CN112813061A - 一种猫体液样本核酸提取前处理试剂及核酸提取方法 - Google Patents

一种猫体液样本核酸提取前处理试剂及核酸提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猫体液样本核酸提取前处理试剂及核酸提取方法，涉及核酸提取技术领域。其包括质量体积浓度为1‑10％的蛋白质二硫键还原剂。该试剂通过蛋白质二硫键还原剂可以还原蛋白质分子中的二硫键，从而使得蛋白质的四级或三级结构被破坏，从而使得胸腹水样本中的黏蛋白更容易在室温下消化。从而降低核酸的杂蛋白含量，有利于核酸的纯度提升，满足荧光定量PCR对于核酸纯度的需求。

Description

一种猫体液样本核酸提取前处理试剂及核酸提取方法
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，具体而言，涉及一种猫体液样本核酸提取前处理试剂及核酸提取方法。
背景技术
目前，猫冠状病毒的检测存在核酸纯度差，实时荧光定量检测受到抑制，临床诊断难度高的问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猫体液样本核酸提取前处理试剂及核酸提取方法以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种猫体液样本核酸提取前处理试剂，其包括质量体积浓度为1-10％的蛋白质二硫键还原剂，猫体液样本为猫胸腹水或痰液。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述蛋白质二硫键还原剂为三(2-羧乙基)膦、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、二硫苏糖醇、N-乙酰-L-半胱氨酸和β-巯基乙醇中的至少一种。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本核酸提取前处理试剂包括质量体积浓度为1.3％的蛋白质二硫键还原剂；
优选地，猫体液样本核酸提取前处理试剂的溶剂为DEPC处理水。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本核酸提取前处理试剂还包括表面活性剂、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和胍盐中的至少一种；
优选地，表面活性剂为SDS、Tween 20、Triton X-100、NP-40和十二烷基肌氨酸钠中的至少一种；优选地，表面活性剂的质量体积浓度为1-20％；
优选地，胍盐为异硫氰酸胍、盐酸胍、硝酸胍、碳酸胍、乙酸胍、辛酸胍、苯基碳酸胍、四甲基胍或二苯胍；
优选地，胍盐的质量体积浓度为20-30％；
优选地，猫体液样本核酸提取前处理试剂中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为10-20mM，优选地，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH为5-6。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本核酸提取前处理试剂还包括体积百分比为3-10％的Triton X-100、质量体积百分比为0.5-4％的SDS、10-20mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和质量体积百分比为20-30％的异硫氰酸胍。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本核酸提取前处理试剂还包括体积百分比为5％的Triton X-100、质量体积百分比为2％的SDS、10mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和质量体积百分比为23％的异硫氰酸胍。
本发明提供了一种检测试剂盒，其包括上述的猫体液样本核酸提取前处理试剂。
本发明提供了一种使用上述猫体液样本核酸提取前处理试剂进行核酸提取的方法，其包括如下步骤：将待提取核酸的样本与猫体液样本核酸提取前处理试剂混合，取上清液进行核酸提取。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述待提取核酸的样本与猫体液样本核酸提取前处理试剂的混合体积比例为(0.5-2):1；
优选地，将待提取核酸的样本与猫体液样本核酸提取前处理试剂混合后，进行离心，取上清进行核酸提取。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述核酸提取为磁珠法核酸提取。
本发明提供了一种猫体液样本核酸提取前处理试剂在制备荧光定量PCR检测猫冠状病毒试剂盒中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种猫体液样本核酸提取前处理试剂，该试剂通过蛋白质二硫键还原剂可以还原蛋白质分子中的二硫键，从而使得蛋白质的四级或三级结构被破坏，从而使得体液样本中的黏蛋白更容易在室温下消化。从而降低核酸的杂蛋白含量，有利于核酸的纯度提升，满足荧光定量PCR对于核酸纯度的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实验例1猫腹水核酸的实时荧光定量PCR曲线图；
图2为实验例2猫腹水核酸的实时荧光定量PCR曲线图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
本发明提供了一种猫体液样本核酸提取前处理试剂，其包括质量体积浓度为1-10％的蛋白质二硫键还原剂，猫体液样本为猫胸腹水或痰液。例如可以是1％，1.5％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％或10％。
发明人发现：致使核酸样本纯度差的原因在于：临床上猫体液中球蛋白或胆红素浓度较高，从而抑制了实时荧光定量PCR。本发明提供了一种前处理试剂可以在室温、快速消化胸腹水样本中的黏蛋白，提高了磁珠法核酸提取试剂盒提取的核酸的纯度，满足了实时荧光定量PCR对核酸纯度的要求，进一步提高了猫冠状病毒核酸临床检测的阳性率，可为医护人员提供可靠的体外诊断依据。
在其他实施方式中，本发明提供的猫体液样本核酸提取前处理试剂也适用于含病毒的粘液，并不限于上述的猫胸腹水或痰液。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述蛋白质二硫键还原剂为三(2-羧乙基)膦(即为TCEP)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、二硫苏糖醇(DTT)、N-乙酰-L-半胱氨酸(即为NAC，N-acetyl-L-cysteine)和β-巯基乙醇中的至少一种。
在其他实施方式中，上述的蛋白质二硫键还原剂也可以是其他的蛋白质二硫键还原剂，并不限于上述列举的几种类型。
在其他实施方式中，也可以根据还原的需要选自将上述的多种蛋白质二硫键还原剂进行组合，包括不限于将DTT与TCEP组合使用。
TCEP试剂在水溶液中的稳定性和溶解性都很好。在酸性、碱性溶液中的稳定性较高。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本核酸提取前处理试剂包括质量体积浓度为1.3％的蛋白质二硫键还原剂；
优选地，猫体液样本核酸提取前处理试剂的溶剂为DEPC处理水。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本核酸提取前处理试剂还包括表面活性剂、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和胍盐中的至少一种。
由于上述的部分蛋白质二硫键还原剂只能对蛋白质分子间的二硫键进行还原，而对于包埋于蛋白质结构内部的溶剂不可及的二硫键的还原，还需要将蛋白质进行变性，因此，选择加入胍盐、表面活性剂以及Tris-HCl，以加快还原速度以及还原深度。
在其他实施方式中，也可以根据需要设置还原剂的种类以及表面活性剂、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)和胍盐。
优选地，表面活性剂为SDS、Tween 20、Triton X-100、NP-40和十二烷基肌氨酸钠中的至少一种；优选地，表面活性剂的质量体积浓度为1-20％。
在其他实施方式中，表面活性剂也可以选择其他的阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂。阳离子表面活性剂可以为季铵化合物，两性离子表面活性剂可以是卵磷脂、氨基酸型或甜菜碱型，非离子表面活性剂可以是烷基葡糖苷、脂肪酸甘油酯、司盘等。
优选地，胍盐为异硫氰酸胍、盐酸胍、硝酸胍、碳酸胍、乙酸胍、辛酸胍、苯基碳酸胍、四甲基胍或二苯胍；胍盐可起到抑制RNase活性，保护病毒RNA不被降解的作用。
在其他实施方式中，上述的胍盐也可以是氨基胍盐酸盐、1-甲基-3-硝基胍、亚硝基胍、乙胍或双胍。需要说明的是，上述的胍盐仅为发明人有限列举的几种类型，在其他实施方式中，上述胍盐的种类也可以根据需要进行选择。
胍盐的质量体积浓度为20-30％；
优选地，猫体液样本核酸提取前处理试剂中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为10-20mM，优选地，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH为5-6。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本核酸提取前处理试剂还包括体积百分比为3-10％的Triton X-100、质量体积百分比为0.5-4％的SDS、10-20mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和质量体积百分比为20-30％的异硫氰酸胍。
Triton X-100的体积浓度为3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％或10％。SDS的质量体积百分比为0.5，1％，1.5％，2％，3％或4％。三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的摩尔浓度为10mM，12mM，13mM，15mM，18mM或20mM。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本核酸提取前处理试剂还包括体积百分比为5％的Triton X-100、质量体积百分比为2％的SDS、10mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和质量体积百分比为23％的异硫氰酸胍。
本发明提供了一种检测试剂盒，其包括上述的猫体液样本核酸提取前处理试剂。在其他实施方式中，上述的检测试剂盒还包括检测猫冠状病毒的缓冲液以及荧光标记液。可选的，合成检测猫冠状病毒的引物，采用上述检测试剂盒实现猫冠状病毒的检测。
本发明提供了一种使用上述猫体液样本核酸提取前处理试剂进行核酸提取的方法，其包括如下步骤：将待提取核酸的样本与猫体液样本核酸提取前处理试剂混合，取上清液进行核酸提取。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述待提取核酸的样本与猫体液样本核酸提取前处理试剂的混合体积比例为(0.5-2):1；
优选地，将待提取核酸的样本与猫体液样本核酸提取前处理试剂混合后，进行离心，取上清进行核酸提取。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述核酸提取为磁珠法核酸提取。
本发明提供了一种猫体液样本核酸提取前处理试剂在制备荧光定量PCR检测猫冠状病毒试剂盒中的应用。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种猫体液样本核酸提取前处理试剂，其包括质量体积浓度为1.3％的TECP盐酸盐溶液，溶剂为DEPC处理水。
上述的猫体液样本核酸提取前处理试剂可以室温保存1年。
实施例2
本实施例提供了一种猫体液样本核酸提取前处理试剂，其包括质量体积浓度为5％的TECP盐酸盐溶液，溶剂为DEPC处理水。
上述的猫体液样本核酸提取前处理试剂可以室温保存1年。
实施例3
本实施例提供了一种猫体液样本核酸提取前处理试剂，其包括质量体积浓度为10％的TECP盐酸盐溶液，溶剂为DEPC处理水。
上述的猫体液样本核酸提取前处理试剂可以室温保存1年。
实施例4
本实施例提供了一种猫体液样本核酸提取前处理试剂，其包括质量体积浓度为1.3％的TECP盐酸盐溶液、体积浓度为5％的Triton-X100、质量体积浓度为2％的SDS、10mM的Tris-HCl(pH5～6)、质量体积浓度为23％的异硫氰酸胍(GUSCN)，溶剂为DEPC处理水。
实施例5
本实施例提供了一种猫体液样本核酸提取前处理试剂，其包括质量体积浓度为1.3％的TECP盐酸盐溶液、体积浓度为5％的Triton-X100、质量体积浓度为2％的SDS、10mM的Tris-HCl(pH5～6)、质量体积浓度为30％的盐酸胍(GUSCN)，溶剂为DEPC处理水。
实施例6
本实施例提供了一种猫体液样本核酸提取前处理试剂，其包括质量体积浓度为1.3％的TECP盐酸盐溶液、体积浓度为5％的Triton-X100、质量体积浓度为4％的SDS、15mM的Tris-HCl(pH5～6)、质量体积浓度为25％的异硫氰酸胍(GUSCN)，溶剂为DEPC处理水。
实验例1
本实验例提供了样本的前处理以及核酸提取实验，提取后的核酸进行核酸纯度和荧光定量PCR检测。同时设置对照组，区别仅在于，样本前处理步骤不添加猫胸腹水样本前处理试剂，其余的核酸提取差值步骤和核酸检测步骤相同。
对照组是指生理盐水与胸腹水样本等体积充分混合后，室温静置5min，12000rpm离心1min，留取上清液。用磁珠法病毒核酸提取试剂盒提取上清液的核酸，然后使用猫冠状病毒核酸检测试剂盒进行检测，根据扩增曲线图，判读样本的Ct，Ct≦36为阳性。
1.样本前处理。
向1.5ml离心管里用加200ul实施例1的猫体液样本核酸提取前处理试剂，加200ul胸腹水(来源于宠物医院的馈赠)涡旋混匀，静置2min，然后在12000rpm下离心1min，留取上清液。
2.核酸提取操作步骤，采用市售的磁珠法病毒核酸提取试剂盒(厂商GNEFINE，型号Y502)进行核酸提取：
(1)向1.5ml的离心管中再依次加入步骤(1)的200ul上清液，200μl裂解液、22μl蛋白酶K液(含内参，冻干状态的蛋白酶K需加30ul水溶解后，取22ul作为蛋白酶K液)；
(2)涡旋震荡混匀，70℃孵育10min，期间颠倒混匀3次。水浴结束后，加入300ul异丙醇，25ul磁珠室温颠倒混匀5min；
(3)将离心管放置在磁力架上静置，磁吸90s，待磁珠完全吸附时小心移去液体；
(4)将离心管小心从磁力架上取下，加入500μl的洗涤液A，摇匀；放置磁力架上磁吸90s，待磁珠完全吸附时小心移去液体；
(5)将离心管小心从磁力架上取下，加入500μl洗涤液B，摇匀；放置磁力架上磁吸90sec，待磁珠完全吸附时小心移去液体。重复步骤(5)一次；
(6)将离心管放在磁力架上，加入350μl洗涤液C，颠倒2次磁力架，磁吸60sec，待磁珠完全吸附时小心移去液体。
(7)将离心管从磁力架上取下，加入100ul～200μl洗脱液，吹吸混匀，56℃孵育5min。
(8)将离心管放置于磁力架上90s，待磁珠完全吸附时小心转移核酸溶液至新的离心管中，-20℃保存或进入下一步实验。
3.测定核酸纯度。
使用NanoDrop超微量分光光度计测定纯度。
表1为高纯度核酸样本的标准吸光度值(来源于NanoDrop超微量分光光度计使用手册)。表2为核酸纯度的测定值。A1是使用猫体液样本核酸提取前处理试剂的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的纯度；A2是未经过猫体液样本核酸提取前处理试剂的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的纯度值。
表1高纯度核酸样本的标准吸光度值。
Figure BDA0002949701700000101
表2为核酸纯度的测定值。
编号 A260 A280 A230 A260/A280 A260/A230 浓度(ng/ul)
A1 0.159 0.086 0.080 1.85 1.99 5.041
A2 0.146 0.191 0.171 0.76 0.85 7.316
4.测定样本Ct。
使用猫冠状病毒核酸实时荧光PCR检测试剂盒进行检测，根据扩增曲线图，判读样本的Ct，Ct≦36为阳性。猫冠状病毒核酸检测试剂盒，主要包含FCoV的冻干Mix和MiX溶解液。检测引物同专利名称为“一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的核酸组合物及其试剂盒和应用”中的检测引物相同。
使用猫冠状病毒核酸实时荧光PCR检测试剂盒检测，体系配置和实时扩增条件设定见表3和表4。
表3为模板加样量和PCR反应体系配置方法。
Figure BDA0002949701700000111
表4实时扩增条件。
Figure BDA0002949701700000112
图1为实时荧光定量PCR曲线图，A1是使用猫体液样本核酸提取前处理试剂的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的检测曲线，Ct为22.9；A2是未经过猫体液样本核酸提取前处理试剂的对照组的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的检测曲线，Ct为27.6。可以看出未使用猫体液样本核酸提取前处理试剂提取的核酸对实时荧光定量PCR有明显的抑制，导致Ct滞后。
实验例2
本实验例提供了样本的前处理以及核酸提取实验，提取后的核酸进行核酸纯度和荧光定量PCR检测。同时设置对照组，区别仅在于，样本前处理步骤不添加猫胸腹水样本前处理试剂，其余的核酸提取差值步骤和核酸检测步骤相同。
对照组是指生理盐水与胸腹水样本等体积充分混合后，室温静置5min，12000rpm离心1min，留取上清液。用磁珠法病毒核酸提取试剂盒提取上清液的核酸，然后使用猫冠状病毒核酸检测试剂盒进行检测，根据扩增曲线图，判读样本的Ct，Ct≦36为阳性。
1.样本前处理。
向1.5ml离心管中用加200ul实施例4的猫体液样本核酸提取前处理试剂，加200ul胸腹水(来源于实验例1相同)涡旋混匀，静置2min，然后在12000rpm下离心1min，留取上清液。
2.核酸提取操作步骤，采用市售的磁珠法病毒核酸提取试剂盒进行核酸提取：
(1)向1.5ml的离心管中再依次加入步骤(1)的200ul上清液，200μl裂解液、22μl蛋白酶K液(含内参，冻干状态的蛋白酶K需加30ul水溶解后，取22ul作为蛋白酶K液)；
(2)涡旋震荡混匀，70℃孵育10min，期间颠倒混匀3次。水浴结束后，加入300ul异丙醇，25ul磁珠室温颠倒混匀5min；
(3)将离心管放置在磁力架上静置，磁吸90s，待磁珠完全吸附时小心移去液体；
(4)将离心管小心从磁力架上取下，加入500μl的洗涤液A，摇匀；放置磁力架上磁吸90s，待磁珠完全吸附时小心移去液体；
(5)将离心管小心从磁力架上取下，加入500μl洗涤液B，摇匀；放置磁力架上磁吸90sec，待磁珠完全吸附时小心移去液体。重复步骤(5)一次；
(6)将离心管放在磁力架上，加入350μl洗涤液C，颠倒2次磁力架，磁吸60sec，待磁珠完全吸附时小心移去液体。
(7)将离心管从磁力架上取下，加入100ul～200μl洗脱液，吹吸混匀，56℃孵育5min。
(8)将离心管放置于磁力架上90s，待磁珠完全吸附时小心转移核酸溶液至新的离心管中，-20℃保存或进入下一步实验。
3.测定核酸纯度。
使用NanoDrop超微量分光光度计测定纯度。
表5为核酸纯度的测定值。A3是使用猫体液样本核酸提取前处理试剂的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的纯度；A4是未经过猫体液样本核酸提取前处理试剂的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的纯度值。
表5为核酸纯度的测定值。
编号 A260 A280 A230 A260/A280 A260/A230 浓度(ng/ul)
A3 0.177 0.089 0.090 1.99 1.97 7.114
A4 0.25 0.128 0.13 1.93 1.90 11.90
4.测定样本Ct。
使用猫冠状病毒核酸实时荧光PCR检测试剂盒进行检测，根据扩增曲线图，判读样本的Ct，Ct≦36为阳性。猫冠状病毒核酸检测试剂盒，主要包含FCoV的冻干Mix和MiX溶解液。引物同实验例1。
使用猫冠状病毒核酸实时荧光PCR检测试剂盒检测，体系配置和实时扩增条件设定同表3和表4。
图2为实时荧光定量PCR曲线图，A3是使用猫体液样本核酸提取前处理试剂的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的检测曲线，Ct为25.1；A4是未经过前处理的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的检测曲线，Ct为25.7。可以看出未使用猫体液样本核酸提取前处理试剂提取的核酸对实时荧光定量PCR无明显差异。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猫体液样本核酸提取前处理试剂，其特征在于，其包括质量体积浓度为1-10％的蛋白质二硫键还原剂，所述猫体液样本为猫胸腹水或痰液。
2.根据权利要求1所述的猫体液样本核酸提取前处理试剂，其特征在于，所述蛋白质二硫键还原剂为三(2-羧乙基)膦、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、二硫苏糖醇、N-乙酰-L-半胱氨酸和β-巯基乙醇中的至少一种；
优选地，所述猫体液样本核酸提取前处理试剂包括质量体积浓度为1.3％的蛋白质二硫键还原剂；
优选地，所述猫体液样本核酸提取前处理试剂的溶剂为DEPC处理水。
3.根据权利要求1或2所述的猫体液样本核酸提取前处理试剂，其特征在于，所述猫体液样本核酸提取前处理试剂还包括表面活性剂、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和胍盐中的至少一种；
优选地，所述表面活性剂为SDS、Tween 20、Triton X-100、NP-40和十二烷基肌氨酸钠中的至少一种；优选地，所述表面活性剂的质量体积浓度为1-20％；
优选地，所述胍盐为异硫氰酸胍、盐酸胍、硝酸胍、碳酸胍、乙酸胍、辛酸胍、苯基碳酸胍、四甲基胍或二苯胍；
优选地，所述胍盐的质量体积浓度为20-30％；
优选地，所述猫体液样本核酸提取前处理试剂中所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为10-20mM，优选地，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的pH为5-6。
4.根据权利要求3所述的猫体液样本核酸提取前处理试剂，其特征在于，所述猫体液样本核酸提取前处理试剂还包括体积百分比为3-10％的Triton X-100、质量体积百分比为0.5-4％的SDS、10-20mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和质量体积百分比为20-30％的异硫氰酸胍。
5.根据权利要求4所述的猫体液样本核酸提取前处理试剂，其特征在于，所述猫体液样本核酸提取前处理试剂还包括体积百分比为5％的Triton X-100、质量体积百分比为2％的SDS、10mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和质量体积百分比为23％的异硫氰酸胍。
6.一种检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的猫体液样本核酸提取前处理试剂。
7.一种使用权利要求1-5任一项所述的猫体液样本核酸提取前处理试剂进行核酸提取的方法，其特征在于，其包括如下步骤：将待提取核酸的样本与所述猫体液样本核酸提取前处理试剂混合，取上清液进行核酸提取。
8.根据权利要求7所述的核酸提取的方法，其特征在于，所述待提取核酸的样本与所述猫体液样本核酸提取前处理试剂的混合体积比例为(0.5-2):1；
优选地，将待提取核酸的样本与所述猫体液样本核酸提取前处理试剂混合后，进行离心，取上清进行核酸提取。
9.根据权利要求7所述的核酸提取的方法，其特征在于，所述核酸提取为磁珠法核酸提取。
10.一种如权利要求1-5任一项所述的猫体液样本核酸提取前处理试剂在制备荧光定量PCR检测猫冠状病毒试剂盒中的应用。
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