CN114507709A - 一种用于保护血液中游离dna的保护剂 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物试剂技术领域，具体公开一种用于保护血液中游离DNA的保护剂，其特征在于，每100ml所述保护剂包括如下组分：乙二胺四乙酸二钠5‑12g，茶多酚0.8‑1.5g，蛋白酶K 2‑8g，枸杞提取物2.5‑4.5g，余量为缓冲液。本申请至少具有以下有益效果之一：本申请提供的保护剂能够用于保护血液中游离DNA，防止游离DNA的降解，也能够防止基因组DNA降解而污染游离的DNA，而且本申请提供的cfDNA保护剂成分简单，来源广泛，不含有害成分，对环境友好，成本低，适用于大规模的工业化生产及推广。
Description
技术领域
本申请属于生物试剂技术领域，更具体地说，它涉及一种用于保护血液中游离DNA的保护剂。
背景技术
伴随着各种治疗手段的不断兴起，如早期的放疗，近代的化疗到现在的靶向治疗及免疫治疗，癌症的治疗正逐渐向精准化治疗模式发展，特别是靶向治疗和免疫治疗，由此对于特异性靶向人群的筛选显得尤为重要，而作为靶向药物疗法中不可或缺的临床辅助手段，癌症的基因检测直接关系到药物对于患者的治疗效率。
血浆游离DNA（cell free DNA，cf-DNA），是血浆中游离存在的DNA，cfDNA来源于机体细胞损伤，有的来自于正常细胞，有的来自于异常细胞（如肿瘤细胞）。对于健康人，其血液中的cfDNA主要来源是体细胞正常的新陈代谢，因此应该维持在一个较低的水平。然而，当有异常细胞（肿瘤细胞）形成或者有很严重的系统性器官损伤时，大量死亡的细胞（不管是凋亡或是坏死）会产生大量的cfDNA。通过对血浆ctDNA的检测可以实现对癌症患者的动态检测。但是cfDNA在血液中含量相对来说较少，而且很容易被降解或清除，最后严重影响检测结果。
发明内容
基于此，为了保护血液中游离DNA即cfDNA，本申请提供一种保护剂，该保护剂成分简单，能够防止血液中游离DNA的损失，使得检测结果更加准确。
本申请是通过以下方案实现的：
本申请提供一种用于保护血液中游离DNA的保护剂，每100ml所述保护剂包括：乙二胺四乙酸二钠5-12g，茶多酚0.8-1.5g，蛋白酶K 2-8g，枸杞提取物2.5-4.5g，余量为缓冲液。
本申请中，通过提供的保护剂能够有效地防止cfDNA的降解。
在本申请的一个具体实施方式中，所述提取物的制备方法如下：
1）取新鲜的枸杞果实清洗，破碎后打浆；过80目筛，收集果汁；
2）将果汁加热至45℃，调节pH值为4.0，然后按照果汁的重量加入0.04的果胶酶，混合均匀，静置0.5后，过滤收集滤液。使用果胶酶处理果汁，可加速果汁过滤，促进滤液的澄清。
3）按照滤液的重量加入0.5的活性炭进行搅拌吸附，过滤收集滤液。通过活性炭吸附枸杞中的玉米黄素，类胡萝卜素等有色色素。
4）向步骤3）的滤液中加入滤液重量0.05%的木瓜蛋白酶搅拌1h，然后加入滤液重量0.2%的三氯乙酸充分搅拌后，过滤收集滤液。通过木瓜蛋白酶酶解枸杞多糖链分子上的蛋白，使更多的枸杞多糖释放出来，然后通过加入的三氯乙酸将释放出的蛋白进行沉淀。
5）在-1.0~-0.8Mpa，温度为50℃-58℃条件下蒸发步骤4）所获得的滤液得到浓缩液。
6）向浓缩物中加入浓缩液重量1.5%-2.5%的活性炭搅拌0.5h-1h后静置，过滤取滤液。通过活性炭脱去浓缩液中的焦糖色素，使得过滤液更加的澄清。
7）向步骤6）中的滤液中加入4-8倍体积95%的乙醇，搅拌0.5h-1h后静置，过滤收集沉淀物，真空干燥，备用。
在本申请的一个具体实施方式中，所述枸杞提取物的制备方法如下：
1）取新鲜的枸杞果实清洗，破碎后打浆；过筛80目筛，收集果汁；
2）将果汁加热至45℃，调节pH值为4.0，然后按照果汁的重量加入0.04%的果胶酶，混合均匀，静置0.5h后，过滤收集滤液；
3）按照滤液的重量加入0.5%的活性炭进行搅拌吸附，过滤收集滤液；
4）向步骤3）的滤液中加入滤液重量0.05%的木瓜蛋白酶搅拌1h，然后加入滤液重量0.2%的三氯乙酸充分搅拌后，过滤收集滤液；
5）在-0.8Mpa，温度为55℃条件下蒸发步骤4）所获得的滤液得到浓缩液；
6）向浓缩物中加入浓缩液重量2%的活性炭搅拌0.5h后静置，过滤取滤液；
7）向步骤6）中的滤液中加入5倍体积95%的乙醇，搅拌0.5h后静置，过滤收集沉淀物，真空干燥，备用。
在本申请的一个具体实施方式中，每100ml所述保存剂中包括乙二胺四乙酸二钠8-10g，茶多酚1.0-1.2g，蛋白酶K 4-6g，上述枸杞提取物3-4g，余量为缓冲液。
在本申请的一个具体实施方式中，每100ml所述保存剂中包括：乙二胺四乙酸二钠10g，茶多酚1.0g，蛋白酶K 5g，上述枸杞提取物4g，余量为缓冲液。
在本申请的一个具体实施方式中，所述缓冲液为0.05mol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、0.2mol/l磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或1×PBS缓冲液中的一种。
在本申请的一个具体实施方式中，所述缓冲液为0.05mol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
在本申请的一个具体实施方式中，所述缓冲液的pH值为7.5。
在本申请的一个具体实施方式中，每100ml所述保存剂中还包括甘油2-6mL，例如每100ml所述保存剂中的甘油为2mL，3mL，4mL，5mL或6mL。
在本申请的一个具体实施方式中，每100ml所述保存剂中包括甘油5mL。
在本申请的一个具体实施方式中，每100ml所述保存剂中包括乙二胺四乙酸二钠10g，茶多酚1.0g，蛋白酶K 5g，上述枸杞提取物4g，甘油5mL，余量为缓冲液。
在本申请的一个具体实施方式中，每100mL cf保护剂中包括乙二胺四乙酸二钠10g，茶多酚1.0g，蛋白酶K 5g，枸杞提取物4g，甘油2mL，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
在本申请的一个具体实施方式中，每100mL cf保护剂中包括乙二胺四乙酸二钠10g，茶多酚1.0g，蛋白酶K 5g，枸杞提取物4g，甘油3mL，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
在本申请的一个具体实施方式中，所述制备方法具体包括将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物先加入到缓冲液中混合均匀，然后加入蛋白酶K进行混合。本申请的发明人发现在将蛋白酶K与乙二胺四乙酸二钠、茶多酚、枸杞提取物同时混合的时候，配制的保护液在放置一段时间之后稍微有些浑浊，而将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物先加入到缓冲液中混合均匀，然后将蛋白酶K加入再混合均匀后所制备的保护剂则无浑浊现象。
在本申请的一个具体实施方式中，如果保护剂中含有甘油，则甘油在最后一步加入，即先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到缓冲液中混合均匀，再加入蛋白酶K进行混合，混合均匀之后，再加入甘油混合均匀。
本申请提供的方法至少具有以下有益效果之一：
本申请提供的保护剂能够用于保护血液中游离DNA，防止游离DNA的降解，也能够防止基因组DNA降解而污染游离的DNA，而且本申请提供的cfDNA保护剂成分简单，来源广泛，不含有害成分，对环境友好，成本低，适用于大规模的工业化生产及推广。
附图说明
图1为本申请实施例中提供的cfDNA检测结果图。
具体实施方式
除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
茶多酚：安徽红星药业，纯度大于95%。
枸杞提取物的制备
1）取新鲜的枸杞果实清洗，破碎后打浆；过筛80目筛，收集果汁；
2）将果汁加热至45℃，调节pH值为4.0，然后按照果汁的重量加入0.04%的果胶酶，混合均匀，静置0.5h后，过滤收集滤液；
3）按照滤液的重量加入0.5%的活性炭进行搅拌吸附，过滤收集滤液；
4）向步骤3）的滤液中加入滤液重量0.05%的木瓜蛋白酶搅拌1h，然后加入滤液重量0.2%的三氯乙酸充分搅拌后，过滤收集滤液；
5）在-0.8Mpa，温度为55℃条件下蒸发步骤4）所获得的滤液得到浓缩液；
6）向浓缩物中加入浓缩液重量2%的活性炭搅拌0.5h后静置，过滤取滤液；
7）向步骤6）中的滤液中加入5倍体积95%的乙醇，搅拌0.5h后静置，过滤收集沉淀物，真空干燥，备用。
实施例1
本实施例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠5g，茶多酚0.8g，蛋白酶K 2g，枸杞提取物2.5g，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
cfDNA保护剂的制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，再加入蛋白酶K混合均匀，最后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
实施例2
本实施例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠8g，茶多酚1.0g，蛋白酶K 4g，枸杞提取物3g，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
cfDNA保护剂的制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，再加入蛋白酶K混合均匀，最后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
实施例3
本实施例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠10g，茶多酚1.2g，蛋白酶K 6g，枸杞提取物4g，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
cfDNA保护剂的制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，再加入蛋白酶K混合均匀，最后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
实施例4
本实施例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠12g，茶多酚1.5g，蛋白酶K 8g，枸杞提取物4.5g，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
cfDNA保护剂的制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，再加入蛋白酶K混合均匀，最后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
实施例5
本实施例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠10g，茶多酚1.0g，蛋白酶K 5g，枸杞提取物4g，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
cfDNA保护剂的制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，再加入蛋白酶K混合均匀，最后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
实施例6
本实施例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠10g，茶多酚1.0g，蛋白酶K 5g，枸杞提取物4g，甘油2mL，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
cfDNA保护剂的制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，再加入蛋白酶K混合均匀，再加入甘油混合均匀，最后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
实施例7
本实施例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠10g，茶多酚1.0g，蛋白酶K 5g，枸杞提取物4g，甘油3mL，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
cfDNA保护剂的制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，再加入蛋白酶K混合均匀，再加入甘油混合均匀，最后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
实施例8
本实施例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠10g，茶多酚1.0g，蛋白酶K 5g，枸杞提取物4g，甘油5mL，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
cfDNA保护剂的制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，再加入蛋白酶K混合均匀，再加入甘油混合均匀，最后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
对比例1
本对比例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠5g，茶多酚0.8g，蛋白酶K 2g，枸杞提取物2.5g，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚，蛋白酶K和枸杞提取物同时加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，然后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
对比例1与实施例1的区别在于cfDNA保护剂的制备方法不同。
对比例2
本对比例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠5g，茶多酚0.8g，蛋白酶K 2g，枸杞提取物5g，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
cfDNA保护剂的制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，再加入蛋白酶K混合均匀，最后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
对比例2与实施例1的区别在于枸杞提取物加入的含量不同。
对比例3
本对比例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠12g，茶多酚1.5g，蛋白酶K 8g，枸杞提取物2g，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
cfDNA保护剂的制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，再加入蛋白酶K混合均匀，最后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
对比例3与实施例4的区别在于枸杞提取物的加入量不同。
对比例4
本对比例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠12g，茶多酚1.5g，蛋白酶K 8g，枸杞提取物5g，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
cfDNA保护剂的制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，再加入蛋白酶K混合均匀，最后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
对比例3与实施例4的区别在于枸杞提取物的加入量不同。
对比例5
本对比例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠10g，茶多酚1.0g，蛋白酶K 5g，枸杞提取物4g，甘油5mL，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚，蛋白酶K，枸杞提取物和甘油同时加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，然后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
对比例5与实施例8的去别在于蛋白酶K与甘油加入的顺序不同。
对比例6
本对比例中提供的cfDNA保护剂：100mL保护剂中：乙二胺四乙酸二钠10g，茶多酚1.0g，蛋白酶K 5g，枸杞提取物4g，甘油7mL，余量为缓冲液，缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为7.5。
cfDNA保护剂的制备方法：量取60ml Tris-HCl缓冲液，称取上述组分，先将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到Tris-HCl缓冲液中，混合均匀，再加入蛋白酶K混合均匀，再加入甘油混合均匀，最后用Tris-HCl缓冲液补足100ml即可。
对比例6与实施例8的区别在于甘油的加入量不同。
上述cfDNA保护剂中，实施例1-8、对比例2-4和对比例6中的cfDNA保护液完全澄清，而对比例1和对比例5中的cfDNA保护液放置一段时间之后稍微有些絮状物。可能原因是蛋白酶K与其他成分直接混合时发生了沉淀反应，从而使蛋白酶发生了沉淀。
去掉对比例1和对比例5，实验实施例1-8，对比例2-4和6中所制备的cfDNA保护剂对血液样本中cfDNA的保护作用。
实验方法：
采用真空采血管对12位志愿者（标记Z1-Z12），每人抽取5ml血液样品，然后分别加入实施例1-8，对比例2-4和6中所制备的cfDNA保护剂，加入量按照保护剂与血液样本的体积比为1:50加入，即5ml的血液样品加入100μL cfDNA保护剂，上下颠倒混匀10次，混合均匀后分装。例如，Z1中加入实施例1所制备的cfDNA保护剂，混合均匀后，将其分装到4个无菌EP管中，每管1ml。将分装后的血液样品分别置于室温下放置0天（不超过6小时）、4天、7天、14天，每个时间点取每个志愿者的1管血液样品进行分离血浆。
血浆分离方法：将血液样品放入离心机中，4℃，1600g离心10min，吸取上清到新的EP管中。将第一次离心后获得的上清再次放入离心机中，4℃，16000g离心10min，只吸取600μl上清到一个新的EP管中，获得血浆样本。
cfDNA的提取：利用CNAKitTMcfDNA提取试剂盒（世和基因）提取血浆样本中的cfDNA。
取3μL上述提取到的cfDNA样本作为模板进行PCR扩增，利用β-actin基因的CT值来检测血液样品中游离DNA量的变化。
PCR反应体系如下：
Primer-F：CTGGGAAGGTTACAGGAAGA
Primer-R：AATTGGCTCAAACAACGTGAAT
PCR反应条件：53℃，2min；97℃，2min；
35个循环：95℃，15s，65℃，45s。
实验结果：在14天时，对比例2和对比例4有沉淀产生，实施例1-8及对比例3和6完全澄清，
上述不同志愿者，不同时间点的检测结果如下表1所示。
表1 检测结果
在14天时，对比例2和对比例4有些许沉淀絮状物，而其他实施例或对比例中的溶液均为澄清。
从上述表1中可以看出，实施例1-3中，cfDNA的CT值分别接近于30.0，实施例4中的CT值接近于31.3，实施例5中的CT值接近于30.2，实施例6中的CT值接近于30.0，实施例7中的CT值31.0，实施例8中的CT值接近于31.1，而且他们的CV值均小于5%，尤其是实施例6-8中的CV值更小，而对比例3和对比例6中的CV值均大于5%，说明实施例1-8中的cfDNA的量稳定。
利用捷伦2100生物分析仪检测实施例1-8中的cfDNA保护液保护的cfDNA的含量。
图1为实施例8中的保存14天后的cfDNA的检测结果图，其他实施例中的检测结果与实施例8的检测结果类似。
从图1可以看出，保存14天后，在180bp左右出现主峰，符合血浆游离DNA片段大小，血浆游离DNA完整无降解，200bp以上无明显杂质峰，说明不存在基因组DNA降解片段，不存在基因组DNA的污染。由此可见，利用本申请提供的cfDNA保护剂能够有效地保护血浆中游离的DNA。
综上，本申请提供的用于保护cfDNA的保护剂，能够有效地保护游离的DNA，使得游离DNA不被降解，也能够防止基因组DNA降解而污染游离的DNA，而且本申请提供的cfDNA保护剂成分简单，来源广泛，不含有害成分，对环境友好，成本低，适用于大规模的工业化生产及推广。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种用于保护血液中游离DNA的保护剂，其特征在于，每100ml所述保护剂包括如下组分：
乙二胺四乙酸二钠5-12g，茶多酚0.8-1.5g，蛋白酶K 2-8g，枸杞提取物2.5-4.5g，余量为缓冲液。
2.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，每100ml所述保存剂中包括：乙二胺四乙酸二钠8-10g，茶多酚1.0-1.2g，蛋白酶K 4-6g，枸杞提取物3-4g，余量为缓冲液。
3.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，每100ml所述保存剂中包括：乙二胺四乙酸二钠10g，茶多酚1.0g，蛋白酶K 5g，枸杞提取物4g，余量为缓冲液。
4.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，所述缓冲液为0.05mol/l Tris-HCl缓冲液、0.2mol/l磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或1×PBS缓冲液中的一种。
5.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，所述缓冲液为0.05mol/l Tris-HCl缓冲液。
6.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，每100ml所述保存剂中还包括甘油2-5mL。
7.根据权利要求6所述的保护剂，其特征在于，所述甘油为5mL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂与血液样本的体积比为1:50~1:55。
9.根据权利要求8所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂与血液样本的体积比为1:50。
10.权利要求1-9中任一项所述的保护剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将乙二胺四乙酸二钠，茶多酚和枸杞提取物加入到缓冲液中混合均匀；
S2：再将蛋白酶加入到缓冲液中混合均匀。
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