ES2942577T3 - Solución de conservación de ácidos nucleicos y procedimientos de uso - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones conservantes de ácido nucleico y métodos de fabricación y uso de las mismas. Las composiciones incluyen un vehículo, un agente caotrópico, un agente amortiguador, un agente quelante, un tensioactivo, un alcohol, un ácido y un agente mucolítico. Las composiciones como soluciones acuosas pueden incluir agua como vehículo. Las realizaciones preferidas incluyen agua, tiocianato de guanidina, Tris, EDTA, SLS, SDA 3C, HCl y N-acetil-L-cisteína. Algunas realizaciones incluyen un tinte coloreado como indicador visual. Los métodos de fabricación incluyen combinar los componentes en una mezcla, como una solución acuosa. Los métodos de uso incluyen proporcionar una muestra biológica que incluye ácido nucleico y poner en contacto la muestra biológica con la composición. Los kits incluyen la composición dispuesta en una parte de un aparato de recogida de muestras biológicas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Solución de conservación de ácidos nucleicos y procedimientos de uso

Antecedentes

1. Campo Técnico

La presente divulgación se refiere a la conservación de ácido nucleico. Específicamente, la presente divulgación se refiere a composiciones y procedimientos para preservar el ácido nucleico humano en una muestra biológica para su posterior análisis.

2. Tecnología relacionada

El ácido nucleico puede extraerse de muestras biológicas que incluyan ácidos nucleicos celulares y/o libres de células. El ácido nucleico extraído puede utilizarse para diversos fines analíticos, incluido el análisis genealógico. La extracción de ácidos nucleicos de la saliva puede ser especialmente útil, ya que la recolección de muestras de saliva es relativamente poco invasiva.

Las muestras biológicas que contienen ácidos nucleicos a menudo necesitan ser procesadas adecuadamente para tipos específicos de análisis de ácidos nucleicos. Las técnicas analíticas como la secuenciación de ácidos nucleicos (por ejemplo, la secuenciación de próxima generación [NGS]), por ejemplo, pueden requerir pasos específicos de procesamiento o preprocesamiento que dependen de la plataforma específica que se vaya a utilizar. En algunos casos, puede ser necesario procesar las muestras biológicas que contienen ácido nucleico para estabilizar la muestra o el ácido nucleico de la misma. A menudo se añaden soluciones estabilizadoras a las muestras biológicas que contienen ácidos nucleicos para garantizar la supervivencia de una parte de los ácidos nucleicos hasta que pueda realizarse su análisis.

Las soluciones estabilizadoras existentes pueden no ser óptimas para determinados tipos de técnicas analíticas o dispositivos para la realización de las mismas. Por ejemplo, una solución estabilizadora formulada para un análisis óptimo o adecuado en un determinado secuenciador de nueva generación, puede no ser óptima o adecuada para el análisis en otros secuenciadores de nueva generación.x En algunos casos, una formulación inadecuada puede producir o conducir a artefactos analíticos, alta señal de fondo (o ruido), contaminación y/o retención de ácidos nucleicos microbianos, y/o reducir el rendimiento potencial total de ácido nucleico humano.

Las soluciones estabilizantes existentes también pueden ser deficientes en el control de la vida microbiana. Las muestras biológicas, como la saliva, a menudo incluyen y/o se contaminan con uno o más microbios (por ejemplo, bacterias, hongos, etc.). Estos microbios contienen ácidos nucleicos que pueden interferir o detectarse junto con el ácido nucleico del huésped o fuente de la muestra biológica. Las soluciones de conservación pueden estabilizar inadvertidamente los ácidos nucleicos microbianos o incluso permitir el crecimiento de los microorganismos.

Los documentos US2014038174 y US2015252354 se refieren a soluciones de conservación de ácidos nucleicos.

En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de una solución universal estabilizadora de ácido nucleico adecuada para una variedad de técnicas y dispositivos analíticos y/o una solución que proporcione un mejor rendimiento global de ácido nucleico y calidad de la muestra, en comparación con los productos existentes.

Breve sumario

La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

Las realizaciones de la presente divulgación resuelven uno o más de los problemas anteriores u otros problemas de la técnica con una o más realizaciones que comprenden composiciones de conservación, estabilización y/o preparación de ácidos nucleicos, kits que comprenden las mismas y procedimientos de fabricación y uso de las mismas. Por ejemplo, algunas realizaciones de la presente divulgación incluyen composiciones para preservar, estabilizar y/o preparar ácido nucleico en una muestra biológica. La composición puede ser adecuada para su uso en una variedad de técnicas y dispositivos analíticos. La composición puede producir grandes cantidades de ácido nucleico para su posterior análisis. Por ejemplo, la composición puede producir altas cantidades de ácido nucleico humano (por ejemplo, ADN), preferentemente y/u opcionalmente con bajas cantidades de ácido nucleico microbiano (por ejemplo, bacteriano) (por ejemplo, ADN) para su posterior análisis. La composición puede comprender una solución o un líquido a base de agua (por ejemplo, acuoso), opcionalmente de color azul (claro), adecuado para su uso en la estabilización del ácido nucleico humano (ADN) y la prevención de la contaminación bacteriana y para el almacenamiento a largo plazo.

Se divulga, pero no forma parte de la invención reivindicada, una composición de conservación de ácidos nucleicos, que comprende un portador acuoso, un agente caotrópico, un agente tamponador, un agente quelante, un tensioactivo, un alcohol, un ácido; y un agente mucolítico. Una realización puede incluir además un indicador visual. En algunas realizaciones, el portador acuoso puede ser o comprender agua, preferentemente filtrada, purificada, destilada y/o desionizada. En algunas realizaciones, el agente caotrópico puede ser o comprender guanidina y/o tiocianato, preferentemente tiocianato de guanidina. En algunas realizaciones, el agente tampón puede ser o comprender tris(hidroximetil)aminometano (Tris), preferentemente Tris-HCl, más preferentemente base Trizma® . En algunas realizaciones, el agente quelante puede ser o comprender ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), preferentemente como sal EDTA disódica, más preferentemente como (sal) EDTA disódica dihidratada. En algunas realizaciones, el tensioactivo puede ser o comprender lauroil sarcosinato sódico (SLS). En algunas realizaciones, el alcohol puede ser o comprender un alcohol especialmente desnaturalizado (SDA) o una mezcla de etanol e isopropanol, preferentemente una mezcla de aproximadamente 95% de etanol, v/vy aproximadamente 5% de isopropanol, v/v, o SDA3C. En algunas realizaciones, el ácido puede ser o comprender ácido clorhídrico. En algunas realizaciones, el agente mucolítico puede ser o comprender N-acetil-L-cisteína. En algunas realizaciones, el indicador visual puede ser o comprender un agente colorante, como un tinte (por ejemplo, FD&C Blue No. 1).

Se divulga, pero no forma parte de la invención reivindicada, una composición de conservación de ácido nucleico humano, que comprende aproximadamente 43,92% de agente caotrópico (p. ej., tiocianato de guanidina), p/p, aproximadamente 2,65% de agente tamponador (p. ej., Tris), p/p, aproximadamente 0,81% de agente quelante (p. ej., EDTA dihidrato disódico), p/p, aproximadamente 0,279% de agente tensioactivo (p. ej, SLS), p/p, aproximadamente 17,73% de alcohol (p. ej., SDA3C), p/p, aproximadamente 0,093% de agente mucolítico (p. ej., N-acetil-L-cisteína), p/p, aproximadamente 0,4% de ácido (p. ej., ácido clorhídrico), p/p, ácido clorhídrico), p/p o ácido qs a aproximadamente pH 8,0; y/o aproximadamente 34,12% de portador (p. ej., un portador acuoso que comprende agua filtrada, purificada, destilada y/o desionizada) o portador qs al 100%. Una realización puede incluir además alrededor de un 0,00037%, p/p, de indicador visual (p. ej., FD&C Blue n.° 1) o su equivalente (p. ej., 0,185%, p/p, de un 0,2%, p/p, de indicador visual concentrado (p. ej., en agua)).

Una o más realizaciones pueden incluir 43,92% de agente caotrópico (p. ej., tiocianato de guanidina), p/p, ±10%, 2,65% de agente tampón (p. ej., Tris), p/p, ±10%, 0,81% agente quelante (p. ej., EDTAo EDTAdisódico (sal) dihidrato), p/p, ±10%, 0,279% tensioactivo (p. ej., SLS), p/p, ±10%, 17,73% alcohol (p. ej., SDA 3C o una mezcla de 95% de etanol, v/v, ±10%, y 5% de isopropanol, v/v, ±10%), p/p, ±10%, 0,093% de agente mucolítico (por ejemplo, N-acetil-L-cisteína), p/p, ±10%, y/o ácido (por ejemplo, ácido clorhídrico) qs a pH 8,0, ±10%, con un portador (por ejemplo, un portador acuoso, preferentemente agua filtrada, purificada, destilada y/o desionizada) qs a 100%. Una realización puede incluir además 0,00037%, p/p, ±10% de indicador visual (p. ej., FD&C Blue No. 1) o su equivalente (p. ej., 0,185%, p/p, ±10%, de un 0,2%, p/p, ±10% de indicadorvisual concentrado (p. ej., en agua)). En algunas realizaciones, la cantidad de cada componente, ±10%, es además (limitada a la cantidad citada) ±9%, preferentemente ±8%, más preferentemente ±7%, aún más preferentemente ±6%, aún más preferentemente ±5%, aún más preferentemente ±4%, aún más preferentemente ±3%, aún más preferentemente ±2%, aún más preferentemente ±1%.

Una o más realizaciones pueden incluir 20-50% de agente caotrópico, p/p, 0,1-5% de agente tampón, p/p, 0,05-2,5% de agente quelante, p/p, 0,01-5% de tensioactivo, p/p, 5-25% de alcohol, p/p, 0,005-0,25% de agente mucolítico, p/p, 0,005-5% de ácido o ácido qs a pH 6,5-9,5, y/o 10-60% de portador o portador qs al 100%. Una realización puede incluir 0,00005-0,5%, p/p, de indicadorvisual (o 0,01-2,5%, p/p, de un 0,05-5%, p/p, de indicadorvisual concentrado (por ejemplo, en agua)).

Una o más realizaciones pueden estar (sustancialmente) desprovistas de (adicional o cualquier) agente(s) antimicrobiano(s) (p. ej., bactericida(s) y/o bacteriostático(s)) (p. ej., además o aparte de alcohol(es), agente(s) caotrópico(s), tensioactivo(s)/detergente(s), y/o agente(s) mucolítico(s)). Una o más realizaciones pueden estar (sustancialmente) desprovistas de inhibidor(es) de ribonucleasas (adicionales o cualesquiera), o de inhibidor(es) de ribonucleasas (por ejemplo, además de los agentes caotrópicos u otros). Una o más realizaciones pueden estar (sustancialmente) desprovistas de (cualquier) proteasa(s).

Se divulga, pero no forma parte de la invención reivindicada, un procedimiento de estabilización de ácido nucleico. El procedimiento puede incluir proporcionar una muestra biológica que contenga el ácido nucleico y combinar una composición de la presente divulgación con la muestra biológica. El procedimiento también puede incluir otros pasos de procesamiento conocidos en la técnica. Una realización de la presente divulgación incluye un procedimiento de estabilización de ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico humano, tal como ADN humano). Una realización comprende poner en contacto una muestra biológica que contiene el ácido nucleico con una composición de la presente divulgación. En una realización, la muestra biológica comprende saliva humana.

Se divulga, pero no forma parte de la invención reivindicada, un kit de conservación de muestras biológicas. El kit puede comprender un aparato de recolección de muestras y una composición de conservación de ácidos nucleicos. El aparato de recolección de muestras puede incluir un compartimento para la solución. La composición de conservación del ácido nucleico puede disponerse en el compartimento de la solución. Una realización de la presente divulgación incluye un kit que comprende una composición de la presente divulgación dispuesta en una porción de un aparato de recolección de muestras.

Se divulga, pero no forma parte de la invención reivindicada, un procedimiento de fabricación de una composición de la presente divulgación. El procedimiento puede incluir la combinación de componentes de la presente divulgación. El procedimiento también puede incluir otros pasos de fabricación conocidos en la técnica. Una realización de la presente divulgación incluye un procedimiento de fabricación de una composición de estabilización de ácido nucleico. Una realización comprende la obtención de un portador y la adición al mismo de componentes o ingredientes de una composición de la presente divulgación.

Las características y ventajas adicionales de las realizaciones ejemplares de la presente descripción se expondrán en la descripción que sigue, y en parte serán evidentes a partir de la descripción, o se pueden aprender mediante la práctica de dichas realizaciones ejemplares. Las características y ventajas de tales realizaciones pueden realizarse y obtenerse por medio de los instrumentos y combinaciones particularmente señalados en las reivindicaciones adjuntas. Estas y otras características se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas, o se pueden aprender mediante la práctica de dichas realizaciones ejemplares que se exponen a continuación.

Breve descripción de las figuras

Con el fin de describir la manera en que pueden obtenerse las ventajas y características citadas y otras ventajas y características de la presente divulgación, se realizará una descripción más particular de las implementaciones descritas brevemente anteriormente haciendo referencia a implementaciones específicas de las mismas, que se ilustran en los dibujos adjuntos. Para una mejor comprensión, los elementos similares han sido designados por números de referencia similares a lo largo de la(s) figura(s). Entendiendo que estos dibujos representan únicamente realizaciones típicas de la invención y que, por lo tanto, no deben considerarse limitativos de su alcance, la invención se describirá y explicará con mayor especificidad y detalle mediante el uso de los dibujos adjuntos en los que:

La figura 1A es una imagen de un gel con ADN de alto peso molecular preservado utilizando composiciones según una realización de la presente divulgación; y

La Figura 1B es una imagen de un gel con Bionexus All Purpose HI-LO DNAMarker.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Antes de describir en detalle diversas realizaciones de la presente divulgación, debe entenderse que esta divulgación no se limita a los parámetros específicos y a la descripción de los sistemas, procedimientos y/o productos particularmente ejemplificados, que pueden variar de una realización a otra. Por lo tanto, aunque ciertas realizaciones de la presente divulgación se describirán en detalle, con referencia a características específicas (por ejemplo, configuraciones, parámetros, propiedades, pasos, componentes, ingredientes, miembros, elementos, partes y/o porciones, etc.), las descripciones son ilustrativas y no deben interpretarse como limitativas del alcance de la presente divulgación y/o de la invención reivindicada. Además, la terminología empleada en el presente documento tiene por objeto describir las realizaciones y no pretende necesariamente limitar el alcance de la presente divulgación y/o de la invención reivindicada.

Aunque la descripción detallada está dividida en secciones, los encabezados de sección y los contenidos de cada sección no pretenden ser descripciones y realizaciones autónomas. Por el contrario, el contenido de cada sección de la descripción detallada debe leerse y entenderse como un todo colectivo en el que los elementos de una sección pueden referirse a otras secciones o informar sobre ellas. En consecuencia, las realizaciones específicamente divulgadas dentro de una sección también pueden relacionarse y/o servir como realizaciones adicionales y/o alternativas en otra sección que tenga los mismos y/o similares sistemas, dispositivos, procedimientos y/o terminología.

Lista abreviada de términos definidos

Para ayudar a comprender el alcance y el contenido de la descripción escrita anterior y siguiente y de las reivindicaciones anexas, a continuación se definen directamente algunos términos seleccionados. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con conocimientos normales en la técnica a la que pertenece la divulgación.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión transitoria "consistente esencialmente en" significa que el alcance de una reivindicación debe interpretarse de manera que abarque los materiales o pasos especificados que se citan en la reivindicación, "y aquellos que no afecten materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s)" de la invención reivindicada. Véase, In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.PQ. 461,463 (CCPA1976) (énfasis en el original); véase también MPEP § 2111.03. Por lo tanto, el término "que consiste esencialmente en" cuando se utiliza en una reivindicación de esta divulgación no debe interpretarse como equivalente a "que comprende"

El término "ácido nucleico", tal como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido o polinucleótido natural o sintético, ya sea ADN o ARN o híbrido ADN-ARN, monocatenario o bicatenario, en sentido o antisentido, que es capaz de hibridarse con un ácido nucleico complementario por apareamiento de bases Watson-Crick. Los ácidos nucleicos de la invención también pueden incluir análogos de nucleótidos (por ejemplo, BrdU, dUTP, 7-deaza-dGTP), y enlaces internucleósidos no fosfodiéster (por ejemplo, ácido nucleico peptídico (PNA) o enlaces tiodiéster). En particular, los ácidos nucleicos pueden incluir, sin limitación, ADN, ARN, ADNc, ADNg, ADNmc, ADNbc o cualquier combinación de los mismos.

El término "muestra", "muestra biológica" y similares se refiere a un animal; un tejido u órgano de un animal; una célula (ya sea dentro de un sujeto, tomada directamente de un sujeto, o una célula mantenida en cultivo o de una línea celular cultivada); un lisado celular (o fracción de lisado) o extracto celular; una solución que contiene una o más moléculas derivadas de una célula, material celular o material viral (p. ej., un polipéptido o ácido nucleico); o una solución que contiene un ácido nucleico natural o no natural, que es o puede ser analizado como se describe en el presente documento. Una muestra también puede ser cualquier fluido corporal o excreción que contenga una o más células, componentes celulares o ácidos nucleicos, incluidos, entre otros, los ácidos nucleicos celulares, nucleares o libres de células.

Por "fluido corporal" se entiende un fluido de origen natural, incluyendo sin limitación un líquido, semisólido, líquido aireado, mezcla de líquido y gas, etc., de un animal (por ejemplo, animal humano o no humano). Dichos fluidos corporales pueden incluir, entre otros, saliva, esputo, suero, plasma, sangre, orina, mucosidad, transpiración, lágrimas u otros fluidos oftálmicos, fluidos óticos, pus (por ejemplo, de una ampolla o llaga), fluidos o jugos gástricos, fluidos fecales, fluidos o jugos pancreáticos, semen, productos de la lactancia o mensuración, líquido cefalorraquídeo, médula ósea fluida o linfa.

Por "esputo" se entiende la materia mucoide contenida o descargada de la cavidad nasal o bucal de un mamífero. El esputo, tal y como se utiliza aquí, incluye generalmente la saliva y las secreciones de las vías respiratorias, incluidos los pulmones.

Por "saliva" se entiende la secreción, o combinación de secreciones, de cualquiera de las glándulas salivales, incluidas las glándulas parótidas, submaxilares y sublinguales, opcionalmente mezclada con la secreción de las glándulas bucales.

Por "mucoide" se entiende cualquier fluido corporal que contenga mucina.

Por "mucina" se entiende cualquier mucoproteína que aumente la viscosidad del medio que rodea a las células que la secretan.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente", con respecto a un valor, significa /-10% del valor declarado o de la cantidad representada por el mismo. Por ejemplo, a lo largo de la presente divulgación, el término "aproximadamente" se utiliza en relación con una concentración o composición porcentual de un componente o ingrediente (por ejemplo, en una mezcla, como una mezcla fluida o líquida, una mezcla acuosa, una solución, etc., opcional o preferentemente medida como porcentaje p/p, porcentaje p/v, porcentaje v/v, etc.). En tal caso, el término "aproximadamente" y/o el término "+/-10%" implica y/o incluye /-10% del valor numérico indicado, en contraposición a /-10 puntos porcentuales del porcentaje mencionado. A modo de ejemplo, cuando el 20% p/p de un componente o ingrediente refleja 20g del componente o ingrediente por 100mL de mezcla total, el término "aproximadamente" y/o el término "+/-10%" implica y/o incluye un intervalo citado de 18g a 22g (es decir, de 18% p/p a 22% p/p), no un intervalo de 10% p/p a 30% p/p. Las alternativas para los denominados valores "aproximadamente" y/o /-10% incluyen /-1%, /-2%, /-3%, /-4%, /-5%, /-6%, /-7%, /-8%, o /-9% del valor declarado, cada uno de los cuales se contempla como una alternativa adecuada o sustituto del término "aproximadamente" o del uso de /-10% en el presente documento.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "aproximadamente" y "sustancialmente" representan o implican una (o cualquier) cantidad cercana a la cantidad indicada (por ejemplo, que aún realiza una función deseada o logra un resultado (deseado o esperado)). Por ejemplo, los términos "aproximadamente" y "sustancialmente" pueden referirse a una cantidad que está dentro, o es inferior, al 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% u otro porcentaje de una cantidad establecida. Como se utiliza en el presente documento, el término "sustancialmente desprovisto" significa (1) una cantidad indetectable o no cuantificable, (2) menos de o por debajo de una cantidad generalmente considerada por los expertos en la materia para reflejar una cantidad detectable o cuantificable, y/o (3) menos de o por debajo de una cantidad generalmente considerada por los expertos en la materia para ser funcional o capaz de lograr un resultado (deseado o esperado) (por ejemplo, menos del 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01%, u otro porcentaje).

Por "Quantum satis" (también denominado "q.s." o "qs") se entiende la cantidad suficiente. Por consiguiente, un componente o ingrediente "qs 100%", "proporcionado en qs 100%" o "qs al 100%" indica que el componente o ingrediente se proporciona o incluye en una cantidad suficiente para completar la composición o para que el total (de todos los componentes, citados o no) alcance el 100%. Cabe señalar, sin embargo, que un componente o ingrediente (final) "qs 100%", "proporcionado en qs 100%" o "qs a 100%" no indica que la mezcla consista en, consista esencialmente en o sólo contenga los componentes enumerados o citados inmediatamente antes del componente "qs 100%". En otras palabras, "qs 100%", y términos similares, pretenden ser una expresión abierta que indica el origen del resto, sea cual sea.

Por "alcohol" se entiende un compuesto orgánico miscible en agua que contiene un grupo hidroxilo, incluidas las mezclas miscibles en agua de compuestos orgánicos que contienen hidroxilo.

Por "acuoso" se entiende un medio o materia que contiene un 30% o más de agua (en volumen o en peso).

Por "solución acuosa" se entiende una solución o suspensión que contiene un 30% o más de agua en volumen.

Por "agente desnaturalizante" se entiende una sustancia que altera el estado natural de aquello a lo que se añade.

Por "agente caotrópico" se entiende una molécula que ejerce una actividad caotrópica. Como comprenderán los expertos en la materia, las moléculas que ejercen una actividad caotrópica pueden perturbar la red de enlaces de hidrógeno entre las moléculas de agua, afectando así a la estabilidad del estado nativo de otras moléculas (en la solución), principalmente macromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos) al debilitar el efecto hidrófobo. En consecuencia, las moléculas que ejercen actividad caotrópica pueden tener actividad desnaturalizante de proteínas (o ser desnaturalizantes de proteínas).

Por "agente antimicrobiano" se entiende una sustancia o grupo de sustancias que reduce la tasa de crecimiento de un organismo en comparación con la tasa de crecimiento del organismo en su ausencia. La reducción de la tasa de crecimiento de un organismo puede ser de al menos un 5%, más deseablemente, de al menos un 10%, aún más deseablemente, de al menos un 20%, 50% o 75%, y más deseablemente, de un 90% o más. La definición también se extiende a las sustancias que afectan a la viabilidad, virulencia o patogenicidad de un organismo. Un agente antimicrobiano puede ser natural (por ejemplo, derivado de bacterias u otra fuente), sintético o recombinante. Un agente antimicrobiano puede ser bacteriostático, bactericida o ambos. Un agente antimicrobiano es bacteriostático si inhibe la división celular sin afectar a la viabilidad de la célula inhibida. Un agente antimicrobiano es bactericida si provoca la muerte celular. La muerte celular suele detectarse por la ausencia de crecimiento celular en un medio de crecimiento líquido (por ejemplo, ausencia de turbidez) o en una superficie sólida (por ejemplo, ausencia de formación de colonias en agar). Los expertos en la materia saben que una sustancia o grupo de sustancias que es bacteriostático a una concentración dada puede ser bactericida a una concentración más alta. Algunas sustancias bacteriostáticas no son bactericidas en ninguna concentración.

Tal como se utiliza aquí, "acetilcisteína" o "N-acetilcisteína" (NAC), incluye cualquier forma de acetilcisteína, incluyendo N-acetil-L-cisteína, N-acetil-D-cisteína y N-acetilcisteína racémica o una mezcla (racémica) de N-acetil-L-cisteína y N-acetil-D-cisteína). La referencia a una forma de acetilcisteína apoya una referencia específica a cualquier forma de acetilcisteína.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "composición" incluye productos, formulaciones y mezclas, así como dispositivos, aparatos, conjuntos, kits, etc. Del mismo modo, el término "procedimiento" incluye procesos, procedimientos, pasos, etc.

Varios aspectos de la presente divulgación, incluyendo sistemas, procedimientos y/o productos pueden ilustrarse con referencia a una o más realizaciones o implementaciones, que son de naturaleza ejemplar. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "realización" e "implementación" significan "que sirve como ejemplo, instancia o ilustración", y no deben interpretarse necesariamente como preferidos o ventajosos sobre otros aspectos divulgados en el presente documento. Además, la referencia a una "realización" de la presente divulgación o invención incluye una referencia específica a una o más realizaciones de la misma, y viceversa, y tiene por objeto proporcionar ejemplos ilustrativos sin limitar el alcance de la invención, que se indica mediante las reivindicaciones adjuntas y no mediante la descripción de la misma.

Tal como se utiliza en el presente documento, una "característica" de la presente divulgación o realización divulgada en el presente documento se refiere a una propiedad, componente, ingrediente, elemento, parte, porción, paso (procedimiento) u otro aspecto de la materia en cuestión.

Tal como se utilizan a lo largo de esta divulgación, las palabras "puede" y "se permite" se utilizan en un sentido permisivo (es decir, que significa tener el potencial de), en lugar del sentido obligatorio (es decir, que significa debe). Además, los términos "incluyendo", "teniendo", "implicando", "conteniendo", "caracterizado por", sus variantes ( p. ej., "incluye", "tiene", "implica", "contiene", etc.), y términos similares utilizados en el presente documento, incluidas las reivindicaciones, serán inclusivos y/o abiertos, tendrán el mismo significado que la palabra "que comprende" y sus variantes (p. ej., "comprende"), y no excluyen elementos o pasos de procedimiento adicionales no citados, a título ilustrativo.

La palabra "o", tal como se utiliza aquí, significa cualquier miembro de una lista particular y también incluye cualquier combinación de miembros de esa lista.

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una", "el" y "la" incluyen referentes en plural a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a una "proteína" contempla y divulga específicamente una, así como dos o más proteínas. Del mismo modo, el uso de un referente plural no requiere necesariamente una pluralidad de tales referentes, sino que contempla, incluye y divulga específicamente uno, así como dos o más de tales referentes, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Cabe señalar que las realizaciones de la presente divulgación pueden comprender una o más combinaciones de dos o más de las características descritas en el presente documento. Tal como se utiliza en el presente documento, "característica(s)" y términos similares pueden incluir, por ejemplo, composiciones, ingredientes, componentes, elementos, miembros, partes, porciones, sistemas, procedimientos, configuraciones, parámetros, propiedades, etcétera. Las realizaciones pueden incluir cualquiera de las características, opciones y/o posibilidades expuestas en otras partes de la presente divulgación, incluso en otros aspectos o realizaciones de la presente divulgación. También se observa que cada una de las características anteriores, siguientes y/u otras descritas en el presente documento representa una realización distinta de la presente divulgación. Las características también pueden combinarse y/o combinarse con otra u otras características en cualquier combinación y/u orden adecuados, con o sin una o más características adicionales incluidas con ellas o realizadas entre ellas, para formar realizaciones únicas, cada una de las cuales se contempla en la presente divulgación. Dichas combinaciones de dos o más de dichas características representan realizaciones distintas de la presente divulgación. En consecuencia, la presente divulgación no se limita a las combinaciones específicas de realizaciones ejemplares descritas en detalle en el presente documento y la divulgación de ciertas características relativas a una realización específica de la presente divulgación no debe interpretarse como una limitación de la aplicación o inclusión de dichas características a la realización específica.

Además, a menos que una característica se describa como requerida en una realización particular, las características descritas en las diversas realizaciones pueden ser opcionales y pueden no estar incluidas en otras realizaciones de la presente divulgación. Por otra parte, a menos que una característica se describe como que requiere otra característica en combinación con el mismo, cualquier característica en este documento se puede combinar con cualquier otra característica de una misma o diferente realización divulgada en este documento. Del mismo modo, los pasos descritos en cualquier procedimiento descrito en el presente documento y/o en las reivindicaciones pueden ejecutarse en cualquier orden adecuado y no se limitan necesariamente al orden descrito y/o citado, a menos que se indique lo contrario (explícita o implícitamente). Sin embargo, en ciertas realizaciones de la presente divulgación, también puede exigirse que dichos pasos se lleven a cabo en un orden determinado.

También se apreciará que donde dos o más valores, o un intervalo de valores (por ejemplo, menor que, mayor que, al menos, y/o hasta un cierto valor, y/o entre dos valores citados) es divulgado o citado, cualquier valor específico o intervalo de valores que caiga dentro de los valores divulgados o intervalo de valores es igualmente específicamente divulgado y contemplado aquí. Por lo tanto, la divulgación de una medida ilustrativa (por ejemplo, longitud, anchura, espesor, etc.) que es menor o igual a aproximadamente 10 unidades o entre 0 y 10 unidades incluye, ilustrativamente, una divulgación específica de: (i) una medida de 9 unidades, 5 unidades, 1 unidades, o cualquier otro valor entre 0 y 10 unidades, incluyendo 0 unidades y/o 10 unidades; y/o (ii) una medida entre 9 unidades y 1 unidades, entre 8 unidades y 2 unidades, entre 6 unidades y 4 unidades, y/o cualquier otro intervalo de valores entre 0 y 10 unidades.

Para facilitar la comprensión, se han utilizado referencias similares (es decir, nombres similares de componentes y/o elementos), cuando ha sido posible, para designar elementos similares comunes a diferentes realizaciones de la presente divulgación. Del mismo modo, los componentes similares, o los componentes con funciones similares, se proporcionarán con designaciones de referencia similares, siempre que sea posible. En el presente documento se utilizará un lenguaje específico para describir las realizaciones ejemplares. No obstante, se entenderá que no se pretende limitar el alcance de la divulgación. Por el contrario, debe entenderse que el lenguaje utilizado para describir las realizaciones ejemplares es meramente ilustrativo y no debe interpretarse como limitativo del alcance de la divulgación (a menos que dicho lenguaje se describa expresamente en el presente documento como esencial).

Realizaciones ilustrativas

La siguiente descripción de las realizaciones incluye la divulgación que es relevante para una o más realizaciones de la presente divulgación. En consecuencia, algunas realizaciones pueden incluir características divulgadas en los siguientes ejemplos sin apartarse del alcance de la presente divulgación. En otras palabras, las características descritas en los siguientes ejemplos pueden incluirse y/o incorporarse a una o varias de las realizaciones descritas en el presente documento.

Composiciones

Algunas realizaciones de la presente divulgación incluyen una composición. Las composiciones pueden convertir el esputo o la saliva en una fuente viable de ácidos nucleicos para su purificación y análisis. Las composiciones proporcionan las propiedades ventajosas de la estabilización química de los ácidos nucleicos y la inhibición de las nucleasas, incluidas las desoxirribonucleasas, y del crecimiento microbiano. La estabilización química de los ácidos nucleicos de una muestra de saliva puede lograrse mediante el uso detampones, ácidos, agentes quelantes, agentes mucolíticos, agentes caotrópicos, tensioactivos y alcohol.

Las composiciones de la presente divulgación, cuando se mezclan con una muestra biológica, por ejemplo, fluido corporal que contiene mucina, pueden preservar los ácidos nucleicos a temperatura ambiente bajo condiciones ambientales durante largos períodos de tiempo. Las muestras también pueden refrigerarse, pero no es necesario congelarlas antes de la recuperación y purificación del ácido nucleico. Las propiedades de cierta composición de la presente divulgación son que (a) estabiliza químicamente los ácidos nucleicos, (b) inhibe las nucleasas que puedan estar presentes en la saliva, y (c) es compatible con enzimas proteolíticas y otros reactivos utilizados para purificar/amplificar oligo- o polinucleótidos.

Portadores

En al menos una realización, la composición puede incluir un portador. Preferentemente, el portador puede ser un portador o disolvente líquido, más preferentemente un portador o disolvente acuoso, aún más preferentemente agua.

Más preferentemente, el portador puede ser o comprender agua purificada, filtrada (por ejemplo, filtrada 0,2 micrones), destilada y/o desionizada. En consecuencia, la composición puede incluir un portador. El portador puede ser o comprender agua, como agua filtrada, agua purificada, agua destilada o agua desionizada.

En algunas realizaciones, la composición puede incluir un portador qs al 100%. En algunas realizaciones, la composición puede incluir un 10-60%, preferentemente un 15-55%, más preferentemente un 20-50%, aún más preferentemente un 25-45%, aún más preferentemente un 28-40%, aún más preferentemente un 30-35%, aún más preferentemente un 31-34%, aún más preferentemente un 32-33% de portador, p/p (o cualquier valor o intervalo de valores entre ambos). Más preferentemente, la composición puede incluir (aproximadamente) un 32,602% de agua, p/p.

Agentes caotrópicos

La composición puede incluir uno o más agentes caotrópicos. En una o más realizaciones, el agente o agentes caotrópicos pueden ser desnaturalizantes de proteínas. En algunas realizaciones, el agente caotrópico puede seleccionarse del grupo que consiste en: cloruro de guanidinio y/o tiocianato de guanidinio. Por consiguiente, en al menos una realización, la composición puede incluir un agente caotrópico. Preferentemente, el agente caotrópico puede ser o comprender guanidina (o guanidinio) o una sal adecuada de la misma. Más preferentemente, el agente caotrópico puede ser o comprender tiocianato de guanidina. En al menos una realización, el agente caotrópico puede ser o comprender tiocianato. En al menos una realización, el agente caotrópico puede ser o comprender isotiocianato de guanidina, cloruro de guanidina, clorhidrato de guanidina, yoduro de guanidinio, etcétera.

En algunas realizaciones, el agente caotrópico puede estar en, tener, comprender, o ser proporcionado en una forma seca, sólida, en polvo, anhidra, y/o granular. En algunas realizaciones, el agente caotrópico puede tener una pureza de al menos, hasta y/o aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%. 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, o 99,9% (medido por un ensayo de material adecuado, como CoA). En algunas realizaciones, el agente caotrópico puede comprender o estar (proporcionado) en forma de una solución madre (por ejemplo, en agua) que tenga cualquier concentración adecuada. En algunas realizaciones, el agente caotrópico puede tener una pureza sustancialmente correspondiente a la concentración del agente caotrópico en solución (medida por un ensayo material adecuado, como CoA).

En algunas realizaciones, la composición puede incluir 20-50%, preferentemente 25-49%, más preferentemente 30-48%, aún más preferentemente 35-47%, aún más preferentemente 40-46%, aún más preferentemente 42-45%, aún más preferentemente 43-44% del agente caotrópico (por ejemplo, tiocianato de guanidina), p/p, o cualquier valor o intervalo de valores entre los mismos. Más preferentemente, la composición puede incluir (aproximadamente) 43,92% de tiocianato de guanidina, p/p. El agente caotrópico (por ejemplo, tiocianato de guanidina) puede incluirse en la composición en aproximadamente 43,92% p/p, o en un intervalo de aproximadamente 35% a aproximadamente 50%, preferentemente de aproximadamente 40% a aproximadamente 46%, más preferentemente de aproximadamente 42% a aproximadamente 45%, aún más preferentemente de aproximadamente 43% a aproximadamente 44%, p/p.

Agentes tamponadores

La composición puede incluir uno o más agentes tamponadores (o tampones, tampones de pH, etc.). Ejemplos de agentes tamponadores incluyen, pero no se limitan a, tris(hidroximetil)aminometano (también conocido como Tris; Tris base, 2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol, THAM, Trometamol) o una formulación adecuada de los mismos (por ejemplo, clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano, oTris-HCl, ), base Trizma® (por ejemplo, solución madre de Tris 40% (p/p) en agua), H^e P^e S, BES, MOPS, HEPES, TAE, T^b E, tampón fosfato, tampón borato sódico, tampón cacodilato sódico, etc. Preferentemente, el agente tampón puede ser o comprender tris(hidroximetil)aminometano (Tris). Más preferentemente, el agente tampón puede ser o comprender Tris-HCl. Más preferentemente, el agente tampón puede ser o comprender base Trizma®.

En algunas realizaciones, el agente tampón puede estar en, tener, comprender, o ser proporcionado en una forma seca, sólida, en polvo, anhidra, y/o granular. En algunas realizaciones, el agente tampón puede tener una pureza de al menos, hasta y/o aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%. 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, o 99,9% (medido por un ensayo de material adecuado, como CoA). En algunas realizaciones, el agente tampón puede comprender o estar (proporcionado) en forma de solución madre (por ejemplo, en agua) con cualquier concentración adecuada (por ejemplo, solución madre de Tris ~40% (p/p) en agua). En algunas realizaciones, el agente tampón puede tener una pureza sustancialmente correspondiente a la concentración del agente tampón en solución (medida por un ensayo material adecuado, como CoA).

El agente tampón puede incluirse en la composición en un porcentaje de aproximadamente 2,65% en peso, o en un intervalo de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5%, preferentemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 4,5%, más preferentemente de aproximadamente 0,75% a aproximadamente 4%, aún más preferentemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 3,5%, aún más preferentemente de aproximadamente 1,5% a aproximadamente 3,25%, aún más preferentemente de aproximadamente 2% a aproximadamente 3%, aún más preferentemente de aproximadamente 2,5% a aproximadamente 2,8%, en peso. En algunas realizaciones, la composición puede incluir 1-5%, preferentemente 1,25-4,5%, más preferentemente 1,5-4%, aún más preferentemente 1,75-3,75%, aún más preferentemente 2-3,5%, aún más preferentemente 2,25-3%, aún más preferentemente 2,5-2,75% del agente tampón (por ejemplo, Tris), p/p, o cualquier valor o intervalo de valores entre ambos. Más preferentemente, la composición puede incluir (aproximadamente) un 2,65% de Tris, p/p.

f. Agentes quelantes

En al menos una realización, la composición puede incluir un agente quelante (o quelatante). Preferentemente, el agente quelante puede ser o comprender ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o una sal adecuada y/o un hidrato del mismo. Más preferentemente, el agente quelante puede ser o comprender, o suministrarse como sal disódica de EDTA. Aún más preferentemente, el agente quelante puede ser o comprender, o proporcionarse como EDTA disódico (sal) dihidrato. En al menos una realización, el agente quelante puede ser o comprender ácido etilenglicol-bis(paminoetil éter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), ácido nitrilotriacético (NTA), una etilendiamina (o 1,2-diaminoetano), etcétera. En algunas realizaciones, el agente quelante comprende, incluye o está provisto de un contraión (por ejemplo, sodio). En al menos una realización, el agente quelante comprende, incluye o se proporciona como un hidrato (por ejemplo, dihidrato).

LLa composición puede incluir uno o más agentes quelantes.. El agente quelante de la composición puede seleccionarse del grupo que consiste en: ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ciclohexano diaminetetraacetato (CDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido tetraaciclododecanetetraacético (DOTA) ácido tetraazaciclotetradecanetetraacético (TETA), deferoximina, ácido nitrilotriacético (NTA), una etilendiamina (o 1,2-diaminoetano), o sus respectivos análogos quelatantes, sales y/o hidratos. Preferentemente, el agente quelante puede ser o comprender EDTA (por ejemplo, como sal disódica de EDTA, preferentemente como (sal) disódica dihidratada de EDTA). En algunas realizaciones, el agente quelante comprende, incluye o está provisto de un contraión (por ejemplo, sodio). En al menos una realización, el agente quelante comprende, incluye o se proporciona como un hidrato (por ejemplo, dihidrato).

En algunas realizaciones, el agente quelante puede estar en, tener, comprender, o ser proporcionado en una forma seca, sólida, en polvo, anhidra, y/o granular. En algunas realizaciones, el agente quelante puede tener una pureza de al menos, hasta y/o aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%. 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, o 99,9% (medido por un ensayo de material adecuado, como CoA). En algunas realizaciones, el agente quelante puede comprender o estar (proporcionado) en forma de una solución madre (por ejemplo, en agua) que tenga cualquier concentración adecuada. En algunas realizaciones, el agente quelante puede tener una pureza sustancialmente correspondiente a la concentración del agente quelante en solución (medida por un ensayo material adecuado, como el CoA).

El agente quelante (por ejemplo, EDTA) puede incluirse en la composición en aproximadamente 0,81% p/p, o en un intervalo de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 2,5%, preferentemente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 2%, más preferentemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%, aún más preferentemente de aproximadamente 0,75% a aproximadamente 0,9%, p/p. En algunas realizaciones, la composición puede incluir 0,05-2,5%, preferentemente 0,1-2,25%, más preferentemente 0,25-2%, aún más preferentemente 0,5-1,75%, aún más preferentemente 0,6-1,5%, aún más preferentemente 0,7-1,25%, aún más preferentemente 0,75-1% del agente quelante (por ejemplo, EDTA), p/p, o cualquier valor o intervalo de valores entre ambos). Más preferentemente, la composición puede incluir (aproximadamente) 0,81% de EDTA o EDTA disódico (sal) dihidrato, p/p.

Tensioactivos

En al menos una realización, la composición puede incluir un tensioactivo o detergente. Preferentemente, el tensioactivo puede ser o comprender un lauroil sarcosinato. Más preferentemente, el tensioactivo puede ser o comprender lauroil sarcosinato sódico (SLS). En al menos una realización, el tensioactivo puede ser o comprender uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en dodecil sulfato sódico (SDS), polisorbatos (Tween™), óxido de lauril dimetilamina, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), alcoholes polietoxilados, sorbitán polioxietilenado, octoxinol (Triton X100™), N,N-dimetildodecilamina-N-óxido, bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HTAB), polioxil 10 lauril éter, sales biliares (desoxicolato sódico, colato sódico), polioxil aceite de ricino (Cremophor™), etoxilato de nonilfenol (Tergitol™), ciclodextrinas, lecitina, cloruro de metilbencetonio (Hyamine™), etc. La composición puede incluir un tensioactivo o detergente, como urea, perclorato, (sodio) dodecil sulfato (SDS), y/o (sodio) lauroil sarcosinato (SLS), preferentemente lauroil sarcosinato de sodio (SLS). En algunas realizaciones, el SLS puede ser preferible al SDS u otros tensioactivos (menos solubles).

En algunas realizaciones, el tensioactivo puede estar en, tener, comprender o suministrarse en forma seca, sólida, en polvo, anhidra y/o granular. En algunas realizaciones, el tensioactivo puede tener una pureza de al menos, hasta y/o aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%. 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, o 99,9% (medido por un ensayo de material adecuado, como CoA). En algunas realizaciones, el tensioactivo puede comprender o estar (proporcionado) en forma de una solución madre (por ejemplo, en agua) que tenga cualquier concentración adecuada (por ejemplo, aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 28%, 29%, 30%, 32%, 35%, 40% o 45%, p/p, solución acuosa (por ejemplo, en agua). En algunas realizaciones, el tensioactivo puede tener una pureza que corresponda sustancialmente a la concentración del tensioactivo en solución (por ejemplo, alrededor del 30%, p/p) (medida mediante un ensayo material adecuado, como CoA).

En algunas realizaciones, el tensioactivo (por ejemplo, SLS) puede incluirse en la composición en aproximadamente 0,279%, p/p. En algunas realizaciones, el tensioactivo puede incluirse en la composición en un intervalo de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5%, p/p, preferentemente de aproximadamente 0,025% a aproximadamente 2,5%, p/p, más preferentemente de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 2%, p/p, aún más preferentemente de aproximadamente 0,075% a aproximadamente 1,5%, p/p, aún más preferentemente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%, p/p, aún más preferentemente de aproximadamente 0,15% a aproximadamente 0,5%, p/p, aún más preferentemente de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,4%, p/p, aún más preferentemente de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 0,3%, p/p. Algunas realizaciones incluyen de 0,01% a 5%, p/p, preferentemente de 0,025% a 2,5%, p/p, más preferentemente de 0,05% a 2%, p/p, aún más preferentemente de 0,075% a 1,5%, p/p, aún más preferentemente de 0,1% a 1%, p/p, aún más preferentemente de 0,15% a 0,5%, p/p, aún más preferentemente de 0,2% a 0,4%, p/p, aún más preferentemente de 0,25% a 0,3%, p/p, más preferentemente 0,279%, p/p, tensioactivo o SLS. En al menos una realización, el tensioactivo (por ejemplo, SLS) puede incluirse en la composición en aproximadamente un 0,93% p/p, de una solución madre (acuosa) al -30%, o su equivalente.

Alcoholes

En al menos una realización, la composición puede incluir un alcohol. Preferentemente, el alcohol puede ser o comprender etanol. Más preferentemente, el alcohol puede ser o comprender una mezcla de etanol y uno o más productos químicos o componentes adicionales. En al menos una realización, el uno o más productos químicos o componentes adicionales pueden ser o comprender isopropanol. Aún más preferentemente, el alcohol puede ser o comprender una mezcla de etanol e isopropanol. En al menos una realización, el uno o más productos químicos adicionales o componentes pueden ser o comprender metanol, propanol, butanol, isobutanol, y así sucesivamente. En al menos una realización, el alcohol puede ser o comprender un alcohol especialmente desnaturalizado (SDA). Más preferentemente, el alcohol puede ser o comprender SDA3C, como saben los expertos en la materia que comprende una mezcla de aproximadamente 95% de etanol v/v y aproximadamente 5% de isopropanol v/v. La composición puede incluir un alcohol, como etanol, metanol, propanol y/o isopropanol, preferentemente un alcohol especialmente desnaturalizado (SDA) o una mezcla de etanol y otro alcohol, como metanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, trifluoroetanol, fenol o 2,6-di-terc-butil-4-metilfenol, más preferentemente una mezcla de etanol e isopropanol, aún más preferentemente una mezcla de etanol y uno o más productos químicos o componentes adicionales, como isopropanol.

En algunas realizaciones, el tensioactivo puede estar en, tener, comprender o suministrarse en forma seca, sólida, en polvo, anhidra y/o granular. En algunas realizaciones, el alcohol puede estar en, tener, comprender o proporcionarse en forma líquida, acuosa y/o de solución. En algunas realizaciones, el alcohol puede comprender o estar (proporcionado) en forma de una solución madre (por ejemplo, en agua) que tenga cualquier concentración adecuada de alcohol (por ejemplo, en agua). En algunas realizaciones, el alcohol puede ser sustancialmente puro, o una mezcla de alcoholes sustancialmente puros. En algunas realizaciones, el alcohol puede tener una pureza de al menos, hasta y/o aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%. 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% (o alcohol etílico puro de 200 grados) (medido por un ensayo material adecuado, como el CoA).

En algunas realizaciones, el alcohol puede ser o comprender una mezcla o solución madre de o que comprenda aproximadamente 95% v/v de etanol y aproximadamente 5% v/v de isopropanol. En algunas realizaciones, el alcohol puede ser o comprender una mezcla o solución madre de o que comprenda 90-99% v/v de etanol y aproximadamente 1- 10% v/v de isopropanol. En ciertas realizaciones, el alcohol puede comprender una mezcla de 50-99% de etanol v/v y 1-50% de isopropanol v/v. Más preferentemente, el alcohol puede comprender una mezcla de 60-98% etanol v/v y 2- 40% isopropanol v/v. Aún más preferentemente, el alcohol puede comprender una mezcla de 75-97% etanol v/v y 3-25% isopropanol v/v. Aún más preferentemente, el alcohol puede comprender una mezcla de 80-96% etanol v/v y 4-20% isopropanol v/v. Aún más preferentemente, el alcohol puede comprender una mezcla de 85-95% etanol v/v y 5-15% isopropanol v/v. Aún más preferentemente, el alcohol puede comprender una mezcla de 90-95% etanol v/v y 5-10% isopropanol v/v. Aún más preferentemente, el alcohol puede comprender una mezcla de 92-95% etanol v/v y 5-8% isopropanol v/v. Aún más preferentemente, el alcohol puede comprender una mezcla de 95% etanol v/v y 5% isopropanol v/v. Más preferentemente, el alcohol puede ser o comprender SDA3C .

El alcohol (por ejemplo, SDA3C) puede incluirse en la composición en aproximadamente 17,73% p/p, o en un intervalo de aproximadamente 10% a aproximadamente 25%, preferentemente de aproximadamente 12% a aproximadamente 22%, más preferentemente de aproximadamente 15% a aproximadamente 20%, aún más preferentemente de aproximadamente 16% a aproximadamente 19%, aún más preferentemente de aproximadamente 17% a aproximadamente 18%, p/p. En algunas realizaciones, la cantidad de alcohol incluida en la composición puede ser menor (por ejemplo, alrededor del 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% o 60% menos) que las soluciones de conservación de ácidos nucleicos típicas, tradicionales o existentes (por ejemplo, haciendo que la composición sea más modificable para el envío o el transporte). En algunas realizaciones, la composición puede incluir 5-25%, preferentemente 10-22%, más preferentemente 12-20%, aún más preferentemente 15-19%, aún más preferentemente 16-18,5%, aún más preferentemente 17-18,25%, aún más preferentemente 17,5-18% de alcohol, p/p, o cualquiervalor o intervalo de valores entre ambos.

Preferentemente, el alcohol comprende una mezcla de etanol y uno o más productos químicos o componentes adicionales, como isopropanol, más preferentemente una mezcla de aproximadamente 95% de etanol, v/v y aproximadamente 5% de isopropanol, v/v. Aún más preferentemente, el alcohol es un alcohol especialmente desnaturalizado (SDA), aún más preferentemente SDA 3C (es decir, una mezcla de ~95% de etanol y -5% de isopropanol, v/v). Más preferentemente, la composición puede incluir (aproximadamente) un 17,73% de SDA3C, p/p. En algunas realizaciones, el alcohol (p. ej, SDA3C) puede incluirse en la composición en aproximadamente 16,84% p/p, etanol o en un intervalo de aproximadamente 10% a aproximadamente 25%, preferentemente de aproximadamente 12% a aproximadamente 22%, más preferentemente de aproximadamente 15% a aproximadamente 20%, aún más preferentemente de aproximadamente 16% a aproximadamente 18%, aún más preferentemente de aproximadamente 16,5% a aproximadamente 17%, p/p, de etanol, y aproximadamente 0,89% p/p, de isopropanol o en un intervalo de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 2,5%, preferentemente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 2%, más preferentemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1,5%, aún más preferentemente de aproximadamente 0,75% a aproximadamente 1,25%, aún más preferentemente de aproximadamente 0,8% a aproximadamente 1%, p/p, de isopropanol.

En algunas realizaciones, la cantidad de alcohol incluida en la composición puede ser menor (p. ej., aproximadamente un 50% menos) que las soluciones de conservación de ácidos nucleicos típicas, tradicionales o existentes (p. ej., haciendo que la composición sea más modificable para el envío o el transporte).

Ácidos

En al menos una realización, la composición puede incluir un ácido. Preferentemente, el ácido puede ser o comprender ácido clorhídrico (HCl). En al menos una realización, el ácido puede ser o comprender ácido bromhídrico (HBr), ácido perclórico (HCO ⁴), ácido nítrico (HNO³) o ácido sulfúrico (H²SO⁴). En al menos una realización, el ácido puede ser o comprender ácido carbónico (H²CO³) o ácido acético (CH³COOH). En al menos una realización, el ácido puede ser o comprender ácido fosfórico (H³PO⁴), ácido bórico (H³BO³), o ácido Emerald Safe (ESA), y así sucesivamente.

En algunas realizaciones, el ácido puede estar en, tener, comprender, o ser proporcionado en una forma seca, sólida, en polvo, anhidra, y/o granular. En algunas realizaciones, el ácido puede tener una pureza de al menos, hasta y/o alrededor del 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%. 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, o 99,9% (medido por un ensayo de material adecuado, como CoA). En algunas realizaciones, el ácido puede comprender o estar (proporcionado) en forma de una solución madre (p. ej., en agua) que tenga cualquier concentración adecuada (p. ej., aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 32%, 35%, 37%, 38%, 40% o 45%, p/p, solución acuosa (p. ej., en agua). En algunas realizaciones, el ácido puede tener una pureza sustancialmente correspondiente a la concentración del ácido en solución (por ejemplo, alrededor del 37%, p/p) (medida por un ensayo material adecuado, como CoA).

En algunas realizaciones, la composición puede incluir ácido (por ejemplo, ácido clorhídrico), qs a pH aproximadamente 8,0, o pH 7,5-9,5, pH 6,5-9,5, pH 7-9, pH 7,2-8,8, pH 7,4-8,6, pH 7,5-8,5, pH 7,6-8,4, o pH 7,8-8,2 (o cualquier valor o intervalo de valores entre ambos). En algunas realizaciones, el pH de la composición puede ser superior a aproximadamente 5 e inferior a aproximadamente 12, preferentemente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 11, más preferentemente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 10, aún más preferentemente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 9, aún más preferentemente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, y más preferentemente, con un pH de aproximadamente 8,0.

En algunas realizaciones, el ácido (por ejemplo, HCl) puede incluirse en la composición en aproximadamente 0,4% p/p, o en un intervalo de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5%, preferentemente de aproximadamente 0,025% a aproximadamente 2,5%, más preferentemente de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 2%, más preferentemente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1,5%, más preferentemente de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 1%, más preferentemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 0,75%, más preferentemente de aproximadamente 0,3% a aproximadamente 0,5%, p/p. En algunas realizaciones, la composición puede incluir 0,005-5%, preferentemente 0,01-2,5%, más preferentemente 0,025-1,5%, aún más preferentemente 0,05-1%, aún más preferentemente 0,1-0,75%, aún más preferentemente 0,25-0,5% de ácido (por ejemplo, ácido clorhídrico), p/p. En al menos una realización, el ácido (por ejemplo, HCl) puede incluirse en la composición en aproximadamente 1,08%, p/p, de una solución madre (acuosa) de -37%, p/p, o ~12M, o equivalente de la misma. Más preferentemente, la composición puede incluir (aproximadamente) 1,08% de ácido clorhídrico 37%, p/p, o su equivalente, o ácido clorhídrico qs a pH (aproximadamente) 8,0.

Sin estar ligado a ninguna teoría, se señala, y los expertos en la materia apreciarán, que diferentes ácidos tienen diferentes "fuerzas" o la capacidad o tendencia del ácido a perder un protón (H⁺). Un ácido fuerte es aquel que se ioniza (disocia) completamente en una disolución (siempre que haya suficiente disolvente). En agua, por ejemplo, un mol de un ácido fuerte HA se disuelve dando un mol de H⁺ (como ion hidronio H³O⁺ y agregados superiores) y un mol de la base conjugada, A ^' . Esencialmente, no queda nada del ácido HA no ionizado. Algunos ejemplos de ácidos fuertes son el ácido clorhídrico (HCl), el ácido yodhídrico (HI), el ácido bromhídrico (HBr), el ácido perclórico (HCO ⁴), el ácido nítrico (HNO³) y el ácido sulfúrico (H²SO⁴). En solución acuosa, cada uno de ellos se ioniza esencialmente al 100%. Por el contrario, un ácido débil sólo se disocia parcialmente. Algunos ejemplos en el agua son el ácido carbónico (H²CO³) y el ácido acético (CH³COOH). En el equilibrio, tanto el ácido como la base conjugada están presentes en la solución. Los ácidos más fuertes tienen una constante de disociación ácida (Ka) mayor y una constante logarítmica (pKa = -log Ka) menor que los ácidos más débiles. Cuanto más fuerte es un ácido, más fácilmente pierde un protón, H+. Dos factores clave que contribuyen a la facilidad de la desprotonación son la polaridad del enlace H-Ay el tamaño del átomo A, que determina la fuerza del enlace H-A. La fuerza de los ácidos también depende de la estabilidad de la base conjugada.

A la luz de lo anterior, la cantidad p/p de cada ácido necesaria para llevar el pH de la composición a un nivel deseado es diferente. Por ejemplo, mientras que (aproximadamente) 1,08% de ácido clorhídrico 37%, p/p (en agua), puede ser suficiente para llevar ciertas realizaciones de la presente divulgación a pH (aproximadamente) 8,0, 1,08% de ácido acético 37%, p/p (en agua), puede ser demasiado débil para llevar una realización similar a pH (aproximadamente) 8,0, 1,08% de ácido sulfúrico 37%, p/p (en agua), puede ser demasiado fuerte para llevar una realización a pH (aproximadamente) 8,0, 1,08% de ácido sulfúrico 37%, p/p (en agua), puede ser demasiado fuerte para llevar la forma de realización a pH (aproximadamente) 8,0, 1,08% de ácido nítrico 37%, p/p (en agua), puede oxidar el alcohol, y así sucesivamente. Sin estar obligados a ninguna teoría, incluso aquellos con conocimientos normales en la materia pueden, con experimentación adicional, no ser capaces de determinar qué ácidos son adecuados en una o más realizaciones de la presente divulgación.

Agentes mucolíticos

En al menos una realización, la composición puede incluir un agente mucolítico. En una o más realizaciones, el agente mucolítico puede ser o comprender un agente reductor. Preferentemente, el agente mucolítico puede ser o comprender una acetilcisteína (es decir, N-acetilcisteína (NAC), incluyendo N-acetil-L-cisteína, N-acetil-D-cisteína y N-acetilcisteína racémica o una mezcla (racémica) de N-acetil-L-cisteína y N-acetil-D-cisteína). Más preferentemente, el agente mucolítico puede ser o comprender N-acetil-L-cisteína. En al menos una realización, el agente mucolítico puede ser o comprender N-acetilcisteína (N-acetil-L-cisteína), ácido ascórbico, ditionito, eriorbato, cisteína, glutatión, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, dieritritol, un tiol soportado por resina, una fosfina soportada por resina, vitamina E, y/o trolox, o sales de los mismos, citrato sódico, citrato potásico, yoduro potásico, cloruro amónico, guaifenesina (o guaifenesina), bálsamo de Tolú, Vasaka, ambroxol, carbocisteína, erdosteína, mecisteína, domasa alfa, etc. La composición puede incluir uno o más agentes mucolíticos. Preferentemente, el agente mucolítico es ácido ascórbico, eritiorbato, N-acetilcisteína, ditiotreitol o 2-mercaptoetanol, y más preferentemente, el agente mucolítico es N-acetilcisteína.

En una o más realizaciones, la composición no contiene ácido ascórbico, ditionito, eriorbato, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, diieritritol, un tiol soportado por resina, una fosfina soportada por resina, vitamina E, trolox y/o sales de los mismos. Al menos una realización carece (sustancialmente) de ácido ascórbico, ditionito, eriorbato, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, diieritritol, un tiol soportado por resina, una fosfina soportada por resina, vitamina E, trolox y/o sales de los mismos. Al menos una realización carece (sustancialmente) de un agente mucolítico además de la N-acetil-L-cisteína.

En algunas realizaciones, el agente mucolítico puede estar en, tener, comprender, o ser proporcionado en una forma seca, sólida, en polvo, anhidra, y/o granular. En algunas realizaciones, el agente mucolítico puede tener una pureza de al menos, hasta y/o aproximadamente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%. 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% (medido por un ensayo de material adecuado, como el CoA). En algunas realizaciones, el agente mucolítico puede comprender o ser (proporcionado) en forma de una solución madre (por ejemplo, en agua) que tenga cualquier concentración adecuada. En algunas realizaciones, el agente mucolítico puede tener una pureza que corresponde sustancialmente a la concentración del agente mucolítico en solución (medida por un ensayo material adecuado, como CoA).

El agente mucolítico (p. ej., N-acetilcisteína) puede incluirse en la composición en aproximadamente 0,093% en peso, o en un intervalo de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,5%, preferentemente de aproximadamente 0,025% a aproximadamente 0,25%, más preferentemente de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 0,2%, aún más preferentemente de aproximadamente 0,075% a aproximadamente 0,15%, aún más preferentemente de aproximadamente 0,08% a aproximadamente 0,1%, en peso.

En algunas realizaciones, la composición puede incluir 0,005-0,25%, preferentemente 0,005-0,2%, más preferentemente 0,01-0,2%, aún más preferentemente 0,025-0,175%, aún más preferentemente 0,05-0,165%, aún más preferentemente 0,075-0,15%, aún más preferentemente 0,08-0,125%, aún más preferentemente 0,09-0,1% del agente mucolítico (por ejemplo, N-acetil-L-cisteína), p/p, o cualquier valor o intervalo de valores entre ambos. Más preferentemente, la composición puede incluir (aproximadamente) un 0,093% de N-acetil-L-cisteína, p/p.

Indicadores visuales

Al menos una realización puede incluir un indicador visual. Preferentemente, el indicador visual puede ser o comprender un agente colorante. Más preferentemente, el indicador visual puede ser o comprender un colorante o tinte coloreado. Aún más preferentemente, el indicador visual puede ser o comprender un colorante azul. Más preferentemente, el indicador visual puede ser o comprender ^f D&C Blue No. 1. La composición puede incluir un indicador visual, preferentemente un agente colorante, más preferentemente un colorante coloreado, aún más preferentemente un colorante azul, aún más preferentemente FD&C Blue No. 1.

En algunas realizaciones, el indicador visual puede estar en, tener, comprender, o ser proporcionado en una forma seca, sólida, en polvo, anhidra, y/o granular. En algunas realizaciones, el indicador visual puede tener una pureza de al menos, hasta y/o aproximadamente 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%. 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, o 99,9% (medido por un ensayo de material adecuado, como CoA). En algunas realizaciones, el indicador visual puede comprender o estar (proporcionado) en forma de una reserva (solución (por ejemplo, en agua)) que tenga cualquier concentración adecuada (por ejemplo, aproximadamente 0,01%, 0,05%, 0,075%, 0,1%, 0,125%, 0,15%, 0,175%, 0,2%, 0,25%, 0,3% o 0,5%, p/p, solución acuosa (por ejemplo, en agua). En algunas realizaciones, la solución madre puede hacerse utilizando el material seco, sólido, en polvo, anhidro y/o granular. En algunas realizaciones, el indicador visual puede tener una pureza sustancialmente correspondiente a la concentración del ácido en la solución (por ejemplo, alrededor del 0,2%, p/p) (medida por un ensayo material adecuado, como CoA).

El indicadorvisual (por ejemplo, FD&C Blue No. 1) puede incluirse en la composición en cualquier cantidad visualmente adecuada, como aproximadamente 0,00037% p/p, o en un intervalo de aproximadamente 0,00005% a aproximadamente 0,001%, preferentemente de aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 0,00075%, más preferentemente de aproximadamente 0,0002% a aproximadamente 0,0005%, p/p, aún más preferentemente de aproximadamente 0,0003% a aproximadamente 0,0004%, p/p. En algunas realizaciones, la composición puede incluir una cantidad visible (o visiblemente adecuada) de un indicador visual, preferentemente un agente colorante, más preferentemente un colorante coloreado, aún más preferentemente un colorante azul, aún más preferentemente FD&C Blue No.1. Más preferentemente, la composición puede incluir (aproximadamente) 0,00037% p/p de FD&C Blue No.

1.

En al menos una realización, el indicadorvisual (por ejemplo, FD&C Blue No. 1) puede añadirse a la composición como concentrado. En algunas realizaciones, el concentrado puede ser acuoso o a base de agua. En algunas realizaciones, la composición puede incluir 0,01-2,5%, p/p, de un concentrado indicadorvisual 0,01-5%, p/p (en agua). Preferentemente, la composición puede incluir 0,05-1%, p/p, de un concentrado indicadorvisual 0,05-1%, p/p (en agua). Más preferentemente, la composición puede incluir 0,075-0,5%, p/p, de un concentrado indicadorvisual 0,075-0,5%, p/p (en agua). Aún más preferentemente, la composición puede incluir 0,1-0,25%, p/p, de un concentrado indicadorvisual 0,1-0,25%, p/p (en agua). Aún más preferentemente, la composición puede incluir (aproximadamente) 0,185% p/p de (aproximadamente) 0,2% p/p (en agua) de concentrado de indicador visual. En al menos una realización, el indicadorvisual (por ejemplo, ^f D&C Blue No. 1) puede incluirse en la composición en aproximadamente 0,185%, p/p, de una solución madre (acuosa) de -0,2%, o equivalente de la misma. Más preferentemente, la composición puede incluir (aproximadamente) un 0,185% p/p de (aproximadamente) un 0,2% p/p (en agua) de concentrado de FD&C Blue No. 1.

Antimicrobianos

En algunas realizaciones, la composición es una solución acuosa. En algunas realizaciones, uno o más de los componentes anteriores pueden presentar actividad antimicrobiana. Por ejemplo, el alcohol, el agente caotrópico, el tensioactivo y/o el agente mucolítico pueden ser antimicrobianos o presentar actividad antimicrobiana en algunas realizaciones. En consecuencia, algunas realizaciones no necesitan incluir un agente antimicrobiano (por ejemplo, bactericida y/o bacteriostático) separado. En una o más realizaciones, las propiedades antimicrobianas del alcohol (p. ej., SDA 3C) persisten incluso en las concentraciones más bajas en las que se proporciona el alcohol en dicha(s) realización(es) de la presente divulgación (p. ej., aproximadamente 17,73%, p/p, o 5-25%, 10-22%, 10-20% 15-19%, 16-18,5%, 17-18,25%, o 17,5-18%, p/p, o cualquier valor o intervalo de valores entre ambos).

Inhibidores de ribonucleasas

Algunas realizaciones incluyen un inhibidor de ribonucleasa, o inhibidor de ribonucleasa, como heparina, heparán sulfato, oligo(ácido vinilsulfónico), poli(ácido vinilsulfónico), oligo(ácido vinilfosfónico), y poli(ácido vinilsulfónico), o sales de los mismos. En ciertas realizaciones (p. ej., preferidas), la composición no incluye un inhibidor de ribonucleasa o inhibidor de ribonucleasa, o está (sustancialmente) desprovista de uno o más (p. ej., cualquier) inhibidor de ribonucleasa o inhibidor de ribonucleasa (p. ej., distinto de un agente caotrópico, como el tiocianato de guanidina, que puede tener actividad inhibidora intrínseca de ARNasa). En consecuencia, al menos una realización carece (sustancialmente) de uno o más (cualquier) inhibidor de ribonucleasa, o inhibidor de ribonucleasa. Una o más realizaciones están (sustancialmente) desprovistas de cualquier inhibidor de ribonucleasa, o inhibidor de ribonucleasa (por ejemplo, distinto de un agente caotrópico, como el tiocianato de guanidina).

Proteasas

Algunas realizaciones incluyen una proteasa. En ciertas realizaciones (p. ej., preferidas), la composición no incluye una proteasa, o está (sustancialmente) desprovista de una o más (p. ej., cualquier) proteasa. En consecuencia, al menos una realización carece (sustancialmente) de una o más (cualquier) proteasa. Sin estar ligada a ninguna teoría, una proteasa (o enzima proteolítica, peptidasa o proteinasa) es un tipo de enzima que rompe uno o más enlaces peptídicos mediante hidrólisis, convirtiendo así las proteínas en fragmentos proteicos más pequeños (o péptidos) o subunidades proteicas individuales (o aminoácidos).

Desnaturalizantes de proteínas

Algunas realizaciones incluyen uno o más desnaturalizantes proteicos. Por ejemplo, en al menos una realización, el (i) agente caotrópico puede ser, comprender o funcionar como un desnaturalizante de proteínas (o desnaturalizar proteínas o tener o exhibir actividad desnaturalizante de proteínas). En al menos una realización, el (ii) tensioactivo/detergente puede ser, comprender o funcionar como desnaturalizante de proteínas (o desnaturalizar proteínas o tener o mostrar actividad desnaturalizante de proteínas). En al menos una realización, el (iii) alcohol puede ser, comprender o funcionar como desnaturalizante de proteínas (o desnaturalizar proteínas o tener o exhibir actividad desnaturalizante de proteínas). En al menos una realización, el (iv) agente mucolítico puede ser, comprender o funcionar como un desnaturalizante de proteínas (o desnaturalizar proteínas o tener o exhibir actividad desnaturalizante de proteínas), como cuando la(s) proteína(s) contiene(n) enlaces o puentes disulfuro accesibles. En algunas realizaciones, dos o más de los (i) agentes caotrópicos, (ii) tensioactivos/detergentes, (iii) alcoholes y (iv) agentes mucolíticos pueden ser, comprender o funcionar como desnaturalizantes de proteínas (o desnaturalizar proteínas o tener o presentar actividad desnaturalizante de proteínas). En algunas realizaciones, cada uno o todos los (i) agentes caotrópicos, (ii) tensioactivos/detergentes, (iii) alcoholes y (iv) agentes mucolíticos pueden ser, comprender o funcionar como desnaturalizantes de proteínas (o desnaturalizar proteínas o tener o presentar actividad desnaturalizante de proteínas).

Sin estar sujeto a ninguna teoría, la actividad de desnaturalización de proteínas de uno o más de los componentes o ingredientes anteriores puede depender de la concentración y/o del tiempo.

Formulaciones

Una realización de la presente divulgación incluye una composición (o formulación) de preservación de ácido nucleico, que comprende un portador, un agente caotrópico, un agente amortiguador, un agente quelante, un tensioactivo, un alcohol, un ácido y un agente mucolítico. Una realización incluye además un indicadorvisual opcional. Una realización puede incluir 20-50% de agente caotrópico, p/p, 1-5% de agente tamponador, p/p, 0,05-2,5% de agente quelante, p/p, 0,05-2,5% de tensioactivo, p/p, 5-25% de alcohol, p/p, 0,005-0,25% de agente mucolítico, p/p, ácido qs a pH 6,5-9,5, y el portador qs a 100%. Una realización puede incluir además 0,005-2,5%, p/p, de indicadorvisual.

En al menos una realización, la composición incluye aproximadamente 43,92% p/p del agente caotrópico, aproximadamente 2,65% p/p del agente amortiguador, aproximadamente 0,81% p/p del agente quelante, aproximadamente 0,279% p/p del tensioactivo, aproximadamente 17,73% p/p del alcohol, aproximadamente 0,093% p/p del agente mucolítico; el ácido qs a un pH de aproximadamente 8,0 (p. ej., aproximadamente 1,08% de una solución ácida al 37%, o su equivalente), y el portador qs al 100%. La composición puede incluir aproximadamente 0,00037% p/p del indicador visual.

En algunas realizaciones, el portador puede ser o comprender un portador acuoso, como agua, preferentemente filtrada, purificada, destilada y/o desionizada. En algunas realizaciones, el agente caotrópico puede ser o comprender guanidina y/o tiocianato, preferentemente tiocianato de guanidina. En algunas realizaciones, el agente tampón puede ser o comprender tris(hidroximetil)aminometano (Tris), preferentemente Tris-HCl, más preferentemente base Trizma® . En algunas realizaciones, el agente quelante puede ser o comprender ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), preferentemente EDTA disódico (sal) dihidrato. En algunas realizaciones, el tensioactivo puede ser o comprender lauroil sarcosinato sódico (SLS). En algunas realizaciones, el alcohol puede ser o comprender un alcohol especialmente desnaturalizado (SDA) o una mezcla de etanol e isopropanol, preferentemente una mezcla de aproximadamente 95% de etanol, v/v y aproximadamente 5% de isopropanol, v/v, o SDA 3C. En algunas realizaciones, el ácido puede ser o comprender ácido clorhídrico. En algunas realizaciones, el agente mucolítico puede ser o comprender N-acetil-L-cisteína.

Una realización de la presente divulgación incluye una composición de estabilización y/o preservación de ácido nucleico, que comprende aproximadamente 43,92% de agente caotrópico (p. ej., tiocianato de guanidina), p/p, aproximadamente 2,65% de agente tampón (p. ej., Tris), p/p, aproximadamente 0,81% de agente quelante (p. ej., EDTA o EDTA (sal) disódica dihidratada), p/p, aproximadamente 0,279% de tensioactivo (p. ej., SLS), p/p, aproximadamente 17,73% de alcohol (p. ej., SDA3C), p/p, aproximadamente 0,093% de agente mucolítico (p. ej., N-acetil-L-cisteína), p/p, ácido (p. ej., ácido clorhídrico) qs a aproximadamente pH 8,0; y/o un portador (p. ej., un portador acuoso que comprende agua filtrada, purificada, destilada y/o desionizada) qs a 100%. Una realización puede incluir además alrededor de un 0,00037%, p/p, de indicadorvisual (por ejemplo, FD&C Blue No. 1).

Una realización de la presente divulgación incluye 43,92% de agente caotrópico (p. ej., tiocianato de guanidina), p/p, ±10%, 2,65% de agente tampón (p. ej., Tris), p/p, ±10%, 0,81% agente quelante (p. ej., EDTA o EDTA (sal) disódica dihidratada), p/p, ±10%, 0,279% tensioactivo (p. ej., SLS), p/p, ±10%, 17,73% alcohol (p. ej., SDA3C o una mezcla de 95% de etanol, v/v, ±10%, y 5% de isopropanol, v/v, ±10%), p/p, ±10%, 0,093% de agente mucolítico (por ejemplo, N-acetil-L-cisteína), p/p, ±10%, y/o ácido (por ejemplo, ácido clorhídrico) qs a pH 8,0, ±10%, con un portador (por ejemplo, un portador acuoso, preferentemente agua filtrada, purificada, destilada y/o desionizada) qs a 100%. Una realización incluye además 0,00037%, p/p, ±10% de indicador visual (p. ej., FD&C Blue No. 1) o su equivalente (p. ej., 0,185%, p/p, ±10%, de un 0,2%, p/p, ±10% de indicador visual concentrado (p. ej., en agua)). En una realización, la cantidad de cada componente, ±10%, es además (limitada a la cantidad citada) ±9%, preferentemente ±8%, más preferentemente ±7%, aún más preferentemente ±6%, aún más preferentemente ±5%, aún más preferentemente ±4%, aún más preferentemente ±3%, aún más preferentemente ±2%, aún más preferentemente ±1%.

En al menos una realización, la composición incluye aproximadamente un 43,92% de tiocianato de guanidina, p/p, aproximadamente un 2,65% de Tris, p/p, aproximadamente un 0,81% de EDTA o EDTA disódico (sal) dihidrato, p/p, aproximadamente un 0,279% de SLS, p/p, aproximadamente un 17,73% de SDA3C, p/p, aproximadamente un 0,093% de N-acetil-L-cisteína, p/p, aproximadamente un 1,08% de ácido clorhídrico 37%, p/p, o su equivalente.73% SDA3C, p/p, aproximadamente 0,093% N-acetil-L-cisteína, p/p, aproximadamente 1,08% ácido clorhídrico 37%, p/p, o su equivalente, o ácido clorhídrico qs a un pH de aproximadamente 8,0, y agua qs al 100%, p/p. La composición puede incluir aproximadamente un 0,00037% p/p de FD&C Blue No. 1 (o un 0,185% p/p de un concentrado del mismo al 0,2% p/p (en agua)), y aproximadamente un 32,602% de agua, p/p.

En algunas realizaciones, la composición puede estar sustancialmente libre o desprovista de contaminación microbiana (por ejemplo, bacteriana, fúngica y/o viral). En algunas realizaciones, la composición puede tener menos de (aproximadamente) 100 ufc/g de bacterias o contaminación bacteriana. En algunas realizaciones, la composición puede tener menos o igual a (aproximadamente) 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 ufc/g de bacterias o contaminación bacteriana. En algunas realizaciones, la composición puede tener menos de o igual a (aproximadamente) 100 ufc/g de hongo (u hongos, como levadura y/o moho) o contaminación fúngica. En algunas realizaciones, la composición puede tener menos o igual que (aproximadamente) 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 ufc/g de hongo (u hongos, como levadura y/o moho) o contaminación fúngica. Como se utiliza aquí, "ufc/g" se refiere a unidades formadoras de colonias (de uno o más microbios) por gramo (de la composición (final y/o líquida)).

Una realización ilustrativa de la presente divulgación se presenta en la Tabla 1, a continuación. La Tabla 1 describe los ingredientes de la composición ilustrativa, así como el uso, función y/o actividad de dichos ingredientes.

Tabla 1

La Tabla 1.1 presenta otra formulación ilustrativa para una composición de la presente divulgación.

Tabla 1.1

Características adicionales de la presente divulgación pueden aprenderse de la Patente de EE.UU. No. de serie 7.482.116.

Kits

Algunas realizaciones incluyen un kit, como un kit de conservación de muestras biológicas. En particular, en una o más realizaciones, la composición inventiva puede incorporarse a un kit. Los kits pueden incluir, por ejemplo, una composición, tal como se divulga y/o describe en el presente documento, y un aparato de recolección de muestras. En al menos una realización, la composición puede disponerse en una porción de un aparato de recolección de muestras. El aparato de recolección de muestras ilustrativo puede incluir un contenedor o vial (por ejemplo, un tubo) que tenga una porción de recolección de muestras. Por ejemplo, el recipiente puede tener una pared exterior que delimite, al menos parcialmente, un compartimento interior. El compartimento interno puede contener la composición, a la que puede añadirse una muestra biológica. Alternativamente, la muestra puede añadirse al compartimento y la composición añadirse a la muestra después de la recolección. Por ejemplo, el aparato puede incluir un dispensador de composición para añadir la composición al compartimento, antes o después de la recolección de la muestra. En al menos una realización, el dispensador puede incluir un tapón para cerrar o sellar una abertura del aparato. La abertura puede desembocar en el compartimento o estar en comunicación fluídica con compartimento. El tapón puede tener un compartimento para retener la composición hasta que se vaya a añadir al compartimento del recipiente.

Algunas realizaciones pueden incluir un kit que comprende un dispositivo (o contenedor) de recolección de muestras biológicas y una composición de la presente divulgación. En al menos una realización, la composición puede disponerse en una porción del dispositivo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición puede disponerse en una porción de un tapón o tapa del dispositivo. El dispositivo de recolección (o contenedor) puede estar configurado para recibir la muestra biológica (por ejemplo, en un compartimento interior del mismo) y para que se le añada la composición.

En algunas realizaciones, la composición del kit puede estar sustancialmente libre o desprovista de contaminación microbiana (como se ha descrito anteriormente).

Varios aparatos de recolección de muestras son conocidos en la técnica.

Las composiciones de la presente divulgación pueden incorporarse a aparatos descritos en la técnica. Las realizaciones de la presente divulgación pueden incluir un ki1 que comprende una composición, tal como se divulga y/o describe en el presente documento, y un aparato de recolección de muestras.

Procedimiento de fabricación

Se divulga, pero no forma parte de la invención reivindicada, un procedimiento de fabricación de una composición de la presente divulgación. Las realizaciones pueden incluir el suministro u obtención de un portador, tal como se describe en el presente documento. Las realizaciones pueden incluir la adición al portador de una cantidad adecuada de uno o más componentes o ingredientes descritos en el presente documento (por ejemplo, a una concentración final descrita en el presente documento). Las realizaciones pueden incluir la adición al portador de una cantidad descrita de solución madre de uno o más componentes o ingredientes descritos en el presente documento.

Al menos una realización incluye añadir al portador un agente caotrópico, un agente amortiguador, un agente quelante, un tensioactivo, un alcohol, un ácido y/o un agente mucolítico. Una o más realizaciones pueden incluir la adición al portador de un indicador visual. Al menos una realización incluye añadir a un portador (líquido), agente caotrópico a una concentración final de 20-50%, p/p, agente tamponador a una concentración final de 0,1-5%, p/p, agente quelante a una concentración final de 0,01-5%, p/p, tensioactivo a una concentración final de 0,01-5%, p/p, alcohol a una concentración final de 5-25%, p/p.01-5%, p/p, tensioactivo a una concentración final de 0,01-5%, p/p, alcohol a una concentración final de 5-25%, p/p, ácido a pH 6,5-9,5 o cantidad equivalente, y/o agente mucolítico a una concentración final de 0,005-0,25%, p/p. Al menos una realización incluye añadir a un portador (líquido) un indicador visual a una concentración final de 0,00005-0,5%, p/p. El portador puede incluirse en qs al 100%

Al menos una realización incluye añadir a un portador (líquido), agente caotrópico a una concentración final de (aproximadamente) 43,92%, p/p, agente tampón a una concentración final de (aproximadamente) 2,65%, p/p, agente quelante a una concentración final de (aproximadamente) 0,81%, p/p, tensioactivo a una concentración final de (aproximadamente) 0,279%, p/p, alcohol a una concentración final de (aproximadamente) 17,73%, p/p, ácido a un pH de (aproximadamente) 0,01%, p/p.81%, p/p, tensioactivo a una concentración final de (aproximadamente) 0,279%, p/p, alcohol a una concentración final de (aproximadamente) 17,73%, p/p, ácido a pH (aproximadamente) 6,5-9,5 o a una concentración final de (aproximadamente) 0,4%, p/p, y/o agente mucolítico a una concentración final de (aproximadamente) 0,093%, p/p. Al menos una realización incluye añadir a un portador (líquido) un indicador visual a una concentración final de (aproximadamente) 0,00037%, p/p. El portador puede incluirse en (aproximadamente) 34,12% o qs a 100%.

En algunas realizaciones, el agente caotrópico puede ser o comprender guanidina y/o tiocianato, el agente tamponador puede ser o comprender Tris o Trizma base, el agente quelante puede ser o comprender EDTA o EDTA disódico (sal) dihidrato, el tensioactivo puede ser o comprender SLS, el alcohol puede ser o comprender etanol y/o isopropanol (p. ej., SDA3C), el agente mucolítico puede ser o comprender N-acetil-L-cisteína, el ácido puede ser o comprender HCl, el portador puede ser o comprender agua, y/o el indicador visual opcional puede ser o comprender FD&C Blue No. 1.

Un procedimiento de fabricación de una composición de estabilización y/o conservación de ácidos nucleicos puede incluir la adición del portador a un recipiente (por ejemplo, cargar un tanque de mezcla con agua (filtrada, desionizada, etc.). En algunas realizaciones, el portador puede incluirse a una concentración final de aproximadamente 34,12%, p/p, de la composición o a qs 100%.

En algunas realizaciones, se puede activar un mezclador antes de añadir uno o más componentes o ingredientes adicionales al portador. En algunas realizaciones, se puede activar un mezclador después de añadir uno o más componentes o ingredientes adicionales al portador. En algunas realizaciones, un mezclador puede ajustarse a una velocidad de 2 - 8, preferentemente 3 -7 , más preferentemente 4-6, aún más preferentemente 5 y/o un barrido de 2 -8, preferentemente 3-7, más preferentemente 4-6, aún más preferentemente 5. En algunas realizaciones, el portador puede calentarse a una temperatura de mezcla adecuada antes de añadir uno o más componentes o ingredientes adicionales al portador. En algunas realizaciones, el portador puede calentarse a una temperatura de mezcla adecuada después de añadir uno o más componentes o ingredientes adicionales al portador. En algunas realizaciones, la temperatura de mezcla adecuada puede ser (aproximadamente) 12,78-35 ± -15 °C, preferentemente 15,55-32,22 ± -15 °C, más preferentemente 18,33-29,44 ± -15 °C, todavía más preferentemente 21,11-26,66 ± -15 °C, más preferentemente 23,88 ± -15 °C.

En algunas realizaciones, puede añadirse una cantidad adecuada de agente caotrópico (por ejemplo, tiocianato de guanidina) al portador (por ejemplo, hasta una concentración final de aproximadamente 43,92%, p/p de la composición). En algunas realizaciones, el agente caotrópico puede mezclarse durante un período de tiempo (por ejemplo, entre 30-300 minutos, preferentemente 60-240 minutos, más preferentemente 120-180, aún más preferentemente 140-160 minutos, más preferentemente 150 minutos, o hasta que el agente caotrópico se disuelva (en solución) en el portador.

En algunas realizaciones, puede añadirse una cantidad adecuada de agente tampón (p. ej., Tris o Trizma Base) al portador (p. ej., hasta una concentración final de aproximadamente el 2,65%, p/p de la composición). En algunas realizaciones, el agente tampón puede mezclarse durante un periodo de tiempo (por ejemplo, entre 1-90 minutos, preferentemente 5-60 minutos, más preferentemente 10-45, aún más preferentemente 12-30 minutos, aún más preferentemente 15-25 minutos, más preferentemente (aproximadamente) 20 minutos, o hasta que el agente tampón se disuelva (en solución) en el portador.

En algunas realizaciones, puede añadirse una cantidad adecuada de agente quelante (p. ej., EDTA, sal disódica de EDTA, (sal) dihidrato disódico de EDTA) al portador (p. ej., hasta una concentración final de aproximadamente 0,81%, p/p de la composición). En algunas realizaciones, el agente quelante puede mezclarse durante un periodo de tiempo (por ejemplo, entre 1-90 minutos, preferentemente 5-60 minutos, más preferentemente 10-45, aún más preferentemente 12-30 minutos, aún más preferentemente 15-25 minutos, más preferentemente (aproximadamente) 20 minutos, o hasta que el agente quelante se disuelva (en solución) en el portador. En al menos una realización, el agente tampón y el agente quelante pueden añadirse al portador juntos, (aproximadamente) al mismo tiempo, contemporáneamente, concomitantemente, y/o (sustancialmente) concurrentemente (o simultáneamente), con o sin ser premezclados juntos. En algunas realizaciones, el agente tampón y el agente quelante pueden añadirse al portador por separado.

En algunas realizaciones, puede añadirse una cantidad adecuada de tensioactivo (por ejemplo, SLS) al portador (por ejemplo, hasta una concentración final de aproximadamente 0,279%, p/p de la composición). En algunas realizaciones, el tensioactivo puede mezclarse durante un periodo de tiempo (por ejemplo, entre 1-90 minutos, preferentemente 5­ 60 minutos, más preferentemente 10-45, aún más preferentemente 15-35 minutos, aún más preferentemente 20-30 minutos, más preferentemente (aproximadamente) 25 minutos, o hasta que el tensioactivo se disuelva (en solución) en el portador.

En algunas realizaciones, puede añadirse al portador una cantidad adecuada de alcohol (por ejemplo, etanol, una mezcla de etanol y otro producto químico, como isopropanol, o un SDA, preferentemente SDA 3C) (por ejemplo, hasta una concentración final de aproximadamente el 17,73%, p/p de la composición). En algunas realizaciones, el alcohol puede mezclarse durante un período de tiempo (por ejemplo, entre 5-90 minutos, preferentemente 10-75 minutos, más preferentemente 15-60, aún más preferentemente 25-45 minutos, aún más preferentemente 30-40 minutos, más preferentemente (aproximadamente) 35 minutos, o hasta que el alcohol se disuelva (en solución) en el portador.

En algunas realizaciones, puede añadirse al portador una cantidad adecuada de un indicador visual opcional (por ejemplo, un agente colorante, un tinte, preferentemente un tinte azul, como FD&C Blue No. 1) (por ejemplo, hasta una concentración final de aproximadamente 0,00037%, p/p de la composición). En algunas realizaciones, el indicador visual puede mezclarse durante un período de tiempo (por ejemplo, entre 5-90 minutos, preferentemente 10-60 minutos, más preferentemente 15-45, aún más preferentemente 10-30 minutos, aún más preferentemente 15-25 minutos, más preferentemente (aproximadamente) 20 minutos, o hasta que el alcohol se disuelva (en solución) en el portador.

En algunas realizaciones, puede añadirse una cantidad adecuada de un ácido (por ejemplo, ácido clorhídrico) al portador (por ejemplo, hasta una concentración final de aproximadamente 0,4%, p/p de la composición o hasta un pH 8,0 de la composición). En algunas realizaciones, el ácido puede mezclarse durante un periodo de tiempo (por ejemplo, entre 5-90 minutos, preferentemente 10-60 minutos, más preferentemente 15-45, aún más preferentemente 10-30 minutos, aún más preferentemente 15-25 minutos, más preferentemente (aproximadamente) 20 minutos, o hasta que el ácido se disuelva (en solución) en el portador y/o la mezcla se equilibre al pH deseado.

En algunas realizaciones, puede añadirse al portador una cantidad adecuada de un agente mucolítico (o agente reductor) (por ejemplo, N-acetilcisteína, N-acetil-L-cisteína) (por ejemplo, hasta una concentración final de aproximadamente 0,093%, p/p de la composición). En algunas realizaciones, el ácido puede mezclarse durante un periodo de tiempo (por ejemplo, entre 5-90 minutos, preferentemente 10-60 minutos, más preferentemente 15-45, aún más preferentemente 10-30 minutos, aún más preferentemente 15-25 minutos, más preferentemente (aproximadamente) 20 minutos, o hasta que el ácido se disuelva (en solución) en el portador y/o la mezcla se equilibre al pH deseado.

En la Tabla 3 se presenta una serie de procedimientos ilustrativos de lotes de fabricación.

Tabla 3

Las pruebas de control de calidad pueden realizarse en cualquier punto adecuado durante la fabricación. Por ejemplo, al finalizar el proceso de fabricación a granel de cada lote, se obtuvieron asépticamente dos (2) muestras (de aproximadamente 4 onzas cada una) del tanque de mezcla a granel utilizando herramientas limpias y desinfectadas, aprobadas y apropiadas para obtener muestras de cada uno de los siguientes lugares: superficie superior del lote cerca del centro del tanque, superficie superior del lote cerca de la pared lateral del tanque, centro del lote cerca del centro del tanque, centro del lote cerca de la pared lateral del tanque, fondo del lote cerca del centro del tanque y fondo del lote cerca de la pared lateral del tanque. Cada muestra se colocó en un vaso estéril y se etiquetó.

Se comprobó el aspecto, la gravedad específica y el pH de cada muestra. Además, se realizaron ensayos para comprobar la concertación y/o la eficacia del agente quelante, el alcohol y el agente mucolítico. Además, se comprobó la contaminación (límites microbianos) midiendo el recuento total de aerobios en placa, levaduras y mohos, Staphylococus aureus y Pseudomonas aeruginosa. El cuadro 4 presenta las especificaciones de las pruebas para diversas medidas de control de calidad.

Tabla 4

En algunas realizaciones, el procedimiento puede incluir el sellado de la composición en un recipiente de almacenamiento adecuado o en una porción de un aparato de recolección de muestras (por ejemplo, una porción de almacenamiento de la composición de un recipiente o vial (por ejemplo, un tubo). Las muestras también se sometieron a pruebas de estabilidad a temperatura ambiente controlada (TRC) y acelerada (ACC) en recipientes de almacenamiento y aparatos de recolección de muestras.

En algunas realizaciones, el procedimiento puede producir o dar como resultado una composición que puede estar sustancialmente libre o desprovista de contaminación microbiana (como se ha descrito anteriormente).

Procedimientos de uso

Algunas realizaciones incluyen un procedimiento de preservación y/o estabilización de ácido nucleico. El procedimiento puede comprender proporcionar una muestra biológica que contenga el ácido nucleico y combinar una composición de la presente divulgación con la muestra biológica. En al menos una realización, la muestra biológica puede ser un fluido o tejido corporal que contenga mucina, como esputo o saliva. El procedimiento puede incluir la reducción de la viscosidad de un fluido corporal o tejido que contenga mucina (por ejemplo, mediante la reducción de los enlaces disulfuro inherentes a la mucina con un agente mucolítico o un agente reductor).

En al menos una realización, el ácido nucleico esADN. En algunas realizaciones, la composición puede estabilizar el ácido nucleico o el ADN (por ejemplo, contra la degradación). En algunas realizaciones, la composición puede estabilizar el ácido nucleico o el ADN durante un primer periodo de tiempo. En algunas realizaciones, el primer período de tiempo puede ser mayor o igual a aproximadamente 14 días, 30 días, 60 días, 90 días, 120 días, 240 días, 300 días o 365 días. En algunas realizaciones, la composición puede estabilizar el ácido nucleico o el ADN durante el primer periodo de tiempo a temperatura ambiente, entre -20°C y 50°C, o a otra temperatura o intervalo de temperaturas adecuado. En algunas realizaciones, la composición puede ser estable durante un segundo periodo de tiempo. En algunas realizaciones, el segundo periodo de tiempo puede ser mayor o igual a aproximadamente 12 meses, 18 meses, 24 meses, 30 meses o 36 meses. En algunas realizaciones, la composición puede permanecer estable durante el segundo periodo de tiempo a temperatura ambiente, entre -20°C y 50°C, o a otra temperatura o intervalo de temperaturas adecuado.

Al menos una realización incluye un procedimiento de recuperación de un ácido nucleico a partir de esputo, que comprende: i) obtener esputo de un sujeto, ii) poner en contacto el esputo con una composición de la presente divulgación para formar una mezcla de muestra, iii) opcionalmente poner en contacto la mezcla con una proteasa, y iv) recuperar el ácido nucleico de la mezcla.

En algunas realizaciones, la composición no inhibe ni interfiere significativamente con el análisis posterior de ácidos nucleicos, como la amplificación de ADN (mediante PCR), la secuenciación (de próxima generación), etc., cuando se añade en una cantidad adecuada a la muestra biológica.

Recolección de la muestra

Se divulga, pero no forma parte de la invención reivindicada, la obtención, suministro y/o recolección de una muestra biológica (por ejemplo, de un sujeto, como un sujeto humano). En algunas realizaciones, la muestra biológica puede ser o comprender saliva (humana). La muestra (humana) puede recogerse de forma aséptica (para evitar la contaminación (microbiana)). En una o más realizaciones, la muestra puede recogerse en un aparato de recolección de muestras o en un contenedor de muestras del mismo. En algunas realizaciones, el aparato o recipiente de recolección de muestras puede formar parte de un kit y/o puede incluir una composición de la presente divulgación. Las realizaciones pueden incluir el contacto de la muestra con una composición de la presente divulgación.

Extracción y análisis de ADN:

Algunas realizaciones de la presente divulgación incluyen la extracción de ácido nucleico de la muestra biológica. A continuación se presenta una lista o descripción no exhaustiva de diversos modos de extracción o procedimientos de extracción que pueden ser adecuados para su uso con las composiciones de la presente divulgación.

Química de extracción

Orgánica - La extracción con fenol-cloroformo sigue siendo un mecanismo empleado tanto en los laboratorios de investigación como en los clínicos y depende del tipo de muestra cuando se trata de la fuente tisular. Para extraer el ADN genómico de alto peso molecular se realizará una extracción manual con fenol/cloroformo seguida de una retroextracción con cloroformo para ayudar a eliminar cualquier contaminación por disolventes orgánicos.

Saturación salina - Tanto las químicas de saturación salina caseras como las comerciales son ampliamente utilizadas para la extracción de ácidos nucleicos de alto peso molecular. El enfoque requiere que se añada una alta concentración de sal a la muestra de saliva para estrellar el ácido nucleico bajo la adición de etanol. Se realizan una serie de lavados para eliminar el exceso de sal de la muestra antes del análisis.

Fase sólida - Diversos proveedores de tecnología ofrecen soluciones tanto de columna de centrifugación como de colector de vacío para unir el ADN a un soporte sólido para la purificación de ácidos nucleicos. Una vez que el ADN está adherido al soporte, se realizan una serie de lavados. Finalmente, el ADN se eluye del soporte sólido en un pequeño volumen para su análisis. La química de las columnas de centrifugación se utiliza con frecuencia tanto en la investigación como en el laboratorio clínico.

A base de microesferas - Las microesferas o microesferas (para)magnéticas se preparan con diversos motivos de unión o por carga para unir ADN de alto peso molecular. Las microesferas son capturadas por un campo magnético, de modo que todo lo que no esté unido a ellas puede lavarse como parte del proceso de purificación. Una vez finalizado el lavado, el ácido nucleico se eluye de las microesferas con una solución que solubiliza el ADN y deja las microesferas, que posteriormente se eliminan volviendo a aplicar un campo magnético. Existen soluciones automatizadas de pequeño y gran volumen para este enfoque en el entorno clínico y de investigación.

Extracciones ilustrativas

Se utilizaron para las pruebas diez muestras de ADN extraídas previamente de los kits de recolección de saliva que contenían composiciones de la presente divulgación y hasta seis muestras de un kit de recolección de saliva existente. Se recogieron otras 23 muestras utilizando el kit inventivo de recolección de saliva. Cada una de las 23 muestras se extrajo en alícuotas duplicadas de 700 ul. Se realizó un control de calidad estándar para evaluar la calidad del ADN.

Se extrajeron 23/23 muestras con dos réplicas por muestra. El rendimiento medio combinado por espectrofotometría UV (Nanodrop) de todas las muestras fue de 20,4ug (2,8-111,4). 20/23 extracciones tenían relaciones 260/280 superiores al valor deseado de 1,7, aunque es probable que las tres muestras inferiores a 1,7 funcionen bien en los análisis posteriores. Todas las muestras tenían ADN de alto peso molecular, como se muestra en la Figura 1A.

Se extrajeron 700 ul de solución de muestra de saliva utilizando reactivos Perkin Elmer para el sistema de extracción MSM1 (Chemagen). Las concentraciones de todas las muestras se determinaron mediante espectrofotometría UV (Nanodrop). Se determinó la pureza mediante espectrofotometría UV midiendo la relación de absorbancia A260/A280. Además, las muestras se analizaron en un gel de agarosa para visualizar la integridad de la muestra. En cada gel se incluye una escalera de tamaño de peso molecular (L) y una muestra de control de más de 50 kb (C). Marcador de ADN Bionexus All Purpose HI-LO utilizado en geles cualitativos (véase la figura 3B).

Enfoques analíticos

Algunas realizaciones incluyen el análisis de los ácidos nucleicos extraídos. Existen varios procedimientos para analizar los ácidos nucleicos extraídos. A continuación se presenta una lista o descripción no exhaustiva de diversos procedimientos para analizar los ácidos nucleicos extraídos que pueden ser adecuados para su uso con las composiciones de la presente divulgación.

PCR

El análisis de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es un medio rápido y rentable para evaluar la fidelidad y limpieza de las plantillas de ADN. Se generará una serie de reacciones PCR (de amplicones de tamaño variable) a partir de todas las plantillas de ADN y se resolverá mediante electroforesis para obtener el producto de amplificación de tamaño correcto. La gama de tamaños de los amplicones PCR proporcionará información sobre la fidelidad de todos los productos de extracción de ADN.

qPCR

La PCR Cuantitativa (qPCR) utiliza sondas fluorogénicas doblemente marcadas para la cuantificación de los amplicones de la PCR. La discriminación alélica utilizando la química Taqman se utilizará para determinar el genotipo específico de todo el ADN recogido y extraído a través de todos los procedimientos de extracción. Se medirá la concordancia de los genotipos de cada uno de los sujetos en todas las variables analizadas. Todas las mediciones cuantitativas se realizarán por triplicado.

dPCR

La PCR digital (dPCR) es una tecnología emergente que se emplea para la detección sensible de genotipos en muestras con cantidades y/o calidad limitantes. Se utilizarán los mismos ensayos Taqman para determinar la sensibilidad absoluta de cada muestra de ADN extraída. Dada la sensibilidad de la dPCR, podremos determinar la sensibilidad final de cada variante analizada.

Microarreglos

La medición de cientos de miles o millones de SNPs simultáneamente tiene enormes implicaciones cuando se trata tanto del descubrimiento como de la clasificación clínica de una única muestra de ADN. Los requisitos de sensibilidad y especificidad son bastante diferentes a los del análisis basado en QPCR y el enfoque para la detección de SNP también es diferente, ya que este enfoque analítico utiliza un mecanismo basado en la hibridación para identificar variantes de ADN. Las tasas de llamadas y la concordancia SNP entre donantes procesados con diferentes químicas de extracción de ADN serán un criterio de valoración analítico crítico.

Secuenciación Sanger

El patrón oro para el análisis de variantes se empleará en todas las muestras de este estudio. Las regiones objetivo para el análisis cubrirán los mismos amplicones de QPCR, dPCR y Microarreglopara validar de forma cruzada los genotipos en todos los demás procedimientos analíticos. La capacidad de realizar llamadas de bases Sanger de alta calidad (y, por tanto, de variantes) depende en gran medida de la calidad del ácido nucleico. Este enfoque se utiliza habitualmente en los análisis clínicos.

Secuenciación NextGen

Tal y como se utiliza aquí, la "secuenciación de nueva generación" (NGS), también conocida como secuenciación de alto rendimiento, se refiere a tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento no basadas en Sanger. La NGS permite secuenciar en paralelo millones o incluso miles de millones de cadenas de ADN, lo que aumenta sustancialmente el rendimiento y reduce al mínimo la necesidad de utilizar los procedimientos de clonación de fragmentos que suelen emplearse en la secuenciación Sanger de genomas. NGS es el término genérico utilizado para describir una serie de diferentes tecnologías o plataformas modernas de secuenciación que incluyen, por ejemplo, la pirosecuenciación, la secuenciación por síntesis, la secuenciación por ligadura, la secuenciación por semiconductores iónicos y otras conocidas en la técnica.

Tal y como entienden los expertos en la materia, la NGS generalmente permite secuenciar grandes cantidades de ADN y ARN de forma mucho más rápida y asequible que la secuenciación Sanger. En la NGS, se secuencian grandes cantidades de lecturas cortas de una sola vez. Para ello, en primer lugar se puede dividir la muestra de entrada en secciones cortas. La longitud de estas secciones depende de la maquinaria de secuenciación utilizada. Ejemplos ilustrativos de tecnologías NGS específicas incluyen, por ejemplo, la secuenciación Illumina® (Solexa), la secuenciación Roche 454™ , Ion torrent™: Secuenciación Proton / PGM, secuenciación SOLiD, etc.

En la secuenciación Illumina, se utilizan lecturas de 100-150bp. Los fragmentos algo más largos se ligan a adaptadores genéricos y se recuecen en un portaobjetos utilizando los adaptadores. La PCR se lleva a cabo para amplificar cada lectura, creando una mancha con muchas copias de la misma lectura. A continuación, se separan en hebras individuales para secuenciarlas. Se inunda el portaobjetos con nucleótidos y ADN polimerasa. Estos nucleótidos están marcados con fluorescencia, y el color corresponde a la base. También tienen un terminador, para que sólo se añada una base cada vez. Se toma una imagen de la diapositiva. En cada lugar de lectura, habrá una señal fluorescente que indicará la base que se ha añadido. A continuación, el portaobjetos se prepara para el siguiente ciclo. Se eliminan los terminadores, lo que permite añadir la siguiente base, y se elimina la señal fluorescente, lo que impide que la señal contamine la siguiente imagen. El proceso se repite, añadiendo un nucleótido cada vez y generando imágenes entre medias. A continuación, se utilizan ordenadores para detectar la base en cada lugar de cada imagen y éstas se utilizan para construir una secuencia. Todas las lecturas de la secuencia tendrán la misma longitud, ya que la longitud de la lectura depende del número de ciclos realizados.

La secuenciación Roche 454™ generalmente puede secuenciar lecturas mucho más largas que Illumina®. Al igual que Illumina®, lo hace secuenciando múltiples lecturas a la vez mediante la lectura de señales ópticas a medida que se añaden bases. Como en Illumina®, el ADN o ARN se fragmenta en lecturas más cortas, en este caso de hasta 1kb. Se añaden adaptadores genéricos a los extremos y éstos se recuecen en las microesferas, un fragmento de ADN por microesfera. A continuación, los fragmentos se amplifican mediante PCR utilizando cebadores específicos del adaptador. A continuación, cada cuenta se coloca en un único pocillo de un portaobjetos. Así, cada pocillo contendrá una única perla, cubierta de muchas copias PCR de una única secuencia. Los pocillos también contienen ADN polimerasa y tampones de secuenciación. El portaobjetos se inunda con una de las cuatro especies NTP Cuando este nucleótido es el siguiente en la secuencia, se añade a la secuencia leída. Si esa única base se repite, se añadirán más. Así que si inundamos con bases de Guanina, y la siguiente en una secuencia es G, se añadirá una G, sin embargo si la siguiente parte de la secuencia es GGGG, entonces se añadirán cuatro Gs. La adición de cada nucleótido libera una señal luminosa. Estas localizaciones de las señales se detectan y se utilizan para determinar a qué perlas se añaden los nucleótidos. Esta mezcla NTP se lava. Ahora se añade la siguiente mezcla de NTP y se repite el proceso, pasando por los cuatro NTP. Este tipo de secuenciación genera gráficos para cada lectura de secuencia, mostrando la densidad de señal para cada lavado de nucleótidos. La secuencia puede entonces determinarse computacionalmente a partir de la densidad de la señal en cada lavado. Todas las lecturas de secuencias que obtengamos del 454 tendrán longitudes diferentes, porque en cada ciclo se añadirán diferentes números de bases.

A diferencia de Illumina® y Roche 454™, Ion torrent™ e Ion proton sequencing no hacen uso de señales ópticas. En su lugar, aprovechan el hecho de que la adición de un dNTP a un polímero de ADN libera un ion H+. Como en otros tipos de NGS, el ADN o ARN de entrada se fragmenta, esta vez ~200 pb. Se añaden adaptadores y se coloca una molécula en una perla. Las moléculas se amplifican en la perla mediante PCR en emulsión. Cada cuenta se coloca en un único pocillo de un portaobjetos. Al igual que Roche 454™, el portaobjetos se inunda con una sola especie de dNTP, junto con tampones y polimerasa, un n Tp cada vez. El pH se detecta es cada uno de los pocillos, ya que cada ion H+ liberado disminuirá el pH. Los cambios en el pH nos permiten determinar si esa base, y cuántas de ellas, se añadieron a la secuencia leída. Los dNTPs se lavan y el proceso se repite pasando por las diferentes especies de dNTPs. El cambio de pH, si lo hay, se utiliza para determinar cuántas bases (si las hay) se añadieron con cada ciclo.

Además, o alternativamente, la secuenciación puede realizarse más generalmente mediante una técnica de secuenciación basada en fluorescencia y/o cualquier técnica de secuenciación basada en corriente eléctrica. Ejemplos ilustrativos de técnicas de secuenciación basadas en fluorescencia incluyen cualquier técnica que incorpore nucleótidos conjugados con un fluoróforo, como, por ejemplo, la secuenciación mediante procedimientos y sistemas de secuenciación basados en Illumina® . Ejemplos ilustrativos de técnicas de secuenciación basadas en la corriente eléctrica incluyen cualquier técnica de secuenciación (incluidos los procedimientos de secuenciación de cadenas) que mide la corriente eléctrica de un polinucleótido a medida que pasa a través de un poro insertado en una membrana cargada o que, de otro modo, interrumpe específicamente la corriente eléctrica de un sensor y/o una membrana cargada. Un ejemplo no limitativo de técnicas de secuenciación basadas en corriente eléctrica incluye los sistemas y procedimientos de secuenciación de ADN Nanopore de Oxford NanoPore Technologies®.

Los sistemas de secuenciación de hebras, como los proporcionados por Oxford NanoPore Technologies®, proporcionan algunas ventajas cuando se determina la variación del número de copias de un ácido nucleico, particularmente la variación del número de copias de una muestra que potencialmente contiene ADN (u otro ácido nucleico) de células neoplásicas y/o cancerosas. Por ejemplo, en las técnicas de secuenciación por hebra, se secuencia continuamente una única porción del genoma, lo que permite un análisis directo de la variación del número de copias en lugar de un análisis implícito de la variación del número de copias que puede producirse al analizar los datos de secuenciación proporcionados por otros procedimientos de secuenciación en los que el ácido nucleico de la muestra se corta en pequeños fragmentos para su secuenciación. Esto puede ser particularmente ventajoso para las realizaciones en las que la cobertura de la secuencia es baja. Es decir, en algunas realizaciones, una ejecución de baja cobertura de secuencia puede devolver un conjunto incompleto de datos genómicos. Puede ser posible inferir a partir de los datos de la secuencia la presencia y/o ausencia de regiones genómicas, además de un número de copia implícito para cada región secuenciada. Sin embargo, en un procedimiento de secuenciación por hebras, las largas lecturas de secuencias producidas pueden permitir una evaluación más definitiva de la variación del número de copias, en particular de las regiones duplicadas o suprimidas. Si no se dispone de una secuencia completa debido a la baja cobertura del experimento de secuenciación, puede ser difícil determinar qué partes del genoma se han eliminado (una forma de variación del número de copias) frente a qué partes del genoma no estaban representadas basándose en la probabilidad estadística (es decir, el muestreo aleatorio).

Como ejemplo ilustrativo, una ejecución de secuenciación que genere datos con una cobertura de 0,5X teóricamente dejará la mitad de la muestra sin representar. Utilizando procedimientos de secuenciación que "trocean" el ácido nucleico en pequeños fragmentos para la secuenciación, el producto final puede ser una biblioteca de secuencias que represente aproximadamente la mitad del genoma de referencia total, donde un genoma de referencia alineado está plagado de un puñado de coincidencias de ácido nucleico más pequeñas. Por otro lado, utilizando un procedimiento de secuenciación por hebras, de nuevo con una cobertura baja (por ejemplo, 0,5X), el resultado puede ser una biblioteca de secuencias que represente, de nuevo, aproximadamente la mitad del genoma de referencia total. Sin embargo, cuando se alinean con un genoma de referencia, las porciones coincidentes son mucho más largas y pueden proporcionar información más definitiva, como qué secuencias se han eliminado, duplicado, insertado, etc. Esto también puede resultar problemático. Mientras que una porción contigua más larga del genoma puede estar representada por un enfoque de secuenciación de cadenas, las porciones contiguas largas del genoma también quedan desconocidas. Así, aunque los procedimientos de secuenciación por hebras pueden permitir una visión de mayor definición de porciones del genoma, las lecturas de secuenciación más pequeñas tienen el potencial de proporcionar una imagen más global de todo el genoma. De esta y otras formas, la secuenciación de cadenas puede proporcionar un modelo sólido para analizar la variación del número de copias.

Aunque lo anterior es ilustrativo de técnicas de secuenciación conocidas y sus aplicaciones a los procedimientos y sistemas inventivos aquí divulgados, debe entenderse que esto no impide que procedimientos de secuenciación aún no descubiertos o no divulgados de otro modo puedan aplicarse dentro del alcance de la presente invención. Es decir, el procedimiento de secuenciación, en sí mismo, no es, en muchas realizaciones, una actividad inventiva requerida (a menos que, por ejemplo, se proporcione una mejora al procedimiento y/o sistema mediante el uso de una técnica de secuenciación particular); más bien, lo que se hace con los datos de secuenciación proporcionados por el procedimiento de secuenciación y/o cómo se aplican esos datos generalmente comprende una actividad inventiva. En consecuencia, debe apreciarse que las futuras tecnologías de secuenciación (y aquellas tecnologías de secuenciación que no se hayan enumerado explícitamente en el presente documento), si se utilizan como herramienta en el procedimiento o los sistemas divulgados, se incluyen en el ámbito de la presente solicitud.

Además, cualquiera de las técnicas de secuenciación anteriores puede utilizarse en cualquier número o capacidad y con cualquier número de celdas de flujo u otras entradas similares que afecten al número total de lecturas de secuenciación proporcionadas para cada reacción/ejecución de secuenciación.

La secuenciación de próxima generación puede convertirse en última instancia en el estándar para el análisis de objetivos tanto de ADN como de ARN. Se crea un panel dirigido que incluye las regiones genómicas cubiertas por qPCR, dPCR y objetivos basados en arreglos para todas las muestras de ADN mediante un proceso estándar de preparación de bibliotecas. Las muestras se codifican con códigos de barras y se multiplexan en una plataforma NextGen para el análisis de variantes. Los datos se desmultiplexan y analizan para la comparación directa de la llamada de genotipo en todas las demás plataformas.

Se probaron varios de los procedimientos anteriores y otros basados en ADN para evaluar la calidad y la utilidad del ADN extraído de muestras recoleccións utilizando kits de recolección de saliva de 2 ml que contenían una composición conservante de ácido nucleico de la presente divulgación. Además, se utilizó un pequeño número de muestras de ADN, extraídas de dos productos existentes, para comparar algunos procedimientos posteriores. A continuación se ofrece una lista no exhaustiva o una descripción de varios procedimientos posteriores probados, incluida la química TaqMan® para la detección de polimorfismos de nucleótido único (SNP) utilizando un formato OpenArray® (n=120 SNP/muestra), una variante de número de copias (CNV) utilizando la química TaqMan® (gen CYP2D6), secuenciación completa de exoma de próxima generación (WES) (Thermo Fisher) y análisis de microarreglos cromosómicos (CMA) (Affymetrix CytoScan HD). Estos procedimientos se eligieron para incluir una amplia variedad de procedimientos comunes utilizados en los laboratorios de genética molecular. Además del análisis posterior, se midió el contenido de ADN bacteriano como porcentaje del ADN total mediante un ensayo de PCR cuantitativa (qPCR). Sin estar atado a ninguna teoría, se sabe que las muestras de saliva tienen una alta concentración de ADN bacteriano que podría ser una sustancia interferente para algunos procedimientos.

Genotipado de SNP TaqMan® Open Array® :

El genotipado del polimorfismo de nucleótido único se realizó mediante un ensayo de genotipado TaqMan® OpenArray® . El ensayo TaqMan® es un ensayo de discriminación alélica que utiliza la amplificación por PCR y un par de detectores de colorantes fluorescentes dirigidos al SNP. Se fija al detector un colorante fluorescente que coincide perfectamente con el primer alelo (por ejemplo, un nucleótido "A") y se fija al detector un colorante fluorescente diferente que coincide perfectamente con el segundo alelo (por ejemplo, un nucleótido "C"). Durante la PCR, la polimerasa libera la sonda fluorescente a la solución, donde se detecta mediante un análisis de punto final en un analizador de Life Technologies, Inc. En concreto, la tecnología OpenArray® es una plataforma de fluídica de nanolitros para reacciones en fase de solución de bajo volumen. La tecnología OpenArray® utiliza una placa del tamaño de una platina de microscopio con 3.072 orificios pasantes. Cada orificio pasante tiene 300 pm de diámetro y 300 pm de profundidad y está tratado con un revestimiento hidrófilo e hidrófobo. La química TaqMan® para un único ensayo se carga previamente y se seca en cada orificio pasante. Los OpenArrays® se obtuvieron mediante el diseño y la fabricación de Life Technologies. Los genotipos se determinaron utilizando el software Taqman Genotyper v1.0.1 de Life Technologies.

Se determinó un total de 5234 genotipos en 44 muestras en un 118-120 SNPs/muestra. Las 44 muestras incluían repeticiones de 3 muestras cada una de extracciones tanto del kit inventivo como de los kits existentes. El genotipado de las muestras de los kits inventivos fue muy satisfactorio y superó las expectativas de rendimiento conocidas para este tipo de ensayo. Sin estar atado a ninguna teoría, se espera que el genotipado Taqman produzca con éxito el genotipado en más del 99% de las muestras. En este experimento, el 99,75% de las muestras produjeron un genotipo (5221/5234). No hubo diferencias significativas en la tasa de genotipado entre los extractos de a Dn de la solución inventiva y los extractos existentes, 99,74% y 99,87%, respectivamente. En las 6 muestras duplicadas tanto en los extractos de ADN de la solución inventiva como en los extractos existentes, todos los genotipos fueron concordantes.

Detección de variantes en el número de copias Taqman® :

Se utilizó un ensayo TaqMan® de número de copias (CYP2D6-Hs00010001_cn) para detectar el número de copias del gen CYP2D6, una CNV bien caracterizada evaluada en farmacogenética. Los ensayos de número de copias TaqMan® emplean la química de sondas TaqMan® MGB para evaluar el número de copias de dianas de ADN genómico. En este ensayo se utilizó un instrumento de PCR en tiempo real Applied Biosystems® 7900 HT y el software copy caller para determinar el número de copias. Cada muestra se amplificó tres veces y se comparó con una curva estándar para determinar el número de copias.

Se analizaron 33 muestras de ADN extraídas inventivas y 5 muestras extraídas existentes para una variante de número de copias bien caracterizada en el gen CYP2D6. 30/33 muestras de ADN extraídas con solución inventiva produjeron resultados de CNV. 5/5 muestras extraídas por competidores produjeron resultados de CNV. Las 3 muestras que no produjeron un resultado CNV eran todas de la misma persona ("B") a partir de 3 muestras independientes recoleccións el mismo día. Una muestra de este mismo individuo que se recogió en un día diferente y se extrajo con el kit de saliva existente produjo un resultado de VNC normal, descartando una posible mutación interferente.

Secuenciación del exoma completo (WES):

Se preparó una biblioteca de exoma utilizando Ion AmpliSeq™ Exome Kit. El kit de bibliotecas se combina con Ampliseq Exome Panel Primer pools, que contiene aproximadamente 294.000 pares de cebadores en 12 grupos de cebadores. A continuación, los amplicones resultantes se tratan con un reactivo para digerir parcialmente los cebadores y fosforilar los amplicones. A continuación, los amplicones se ligan a adaptadores de iones con códigos de barras y se purifican. Una vez finalizada la preparación de la biblioteca de exornas, la biblioteca purificada y enriquecida en exornas se cuantifica mediante PCR en tiempo real. A continuación, la biblioteca cuantificada se diluye a 100pM y se utiliza para preparar partículas Ion PI™ Ion Sphere™ Particles (ISPs) templadas para la secuenciación. A continuación, la muestra se secuenció en el sistema Ion Proton utilizando un Ion P ⁱ™ Chip v3. Se utilizó la química Ion Hi-Q Sequencing 200 V2 para secuenciar bibliotecas de insertos de hasta 200 pares de bases de promedio.

Cuatro muestras, 3 extraídas del kit de saliva inventivo y una extraída del kit de saliva existente se evaluaron con una preparación de biblioteca de exoma completo (AmpliSeq Exome, Thermo Fisher) seguida de secuenciación de próxima generación en el instrumento Ion Proton (Thermo Fisher). Los resultados típicos esperados son > 30 millones de lecturas, profundidad media de cobertura superior a 80X y >80% de bases cubiertas a una profundidad de > 20X. Tres de las cuatro muestras cumplían estos criterios. Hubo una muestra extraída del kit de saliva inventiva que no cumplió dos de las tres métricas de control de calidad, con <30 millones de lecturas y menos de 80X de cobertura de profundidad media. Cabe señalar que la muestra de bajo rendimiento fue una de las mismas muestras que tampoco obtuvo un análisis CNV satisfactorio. El examen del perfil de control de calidad del ADN no reveló nada inusual en esta muestra. Se cumplieron todos los parámetros de control de calidad. Aunque de rendimiento inferior, esta muestra arrojó resultados de secuenciación del exoma adecuados para su evaluación.

Microarregloos cromosómicos (CMA):

El análisis CMA se realizó utilizando el ensayo Affymetrix CytoScan HD siguiendo el protocolo del fabricante. Las muestras se escanearon en un Genome Analyzer 3000. Se utilizaron microarreglos cromosómicos para detectar aberraciones cromosómicas con mayor resolución que el cariotipo. El ensayo consistió en la preparación del ADN seguida de la hibridación con el chip CytoScan HD, que contiene aproximadamente 2,7 millones de CNV en todo el genoma. Las muestras se evaluaron utilizando el software ChAS de Affymetrix.

Se seleccionó una muestra de los ADN extraídos del kit de saliva Spectrum. Se evaluó con éxito en una microarreglo cromosómico (Affymetrix, CytoScan HD). La muestra tenía un valor MAPD de <0,25 (0,18), un valor SNPQC de > 15 (16,47), un valor de ondulación de < 0,12 (0,09) y una tasa de llamadas QC de > 95% (96,8%).

Contenido de ADN bacteriano mediante un ensayo qPCR:

El contenido de ADN bacteriano en la muestra se determinó utilizando un protocolo modificado descrito en la bibliografía. En resumen, se creó una curva estándar utilizando una dilución en serie de E. coli para compararla con los datos de PCR en tiempo real generados. Los cebadores de la PCR se eligieron a partir de una región del gen 16S rRNA que se sabe que está conservada en una amplia variedad de microorganismos y que no se encuentra en el ADN de los eucariotas. Se comprobó la presencia del gen 16S rRNA en el ADN mediante qPCR en tiempo real en un instrumento ThermoFisher 7900HT utilizando el software copy caller.

Se ha pensado que el contenido de ADN bacteriano, como porcentaje de la cantidad total de ADN de la muestra recolección de saliva, posiblemente inhibe o reduce la tasa de éxito del análisis posterior. se analizaron 33 muestras de ADN extraídas del kit de saliva inventivo y 5 muestras de ADN extraídas del kit de saliva existente para determinar el porcentaje de ADN bacteriano presente. Datos anteriores del competidor estimaban que el porcentaje de ADN bacteriano era aproximadamente del 13%. El contenido bacteriano medio de las extracciones del kit de saliva inventiva fue del 5,5% (1,1-14,3%). El contenido bacteriano medio de las extracciones del kit de saliva competidor fue del 26% (2,1-96,2%)-14,31%).

Una serie de las pruebas experimentales anteriores y/u otras se realizaron para apoyar una presentación a la FDA para consideración 510K con el fin de obtener la aprobación para el uso de una formulación de la presente divulgación en un dispositivo de recolección para la extracción de ácido nucleico utilizando cualquiera de una variedad de enfoques químicos disponibles, incluyendo extracción orgánica, en fase sólida, basada en microesferas, y extracción por salazón, así como cualquiera de una variedad de análisis moleculares utilizados actualmente, incluyendo PCR, qPCR, dPCR, microarreglos, secuenciación Sanger, y la llamada secuenciación de próxima generación (o NextGen) (NGS), como se indica en la Tabla 5, a continuación.

Tabla 5

Sumario de Resultados

El ADN se extrajo con éxito de todas las muestras en todas las réplicas. En general, el tamaño (y el rendimiento) del ADN extraído fue elevado. Los indicios de degradación eran mínimos. Las réplicas de una muestra eran muy comparables en términos de rendimiento. Además, los rendimientos de lo que se supone que es el mismo individuo se comportaron de forma similar. El genotipado para SNPs produjo un resultado de alta calidad y alcanzó el rendimiento esperado. Las muestras de un individuo, 4 muestras recoleccións por separado, no cumplieron los parámetros de control de calidad para la VNC (n=3) o la NGS (n=1). El contenido de ADN bacteriano como porcentaje del ADN total fue relativamente bajo en las extracciones de ADN del kit de saliva inventivo.

En otro ejemplo, presentado en las Tablas 6 y 7, se utilizaron 100 muestras para probar el rendimiento de una composición conservante de ácido nucleico de la presente divulgación ("Inventiva") y dos productos existentes ("Existente 1" y "Existente 2"). Como se presenta en la Tabla 6, la composición conservante de ácido nucleico "Inventiva" de la presente divulgación produjo una mayor concentración media de ADN y una mayor cantidad (rendimiento) de ADN total que cualquiera de los productos "Existentes".

Tabla 6

Como se presenta además en la Tabla 7, las muestras procesadas con la composición conservante de ácido nucleico "Inventiva" de la presente divulgación tenían una cantidad media significativamente menor de ADN no humano que cualquiera de los productos "Existentes".

Tabla 7

En consecuencia, las composiciones de la presente divulgación son sorprendentemente, significativamente superiores a los productos existentes para la preservación del ADN. En particular, fue sorprendente e inesperado que las composiciones de la presente divulgación funcionaran tan bien (por ejemplo, que produjeran altas cantidades de ácido nucleico (ADN) (humano) y/o que tuvieran o presentaran bajos niveles de contaminación microbiana). Fue además sorprendente e inesperado que las composiciones de la presente divulgación funcionaran tan bien con la baja cantidad de alcohol proporcionada en algunas realizaciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cantidad de alcohol incluida en la composición puede ser menor (por ejemplo, aproximadamente un 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% o 60% menos) que las soluciones de conservación de ácidos nucleicos típicas, tradicionales o existentes. Además, la menor cantidad de alcohol es más económica y/o hace que la composición sea más modificable para su envío o transporte (por ejemplo, cumpliendo más fácilmente los requisitos y normativas de envío, reduciendo la volatilidad, etc.).

Conclusión

Se apreciará que ciertas realizaciones (p. ej., composiciones, kits, procedimiento, etc.) pueden incluir, incorporar o comprender de otro modo características (p. ej., propiedades, componentes, ingredientes, elementos, partes, porciones, pasos, etc.) descritas en otras realizaciones divulgadas y/o descritas en el presente documento. En consecuencia, las diversas características de una realización pueden ser compatibles con, combinado con, incluido en, y / o incorporados en otras realizaciones de la presente divulgación. La divulgación de ciertas características relativas a una realización de la presente divulgación no debe interpretarse como una limitación de la aplicación o inclusión de dichas características en la realización específica. Más bien, se apreciará que otras realizaciones también pueden incluir dichas características sin apartarse necesariamente del alcance de la presente divulgación. Por otra parte, a menos que una característica se describe como que requieren otras características en combinación con el mismo, cualquier característica descrita en este documento se puede combinar con cualquier otra característica de una misma o diferente realización divulgada en este documento.

Las realizaciones descritas deben considerarse en todos los aspectos únicamente ilustrativas y no restrictivas. Por lo tanto, el alcance de la invención viene indicado por las reivindicaciones adjuntas más que por la descripción anterior.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de conservación de ácidos nucleicos, que comprende:

43,92%, p/p, ±10% tiocianato de guanidina;

2,65%, p/p, ±10% tris(hidroximetil)aminometano (Tris);

0,81%, p/p, ±10% de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o EDTA disódico (sal) dihidratado;

0,279%, p/p, ±10% lauroilsarcosinato sódico (SLS);

17,73%, p/p, ±10% de alcohol, comprendiendo el alcohol etanol;

0,093%, p/p, ±10% N-acetil-L-cisteína (NAC);

ácido qs a pH 8,0, ±10%; y

un portador acuoso qs al 100%, p/p;

en la que ±10% es del valor numérico indicado

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que:

a) en la que la composición comprende:

43,92%, p/p, ±1%, del tiocianato de guanidina;

2,65%, p/p, ±1%, del Tris;

0,81%, p/p, ±1%, del EDTA o EDTA disódico (sal) dihidratado;

0,279%, p/p, ±1%, del SLS;

17,73%, p/p, ±1%, del alcohol; y/o

0,093%, p/p, ±1%, del NAC; donde ±1% es del valor numérico indicado; o

(b) en la que la composición comprende:

43,92%, p/p, ±5%, del tiocianato de guanidina;

2,65%, p/p, ±5%, del Tris;

0,81%, p/p, ±5%, del EDTA o EDTA disódico (sal) dihidratado;

0,279%, p/p, ±5%, p/p, del SLS;

17,73%, p/p, ±5%, del alcohol; y/o

0,093%, p/p, ±5%, p/p, del NAC; donde ±5% es del valor numérico indicado.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que el ácido se incluye qs a pH 7,6-8,4, preferentemente pH 7,8-8,2, más preferentemente alrededor de pH 8,0.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el alcohol comprende un alcohol especialmente desnaturalizado (SDA), más preferentemente una mezcla de aproximadamente 95% de etanol v/v y aproximadamente 5% de isopropanol v/v (SDA 3C).

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la composición está sustancialmente libre o desprovista de una o cualquier proteasa(s).

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la composición

i) está sustancialmente libre o desprovista de agente(s) mucolítico(s) distinto(s) de la N-acetil-L-cisteína; (ii) está sustancialmente libre o desprovista de agente(s) antimicrobiano(s), agente(s) bactericida(s) y/o agente(s) bacteriostático(s) adicional(es) o distinto(s) del alcohol, el tiocianato de guanidina, el SLS y el nAC; y/o

(iii) está sustancialmente libre o desprovista de inhibidor(es) de la ribonucleasa o de inhibidor(es) de la ribonucleasa adicionales o distintos del tiocianato de guanidina; preferentemente, la composición está sustancialmente desprovista de heparina, heparán sulfato, oligo(ácido vinilsulfónico), poli(ácido vinilsulfónico), oligo(ácido vinilfosfónico), y/o poli(ácido vinilsulfónico), o sal(es) de los mismos).

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la composición está sustancialmente libre o desprovista de ácido ascórbico, ditionito, eriorbato, ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, diieritritol, un tiol soportado por resina, una fosfina soportada por resina, vitamina E, y/o trolox, o sal(es) de los mismos.

8. LA composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que:la composición está:

(i) sustancialmente libre o desprovista de microbio(s) y/o contaminación microbiana; y/o

(ii) tiene menos o igual a aproximadamente 100, 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 unidades formadoras de colonias (ufc) de uno o más microbios por gramo de la composición (ufc/g).

9. La composición de la reivindicación 1, en la que el alcohol comprende una mezcla de etanol y uno o más productos químicos adicionales, preferentemente en la que el uno o más productos químicos adicionales comprenden isopropanol.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la composición comprende ácido clorhídrico.

11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que el portador acuoso comprende agua filtrada, purificada, destilada y/o desionizada.

12. Un kit de conservación de muestras biológicas, que comprende:

un aparato de recolección de muestras; y

la composición de conservación de ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 dispuesta en el compartimento de la solución.

13. Un procedimiento de estabilización de ácido nucleico humano, comprendiendo el procedimiento poner en contacto una muestra biológica que contiene el ácido nucleico humano con la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la muestra biológica comprende saliva humana.

15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende además un indicador visual, el indicador visual:

comprendiendo preferentemente un agente colorante, más preferentemente un tinte coloreado, todavía más preferentemente un colorante azul, todavía más preferentemente FD&C Blue No. 1; y

incluyéndose preferentemente en la composición a una concentración del 0,00037%, p/p, ±10%, más preferentemente del 0,00037%, p/p, ±5% y todavía más preferentemente del 0,00037%, p/p, ±1%; donde ±10%, ±5% y ±1% son del valor numérico indicado.