CN114634971A - 一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114634971A CN114634971A CN202210372174.5A CN202210372174A CN114634971A CN 114634971 A CN114634971 A CN 114634971A CN 202210372174 A CN202210372174 A CN 202210372174A CN 114634971 A CN114634971 A CN 114634971A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- pig farm
- acid extraction
- reagent
- farm environment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 111
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 111
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 111
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 80
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 title claims description 38
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 30
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 16
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims abstract description 14
- PEASPLKKXBYDKL-FXEVSJAOSA-N enfuvirtide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(C)=O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PEASPLKKXBYDKL-FXEVSJAOSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- OZZOVSQSDIWNIP-UHFFFAOYSA-N acetic acid;azane Chemical compound [NH4+].[NH4+].CC([O-])=O.CC([O-])=O OZZOVSQSDIWNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 19
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 abstract description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 abstract 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 74
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 20
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical group [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 229940074439 potassium sodium tartrate Drugs 0.000 description 1
- -1 preferably Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229940045885 sodium lauroyl sarcosinate Drugs 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂及其制备方法和应用，涉及畜牧养殖病原体检测技术领域。该试剂的原料按体积质量百分比含量计包括：0.3‑0.8％的乳化剂T‑20、0.1‑0.2％的月桂醇硫酸钠、0.7‑1％的氯化钠、1‑2％的乙二胺四乙酸、0.5‑1％的缓冲液和余量的水。本申请可以有效清除猪场环境样本中的杂蛋白和其他杂质，显著提升核酸提取纯度的质量，对于杂质的高效沉降分离及核酸的高纯度分离纯化发挥重要作用，从而满足荧光定量PCR实验对核酸纯度的要求，有效提升检测结果的准确性，解决杂质影响检测结果的问题，保障养猪产业的健康发展。
Description
技术领域
本发明涉及畜牧养殖病原体检测技术领域，具体而言，涉及一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂及其制备方法和应用。
背景技术
荧光定量PCR检测技术作为综合常规PCR、荧光标记、激光照射和数码显象技术为一体的检测手段，拥有特异性强、灵敏度高、假阳性低等优势，因此广泛应用于畜牧养殖病原体检测，特别是深受非洲猪瘟困扰的养猪产业。
然而在猪群生产过程中却存在环境样本核酸提取效果差导致检出率低或假阳性的问题。具体表现在猪场环境样本成分复杂，至少含有且不局限于饲料、粪便、粉尘、泥垢、针织物、消毒剂等杂质，其对核酸提取纯化的质量存在较大抑制作用，从而影响下游荧光定量PCR检测结果的准确性，不利于猪群各类疾病的及时诊断，对养猪产业的健康发展危害巨大。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂及其制备方法和应用，其能够有效清除猪场环境样本中的杂蛋白和其他杂质，显著提升核酸提取纯度的质量，对于杂质的高效沉降分离及核酸的高纯度分离纯化发挥重要作用，从而满足荧光定量PCR实验对核酸纯度的要求，有效提升检测结果的准确性，解决杂质影响检测结果的问题，保障养猪产业的健康发展。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂，其原料按体积质量百分比含量计包括：0.3-0.8％的乳化剂T-20、0.1-0.2％的月桂醇硫酸钠、0.7-1％的氯化钠、1-2％的乙二胺四乙酸、0.5-1％的缓冲液和余量的水。
在可选的实施方式中，其原料按体积质量百分比含量计包括：0.4-0.6％的乳化剂T-20、0.12-0.17％的月桂醇硫酸钠、0.8-0.9％的氯化钠、1.5-1.7％的乙二胺四乙酸、0.6-0.8％的缓冲液和余量的水。
在可选的实施方式中，所述缓冲液包括Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液。
在可选的实施方式中，所述猪场环境样本核酸提取前处理试剂还包括pH调节剂，所述pH调节剂为HCl。
在可选的实施方式中，所述猪场环境样本核酸提取前处理试剂的pH为7.5-9.0。
第二方面，本发明提供一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂的制备方法，其包括将如前述实施方式任一项所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂的原料混合均匀。
第三方面，本发明提供如前述实施方式任一项所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂在制备猪场环境样本核酸提取前处理试剂、核酸分离纯化试剂或在核酸提取中作为前处理试剂中的应用。
第四方面，本发明提供一种猪场环境样本中核酸的提取方法，将猪场环境样本置于如前述实施方式任一项所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂中进行重悬混匀，接着进行全核酸提取。
第五方面，本发明提供一种猪场环境样本核酸提取检测试剂盒，其包括如前述实施方式任一项所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂或者制备如前述实施方式任一项所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂的原料。
在可选的实施方式中，所述猪场环境样本核酸提取检测试剂盒还包括病毒核酸提取试剂和PCR反应试剂。
本发明具有以下有益效果：
本申请提供的猪场环境样本核酸提取前处理试剂通过将乳化剂T-20、月桂醇硫酸钠、氯化钠和乙二胺四乙酸进行组合，同时配合缓冲液和pH调节剂，调配合适的组分用量，可以有效清除猪场环境样本中的杂蛋白和其他杂质，显著提升核酸提取纯度的质量，对于杂质的高效沉降分离及核酸的高纯度分离纯化发挥重要作用，从而满足荧光定量PCR实验对核酸纯度的要求，有效提升检测结果的准确性，解决杂质影响检测结果的问题，保障养猪产业的健康发展。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为猪场含有粪便的环境样本经不同试剂处理后荧光定量PCR检测的Ct值；
图2为猪场含有泥垢环境样本经不同试剂处理后荧光定量PCR检测的Ct值；
图3为猪场含有饲料的环境样本经不同试剂处理后荧光定量PCR检测的Ct值。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂，其原料按体积质量百分比含量计包括：0.3-0.8％的乳化剂T-20、0.1-0.2％的月桂醇硫酸钠、0.7-1％的氯化钠、1-2％的乙二胺四乙酸、0.5-1％的缓冲液和余量的水。
由于猪场环境样本中成分复杂，含有各种饲料、粪便、粉尘、泥垢、针织物、消毒剂、毛发等。本申请提供的猪场环境样本核酸提取前处理试剂中，乳化剂T-20能有效破坏膜蛋白的完整性，降解蛋白高级结构，有利于核酸与蛋白质的分离，从而达到提高核酸提取纯化质量的效果。
月桂醇硫酸钠是高效的阴离子表面活性去污剂，能迅速使蛋白质变性，让蛋白质充分裂解同时与核酸彻底解离，从而使核酸有效游离在试剂体系中。
氯化钠在120-160mmol/L的浓度能对核酸起明显的盐析作用使之处于液体上层，同时能让固体杂质更好地沉降于底部，从而让核酸和杂质更好地分离。
乙二胺四乙酸一方面是二价金属螯合剂，其能抑制依赖二价金属的DNA酶活性，从而保护DNA完整结构防止降解，另一方面能够有助于细胞裂解、蛋白质洗脱，有利于核酸的纯化，同时乙二胺四乙酸还有一定的抗菌作用，有利于样本的保存。
缓冲液可以在水中高度溶解使各种酶(例如：DNA酶、RNA酶)和化学试剂维持惰性。缓冲液的种类有多种，包括但不限于Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液，优选地，缓冲液为Tris缓冲液，Tris缓冲液在pH 7.5-9.0之间具有强缓冲能力。
此外，本申请还包括pH调节剂，pH调节剂为HCl，HCl一方面与Tris一起协同发挥维持和稳定PH的作用，另一方面它也有利于改变细胞膜的通透性，有助于DNA与蛋白质的分离纯化。本申请中利用pH调节剂将猪场环境样本核酸提取前处理试剂调节为pH为7.5-9.0。
优选地，其原料按体积质量百分比含量计包括：0.4-0.6％的乳化剂T-20、0.12-0.17％的月桂醇硫酸钠、0.8-0.9％的氯化钠、1.5-1.7％的乙二胺四乙酸、0.6-0.8％的缓冲液和余量的水。
本申请中，乳化剂T-20、月桂醇硫酸钠、氯化钠和乙二胺四乙酸的组合，同时配合缓冲液和pH调节剂，可以有效清除猪场环境样本中的杂蛋白和其他杂质，显著提升核酸提取纯度的质量，对于杂质的高效沉降分离及核酸的高纯度分离纯化发挥重要作用，从而满足荧光定量PCR实验对核酸纯度的要求，有效提升检测结果的准确性，解决杂质影响检测结果的问题，保障养猪产业的健康发展。
进一步地，本发明还提供了上述猪场环境样本核酸提取前处理试剂的制备方法，其包括将猪场环境样本核酸提取前处理试剂的原料混合均匀，整个制备方法简单，操作容易。制备获得的猪场环境样本核酸提取前处理试剂可以广泛应用于制备猪场环境样本核酸提取前处理试剂、核酸分离纯化试剂或在核酸提取中作为前处理试剂使用。
进一步地，本发明还提供了一种猪场环境样本中核酸的提取方法，将猪场环境样本置于上述猪场环境样本核酸提取前处理试剂中进行重悬混匀，接着进行全核酸提取。猪场环境样本核酸提取前处理试剂直接与猪场环境样本进行混合，无需低温保存，更节约成本。
此外，本发明还提供了一种猪场环境样本核酸提取检测试剂盒，其包括猪场环境样本核酸提取前处理试剂或者制备猪场环境样本核酸提取前处理试剂的原料。该猪场环境样本核酸提取检测试剂盒还包括病毒核酸提取试剂和PCR反应试剂。该猪场环境样本核酸提取检测试剂盒可以实现对该猪场环境样本的前处理、核酸提取和荧光定量RT-PCR的检测。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂，其制备方法包括：量取5mL乳化剂T-20，称取1.5g月桂醇硫酸钠、8.19g氯化钠、16.07g乙二胺四乙酸和6.67g Tris粉末，用990mL灭菌超纯水充分溶解均匀，再用HCl调节溶液PH为8.0，最后用灭菌超纯水定容至1L。
实施例2
本实施例提供了一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂，其制备方法包括：量取3mL乳化剂T-20，称取1.2g月桂醇硫酸钠、7.5g氯化钠、12g乙二胺四乙酸和5.5g Tris粉末，用990mL灭菌超纯水充分溶解均匀，再用HCl调节溶液PH为7.5，最后用灭菌超纯水定容至1L。
实施例3
本实施例提供了一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂，其制备方法包括：量取8mL乳化剂T-20，称取1.8g月桂醇硫酸钠、10g氯化钠、18g乙二胺四乙酸和8g Tris粉末，用990mL灭菌超纯水充分溶解均匀，再用HCl调节溶液PH为9，最后用灭菌超纯水定容至1L。
对比例1
本对比例与实施例1基本相同，区别在于，本对比例中，将月桂醇硫酸钠替换为其他阴离子表面活性去污剂(月桂酰基肌氨酸钠)。
对比例2
本对比例与实施例1基本相同，区别在于，本对比例中，将月桂醇硫酸钠的用量从1.5g替换为2.5g。
对比例3
本对比例与实施例1基本相同，区别在于，本对比例中，将乙二胺四乙酸替换为酒石酸钾钠。
对比例4
本对比例与实施例1基本相同，区别在于，本对比例中，将乙二胺四乙酸的用量从16.07g(摩尔浓度为55mmol/L)替换为0.3g(摩尔浓度为1mmol/L)。
对比例5
本对比例与实施例1基本相同，区别在于，本对比例中，将乙二胺四乙酸的用量从16.07g(摩尔浓度为55mmol/L)替换为25g(摩尔浓度为86mmol/L)。
试验例：
使用本发明实施例1提供的猪场环境样本核酸提取前处理试剂(即图1-图3中标示的核酸保护剂)、常规的生理盐水以及对比例1-5提供的试剂分别采样处理进行对比实验。
本试验例分别针对猪场含有粪便的环境样本、猪场含有泥垢环境样本以及猪场含有饲料的环境样本进行检测，针对每种猪场环境样本分别取27份含等量的PEDV病毒(RNA病毒)的猪场环境样本，每种猪场环境样本均被分成9组，每组做3次取平均值。其中，生理盐水组为常规生理盐水1ml与环境样本重悬混匀；实施例1组为本发明实施例1提供的猪场环境样本核酸提取前处理试剂1ml与环境样本重悬混匀；对比例1-5组为本发明对比例1-5提供的试剂1ml与环境样本重悬混匀。
将样品放置0天、7天、14天、21天、28天后进行核酸提取，提取前再次将样品进行重悬混匀，取200μL样本用天根的病毒提取试剂盒进行全核酸提取。获得核酸样本后分别进行荧光定量RT-PCR的检测。
荧光定量PCR检测：对获得的核酸进行荧光定量RT-PCR验证，检测PEDV的基因序列，通过检测Ct值的大小反应样本中的病毒核酸浓度，Ct值的大小与病毒核酸的浓度成反比。
其中，猪场含有粪便的环境样本经不同试剂处理后荧光定量PCR检测的Ct值请参阅图1；猪场含有泥垢环境样本经不同试剂处理后荧光定量PCR检测的Ct值请参阅图2；猪场含有饲料的环境样本经不同试剂处理后荧光定量PCR检测的Ct值请参阅图3。
从图1-图3可以看出，常规的生理盐水处理的样品病毒基因的检测Ct值随着时间的推移明显变大，说明有核细胞破裂，基因组RNA游离到生理盐水中被迅速降解，常规的生理盐水无法保护核酸不被降解。本发明实施例1提供的猪场环境样本核酸提取前处理试剂所处理的样品，病毒基因检测Ct值0天就低于对照组，随着时间的推移虽然CT值也逐渐增大，但增大的幅度较小，本发明实施例1提供猪场环境样本核酸提取前处理试剂处理的样本可保护样本28天，由于实施例2和实施例3提供的猪场环境样本核酸提取前处理试剂处理结果与实施例1基本相同，因此本申请仅列出了实施例1的数据结果。进一步地，从对比例1-对比例5的数据结果可以看出，本发明能够有效保护核酸不被降解，提高样品的检出率。
综上所述，本申请提供的猪场环境样本核酸提取前处理试剂通过将乳化剂T-20、月桂醇硫酸钠、氯化钠和乙二胺四乙酸进行组合，同时配合缓冲液和pH调节剂，调配合适的组分用量，可以有效清除猪场环境样本中的杂蛋白和其他杂质，显著提升核酸提取纯度的质量，对于杂质的高效沉降分离及核酸的高纯度分离纯化发挥重要作用，从而满足荧光定量PCR实验对核酸纯度的要求，有效提升检测结果的准确性，解决杂质影响检测结果的问题，保障养猪产业的健康发展。目前现有的其他核酸保存试剂，大多需要低温保存，但考虑到猪场内样本运输和保存工作的便捷程度等问题，本试剂只需要常温保存，更能节省成本。目前也有部分常温保存核酸样本的试剂和方法，但是其保存试剂的作用主要是防止细胞破裂、维持细胞形态等方面，且需要用沉淀物进行下一步的提取检测，沉淀物中的杂质极有可能会对核酸提取检测产生不利影响。本申请提供的猪场环境样本核酸提取前处理试剂可以针对猪场环境这种成分复杂的样品进行前处理和保存，该试剂有助于猪场内生物安全防控工作的推进。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂，其特征在于，其原料按体积质量百分比含量计包括：0.3-0.8％的乳化剂T-20、0.1-0.2％的月桂醇硫酸钠、0.7-1％的氯化钠、1-2％的乙二胺四乙酸、0.5-1％的缓冲液和余量的水。
2.根据权利要求1所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂，其特征在于，其原料按体积质量百分比含量计包括：0.4-0.6％的乳化剂T-20、0.12-0.17％的月桂醇硫酸钠、0.8-0.9％的氯化钠、1.5-1.7％的乙二胺四乙酸、0.6-0.8％的缓冲液和余量的水。
3.根据权利要求1所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂，其特征在于，所述缓冲液包括Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸-醋酸铵缓冲液。
4.根据权利要求1所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂，其特征在于，所述猪场环境样本核酸提取前处理试剂还包括pH调节剂，所述pH调节剂为HCl。
5.根据权利要求1所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂，其特征在于，所述猪场环境样本核酸提取前处理试剂的pH为7.5-9.0。
6.一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂的制备方法，其特征在于，其包括将如权利要求1-5任一项所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂的原料混合均匀。
7.如权利要求1-5任一项所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂在制备猪场环境样本核酸提取前处理试剂、核酸分离纯化试剂或在核酸提取中作为前处理试剂中的应用。
8.一种猪场环境样本中核酸的提取方法，其特征在于，将猪场环境样本置于如权利要求1-5任一项所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂中进行重悬混匀，接着进行全核酸提取。
9.一种猪场环境样本核酸提取检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1-5任一项所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂或者制备如权利要求1-5任一项所述的猪场环境样本核酸提取前处理试剂的原料。
10.根据权利要求9所述的猪场环境样本核酸提取检测试剂盒，其特征在于，所述猪场环境样本核酸提取检测试剂盒还包括病毒核酸提取试剂和PCR反应试剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210372174.5A CN114634971A (zh) | 2022-04-11 | 2022-04-11 | 一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210372174.5A CN114634971A (zh) | 2022-04-11 | 2022-04-11 | 一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114634971A true CN114634971A (zh) | 2022-06-17 |
Family
ID=81951412
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210372174.5A Pending CN114634971A (zh) | 2022-04-11 | 2022-04-11 | 一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114634971A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111218527A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-06-02 | 广州赛百纯生物科技有限公司 | 一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法 |
| CN112375849A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-02-19 | 北京明日达科技发展有限责任公司 | 非洲猪瘟病毒三重荧光pcr检测试剂盒及其应用 |
| CN112813061A (zh) * | 2021-02-24 | 2021-05-18 | 上海基灵生物科技有限公司 | 一种猫体液样本核酸提取前处理试剂及核酸提取方法 |
| CN112921071A (zh) * | 2021-02-24 | 2021-06-08 | 上海基灵生物科技有限公司 | 一种猫体液样本处理试剂、检测试剂盒及应用 |
| CN113005173A (zh) * | 2019-12-19 | 2021-06-22 | 武汉艾米森生命科技有限公司 | 一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用 |
| CN114107289A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-03-01 | 江苏康为世纪生物科技股份有限公司 | 粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法 |
-
2022
- 2022-04-11 CN CN202210372174.5A patent/CN114634971A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113005173A (zh) * | 2019-12-19 | 2021-06-22 | 武汉艾米森生命科技有限公司 | 一种粪便脱落细胞核酸保存试剂及其制备方法与应用 |
| CN111218527A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-06-02 | 广州赛百纯生物科技有限公司 | 一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法 |
| CN112375849A (zh) * | 2021-01-14 | 2021-02-19 | 北京明日达科技发展有限责任公司 | 非洲猪瘟病毒三重荧光pcr检测试剂盒及其应用 |
| CN112813061A (zh) * | 2021-02-24 | 2021-05-18 | 上海基灵生物科技有限公司 | 一种猫体液样本核酸提取前处理试剂及核酸提取方法 |
| CN112921071A (zh) * | 2021-02-24 | 2021-06-08 | 上海基灵生物科技有限公司 | 一种猫体液样本处理试剂、检测试剂盒及应用 |
| CN114107289A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-03-01 | 江苏康为世纪生物科技股份有限公司 | 粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA1231303A (en) | Detection of bacteria by nucleic acid hybridization | |
| Reeder | Transcription of chromatin by bacterial RNA polymerase | |
| CA2243829C (en) | Method and device for the simultaneous isolation of genomic dna and high-purity total rna | |
| Opelt et al. | Diversity and antagonistic potential of bacteria associated with bryophytes from nutrient-poor habitats of the Baltic Sea Coast | |
| JP4735645B2 (ja) | Ｒｎａの検出法 | |
| EP2379738B1 (en) | Coliform detection process | |
| Krueger et al. | Vertical transmission of chemoautotrophic symbionts in the bivalve Solemya velum (Bivalvia: Protobranchia) | |
| Priemé et al. | Extraction of methane-oxidizing bacteria from soil particles | |
| DE3586660T2 (de) | Hybridisierungstest fuer nukleinsaeure. | |
| CN1452665A (zh) | 在母体样品中鉴定胎儿dna的诊断方法 | |
| US8574890B2 (en) | Nucleic acid extraction from complex matrices | |
| CN108026570A (zh) | 从血液样品中纯化核酸的组合物和方法 | |
| US6852495B2 (en) | Process of extracting nucleic acid and process of simultaneously carrying out extraction and purification of nucleic acid | |
| Young et al. | Intron-containing T4 bacteriophage gene sunY encodes an anaerobic ribonucleotide reductase. | |
| Davidson et al. | Genetic cause of autosomal recessive hereditary nephropathy in the English Cocker Spaniel | |
| JP6815334B2 (ja) | 核酸の単離のための自動化可能な方法 | |
| US6767723B2 (en) | Method for synthesis of nucleic acids | |
| Papakostas et al. | Evaluation of DNA methodologies in identifying Brachionus species used in European hatcheries | |
| CN114634971A (zh) | 一种猪场环境样本核酸提取前处理试剂及其制备方法和应用 | |
| CN111996598A (zh) | 一种单细胞染色质可及性的建库方法 | |
| AU621936B2 (en) | Method for the isolation of dna | |
| Hecht et al. | DNA polymerases in mouse spermatogenic cells separated by sedimentation velocity | |
| US20210284989A1 (en) | Sperm cell isolation and sperm-associated dna purification | |
| Löschenberger et al. | Detection of the protozoan Neospora caninum using in situ polymerase chain reaction | |
| JP4964230B2 (ja) | ネコ・ヘモプラズマの分離株 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |