JP2010217198A - 生物学的試料を収集し安定化させるための方法および装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】所定の体積の生物学的試料、特に全血試料を収集するための収集容器および方法は、遺伝子誘導を安定化させ抑制するのに有効な量で、少なくとも1種の遺伝子誘導阻止剤を含む。遺伝子誘導阻止剤は、収集時点で生物学的試料中の核酸を安定化させ、室温で保管される場合に、試料中の生体外遺伝子誘導を阻止することができる。安定化剤には、陽イオン性化合物、洗剤、特に陽イオン性洗剤、カオトロピック塩、リボヌクレアーゼ阻害物質、キレート剤、有機溶媒、有機還元試薬、およびこれらの混合物が含まれる。生物学的試料は、動物から直接収集され、いずれの中間の処理または取扱いなしに、すぐに遺伝子誘導阻止剤と混合される。
【選択図】図1
Description
本発明は、生物学的試料、特に全血試料を、患者から直接収集し、保管し、輸送し、安定化させるための方法および装置を指向する。より詳細には、本発明は、生物学的試料を収集した後すぐに核酸を安定化させ、保管中の生体外での(ex vivo)遺伝子の誘導(induction)および分解を抑制する安定化添加剤がその中に含まれた液体試料用の陰圧容器に関する。
この例では、血液と安定化剤の比、ならびに安定化剤の濃度の影響を実証する。
125mM酒石酸
試料 pH 保管期間(時間) 収量(μg)
1 3.3 24 8.4
2 3.3 24 7.6
3 3.5 24 9.5
4 3.5 24 9.8
5 3.7 24 13.3
6 3.7 24 17.2
7 3.3 72 7.2
8 3.3 72 6.8
9 3.5 72 10.3
10 3.5 72 10.9
11 3.7 72 14.8
12 3.7 72 16.1
200mM酒石酸
試料 pH 保管期間(時間) 収量(μg)
13 3.3 24 5.9
14 3.3 24 7.4
15 3.5 24 10.6
16 3.5 24 10.9
17 3.7 24 17.2
18 3.7 24 18.5
19 3.3 72 5.1
20 3.3 72 5.3
21 3.5 72 7.2
22 3.5 72 7.1
23 3.7 72 13.3
24 3.7 72 16.6
この例は、室温で1時間、24時間、48時間、および72時間保管した、3人の異なるドナー由来の血液試料で実施したノーザンブロット分析の結果を示す。
この例では、本発明の収集装置によるRNAの安定化と、従来のEDTAの入ったチューブによるRNAの安定化とを比較する。
また、安定化された血液試料からゲノムDNAを単離することも可能であった。クエン酸ナトリウムを含む血液収集装置で血液2.5mlを引き込み、16×100mmポリエチレンチューブ内で、4%(w/v)テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートおよび200mM酒石酸を含む安定化緩衝液6.9mlと混合した。試料は、それぞれ室温で24時間および72時間保管した。ゲノムDNAを単離するために、チューブを5000×gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを水で1回洗浄した。さらに5000×gで10分間遠心分離した後、ペレットを、EDTAと塩化ナトリウムを含む緩衝液300μl、および溶解緩衝液、すなわちAL緩衝液(QIAGEN GmbH)400μlに溶解させ、20μlのプロテイナーゼKを加えた。65℃で10分間のプロテイナーゼ消化の後、98%エタノール420μlを加えた。次いで、8000×gでの1分間の遠心分離によって、試料をシリカ膜を含むスピンカラムに適用した。スピンカラムを、グアニジニウムヒドロクロリドを含む洗浄緩衝液様の緩衝液AW1(QIAGEN GmbH)で1回洗浄し、エタノールを含む緩衝液様の緩衝液AW2(QIAGEN GmbH)で1回洗浄した。次いで、300μlのトリス緩衝液によってDNAをシリカ膜から溶出させた。
Claims (27)
- 生物学的試料を収集し安定化するための装置であって、前記装置が
前記生物学的試料を受け入れるために寸法設定された内部チャンバを画定する容器であって、前記容器が開口端部と、前記開口端部を密閉するクロージャとを有し、前記容器に所定の体積の前記生物学的試料を引き込むための大気圧未満の内圧を有するもの、および、
前記生物学的試料中での生体外遺伝子誘導を阻止し、核酸の酵素分解に対して前記生物学的試料を安定化させるための、前記容器内に含まれる遺伝子誘導阻止剤
を含み、
前記遺伝子誘導阻止剤が陽イオン性化合物を含み、かつ前記試料中で核酸を安定化するためのプロトン供与体を含まないことを特徴とする装置。 - 前記生物学的試料は、全血であり、前記容器は、前記遺伝子誘導阻止剤で予備充填され、血液試料を含むように寸法設定されていることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記陽イオン性化合物は、式YR1R2R3R4Xを有する安定化剤を含むことを特徴とする請求項1に記載の装置。
(式中、Yは、窒素またはリンであり、
R1、R2、R3、およびR4は、分岐アルキル、非分岐アルキル、C6〜C20アリール、およびC6〜C26アラルキルから成る群から独立して選択され、
Xは、陰イオンである。) - 前記分岐アルキルは、C3〜C20アルキルであり、前記非分岐アルキルは、C1〜C20アルキルであることを特徴とする請求項3に記載の装置。
- Xは、ホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキサレート、マロネート、スクシネート、シトレート、ブロミド、およびクロリドから成る群から選択されることを特徴とする請求項3に記載の装置。
- 前記R1は、12、14、または16個の炭素原子を有するアルキルであり、R2、R3、およびR4は、メチルであることを特徴とする請求項3に記載の装置。
- 前記遺伝子誘導阻止剤は、前記生物学的試料中の細胞を溶解させるものであることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記遺伝子誘導阻止剤は、網状赤血球、バクテリア、赤血球、および白血球を溶解させることを特徴とする請求項7に記載の装置。
- 前記遺伝子誘導阻止剤は、前記生物学的試料中の核酸を保護し、安定化させるものであることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 生物学的試料中の生体外遺伝子誘導を阻止する方法であり、
試料収集容器を提供する工程であって、前記容器が生物学的試料の生体外遺伝子誘導を安定化させ阻止する、少なくとも1種の遺伝子誘導阻止剤を含む内部チャンバを有し、大気圧未満の内圧を有し、前記方法は、前記陰圧によって所定体積の前記生物学的試料を前記容器内に直接引き込んで、前記遺伝子誘導阻止剤と混合することを含み、前記遺伝子誘導阻止剤が陽イオン性化合物を含み、かつ、前記遺伝子誘導阻止剤は前記試料中で核酸を安定化するためのプロトン供与体を含まない工程と、
生物学的試料を動物から前記試料収集容器内に直接収集し、すぐに前記生物学的試料を前記遺伝子誘導阻止剤と混合して、安定化された生物学的試料を形成する工程
とを含むことを特徴とする方法。 - 前記生物学的試料は全血であり、前記方法は、前記全血試料を動物から取り出し、前記試料収集容器内の前記遺伝子誘導阻止剤に直接接触するように前記全血試料を導入し、前記全血試料中の細胞を溶解させ、核酸を安定化させる工程を含むことを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記生物学的試料は、赤血球濃縮液、血小板濃縮液、白血球濃縮液、腫瘍細胞、骨髄吸引物、組織、細針吸引物、および頸部試料から成る群から選択されることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記生物学的試料は、血漿、血清、尿、ならびに脳脊髄液および唾液から成る群から選択される体液であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記生物学的試料は、バクテリアおよび真核微生物から成る群から選択されることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記生物学的試料は、体液、組織、体物質スワブ、および体物質スミアから成る群から選択されることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記遺伝子誘導阻止剤は、式YR1R2R3R4Xを有する安定化剤を含むことを特徴とする請求項10に記載の方法。
(式中、Yは、窒素またはリンであり、
R1、R2、R3、およびR4は、分岐アルキル、非分岐アルキル、C6〜C20アリール、およびC6〜C26アラルキルから成る群から独立して選択され、
Xは、陰イオンである。) - 前記分岐アルキルは、C3〜C20アルキルであり、前記非分岐アルキルは、C1〜C20アルキルであることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- Xは、ホスフェート、サルフェート、ホルメート、アセテート、プロピオネート、オキサレート、マロネート、スクシネート、シトレート、ブロミド、およびクロリドから成る群から選択されることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記R1は、12、14、または16個の炭素原子を有するアルキルであり、R2、R3、およびR4は、メチルであることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 安定な全血試料を調製する方法であって、前記方法が、
内部チャンバを有する試料収集容器であって、前記容器が、全血試料中の生体外遺伝子誘導を安定化させ阻止する遺伝子誘導阻止剤の水溶液または分散液で予備充填され、大気圧未満の内圧を有しており、前記方法が、前記陰圧によって所定体積の前記生物学的試料を前記容器内に直接引き込むことを含むものを提供する工程と、
全血試料を患者から前記試料収集容器内に直接収集し、前記血液試料を前記遺伝子誘導阻止剤と混合して、室温で安定な全血試料を形成する工程
とを含み、
前記遺伝子誘導阻止剤が、式YR1R2R3R4X(式中、Yは、窒素あり、R1、R2、R3、およびR4は、分岐または非分岐アルキルから独立して選択され、Xは、陰イオンである。)であり、かつ、前記遺伝子誘導阻止剤は前記試料中の核酸を安定化するプロトン供与体を含まないことを特徴とする方法。 - 前記クロージャは、隔壁であり、前記方法は、前記隔壁をカニューレで穿孔し、前記カニューレを通じて前記全血試料を前記収集容器に導入する工程を含むことを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 前記水溶液または分散液は、pH2からpH5のpHを有することを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 前記水溶液または分散液は、前記血液試料と混合する前に、pH3.6からpH3.8のpHを有することを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 前記遺伝子誘導阻止剤は、3.9から4.1のpHを有する前記血液試料との混合物を生成することを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 前記血液試料と前記遺伝子誘導阻止剤とを、血液対阻害剤の体積比1:2.5から1:3.1で混合する工程を含むことを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 前記遺伝子誘導阻止剤は、室温で安定な前記血液試料との混合物を形成することを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 前記遺伝子誘導阻止剤は、−20℃から−80℃の温度で安定な前記血液試料との混合物を形成し、前記混合物は、実質的に核酸の分解なしに解凍できることを特徴とする請求項20に記載の方法。
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