CN111218527A

CN111218527A - 一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN111218527A
Application number: CN202010162844.1A
Authority: CN
Inventors: 姬宏超; 万艳娟; 胡东雄; 阳享元
Original assignee: Guangzhou Surbiopure Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Surbiopure Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2040-03-10
Also published as: CN111218527B

Abstract

本发明涉及一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。本发明提供一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒，包括特异性引物AP72‑F(SEQ ID NO：1)和AP72‑R(SEQ ID NO：2)，以及TaqMan探针AP72‑P(SEQ ID NO：3)；所述探针的5′端标记报告荧光染料为FAM，3′端标记荧光淬灭基团为BHQ‑1。本发明提供的环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法，可广泛用于检测养殖环境中多种环境样本，打破了单个环境样本检测的局限性，其检测方法灵敏度达10copise/μl，所述环境样本非洲猪瘟病毒的检测与多种病毒无交叉反应，可广泛适用于非洲猪瘟恢复养殖的实时监控。

Description

一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

非洲猪瘟病毒防控一直是各国重点防控的疫病，无论是已成功根除非洲猪瘟的西班牙、巴西等国或仍在与非洲猪瘟斗争的俄罗斯，历史经验都证明根除非洲猪瘟需要耗费大量人力、物力，非洲猪瘟不仅对养猪业造成重创，兽药和饲料行业也受到不小影响。我国生猪产业链影响因素错综复杂，面对非洲猪瘟疫情，除了提升诊断水平和积极研发疫苗提供技术支持，还应找到各个防控环节实际关键点，推动产业一体化转型升级。

常规的猪瘟检测主要是以猪的血清、血浆、抗凝血、口腔黏液以及肺、淋巴结、肾脏、骨髓和扁桃体组织中进行抽样，都是从猪的本身来检测，起不到未雨绸缪的作用；非洲猪瘟恢复养殖过程中，首先要确定的是养殖环境是否安全，是否在消毒后，非洲猪瘟病毒被完全消除。如果养殖之前，养殖环境仍残留非洲猪瘟病毒，通过虫媒传播，会给养殖户及整个产业链再次带来沉重打击。养殖的环境样本基本上包括：猪舍、养殖用水、食槽及食槽下面的食物残渣、土壤(猪场附近3公里内)、猪的粪便、猪尿液、猪唾液以及运送饲料、生猪的车辆、参与养殖的人员穿戴、猪舍内的灰尘、蜘蛛网等。不但要对这些部位进行清理、消毒，还要对消毒后的这些部位进行荧光定量检测，确保环境中无非洲猪瘟的存在，这样才能为非洲猪瘟恢复养殖保驾护航。

申请号为201910534130.6的中国专利，公开了将蚯蚓投放在猪舍周边或生产污区或病死猪处理位置或猪场进出入口的土壤中培养，之后再检测蚯蚓进行粉碎，使用荧光定量PCR检测，确定是否有非洲猪瘟的存在。该方法只能适合消毒后的土壤检测，而对于其他环境样本(养殖用水、食槽内、食槽下面、猪舍内蜘蛛网、运输生猪车辆等)具有局限性。申请号为201910853261.0的中国专利，公开了使用免提取的方法只能对已经病变的猪或者濒危的病猪进行检测，无法满足非洲猪瘟恢复养殖的现实需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒，包括特异性引物AP72-F和AP72-R，以及TaqMan探针AP72-P；所述探针的5′端标记报告荧光染料为FAM，3′端标记荧光淬灭基团为BHQ-1；其中特异性引物和TaqMan探针序列如下：

AP72-F：5’-TGCGATGATGATTACCTTTG-3’；SEQ ID NO：1；

AP72-R：5’-TGCTCTGGATACGTTAATATG-3’；SEQ ID NO：2；

AP72-P：5’-FAM-TTGGTATTCCTCCCGTGGCTT-3’-BHQ-1；SEQ ID NO：3。

作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述检测试剂盒还包括：环境样本DNA提取纯化试剂、扩增反应液、阳性对照和阴性对照。

作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述环境样本DNA提取纯化试剂包括裂解液、裂解增强剂、去抑制剂因子、结合液、漂洗液、洗液、磁珠液、二氧化锆珠、洗脱液。

作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述裂解液包括181mM Na₂HPO₄和121mM GuHCl；所述裂解增强剂包括0.5M SDS、10mM Tris和20mM EDTA；所述去抑制剂因子为133mM Al³⁺；所述结合液包括5MGuHCl和体积浓度为10％Isopropanol；所述漂洗液为3MGuSCN；所述洗液为50mM Tris，pH为6.6；所述磁珠液粒径1μm，浓度为50mg/ml；所述二氧化锆珠的直径为1mm；所述洗脱液为10mM Tris，pH为8.5。

作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述扩增反应液包括20mM Tris、4mM Mg²⁺、20mM K⁺、体积浓度为10％的甘油、1～5pmol上下游引物AP72-R\F、1～3pmol探针AP72-P和1Unit DNA扩增聚合酶；其中所述20mM Tris的pH为9.2。

作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述阳性对照包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，采用所述试剂盒检测环境样本非洲猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：

(1)待测样本DNA的提取；

(2)PCR扩增：反应体系设为25μl，在多个PCR反应管内加入非洲猪瘟病毒扩增反应液20μl，将步骤(1)提取的待测样本DNA5μl、阳性对照5μl、阴性对照(无菌水)5μl分别加入不同的PCR反应管中，混匀离心进行PCR反应；所述PCR扩增的反应程序为：预变性95℃10min，1个循环；95℃15s，55℃30s，40个循环；55℃结束时采集Fam荧光信号；

(3)PCR扩增产物的检测结果与判定：通过检测通道的Ct值进行结果判定。

本发明所述的采用所述试剂盒检测环境样本非洲猪瘟病毒的方法中，根据待检测样本总数，计算所需要的PCR反应管数量为N(N＝待测样本数+1份阴性对照+1份阳性对照)，在每个PCR反应管中加入非洲猪瘟病毒(ASFV)反应液20μl，然后转入加样区；将提取的DNA、阳性对照、阴性对照各取5μl，分别加入上述分装有20μl反应液的PCR反应管中，盖好管盖，混匀后短暂离心，使所有反应液集中于管底；将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μl；荧光通道选择：检测通道(Reporter Dye)选择“FAM”，淬灭通道(Quencher Dye)选择“None”。

本发明所述的采用所述试剂盒检测环境样本非洲猪瘟病毒的方法中，其结果判断：若检测样本为阳性，则检测通道Ct值≤40，且曲线有明显的“S”型增长曲线；若检测样本可疑，则检测通道40<Ct值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为40<Ct值≤45，且曲线有明显的“S”型增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；若检测样本为阴性，则样本检测结果无Ct值，扩增曲线在阈值线附近，无明显增长曲线。

本发明所述的采用所述试剂盒检测环境样本非洲猪瘟病毒的方法中，其质控标准，阴性质控品：无Ct值显示，且无明显扩增曲线；阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤35；以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，采用所述试剂盒检测环境样本非洲猪瘟病毒的方法，步骤(1)中，所述待测样本DNA的提取，包括如下步骤：

(a)环境样本处理：所述环境样本取自养猪环境中的猪粪便、污泥、养殖饲料、土壤、猪舍食、猪唾液、擦拭环境的抹布、拭子、猪尿液、养殖用水中的至少一种；

(b)将60μl S2-Lysis Enhancer溶液加入至步骤(a)处理后的样品中，65℃孵育10min，涡旋震荡10min，然后12000rpm离心5min，取400μl上清至1.5ml的离心管中；离心后上清表面可能出现一层杂质，避免吸取这些杂质，以免杂质影响下游的扩增；

(c)往步骤(b)所述的1.5ml的离心管中加入250μl S3-Cleanup Buffer，混匀，12000rpm离心2min，取全部上清液(约500μl)转移至结合液(预封装试剂96孔板的孔1、7)中，将与分装试剂板放入到核酸提取仪中，插入磁棒套，然后编辑核酸自动提取仪，并启动运行(打开核酸自动提取仪，选择编辑程序并命名“environmental samples”，按照表1进行编辑)，待程序运行25min结束后，将洗脱孔6、12的核酸转移至另一离心管中，进行定量PCR(q-PCR)检测。

采用本发明所述试剂盒检测环境样本非洲猪瘟病毒的方法，涉及了一种从环境样本中的DNA提取纯化，从环境样本中的DNA提取纯化涉及了一种能够将样本中含有的腐殖酸、多糖、多酚、色素等去除剂。

采用本发明所述试剂盒检测环境样本非洲猪瘟病毒的方法，可广泛适合养殖环境中多种环境样本(猪舍、养殖用水、食槽及食槽下面的食物残渣、猪场附近3公里内土壤、猪的粪便、猪尿液、猪唾液以及运送饲料、生猪的车辆、参与养殖的人员穿戴、猪舍内的灰尘和蜘蛛网)的检测，且灵敏度达10copise/μl，与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性肠胃炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒(G5型)、猪圆环病毒2型(ZJ/C)、猪链球菌、大肠杆菌、流行腹泻病毒、猪蓝耳病毒、口蹄疫(A\O\亚洲型)无交叉反应，所述方法可广泛适用于非洲猪瘟恢复养殖的实时监控。

作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，步骤(a)中，所述环境样本处理的具体操作如下：

猪粪便、污泥、养殖饲料、土壤、猪舍食或猪唾液的处理：取小于0.25g猪粪便或污泥加入Dry beads Tube中，加入750～900μl S1-Lysis Enhancer涡旋、混匀；若饲料、污泥吸水过多，可以适当曾加S1-Lysis Enhancer的用量；

擦拭环境的抹布或拭子的处理：取擦拭环境的抹布或拭子置于15ml或50ml离心管中，加入1ml PBS缓冲溶液浸泡后，用镊子挤压抹布或拭子，取250μl液体至Dry beads Tube中，加入750μl S1-Lysis Enhancer涡旋、混匀；

猪尿液或养殖用水的处理：使用负压设备，配合抽滤装置抽滤50ml～200mL的猪尿液或养殖用水，将抽滤装置中的滤膜取出，用剪刀剪碎放入Dry beads Tube中，加入750μlS1-Lysis Enhancer涡旋彻底、混匀。

作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，所述抽滤装置为0.22μm的微孔过滤器并配合使用注射器，所述养殖用水抽滤的量为50ml。

作为本发明所述试剂盒的一种优选实施方式，步骤(b)中，用研磨仪涡旋震荡，所述研磨仪的频率为6.5m/s，所述涡旋震荡的处理时间为30s，10个循环；步骤(c)中，所述核酸自动提取仪的编辑程序的步骤及步骤中的参数如下表1所示；所述预封装试剂板中孔位试剂分布及试剂体积如下表2所示；

表1

表2(单位：μl)

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法，可广泛用于检测养殖环境中多种环境样本，打破了单个环境样本检测的局限性，多种环境样本包括来自如下环境的样本：猪舍、养殖用水、食槽及食槽下面的食物残渣、猪场附近3公里内土壤、猪的粪便、猪尿液、猪唾液以及运送饲料、运送生猪的车辆、参与养殖的人员穿戴、猪舍内的灰尘和蜘蛛网；

(2)本发明提供的环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法，其检测方法灵敏度达10copise/μl，本所述环境样本非洲猪瘟病毒的检测与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性肠胃炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒(G5型)、猪圆环病毒2型(ZJ/C)、猪链球菌、大肠杆菌、流行腹泻病毒、猪蓝耳病毒、口蹄疫的检测(A\O\亚洲型)无交叉反应，可广泛适用于非洲猪瘟恢复养殖的实时监控；

(3)本发明提供的环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法，通过对环境样本进行荧光定量检测，确保环境中无非洲猪瘟的存在，为非洲猪瘟恢复养殖提供技术支持。

附图说明

图1为实施例1郑州中道试剂与本发明非洲猪瘟病毒检测的比较图；

图2为实施例2所述的多种病毒PCR检测图；

图3为实施例3非洲猪瘟病毒克隆得到阳性对照质粒DNA的PCR检测图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

从上元生态农业公司养殖厂周围取3份土壤样本，分别编号19001、19002、19003；猪舍食槽底部1份(含有饲料残渣及土壤、粪便)，样本编号19004；2份含有猪唾液采集包(广东爱苏生物科技有限公司)取样回来挤压出唾液样本，收集至1.5ml的离心管中，样本编号：19005、19006；从广州市海大饲料有限公司取样猪饲料3份，样本编号19007、19008、19009；从牧原股份养殖基地周边取水样3份，样本编号190010、190011、190012。分别采用本发明所述的环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的DNA提取试剂(A)与购买的病毒DNA&RNA提取试剂(郑州中道生物科技有限公司)进行样本处理(B)。具体步骤如下：

1、采用本发明所述的环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的DNA提取试剂对环境样本处理，包括如下步骤：

(a)用天平称取0.2g土壤样本、0.2g食槽下面采集的样本以及0.2g广州市海大饲料有限公司取样猪饲料(19001、19002、19003、19004、19007、19008、19009)至含有研磨珠的Dry beads tube中；唾液样本(19005、19006)直接取250μl唾液加入Dry beads tube中；使用负压设备，配合抽滤装置抽滤200mL牧原股份养殖基地周边采集的水样(190010、190011、190012)，将抽滤装置中的滤膜取出，用剪刀剪碎放入Dry beads Tube中；然后分别加入750μl S1-Lysis Buffer涡旋彻底、混匀；

(b)将60μl S2-Lysis Enhancer溶液加入至步骤(a)处理后的样品中，65℃孵育10min，剧烈涡旋震荡10min，然后12000rpm离心5min，取400μl上清至1.5ml的离心管中；离心后上清表面可能出现一层杂质，避免吸取这些杂质，以免杂质影响下游的扩增；

(c)往步骤(b)所述的1.5ml的离心管中加入250μl S3-Cleanup Buffer，彻底混匀，12000rpm离心2min，取全部上清液(约500μl)转移至结合液(预封装试剂96孔板的孔1、7，预封装试剂板中孔位试剂分布及试剂体积如表2所示)中，将与分装试剂板放入到核酸提取仪中，插入磁棒套，然后编辑核酸自动提取仪，然后编辑核酸自动提取仪，并启动运行(打开核酸自动提取仪，选择编辑程序并命名“environmental samples”，按照表1进行编辑)，待程序运行25min结束后，将洗脱孔6、12的DNA转移至另一离心管中，进行定量PCR(q-PCR)检测。

2、病毒DNA&RNA提取试剂盒(郑州中道生物科技有限公司)对环境样本处理，包括如下步骤：直接吸取(由环境样本非洲猪瘟病毒DNA提取试剂S1-Lysis Buffer处理后)200μl加入到RNase&DNase free 1.5ml离心管中，然后加入200μl裂解液，涡旋震荡10s或颠倒混匀10次；将液体转移有收集管的吸附柱中，掌上离心1min；弃收集管中液体，向吸附柱中加600μl洗液Ⅰ，掌上离心机离心30s；弃收集管中液体，向吸附柱中加600μl洗液Ⅱ，掌上离心机离心30s；弃收集管中液体，掌上离心机离心1min，以彻底去除残留洗液；将吸附柱转入心的RNase/DNase-free 1.5ml离心管中，向柱中央加入50μl洗脱液，掌上离心1min，离心管中的液体即为核酸DNA，保存于-20℃备用。

3、使用本发明所述的环境样本非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)、西安天隆科技有限公司荧光定量PCR仪对上述两种不同环境样本处理方法提取的DNA进行检测：

本发明所述的环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒，包括特异性引物AP72-F和AP72-R，以及TaqMan探针AP72-P、环境样本DNA提取纯化试剂、扩增反应液、阳性对照和阴性对照；所述探针的5′端标记报告荧光染料为FAM，3′端标记荧光淬灭基团为BHQ-1；

上述特异性引物、TaqMan探针和阳性对照的核酸序列如下所示：

AP72-F：5’-TGCGATGATGATTACCTTTG-3’；SEQ ID NO：1；

AP72-R：5’-TGCTCTGGATACGTTAATATG-3’；SEQ ID NO：2；

AP72-P：5’-FAM-TTGGTATTCCTCCCGTGGCTT-3’-BHQ-1；SEQ ID NO：3；

阳性对照的核苷酸序列：SEQ ID NO：4。

上述环境样本DNA提取纯化试剂包括裂解液(181mM Na₂HPO₄和121mM GuHCl)、裂解增强剂(0.5M SDS、10mM Tris和20mM EDTA)、去抑制剂因子(133mM Al³⁺)、结合液(5M GuHCl和体积浓度为10％Isopropanol)、漂洗液(3M GuSCN)、洗液(50mM Tris，pH为6.6)、磁珠粒径1nm，浓度50mg/ml、二氧化锆珠直径为1mm、洗脱液(10mM Tris，pH为8.5)；

上述扩增反应液包括20mM Tris(pH＝9.2)、4mM Mg²⁺、20mM K⁺、体积浓度为10％的甘油、1～5pmol上下游引物AP72-R\F、1～3pmol探针AP72-P和1Unit DNA扩增聚合酶。

上述1和2的两种不同环境样本处理方法提取的DNA进行检测，包括如下步骤：

(1)根据待检测样本总数，计算所需要的PCR反应管数量为8(8＝6份待测样本数+1份阴性对照+1份阳性对照)，在每个PCR反应管中加入扩增反应液20μl，然后转入加样区；

(2)将提取的DNA、阳性对照、阴性对照(无菌水)各取5μl，分别加入上述分装有20μl反应液的PCR反应管中，盖好管盖，混匀后短暂离心，使所有反应液集中于管底；

(3)将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内；设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μl；荧光通道选择：检测通道(Reporter Dye)选择“FAM”，淬灭通道(QuencherDye)选择“None”；

(4)PCR扩增的反应程序为：预变性95℃10min，1个循环；95℃15s，55℃30min，40个循环；55℃结束时采集Fam荧光信号。

实验结果：

对上述两种环境样本处理获得的非洲猪瘟病毒核酸(DNA)进行q-PCR，其检测结果通过检测通道的Ct值进行结果判定，结果如图1和表3所示。

本实施例采用所述试剂盒检测环境样本非洲猪瘟病毒的方法中，其结果判断：若检测样本为阳性，则检测通道Ct值≤40，且曲线有明显的“S”型增长曲线；若检测样本可疑，则检测通道40<Ct值≤45，建议重复检测，如果检测通道仍为40<Ct值≤45，且曲线有明显的“S”型增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；若检测样本为阴性，则样本检测结果无Ct值，扩增曲线在阈值线附近，无明显增长曲线。

表3环境样本的不同处理所提取的非洲猪瘟病毒DNA对比检测结果

由图1和表3的实验结果可知，阴性无Ct，阳性对照Ct<35，且有明显的“S”型曲线，说明本实施例的实验有效；有环境样本非洲猪瘟病毒DNA提取试剂得到的样本的阳性率91.667％，而普通的病毒DNA&RNA提取试剂的阳性率仅有58.333％，对于同一样本，经过环境样本非洲猪瘟病毒DNA提取试剂处理的灵敏度远远(约1000倍)高于普通的病毒提取试剂盒。

实施例2

使用本发明所述的环境样本非洲猪瘟病毒核酸提取试剂对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性肠胃炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒(G5型)、猪圆环病毒2型(ZJ/C)、猪链球菌、大肠杆菌、猪蓝耳病毒、口蹄疫(A\O\亚洲型)病毒进行提取，提取核酸采用本发明所述的环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法扩增检测，具体操作步骤同实施例1，结果如图2和表4所示。

实验结果：

表4不同病毒检测的实验结果

由图2和表4的实验结果可知，上述病毒的检测均为阴性无Ct，阳性对照Ct<35，且有明显的“S”型曲线，说明本实施例的实验有效；根据产品分析性能评估结果，本发明所述的环境样本非洲猪瘟病毒检测与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性肠胃炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒(G5型)、猪圆环病毒2型(ZJ/C)、猪链球菌、大肠杆菌、流行腹泻病毒、猪蓝耳病毒、口蹄疫的检测(A\O\亚洲型)无交叉反应，特异性好。

实施例3

根据NCBI报道的非洲猪瘟病毒序列，进行克隆得到阳性对照质粒DNA(阳性对照的核苷酸序列如SEQ ID NO：4)，按照10倍梯度进行稀释，稀释后根据浓度和Copise数的关系进行推算到单拷贝。对得到的梯度DNA进行扩增，测试试剂的灵敏度，其检测的具体操作步骤同实施例1，检测结果如图3所示。图3为梯度稀释的阳性质粒，经过定量后稀释的copy值，体现了测试试剂盒的灵敏度的。

实验结果：Y＝-3.273*LOG(X)+40.19,R2＝1，扩增效率为102.1％，梯度稀释的质粒的线型相关系数R2＝1，阴性对照无Ct，实验有效，根据结果产品分析，本试剂盒的灵敏度为10copise/μl。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州赛百纯生物科技有限公司

<120> 一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒及检测方法

<130> 2020

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcgatgatg attacctttg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgctctggat acgttaatat g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttggtattcc tcccgtggct t 21

<210> 4

<211> 275

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tccgtaactg ctcatggtat caatcttatc gataagtttc catcaaagtt ctgcagctct 60

tacataccct tccactacgg aggcaatgca attaaaaccc ccgatgatcc gggtgcgatg 120

atgattacct ttgctttgaa gccacgggag gaataccaac ccagtggtca tattaacgta 180

tccagagcaa gagaatttta tattagttgg gacacggatt acgtggggtc tatcactacg 240

gctgatcttg tggtatcggc atctgctatt aactt 275

Claims

1.一种环境样本非洲猪瘟病毒检测试剂盒，其特征在于，包括特异性引物AP72-F和AP72-R，以及TaqMan探针AP72-P；所述探针的5′端标记报告荧光染料为FAM，3′端标记荧光淬灭基团为BHQ-1；其中特异性引物和TaqMan探针序列如下：

AP72-F：5’-TGCGATGATGATTACCTTTG-3’；SEQ ID NO：1；

AP72-R：5’-TGCTCTGGATACGTTAATATG-3’；SEQ ID NO：2；

AP72-P：5’-FAM-TTGGTATTCCTCCCGTGGCTT-3’-BHQ-1；SEQ ID NO：3。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括：环境样本DNA提取纯化试剂、扩增反应液、阳性对照和阴性对照。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述环境样本DNA提取纯化试剂包括裂解液、裂解增强剂、去抑制剂因子、结合液、漂洗液、洗液、磁珠液、二氧化锆珠、洗脱液；

所述裂解液包括181mM Na₂HPO₄和121mM GuHCl；所述裂解增强剂包括0.5M SDS、10mMTris和20mM EDTA；所述去抑制剂因子为133mM Al³⁺；所述结合液包括5MGuHCl和体积浓度为10％Isopropanol；所述漂洗液为3M GuSCN；所述洗液为50mM Tris，pH为6.6；所述磁珠液粒径1nm，浓度为50mg/ml；所述二氧化锆珠的直径为1mm；所述洗脱液为10mM Tris，pH为8.5。

4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液包括20mM Tris、4mMMg²⁺、20mM K⁺、体积浓度为10％的甘油、1～5pmol上下游引物AP72-R\F、1～3pmol探针AP72-P和1Unit DNA扩增聚合酶；其中所述20mM Tris的pH为9.2。

5.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

6.如权利要求1-5任一所述的检测试剂盒，其特征在于，采用所述试剂盒检测环境样本非洲猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：

(1)待测样本DNA的提取；

(2)PCR扩增：反应体系设为25μl，在多个PCR反应管内加入非洲猪瘟病毒扩增反应液20μl，将步骤(1)提取的待测样本DNA5μl、阳性对照5μl、阴性对照5μl分别加入不同的PCR反应管中，混匀离心进行PCR反应；所述PCR扩增的反应程序为：预变性95℃ 10min，1个循环；95℃ 15s，55℃ 30s，40个循环；55℃结束时采集Fam荧光信号；

7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，采用所述试剂盒检测环境样本非洲猪瘟病毒的方法，步骤(1)中，所述待测样本DNA的提取，包括如下步骤：

(b)将60μl S2-Lysis Enhancer溶液加入至步骤(a)处理后的样品中，65℃孵育10min，涡旋震荡10min，然后12000rpm离心5min，取400μl上清至1.5ml的离心管中；

(c)往步骤(b)所述的1.5ml的离心管中加入250μl S3-Cleanup Buffer，混匀，12000rpm离心2min，取上清液转移至结合液中，将与分装试剂板放入到核酸提取仪中，插入磁棒套，然后编辑核酸自动提取仪，并启动运行，待程序运行25min结束后，将洗脱孔的核酸转移至另一离心管中，进行定量PCR检测。

8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，步骤(a)中，所述环境样本处理的具体操作如下：

猪粪便、污泥、养殖饲料、土壤、猪舍食或猪唾液的处理：取小于0.25g猪粪便或污泥加入Dry beads Tube中，加入750～900μl S1-Lysis Enhancer涡旋、混匀；

猪尿液或养殖用水的处理：使用负压设备，配合抽滤装置抽滤50ml～200mL的猪尿液或养殖用水，将抽滤装置中的滤膜取出，用剪刀剪碎放入Dry beads Tube中，加入750μl S1-Lysis Enhancer涡旋彻底、混匀。

9.如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抽滤装置为0.22μm的微孔过滤器并配合使用注射器，所述养殖用水抽滤的量为50ml。

10.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，步骤(b)中，用研磨仪涡旋震荡，所述研磨仪的频率为6.5m/s，所述涡旋震荡的处理时间为30s，10个循环；步骤(c)中，所述核酸自动提取仪的编辑程序的步骤及步骤中的参数如下表1所示：

表1