试剂盒中所述配制标准曲线溶液、对照组溶液、检测样本溶液。振荡混匀后放置于37℃、5％CO2培养箱中培养30min，再用酶标仪(Spectrophotometer，Thermo Fisher Scientific)在562nm下检测吸光度值。绘制标准曲线，计算肌肉组织培养上清中胞外囊泡的蛋白浓度，如图1。
以上分析如图1中所示，从图中可以看出，每个组分的接样时间为1min，接样体积为0.5mL，从图中可以看出层析法在第5～11个组分能有效将蛋白和胞外囊泡进行有效分离。试验二提取的外泌体或微囊泡效率比较：
将实施例5或6中，以及对照组1中所得肌肉组织外泌体从-80℃冰箱取出，放置于冰盒上溶解后加入适量生理盐水稀释5000倍、10000倍，采用粒径分析仪(PARTICLEMETRIX，Germany)进行粒径分析。分析计算每g肌肉组织培养后所得外泌体或微囊泡的粒径分布和粒子浓度，如图3。
从图3中试剂盒法和层析法提取的肌肉组织胞外囊泡效率比较，可以看出试剂盒法和层析法的提取效率相近，但层析法的分离效果更好。
试验三SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测肌肉组织胞外囊泡的蛋白组分：
将实施例6和对照组1中所得小鼠肌肉组织胞外囊泡从-80℃冰箱取出，放置于冰盒上溶解。每个泳道加入20μg总蛋白，用10％的分离胶进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。并用小鼠骨髓间充质干细胞全蛋白作为阴性对照(10μg)，以小鼠脂肪组织胞外囊泡作为阳性对照(10μg)，如图2。
其中Marker为预染的蛋白(上样量：5μL)，NC为阴性对照，小鼠骨髓间充质干细胞全蛋白(上样量：10μg)；PC为阳性对照，小鼠脂肪组织胞外囊泡(上样量：10μg)；Reagent为代表试剂盒法提取肌肉组织胞外囊泡；CXZ为代表层析法提取肌肉组织胞外囊泡；M-EV为肌肉组织胞外囊泡(上样量：20μg)。
由此图2可看出层析法较试剂盒法提取的肌肉组织胞外囊泡杂蛋白较少，且获得的胞外囊泡纯度较高。
试验四 NTA法(Nanoparticle Tracking Analysis，纳米颗粒跟踪分析法)检组织胞外囊泡的粒径(度)分布：
将实施例4-7中所得各种组织胞外囊泡从-80℃冰箱取出，放置于冰盒上溶解，加入适量生理盐水稀释，采用粒径分析仪(PARTICLEMETRIX，Germany)进行粒径分析，如图5。
从图5中可以看出本发明中方法提取出来组织胞外囊泡介于10～250nm之间，平均直径为114±8nm，提取方法组织及胞外囊泡存在稳定。
试验五TEM法(Transmission Electron Microscope，透射电镜)检测各组织细胞外囊泡的形态：
将本发明中实施例4-7中所得各种组织胞外囊泡从-80℃冰箱取出，放置于冰盒上溶解。用生理盐水稀释成蛋白浓度为2μg/μL，送四川大学分析测试中心检测，如图4。
从图4中可以看出本发明中方法提取出来的组织胞外囊泡具有双层膜结构，大小也介于10～250nm之间，平均直径同样约为114±8nm，符合直径和结构的要求。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种软组织胞外囊泡的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)获取目标软组织，清洗后剪碎成小块；
(2)将剪碎后的组织块转移至悬浮培养瓶中，加入基础培养基，放在培养箱中培养，磁力搅拌器速度为50～500rpm，培养温度36～38℃，培养时间为1～96h；
(3)将组织培养上清转移至离心管中或EP管中，温度3～5℃，500～3000g离心5～30min；
(4)将离心后组织培养上清转移至超滤管中，温度3～5℃，2000～10000g离心20～50min，得截留液；
(5)加入截留液至层析柱中层析，收集组分；
(6)收集步骤(5)中层析后的截留液，置于-82～-78℃保存，即得。
2.根据权利要求1所述的一种软组织胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述组织块与基础培养基质量体积比例为1:1～30；所述基础培养基为α-MEM混合培养基。
3.根据权利要求1所述的一种软组织胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中清洗前将软组织放入组织保存液中保存，保存温度2～8℃，72h内处理；所述步骤(3)离心后将组织培养上清用40～100μm筛网过滤，然后再用0.40～0.5μm滤器进行过滤后上清转移至步骤(4)中的超滤管中。
4.根据权利要求3所述的一种软组织胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述组织保存液为1～5mL青霉素/链霉素溶液加入100mL生理盐水或α-MEM基础培养基中混合而得。
5.根据权利要求1所述的一种软组织胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述步骤(5)中将收集的组分转移至100KDa的超滤管中，温度3～5℃，优化方案中温度4℃；再2000～10000g离心20～50min，离心后分装、置于低温中保存，优化方案中低温为-196～-20℃，进一步优化方案中低温为-82～-78℃。
6.根据权利要求1所述的一种软组织胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中在培养温度37℃、质量浓度4-6％的CO2培养箱中培养，优化方案中质量浓度为5％的CO2培养箱中培养；优化方案所述步骤(3)和步骤(4)中温度为4℃。
7.根据权利要求1或5所述的一种软组织胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述步骤(6)中用0.45μm滤器进行过滤；所述步骤(10)中置于-80℃保存。
8.根据权利要求1所述的一种软组织胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述方法中提取的软组织胞外囊泡直径介于10～250nm之间，平均直径为114±8nm。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的一种软组织胞外囊泡的提取方法，其特征在于：所述软组织为小鼠肌肉组织、猪肌肉组织、人脐带组织或人脐带胎盘组织。
10.根据权利要求1所述的一种软组织胞外囊泡的应用，其特征在于：所述胞外囊泡中提取的外泌体或微囊泡在制备疾病治疗的药物上应用，和在检测疾病诊断上的应用，以及在制备医学保健与美容用物质上的应用。
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