CN113736755B - 一种可常温保存的灭活型病毒保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒保存液领域，公开了一种可常温保存的灭活型病毒保存液及其制备方法，保存液的原料包括：异硫氰酸胍190~210g/L；柠檬酸钠2~3g/L；十二烷基肌氨酸钠1.8~2.0g/L；HAc‑NaAc缓冲液55~65mL/L；二茂铁‑谷胱甘肽10~30mg/L；酸碱指示剂30~50 mg/L。本发明在保存液中加入异硫氰酸胍、二茂铁‑谷胱甘肽及十二烷基肌氨酸钠，通过各组分的复配可以实现对病毒迅速灭活，并可以维持样本核酸的稳定性，可以在常温下长时间保存不降解，提高了核酸检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及病毒保存液领域，尤其是涉及一种可常温保存的灭活型病毒保存液及其制备方法。
背景技术
呼吸道病毒感染作为临床最常见的疾病之一，病原学复杂，大多数呼吸道病毒感染表现出相似症状，临床医师很难仅根据患者的临床表现作出准确诊断，精确的病原学分析不仅是确诊依据，也是合理选择治疗方案的基础。病毒性感染检测的金标准是实时荧光定量PCR，检测前需要提取疑似样本中的核酸(DNA、RNA)。而受到时间或距离的限制，一般需要将待测样本保存一段时间，或送至特定的地点才能进行检测。病毒保存液用于病毒样本采集保存运输工作，是采样管内浸没采样拭子病毒样本的一种保护病毒的被检测物质的液体，可采集咽拭子、鼻拭子或特定部位组织样本，储存的样本可用于后续的核酸提取或纯化等临床实验。样本的采集和保存为病原体检测的关键步骤之一，是影响病原体检测结果准确性的重要因素之一。
病毒保存液主要有非灭活型和灭活型两种，非灭活型病毒保存液不含裂解盐，同时保留了病毒的蛋白质外壳以及病毒核酸DNA或者RNA，这样病毒在体外具有蛋白抗原表位和核酸的完整性，检出率更高，但操作时有一定的感染性风险，安全性低。灭活型病毒保存液中添加有高浓度的裂解盐，能够迅速高效地使待测样本利的病毒蛋白裂解失活，可以有效防止操作员二次感染，同时又含有RNA酶抑制剂，能保护病毒核酸不被降解，适用于大多数病毒样本采集。例如，在中国专利文献上公开的“一种灭活型病毒保存液配方及其制作方法”，其公开号CN113186251A，包括以下组分及各组分的重量数为：蛋白变性剂：高浓度胍盐，盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或多种组合，5～20g；RNA酶抑制剂：0.5～2g；缓冲稳定剂：Tris2～6g；表面活性剂：十二烷基肌氨酸钠1～4g；酸碱指示剂：0.001～0.01g；防冻剂：0.2～1g。该保存液实现了保存液安全无毒，可在低温下保持液体状态，方便采样，可灭活病毒并保护RNA酶降解病毒。
但现有的灭活型保存液取样后样本通常需要低温保存，无法实现在常温下的长时间保存，在常温下容易造成样本降解，导致“假阴性”，不利于病毒核酸检测样本的保存。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的灭活型保存液取样后样本通常需要低温保存，无法实现在常温下的长时间保存的问题，提供一种可常温保存的灭活型病毒保存液及其制备方法，可以对病毒迅速灭活，并可以维持样本核酸的稳定性，可以在常温下长时间保存不降解，提高了核酸检测的准确性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种可常温保存的灭活型病毒保存液，原料包括：
本发明在保存液中加入了异硫氰酸胍，异硫氰酸胍能迅速破碎灭活病毒，使核蛋白与核酸迅速分离，有效防止二次感染风险，同时抑制释放出的RNA酶活性，保证核酸一级结构的完整性，提高核酸提取效率。同时，本发明在保存液中加入了二茂铁-谷胱甘肽，谷胱甘肽中的巯基可破坏RNA酶蛋白质中的二硫键，使RNA酶变性，与异硫氰酸胍共同作用能有效保护病毒核酸不被降解，提高病毒的检出率，保证检测结果的准确性；并且，将谷胱甘肽修饰在二茂铁上，可以提高谷胱甘肽的抑菌性，延长取样后样本在常温下的保存时间。本发明还添加十二烷基肌氨酸钠作为表面活性剂，可提高保存液中各组分的相容性及核酸在保存液中的溶解性，同时也具有抗菌作用；添加缓冲液和酸碱指示剂，可以使保存液的pH保持在一定范围内，保证样本的稳定性。本发明通过各组分的配合及对其用量的调控，可使样本在常温下能稳定保存30天，保障了后续核酸检测的准确性。
作为优选，所述二茂铁-谷胱甘肽的制备方法为：
A)将二茂铁甲酸溶于水和丙酮的混合溶剂中，冷却至0～4℃后依次滴加三乙胺的丙酮溶液和氯甲酸乙酯的丙酮溶液，搅拌25～35min后再滴加叠氮化钠水溶液，搅拌反应60～90min后萃取有机相并干燥后得到叠氮羰基二茂铁；其中二茂铁甲酸、三乙胺、氯甲酸乙酯和叠氮化钠的添加量之比为1g:0.6～0.8mL:0.3～0.5mL:0.4～0.5g；
B)将叠氮羰基二茂铁加入叔丁醇中，叠氮羰基二茂铁与叔丁醇的质量体积比为19～20mg:1mL；75～85℃回流反应1～2h，将反应液蒸干后得到叔丁基氧-氨基二茂铁；
C)将叔丁基氧-氨基二茂铁溶于乙酸乙酯中，0～4℃下通干燥的HCl气体60～90min，然后再室温下反应30～60min，将反应液蒸干后得到氨基修饰的二茂铁；
D)将二碳酸二叔丁酯的1,4-二氧己环溶液与饱和碳酸氢钠溶液混合，然后加入还原型谷胱甘肽，二碳酸二叔丁酯、碳酸氢钠与还原型谷胱甘肽的质量比为1.2～1.3:0.7～0.8:1，搅拌反应8～12h后分离油相并干燥得到氨基保护的还原型谷胱甘肽；
E)将氨基保护的还原型谷胱甘肽加入二氯甲烷中溶解，降温至0～4℃下加入三乙胺，再加入HBTU，保温反应60～90min后加入氨基修饰的二茂铁，氨基保护的还原型谷胱甘肽、三乙胺、HBTU和氨基修饰的二茂铁的添加量之比为310～330mg:1mL:400～420mg:300～310mg；继续保温反应2～3h，再升温至25～30℃反应8～12h，反应结束后依次用饱和碳酸氢钠溶液、盐酸和水洗涤，分离油相并干燥后得到叔丁基氧-二茂铁-谷胱甘肽；
F)将叔丁基氧-二茂铁-谷胱甘肽溶于乙酸乙酯中，0～4℃下通干燥的HCl气体60～90min，然后再室温下反应30～60min，将反应液蒸干后得到所述二茂铁-谷胱甘肽。
本发明先通过步骤A)～C)在二茂铁上修饰上氨基，然后通过步骤D)和E)对还原型谷胱甘肽中的氨基进行保护，并利用谷胱甘肽中的羟基与二茂铁上的氨基反应，将还原型谷胱甘肽修饰在二茂铁上，最终通过步骤F)对氨基去保护，得到二茂铁-谷胱甘肽。
本发明将谷胱甘肽修饰在二茂铁上，可以在保持谷胱甘肽对RNA酶抑制作用的同时提高谷胱甘肽的抑菌作用，同时经谷胱甘肽修饰后也提高了二茂铁的溶解性，从而使得到的二茂铁-谷胱甘肽加入保存液中可以与异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠配合作用，使样本可以在常温下长时间保存。
作为优选，所述HAc-NaAc缓冲液的pH为4.0～4.5。
作为优选，所述酸碱指示剂为甲基红。
本发明还公开了一种上述灭活型病毒保存液的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)配制柠檬酸钠溶液；
(2)配制十二烷基肌氨酸钠溶液；
(3)配制HAc-NaAc缓冲液；
(4)配制异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液；
(5)按各原料的比例将柠檬酸钠溶液加入异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液中，再加入十二烷基肌氨酸钠溶液，混合均匀后加入HAc-NaAc缓冲液，再加入酸碱指示剂，用水定容；过滤、灭菌后得到所述灭活型病毒保存液。
作为优选，步骤(1)中所述的柠檬酸钠溶液的浓度为0.65～0.75mol/L。
作为优选，步骤(2)中所述的十二烷基肌氨酸钠溶液的质量分数为8～10％。
作为优选，步骤(4)中的混合溶液中，异硫氰酸胍的浓度为190～210g/800mL。
作为优选，步骤(5)中的灭菌温度120～125℃，灭菌时间25～35min。
作为优选，步骤(1)～(5)使用的水为无酶无菌水。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)安全：对病原体迅速灭活，保障生物安全性；
(2)维持样本核酸的稳定性：可使病原体核酸在常温条件下保存30天而不降解，保障后续核酸检测的准确性；
(3)适用范围广：适用于市场上绝大部分的提取试剂；
(4)保存期长：有效期可达2年(市售同类产品多为1-1.5年)。
附图说明
图1是实施例1中的保存液对最低浓度样本检出率影响的测试结果图。
图2是对比例1中的保存液对最低浓度样本检出率影响的测试结果图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步的描述。
在本发明中，若非特指，所有原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
实施例1：
一种可常温保存的灭活型病毒保存液，原料包括：
其中，二茂铁-谷胱甘肽的制备方法为：
A)将二茂铁甲酸溶于水和丙酮的体积比为3:10的混合溶剂中，冷却至0℃后依次滴加三乙胺的丙酮溶液和氯甲酸乙酯的丙酮溶液，搅拌30min后再滴加叠氮化钠水溶液，搅拌反应80min后萃取有机相并干燥后得到叠氮羰基二茂铁；其中二茂铁甲酸、三乙胺、氯甲酸乙酯和叠氮化钠的添加量之比为1g:0.7mL:0.4mL:0.45g；
B)将叠氮羰基二茂铁加入叔丁醇中，叠氮羰基二茂铁与叔丁醇的质量体积比为19.5mg:1mL；80℃回流反应1.5h，将反应液蒸干后得到叔丁基氧-氨基二茂铁；
C)将叔丁基氧-氨基二茂铁溶于乙酸乙酯中，0℃下通干燥的HCl气体80min，然后再室温下反应40min，将反应液蒸干后得到氨基修饰的二茂铁；
D)将二碳酸二叔丁酯的1,4-二氧己环溶液与饱和碳酸氢钠溶液混合，然后加入还原型谷胱甘肽，二碳酸二叔丁酯、碳酸氢钠与还原型谷胱甘肽的质量比为1.25:0.75:1，搅拌反应10h后分离油相并干燥得到氨基保护的还原型谷胱甘肽；
E)将氨基保护的还原型谷胱甘肽加入二氯甲烷中溶解，降温至0℃下加入三乙胺，再加入HBTU，保温反应70min后加入氨基修饰的二茂铁，氨基保护的还原型谷胱甘肽、三乙胺、HBTU和氨基修饰的二茂铁的添加量之比为320mg:1mL:410mg:305mg；继续保温反应2.5h，再升温至26℃反应10h，反应结束后依次用饱和碳酸氢钠溶液、盐酸和水洗涤，分离油相并干燥后得到叔丁基氧-二茂铁-谷胱甘肽；
F)将叔丁基氧-二茂铁-谷胱甘肽溶于乙酸乙酯中，0℃下通干燥的HCl气体70min，然后再室温下反应40min，将反应液蒸干后得到所述二茂铁-谷胱甘肽。
上述灭火型病毒保存液的制备方法为：
(1)配制0.65mol/L的柠檬酸钠溶液：将191.16g二水合柠檬酸三钠加入200mL无酶无菌水溶解，调整溶液pH值≥7，再加无酶无菌水定容至1L，得到0.65mol/L的柠檬酸钠溶液，放入贴好标签，2～8℃保存；
(2)配制8wt％十二烷基肌氨酸钠溶液：将80g十二烷基肌氨酸钠加入无酶无菌水中溶解，定容到1L，得到8wt％的十二烷基肌氨酸钠溶液，放入贴好标签，2～8℃保存；
(3)配制pH＝4.0的HAc-NaAc缓冲液：
I)配制2.0mol/L醋酸钠溶液：将299.37g三水醋酸钠加入无酶无菌水中溶解，定容到1L，得到2.0mol/L的醋酸钠溶液；
II)配制2.0mol/L醋酸溶液：将118mL冰醋酸加入无酶无菌水中溶解，定容到1L，得到2.0mol/L的醋酸溶液；
III)将9mL 2.0mol/L的醋酸钠溶液与41mL 2.0mol/L的醋酸溶液混合，搅拌均匀得到pH＝4.0的HAc-NaAc缓冲液；
(4)配制异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液：将200g异硫氰酸胍和20mg二茂铁-谷胱甘肽加入800mL无酶无菌水中溶解，得到异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液；
(5)将13.6mL 0.65mol/L的柠檬酸钠溶液加入上述异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液中混匀，再加入24.4mL 8wt％的十二烷基肌氨酸钠溶液混匀；再加入60mL pH＝4.0的HAc-NaAc缓冲液混匀，加入甲基红，用无酶无菌水定容至1L；过滤、121℃灭菌30min，得到灭活型病毒保存液。
实施例2：
一种可常温保存的灭活型病毒保存液，原料包括：
其中，二茂铁-谷胱甘肽的制备方法为：
A)将二茂铁甲酸溶于水和丙酮的体积比为3:10的混合溶剂中，冷却至4℃后依次滴加三乙胺的丙酮溶液和氯甲酸乙酯的丙酮溶液，搅拌25min后再滴加叠氮化钠水溶液，搅拌反应90min后萃取有机相并干燥后得到叠氮羰基二茂铁；其中二茂铁甲酸、三乙胺、氯甲酸乙酯和叠氮化钠的添加量之比为1g:0.6mL:0.3mL:0.4g；
B)将叠氮羰基二茂铁加入叔丁醇中，叠氮羰基二茂铁与叔丁醇的质量体积比为19mg:1mL；75℃回流反应2h，将反应液蒸干后得到叔丁基氧-氨基二茂铁；
C)将叔丁基氧-氨基二茂铁溶于乙酸乙酯中，4℃下通干燥的HCl气体90min，然后再室温下反应60min，将反应液蒸干后得到氨基修饰的二茂铁；
D)将二碳酸二叔丁酯的1,4-二氧己环溶液与饱和碳酸氢钠溶液混合，然后加入还原型谷胱甘肽，二碳酸二叔丁酯、碳酸氢钠与还原型谷胱甘肽的质量比为1.2:0.7:1，搅拌反应8h后分离油相并干燥得到氨基保护的还原型谷胱甘肽；
E)将氨基保护的还原型谷胱甘肽加入二氯甲烷中溶解，降温至4℃下加入三乙胺，再加入HBTU，保温反应90min后加入氨基修饰的二茂铁，氨基保护的还原型谷胱甘肽、三乙胺、HBTU和氨基修饰的二茂铁的添加量之比为310mg:1mL:400mg:300mg；继续保温反应3h，再升温至25℃反应12h，反应结束后依次用饱和碳酸氢钠溶液、盐酸和水洗涤，分离油相并干燥后得到叔丁基氧-二茂铁-谷胱甘肽；
F)将叔丁基氧-二茂铁-谷胱甘肽溶于乙酸乙酯中，4℃下通干燥的HCl气体90min，然后再室温下反应60min，将反应液蒸干后得到所述二茂铁-谷胱甘肽。
上述灭火型病毒保存液的制备方法为：
(1)配制0.7mol/L的柠檬酸钠溶液：将205.87g二水合柠檬酸三钠加入200mL无酶无菌水溶解，调整溶液pH值≥7，再加无酶无菌水定容至1L，得到0.7mol/L的柠檬酸钠溶液，放入贴好标签，2～8℃保存；
(2)配制9wt％十二烷基肌氨酸钠溶液：将90g十二烷基肌氨酸钠加入无酶无菌水中溶解，定容到1L，得到9wt％的十二烷基肌氨酸钠溶液，放入贴好标签，2～8℃保存；
(3)配制pH＝4.0的HAc-NaAc缓冲液：
I)配制2.0mol/L醋酸钠溶液：将299.37g三水醋酸钠加入无酶无菌水中溶解，定容到1L，得到2.0mol/L的醋酸钠溶液；
II)配制2.0mol/L醋酸溶液：将118mL冰醋酸加入无酶无菌水中溶解，定容到1L，得到2.0mol/L的醋酸溶液；
III)将9mL 2.0mol/L的醋酸钠溶液与41mL 2.0mol/L的醋酸溶液混合，搅拌均匀得到pH＝4.0的HAc-NaAc缓冲液；
(4)配制异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液：将190g异硫氰酸胍和30mg二茂铁-谷胱甘肽加入800mL无酶无菌水中溶解，得到异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液；
(5)将11mL 0.7mol/L的柠檬酸钠溶液加入上述异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液中混匀，再加入20mL 9wt％的十二烷基肌氨酸钠溶液混匀；再加入55mL pH＝4.0的HAc-NaAc缓冲液混匀，加入甲基红，用无酶无菌水定容至1L；过滤、120℃灭菌35min，得到灭活型病毒保存液。
实施例3：
一种可常温保存的灭活型病毒保存液，原料包括：
其中，二茂铁-谷胱甘肽的制备方法为：
A)将二茂铁甲酸溶于水和丙酮的体积比为3:10的混合溶剂中，冷却至0℃后依次滴加三乙胺的丙酮溶液和氯甲酸乙酯的丙酮溶液，搅拌35min后再滴加叠氮化钠水溶液，搅拌反应60min后萃取有机相并干燥后得到叠氮羰基二茂铁；其中二茂铁甲酸、三乙胺、氯甲酸乙酯和叠氮化钠的添加量之比为1g:0.8mL:0.5mL:0.5g；
B)将叠氮羰基二茂铁加入叔丁醇中，叠氮羰基二茂铁与叔丁醇的质量体积比为20mg:1mL；85℃回流反应1h，将反应液蒸干后得到叔丁基氧-氨基二茂铁；
C)将叔丁基氧-氨基二茂铁溶于乙酸乙酯中，0℃下通干燥的HCl气体60min，然后再室温下反应30min，将反应液蒸干后得到氨基修饰的二茂铁；
D)将二碳酸二叔丁酯的1,4-二氧己环溶液与饱和碳酸氢钠溶液混合，然后加入还原型谷胱甘肽，二碳酸二叔丁酯、碳酸氢钠与还原型谷胱甘肽的质量比为1.3:0.8:1，搅拌反应12h后分离油相并干燥得到氨基保护的还原型谷胱甘肽；
E)将氨基保护的还原型谷胱甘肽加入二氯甲烷中溶解，降温至0℃下加入三乙胺，再加入HBTU，保温反应60min后加入氨基修饰的二茂铁，氨基保护的还原型谷胱甘肽、三乙胺、HBTU和氨基修饰的二茂铁的添加量之比为330mg:1mL:420mg:310mg；继续保温反应2h，再升温至30℃反应8h，反应结束后依次用饱和碳酸氢钠溶液、盐酸和水洗涤，分离油相并干燥后得到叔丁基氧-二茂铁-谷胱甘肽；
F)将叔丁基氧-二茂铁-谷胱甘肽溶于乙酸乙酯中，0℃下通干燥的HCl气体60min，然后再室温下反应30min，将反应液蒸干后得到所述二茂铁-谷胱甘肽。
上述灭火型病毒保存液的制备方法为：
(1)配制0.75mol/L的柠檬酸钠溶液：将220.57g二水合柠檬酸三钠加入200mL无酶无菌水溶解，调整溶液pH值≥7，再加无酶无菌水定容至1L，得到0.75mol/L的柠檬酸钠溶液，放入贴好标签，2～8℃保存；
(2)配制10wt％十二烷基肌氨酸钠溶液：将100g十二烷基肌氨酸钠加入无酶无菌水中溶解，定容到1L，得到10wt％的十二烷基肌氨酸钠溶液，放入贴好标签，2～8℃保存；
(3)配制pH＝4.5的HAc-NaAc缓冲液：
I)配制2.0mol/L醋酸钠溶液：将299.37g三水醋酸钠加入无酶无菌水中溶解，定容到1L，得到2.0mol/L的醋酸钠溶液；
II)配制2.0mol/L醋酸溶液：将118mL冰醋酸加入无酶无菌水中溶解，定容到1L，得到2.0mol/L的醋酸溶液；
III)将17.7mL 2.0mol/L的醋酸钠溶液与32.3mL 2.0mol/L的醋酸溶液混合，搅拌均匀得到pH＝4.5的HAc-NaAc缓冲液；
(4)配制异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液：将210g异硫氰酸胍和10mg二茂铁-谷胱甘肽加入800mL无酶无菌水中溶解，得到异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液；
(5)将15.5mL 0.75mol/L的柠檬酸钠溶液加入上述异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液中混匀，再加入20mL 10wt％的十二烷基肌氨酸钠溶液混匀；再加入65mL pH＝4.5的HAc-NaAc缓冲液混匀，加入甲基红，用无酶无菌水定容至1L；过滤、125℃灭菌25min，得到灭活型病毒保存液。
对比例1(不添加二茂铁-谷胱甘肽)：
一种灭活型病毒保存液，原料包括：
上述灭火型病毒保存液的制备方法与实施例1中相同。
对比例2(二茂铁-谷胱甘肽添加过多)：
一种灭活型病毒保存液，原料包括：
上述灭火型病毒保存液的制备方法与实施例1中相同。
对比例3(谷胱甘肽上不修饰二茂铁)：
一种灭活型病毒保存液，原料包括：
上述灭火型病毒保存液的制备方法与实施例1中相同。
对比例4(二茂铁与谷胱甘肽直接混合)：
一种灭活型病毒保存液，原料包括：
上述灭火型病毒保存液制备时，步骤(4)中将200g异硫氰酸胍和12.5mg谷胱甘肽和7.5mg二茂铁加入800mL无酶无菌水中溶解，得到异硫氰酸胍和二茂铁、谷胱甘肽的混合溶液；其余均与实施例1中相同。
对比例5(异硫氰酸胍添加过少)：
一种灭活型病毒保存液，原料包括：
上述灭火型病毒保存液的制备方法与实施例1中相同。
对比例6(异硫氰酸胍添加过多)：
一种灭活型病毒保存液，原料包括：
上述灭火型病毒保存液的制备方法与实施例1中相同。
对比例7(十二烷基肌氨酸钠添加过少)：
一种灭活型病毒保存液，原料包括：
对比例8(十二烷基肌氨酸钠添加过多)：
一种灭活型病毒保存液，原料包括：
对上述实施例和对比例中的灭活型病毒保存液的性能进行测试：
1、不同保存液对检测效果的影响
选取4例阳性咽拭子样本及2例阴性咽拭子样本(编号2M-1～2M～6)，分别使用实施例及对比例中的保存液进行100倍稀释，使用核酸提取试剂盒提取样本核酸，使用PCR试剂盒对核酸进行检测。分析不同保存液稀释样本Ct值的差异，比较各保存液对检测效果的影响，结果如表1中所示。
表1：样本Ct值测试结果(仪器型号ABI7500)。
从表1中可以看出，实施例1～3中采用本发明中的原料和配比制得的保存液的样本Ct值较小，而对比例中改变保存液的原料种类或配比，都会造成Ct值的增大，影响检出效果。
2、不同保存液对最低检测限浓度样本的检出效果的影响用实施例1和对比例1中的保存液对2例阳性咽拭子样本(编号2M-7、2M-8)稀释100倍，使稀释样本处于最低检出限浓度，对其分别重复20次检测，对最低检出限进行验证，检测仪器为ABI7500实时荧光定量PCR仪，检测保存液对最低检出限浓度样本检出率的影响，结果如表2、表3和图1、图2中所示。
表2：实施例1中的保存液对最低检出限浓度样本检出效果的影响测试结果。
表3：对比例1中的保存液对最低检出限浓度样本检出效果的影响测试结果。
从表2、表3和图1、图2中的结果可以看出，实施例1和对比例1中的样本保存液稀释的最低检出限浓度样本均100％检出，但实施例1中的保存液Ct较对比例1中提前1个左右。
3、不同保存液维持核酸稳定性的效期研究
选用3例不同浓度水平的病毒样本(编号2M-9、2M-10、2M-11)，每例样本分成30份，每份20μL，每份样本分别加入180μL实施例和对比例中的样本保存液，将稀释后的样本置于37℃恒温培养箱中，分别于第7天、第14天、第21天和第30天取出，与置于-20℃条件下保存的样本检测结果进行比较。结果如表4所示。
表4：保存液维持核酸稳定性效期研究测试结果(Ct值)。
从表4中可以看出，实施例1中采用本发明中的原料和配比制得的保存液的保存的样本在37℃能稳定存放30天，而对比例1中的保存液中不添加二茂铁-谷胱甘肽，Ct值与实施例1中相比明显增大，且保存的样本在37℃下仅能存放7天；对比例2中二茂铁-谷胱甘肽的添加量过多，超出本发明的范围外，Ct值有所增大的同时样本在常温的存放时间也缩短至14天；对比例3的保存液中添加不经二茂铁修饰的谷胱甘肽，检测效果比实施例1中有所降低的同时样本在常温下的存放时间也无法达到30天；对比例4中直接将谷胱甘肽和二茂铁混合加入保存液中，不将二者键合，由于二茂铁的溶解度较小，会对样本的检测效果造成较大影响，Ct值明显增大；样本的保存稳定性也显著降低；对比例5的保存液中异硫氰酸胍添加过少，Ct值较大，样本的检测效果不佳，且异硫氰酸胍对RNA酶的抑制作用减弱，导致样本的保存时间缩短；对比例6中异硫氰酸胍添加过多，同样也会影响样本在常温下的保存时间；对比例7中表面活性剂十二烷基肌氨酸钠的添加量过少，对核酸的增溶能力降低，且保存液的抑菌性能下降，导致样本的检测效果和保存时间均下降；对比例8中十二烷基肌氨酸钠的添加量过多，也不利于样本的稳定保存。综上，保存液中各组分的种类和配比均对样本的检测效果和保存时间有较大影响，本发明在各组分的共同作用下可有效提高样本的检测效果并延长其在常温下的保存时间，提高了核酸检测的准确性。
Claims (9)
1.一种可常温保存的灭活型病毒保存液，其特征是，原料包括：
异硫氰酸胍 190~210g/L；
柠檬酸钠 2~3g/L；
十二烷基肌氨酸钠 1.8~2.0g/L；
HAc-NaAc缓冲液 55~65mL/L；
二茂铁-谷胱甘肽 10~30mg/L；
酸碱指示剂 30~50 mg/L；
所述灭活型病毒保存液中的样本在常温下能稳定保存30天。
2.根据权利要求1所述的一种可常温保存的灭活型病毒保存液，其特征是，所述HAc-NaAc缓冲液的pH为4.0~4.5。
3.根据权利要求1所述的一种可常温保存的灭活型病毒保存液，其特征是，所述酸碱指示剂为甲基红。
4.一种如权利要求1~3任一所述的灭活型病毒保存液的制备方法，其特征是，包括如下步骤：
（1）配制柠檬酸钠溶液；
（2）配制十二烷基肌氨酸钠溶液；
（3）配制HAc-NaAc缓冲液；
（4）配制异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液；
（5）按各原料的比例将柠檬酸钠溶液加入异硫氰酸胍和二茂铁-谷胱甘肽的混合溶液中，再加入十二烷基肌氨酸钠溶液，混合均匀后加入HAc-NaAc缓冲液，再加入酸碱指示剂，用水定容；过滤、灭菌后得到所述灭活型病毒保存液。
5.根据权利要求4所述的一种灭活型病毒保存液的制备方法，其特征是，步骤（1）中所述的柠檬酸钠溶液的浓度为0.65~0.75mol/L。
6.根据权利要求4所述的一种灭活型病毒保存液的制备方法，其特征是，步骤（2）中所述的十二烷基肌氨酸钠溶液的质量分数为8~10%。
7.根据权利要求4所述的一种灭活型病毒保存液的制备方法，其特征是，步骤（4）中的混合溶液中，异硫氰酸胍的浓度为190~210g/800mL。
8.根据权利要求4所述的一种灭活型病毒保存液的制备方法，其特征是，步骤（5）中的灭菌温度120~125℃，灭菌时间25~35min。
9.根据权利要求4所述的一种灭活型病毒保存液的制备方法，其特征是，步骤（1）~（5）使用的水为无酶无菌水。
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| GR01 | Patent grant | ||
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