CN108273041A - 一种促进皮肤伤口愈合的制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药产品领域，尤其涉及一种促进皮肤伤口愈合的制剂及其制备方法和应用。本发明提供了一种制剂，由内皮祖细胞、血管内皮因子、脐带干细胞条件培养基和基质胶制成。实验结果表明，本发明制剂能够促进皮肤伤口愈合。本发明制剂在敷贴后，制剂中的细胞因子和内皮祖细胞被释放出来，进而促进形成新生组织，起到定植修复的作用；脐带干细胞条件培养基中含有多种活性因子，能够提高组织的再生能力、促进原有组织的修复，起到全方位促进伤口愈合的作用。

Description

一种促进皮肤伤口愈合的制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药产品领域，尤其涉及一种促进皮肤伤口愈合的制剂及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤是人体的重要器官，具有屏障保护、吸收与代谢、分泌与排泄、体温调节、免疫等各种功能。由于创伤等原因，可能导致皮肤的大范围伤害，并有可能导致并发症，危及人类生命。伤口愈合过程分为四期：(1)组织液渗出期：由胶原纤维细胞分泌胶原蛋白填充伤口，其中I型胶元蛋白为形成瘢痕的主要胶原。(2)炎症期(清创期)：发生在24-48小时，并伴随细菌感染，此时主要有免疫细胞清除受损组织和微生物。(3)增殖分化期：首先是表皮干细胞分化表皮，真皮干细胞分化表皮组织，成纤维细胞，以及毛发、汗腺和皮脂腺等皮肤附属器，造血干细胞中的内皮祖细胞分化新生血管、淋巴管和神经。(4)组织重朔：过度纤维化的瘢痕难以被机体吸收，造成血管以及毛发等皮肤附属器的重建发生严重障碍，形成终身病理性瘢痕。
目前对于皮肤创伤等处理主要方式有机体组织自行修复或移植皮肤，但前者修复时间长，后者会对患者造成二次伤害。
发明内容
本发明提供了一种促进皮肤伤口愈合的制剂及其制备方法和应用，用于解决目前创伤处理方式修复时间长或会对患者造成二次伤害的问题。
本发明的具体技术方案如下：
一种制剂，由内皮祖细胞、血管内皮因子、脐带干细胞条件培养基和基质胶制成。
优选的，所述脐带干细胞条件培养基和所述基质胶的体积比为1：1～2。
优选的，所述内皮祖细胞在所述制剂中的含量为5～8×106个/mL。
优选的，所述血管内皮因子在所述制剂中的含量为25～75ng/mL。
本发明还提供了一种制剂的制备方法，包括：
a)0～4℃下将脐带干细胞条件培养基和基质胶混匀，得到第一混合液；
b)将含血管内皮因子的生理盐水重悬内皮祖细胞，得到第二混合液；
c)0～4℃下将所述第一混合液和所述第二混合液混匀后置于模具中成型，得到所述制剂。
优选的，所述第一混合液和所述第二混合液的体积比为1：1～3。
优选的，所述脐带干细胞条件培养基按照如下方法获得：
将脐带干细胞进行传代培养，获得P2～P5代脐带干细胞，收集所述P2～P5代脐带干细胞的培养上清液，得到所述脐带干细胞条件培养基。
进一步的，将所述脐带干细胞进行传代培养之前，还包括：
将脐带组织依次进行消化处理和离心分离，得到脐带干细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述制剂或上述技术方案所述制备方法制得的制剂在促进皮肤伤口愈合中的应用。
优选的，所述制剂的储存温度为0～4℃。
综上所述，本发明提供了一种制剂，由内皮祖细胞、血管内皮因子、脐带干细胞条件培养基和基质胶制成。实验结果表明，本发明制剂能够促进皮肤伤口愈合。本发明制剂在敷贴后，制剂中的细胞因子和内皮祖细胞被释放出来，进而促进形成新生组织，起到定植修复的作用；脐带干细胞条件培养基中含有多种活性因子，能够提高组织的再生能力、促进原有组织的修复，起到全方位促进伤口愈合的作用。
具体实施方式
本发明提供了一种促进皮肤伤口愈合的制剂及其制备方法和应用，用于解决目前创伤处理方式修复时间长或会对患者造成二次伤害的问题。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种制剂，由内皮祖细胞、血管内皮因子、脐带干细胞条件培养基和基质胶制成。
基质胶(Matrigel)是一种可溶性的基底膜基质，主要成分包括层黏连蛋白和胶原IV等，同时含有TGF-β成纤维细胞生长因子、组织纤维酶原活化因子以及其它在EHS肿瘤中自然表达的生长因子等。基质胶可以有效帮助上皮细胞等各类细胞的附着和分化，其中，包括神经细胞、肝细胞、哺乳动物上皮细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞及毛囊细胞等。并且，基质胶还会影响鼠乳腺上皮细胞的蛋白表达水平，支持周围神经再生和牛输软管上皮细胞的分化。
生物可降解高分子材料一般用于生物体内，是非永久性植入材料，在发挥作用之后能被活体吸收或参与正常的代谢而被排出体外，同时其降解产物对生物体无毒。本发明中，基质胶作为一种天然的水溶性的生物可降解高分子材料，其降解产物易被吸收而不产生炎症反应。本发明制剂由内皮祖细胞、血管内皮因子、脐带干细胞条件培养基和基质胶制成，基质胶可被人体降解且对上皮祖细胞无毒副作用，并能起到很好的皮肤修复作用，使得该制剂能够与皮肤进行贴合。此外，内皮祖细胞在细胞因子和生长因子的作用下，能够分化形成新的皮肤组织，使得创口快速愈合；脐带干细胞条件培养基可以改善肤质，防止皮肤粗糙，对皮肤发育与维持起着十分重要的作用。
本发明中，制剂由内皮祖细胞、血管内皮因子、脐带干细胞条件培养基和基质胶制成。该制剂采用基质胶联合内皮祖细胞、血管内皮因子和脐带干细胞条件培养基，能够对创口进行修复，该制剂使用时，仅需要敷贴在创口处，即可起到立竿见影的修复效果，避免了对机体造成多次伤害。本发明制剂在敷贴后，制剂中的细胞因子和内皮祖细胞被释放出来，进而促进形成新生组织，起到定植修复的作用。此外，脐带干细胞条件培养基中含有多种活性因子，能够提高组织的再生能力、促进原有组织的修复，起到全方位促进伤口愈合的作用。
本发明中，脐带干细胞条件培养基和基质胶的体积比为1：1～2。
内皮祖细胞在制剂中的含量为5～8×106个/mL。
血管内皮因子在制剂中的含量为25～75ng/mL。
本发明还提供了上述技术方案制剂的制备方法，包括：
a)0～4℃下将脐带干细胞条件培养基和基质胶混匀，得到第一混合液；
b)将含血管内皮因子的生理盐水重悬内皮祖细胞，得到第二混合液；
c)0～4℃下将第一混合液和第二混合液混匀后置于模具中成型，得到制剂。
本发明中，第一混合液和第二混合液的体积比为1：1～3。
本发明中，脐带干细胞条件培养基按照如下方法获得：
将脐带干细胞进行传代培养，获得P2～P5代脐带干细胞，收集P2～P5代脐带干细胞的培养上清液，得到脐带干细胞条件培养基。
进一步的，将脐带干细胞进行传代培养之前，还包括：
将脐带组织依次进行消化处理和离心分离，得到脐带干细胞。
本发明还提供了上述技术方案制剂或上述技术方案制备方法制得的制剂在促进皮肤伤口愈合中的应用。
本发明中，制剂的储存温度为0～4℃。
本发明提供了一种制剂，由内皮祖细胞、血管内皮因子、脐带干细胞条件培养基和基质胶制成。实验结果表明，本发明制剂能够促进皮肤伤口愈合。本发明制剂在敷贴后，制剂中的细胞因子和内皮祖细胞被释放出来，进而促进形成新生组织，起到定植修复的作用；脐带干细胞条件培养基中含有多种活性因子，能够提高组织的再生能力、促进原有组织的修复，起到全方位促进伤口愈合的作用。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。
实施例1
内皮祖细胞的分离提取
本实施例采用Ficoll梯度离心法分离人脐血单核细胞中的活细胞，联合MACS磁珠抗体标记法分选CD133+细胞以除去大部分血液细胞及血小板等，再通过贴壁法除去成熟的内皮细胞和单核细胞，利用内皮祖细胞的贴壁性能去除其它细胞，获得内皮祖细胞。
实施例2
脐带干细胞条件培养基的收集
取汇合度80％～90％的P2～P3代的脐带干细胞，用PBS清洗1～3遍后，往细胞中加入0.015～0.04mL/cm2的0.05％～0.3％的胰酶+0.01％～0.04％EDTA消化1～3min，用5～10倍于消化液的完全培养基终止酶解，200～400g离心5min，用完全培养基重悬后，接种于培养皿或培养瓶中，传代密度为8000～15000cell/cm2。培养24h后，更换无酚红1640基础培养基，细胞继续培养48h后，收集培养上清液，200-400g离心5min，取上清，将体积浓缩至50mL，即得脐带干细胞条件培养基，将脐带干细胞条件培养基置于4℃保存备用。其中，更换的无酚红1640基础培养基的体积是一定的，即50mL，培养24h后的脐带干细胞的数量则不是一定的，脐带干细胞可为5×106cell/mL、1×107cell/mL或5×107cell/mL。
实施例3
制剂的制备
制剂由内皮祖细胞、血管内皮因子、脐带干细胞条件培养基和基质胶制成，制备步骤包括：
1)0℃下取出基质胶，待基质胶凝固前，将实施例2收集的脐带干细胞条件培养基与基质胶按体积比为1：1～2充分混匀，得到第一混合液；
2)往生理盐水中添加血管内皮因子，调整浓度为50～150ng/mL，用含有血管内皮因子的生理盐水重悬内皮祖细胞，得到第二混合液。
3)0～4℃下将第一混合液和第二混合液按体积比1：1混匀后置于模具中成型，得到制剂，其中，内皮祖细胞在制剂中的含量为5～8×106cell/mL，将制剂置于4℃冰箱保存备用。
实施例4
制剂的质量控制
对制剂进行细菌、真菌、内毒素、甲肝、乙肝、丙肝、梅毒和HIV等各类病毒检测，检测结果均为阴性。该制剂在0℃时是液体状态，当温度高于4℃时，会逐渐凝固，形成薄膜结构，能够与皮肤完全贴合。
实施例5
取80只SD大鼠，20只/组，进行创伤模型制备及分组。分组分为四组，空白对照组的制剂成分只包括基质胶，组1～组3的制剂由内皮祖细胞、血管内皮因子、脐带干细胞条件培养基和基质胶制成，但组1～组3中基质胶和脐带干细胞条件培养基的比例不同，各组的成分详见表1，各组的制剂均为固体。
将小鼠常规饲养7d后，按30mg/kg腹腔注射质量分数1％的戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，剃去背部毛，在背中部制备一个1cm×1cm创面，创面深至皮下，建立机械损伤小鼠模型。将上述的固体制剂分别展铺在伤口处，用医用胶布固定3天后，取下伤口上剩余敷料，用无菌纱布继续包扎伤口，7天后检测伤口愈合程度，结果如表2所示。
从表2可知，空白对照组的伤口愈合率为43.87％，组1～组3的伤口愈合率分别为43.87％、46.15％、35.02％，与空白对照组相比，P<0.05，均具有显著性差异，说明组1～组3的伤口愈合率要优于空白对照组；组3的伤口愈合率低于组1和组2，说明基质胶与脐带干细胞条件培养基的比例在1：1～2之间时，制剂的促进皮肤伤口愈合的效果较好。
表1实施例5中各组的制剂成分
组别 制剂成分
空白对照组 基质胶
组1 基质胶：脐带干细胞条件培养基＝1：1
组2 基质胶：脐带干细胞条件培养基＝1：2
组3 基质胶：脐带干细胞条件培养基＝1：3
表2实施例5中各组的伤口愈合率
组别 愈合率
空白对照组 26.14±3.84％
组1 43.87±2.56％*
组2 46.15±4.93％*
组3 35.02±2.41％*
*P<0.05，表示与对照组相比，具有显著性差异。
实施例6
取90只老鼠，进行创伤模型建立及分组。分组分为六组，阴性对照组1的制剂成分只包括基质胶，阴性对照组2的制剂成分包括基质胶和脐带干细胞条件培养基，基质胶与脐带干细胞条件培养基的比例为1：1，对比例的制剂成分包括脂肪干细胞、白蛋白、明胶和溶剂，组4～组6的制剂由内皮祖细胞、血管内皮因子、脐带干细胞条件培养基和基质胶制成，基质胶和脐带干细胞条件培养基的比例为1：1，血管内皮因子的含量为100ng/mL，但组4～组6内皮祖细胞的含量不同，各组的成分详见表3，各组的制剂均为固体。
将小鼠常规饲养7d后，按30mg/kg腹腔注射质量分数1％的戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，剃去背部毛，在背中部制备一个1cm×1cm创面，创面深至皮下，建立机械损伤小鼠模型。将上述的固体制剂分别展铺在伤口处，用医用胶布固定3天后，取下伤口上剩余敷料，用无菌纱布继续包扎伤口，7天后检测伤口愈合程度，结果如表4所示。
从表4可知，阴性对照组2的伤口愈合率为40.58％，对比例的伤口愈合率为75.46％，组4～组6的伤口愈合率分别为50.71％、86.83％、87.42％，与阴性对照组1的25.53％进行比较，P<0.001，均具有极显著性差异，说明了阴性对照2、对比例和组4～6的制剂的伤口愈合效果优于阴性对照组1；与阴性对照2相比，P<0.05，组4具有显著性差异；与阴性对照2相比，P<0.001，对比例和组5、组6均具有极显著差异，说明了添加内皮祖细胞的制剂的伤口愈合效果更好。此外，组5和组6制剂的伤口愈合效果优于对比例，P<0.05，具有显著性差异。
表3实施例6中各组的制剂成分
表4实施例6中各组的愈合率
组别 愈合率
阴性对照组1 25.43±2.49％◆◆
阴性对照组2 40.58±4.62％**◆◆
对比例 75.46±1.47％**##
组4 50.71±3.68％**◆◆
组5 86.83±5.39％**##◆
组6 87.42±3.65％**##◆
*P<0.05表示与阴性对照组相比，具有显著性差异；**P<0.001表示与阴性对照组相比，具有极显著性差异；#P<0.05表示与阳性对照组相比，具有显著性差异；##P<0.001表示与阳性对照组相比，具有极显著性差异；◆P<0.05表示与对比例1相比，具有显著性差异；◆◆P<0.001表示与对比例1相比，具有显著性差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种制剂，其特征在于，由内皮祖细胞、血管内皮因子、脐带干细胞条件培养基和基质胶制成。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述脐带干细胞条件培养基和所述基质胶的体积比为1：1～2。
3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述内皮祖细胞在所述制剂中的含量为5～8×106个/mL。
4.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述血管内皮因子在所述制剂中的含量为25～75ng/mL。
5.一种制剂的制备方法，其特征在于，包括：
a)0～4℃下将脐带干细胞条件培养基和基质胶混匀，得到第一混合液；
b)将含血管内皮因子的生理盐水重悬内皮祖细胞，得到第二混合液；
c)0～4℃下将所述第一混合液和所述第二混合液混匀后置于模具中成型，得到所述制剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一混合液和所述第二混合液的体积比为1：1～3。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述脐带干细胞条件培养基按照如下方法获得：
将脐带干细胞进行传代培养，获得P2～P5代脐带干细胞，收集所述P2～P5代脐带干细胞的培养上清液，得到所述脐带干细胞条件培养基。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将所述脐带干细胞进行传代培养之前，还包括：
将脐带组织依次进行消化处理和离心分离，得到脐带干细胞。
9.权利要求1～4任意一项所述制剂或权利要求5～8任意一项所述制备方法制得的制剂在促进皮肤伤口愈合中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述制剂的储存温度为0～4℃。
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