CN111424031A - 适于冠状病毒提取、纯化和保存的复合缓冲液和试剂盒 - Google Patents

适于冠状病毒提取、纯化和保存的复合缓冲液和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了复合缓冲液和试剂盒，其中，该复合缓冲液包括：2.05‑2.4M变性剂、2‑10体积％增溶剂、1‑7mM有机还原剂、40‑100mM两性离子缓冲液、1‑6mM非离子螯合剂、0.01‑0.05质量/体积％非离子型表面活性剂，且pH＝7.0‑8.0。该复合缓冲液理化性质稳定，便于室温保存运输，显著提高样本保存的稳定性，并能直接用于核酸样本的提取和纯化浓缩。

Description

适于冠状病毒提取、纯化和保存的复合缓冲液和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及适于冠状病毒提取、纯化和保存的复合缓冲液 和试剂盒。
背景技术
目前，核酸检测已广泛应用于临床和生物研究领域，而核酸样本的提取和保存效果直接 影响核酸检测的结果，而RNA对提取和保存溶液的要求更高。2020年1月12日，世界卫 生组织(WHO)发布公告，本次肺炎疫情由一种新型的冠状病毒(2019-nCov)导致。冠状病毒是一类在动物之间传播的病毒，核酸类型为单链RNA。卫健委发布的新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第三版)指导指出采集的材料包括呼吸材料(鼻咽和口拭子、 痰液、肺泡灌洗液等)和血清样本等，其中咽拭子、鼻拭子采样形式比较方便，在临床应用 中经常作为早期筛查以及轻症筛查的样本采集手段。拭子采样完成后，拭子头浸入的，含 3mL病毒保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液或磷酸盐缓冲液)的管中，尾部弃去，旋紧盖管。核酸样本RNA降解是PCR检测中常见问题。目前常见的样品处理液一般为生理 盐水Hank’s缓冲液，在后续的核酸样本保存过程中，病原体会破裂，释放出核酸，但Hank’s 液无法抑制RNase活性，核酸很容易被降解，从而影响检测结果的灵敏度。实际临床核酸 检测中，标本还需要寄送到第三方检验中心进行检测，运输过程中需要维持低温保存冷链运输，代价比较高。因此标本的常温运输保存是急需要解决的问题。
另外样品采集后，医护人员在检验操作过程中容易带来实验室暴露感染。目前采取的高 温灭活的方式，虽然能实现病毒的无害化，但也会造成RNA模板的加速降解。所以如何实 现这些有生物危害性的样本采集后就被灭活，以减少实验室检验人员感染的风险，同时保证 检测灵敏度，也是需要解决的问题。
再者，临床的采样液体积太大，会造成病原模板的进一步稀释，样本制备的时候会加入 额外体积量的缓冲液进行模板回收，一次提取体系体积太大，也造成模板浓缩操作的各种不 便。最终导致体系中的模板浓度降低，进一步挑战下游qPCR的检测灵敏度。
由此，现有的核酸提取和保存的溶液有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提 出一种复合缓冲液，理化性质稳定，便于室温保存运输，显著提高样本保存的稳定性，并能 直接用于核酸样本的提取和纯化浓缩。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种复合缓冲液。根据本发明的实施例，该复合 缓冲液包括：2.05-2.4M变性剂、2-10体积％增溶剂、1-7mM有机还原剂、40-100mM两性离子缓冲液、1-6mM非离子螯合剂、0.01-0.05质量/体积％非离子型表面活性剂，且 pH＝7.0-8.0。
根据本发明实施例的复合缓冲液，理化性质稳定，便于室温保存运输，并且具有病原体 的灭活作用，可显著降低缓冲液实验室暴露感染的风险，显著提高样本保存的稳定性，同时， 具有抑制RNase活性功能，使RNA不被核酸酶降解，此外，该复合缓冲液还无害化病毒表 面的蛋白使之不能与细胞受体结合，并能直接用于核酸样本的提取和纯化浓缩，适于临床和 科研的广泛使用。
另外，根据本发明上述实施例的复合缓冲液还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述变性剂为选自异硫氰酸胍和盐酸胍中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述增溶剂为选自异丙醇和乙醇中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述有机还原剂为选自二硫苏糖醇(DTT)和三(2-羧乙基)膦 (TCEP)盐中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述两性离子缓冲液为选自Tris缓冲液，MOPS缓冲液、PIPES 缓冲液和HEPES缓冲液中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述非离子螯合剂为选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、乙二 醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)和次氮基三乙酸三钠盐一水合物(NTA)中的至少一种，优选地，为乙二胺四乙酸。
根据本发明的实施例，所述非离子型表面活性剂为选自吐温-20-80、乙基苯基聚乙二醇 (NP-40)、异辛醇聚氧乙烯聚氧丙烯醚(CA-60)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)中 的至少一种，优选地，为吐温-20-80。
根据本发明的实施例，pH＝7.0-7.5。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液包括：2.05-2.3M异硫氰酸胍、4-8体积％异丙醇、 1-6mM二硫苏糖醇、40-80mM Tris缓冲液、1-6mM乙二胺四乙酸、0.01-0.05质量/体积％吐 温-20-80，且pH＝7.0-7.5。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包 括前述的复合缓冲液。
根据本发明实施例的试剂盒具有前述的复合缓冲液，该复合缓冲液理化性质稳定，便于 室温保存运输，并且具有病原体的灭活作用，可显著降低缓冲液实验室暴露感染的风险，显 著提高样本保存的稳定性，同时，具有抑制RNase活性功能，使RNA不被核酸酶降解，此 外，该复合缓冲液还无害化病毒表面的蛋白使之不能与细胞受体结合，并能直接用于核酸样 本的提取和纯化浓缩，由此，该试剂盒的检测灵敏性和准确高。
根据本发明的再一方面，本发明提供了前述复合缓冲液用于核酸提取、纯化和保存的用 途。由于该复合缓冲液理化性质稳定，便于室温保存运输，并且具有病原体的灭活作用，可 显著降低缓冲液实验室暴露感染的风险，显著提高样本保存的稳定性，同时，具有抑制RNase 活性功能，使RNA不被核酸酶降解，此外，该复合缓冲液还无害化病毒表面的蛋白使之不 能与细胞受体结合，由此，该复合缓冲液能直接用于核酸样本的提取、纯化和保存。
根据本发明的再一方面，本发明提供了前述试剂盒用于核酸检测的用途。由于本发明实 施例的试剂盒具有前述的复合缓冲液，该复合缓冲液理化性质稳定，便于室温保存运输，并 且具有病原体的灭活作用，可显著降低缓冲液实验室暴露感染的风险，显著提高样本保存的 稳定性，同时，具有抑制RNase活性功能，使RNA不被核酸酶降解，此外，该复合缓冲液 还无害化病毒表面的蛋白使之不能与细胞受体结合，并能直接用于核酸样本的提取和纯化浓 缩，由此，该试剂盒适用于核酸检测，并且检测的灵敏性和准确高。
根据本发明的再一方面，本发明提供了前述的试剂盒用于病原微生物核酸检测的用途， 优选地，所述病原微生物为冠状病毒。由于本发明实施例的试剂盒具有前述的复合缓冲液， 该复合缓冲液理化性质稳定，便于室温保存运输，并且具有病原体的灭活作用，可显著降低 缓冲液实验室暴露感染的风险，显著提高样本保存的稳定性，同时，具有抑制RNase活性功 能，使RNA不被核酸酶降解，此外，该复合缓冲液还无害化病毒表面的蛋白使之不能与细 胞受体结合，并能直接用于核酸样本的提取和纯化浓缩，由此，该试剂盒适用于病原微生物 核酸检测，尤其是冠状病毒核酸检测，并且检测的灵敏性和准确高。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和 容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的基因组的状态结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或 类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的 实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对 重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以 明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明， “多个”的含义是两个或两个以上。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种复合缓冲液。根据本发明的实施例，该复合 缓冲液包括：2.05-2.4M变性剂、2-10体积％增溶剂、1-7mM有机还原剂、40-100mM两性离子缓冲液、1-6mM非离子螯合剂、0.01-0.05质量/体积％非离子型表面活性剂，且 pH＝7.0-8.0。
根据本发明实施例的复合缓冲液，成分安全，理化性质稳定，不含有有毒易挥发性物质， 操作安全，便于室温保存运输，并且具有病原体的灭活作用，可显著降低缓冲液实验室暴露 感染的风险，显著提高样本保存的稳定性，同时，具有抑制RNase活性功能，使RNA不被 核酸酶降解，此外，该复合缓冲液还无害化病毒表面的蛋白使之不能与细胞受体结合，并能 直接用于核酸样本的提取和纯化浓缩，并且，该复合缓冲液成本低，适于临床和科研的广泛 使用。
根据本发明实施例的复合缓冲液能有效阻止Dnase/RNase降解核酸，灭活病原体，并且 不影响后续检测拭子样本保存液，对拭子样本的分子生物学研究和临床上的应用非常重要， 适用于高通量测序核酸样本的提取、纯化和保存，对RNA，尤其是冠状病毒样本的提取、 纯化和保存效果更佳。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液包括2.05-2.4M变性剂，且pH＝7.0-8.0。变性剂用 于变性裂解细胞，提取RNA和DNA，且无RNA酶和DNA酶活性，并且，在该浓度下，变 性效果好。根据本发明的实施例，所述变性剂为选自异硫氰酸胍和盐酸胍中的至少一种。发 明人采用高浓度的异硫氰酸胍等安全不易挥发的变性剂，而放弃使用如Trizol变性剂等含有苯酚等有毒挥发气体的变性剂，增加缓冲液使用的安全性，并且，发明人采用高浓度的异硫氰酸胍盐，和pH＝7.0-8.0范围内，能直接用于基于硅羟基的富集方法，例如玻璃纤维膜，和磁珠法的提取。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液包括2-10体积％增溶剂。由此，增加样本中脂类溶 解度，提高核酸提取回收羟基的能力，使核酸检测的灵敏度更高。根据本发明的实施例，所 述增溶剂为选自异丙醇和乙醇中的至少一种。由此，脂类的溶解度高，核酸的提取率高。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液包括1-7mM有机还原剂。根据本发明的实施例， 所述有机还原剂为选自二硫苏糖醇(DTT)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)盐中的至少一种。上 述还原剂具有良好的抑制RNase活性功能，可用于保存RNA不被核酸酶降解，同时还无害化病毒表面的蛋白使之不能与细胞受体结合。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液包括40-100mM两性离子缓冲液。发明人利用低 浓度的两性离子缓冲液，控制pH在中性，让长链核酸保持在相对螺旋度较高的状态，保持 分子刚性和减少相互交缠，同时能减少核酸和塑料表面的接触面积。根据本发明的实施例， 所述两性离子缓冲液为选自Tris缓冲液，MOPS缓冲液、PIPES缓冲液和HEPES缓冲液中的至少一种。由此，缓冲效果好。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液包括1-6mM非离子螯合剂。发明人采用该浓度的 非离子螯合剂，一方面有利于抑制依赖于二价盐的DNase的活性，另一方面，避免金属螯合剂浓缩后会导致这部分试剂的浓度上升，造成液相捕获特异性和灵敏度的偏差。
根据本发明的实施例，该非离子螯合剂为选自乙二胺四乙酸(EDTA)盐、柠檬酸盐、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)盐和次氮基三乙酸三钠盐一水合物(NTA)盐中的至少 一种，优选地，为乙二胺四乙酸盐。由此，对DNase的抑制性好，避免核酸降解，液相捕 获特异性和灵敏度的偏差小。
根据本发明的实施例，该复合缓冲液包括0.01-0.05质量/体积％非离子型表面活性剂， 发明人利用低浓度的非离子型表面活性剂在溶液中形成胶束，提高中性pH下核酸的水溶性， 并对疏水的塑料表面进行饱和吸附，以降低塑料对核酸分子的吸附稳定性。
根据本发明的实施例，该非离子型表面活性剂为选自吐温-20-80、乙基苯基聚乙二醇 (NP-40)、异辛醇聚氧乙烯聚氧丙烯醚(CA-60)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)中 的至少一种，优选地，为吐温-20-80。由此，核酸在复合缓冲液中的溶解性高，且不易吸附 于塑料表面，有利于降低检测结果的假阳性率。
进一步地，发明人对复合缓冲液的配方进行了优化，根据本发明的实施例，该复合缓冲 液包括：2.05-2.3M异硫氰酸胍、4-8体积％异丙醇、1-6mM二硫苏糖醇、40-80mM Tris缓 冲液、1-6mM乙二胺四乙酸、0.01-0.05质量/体积％吐温-20-80，且pH＝7.0-7.5。由此，该复 合缓冲液灭活病原体的效果好，显著提高样本提取、保存和纯化的稳定性，有效避免RNA 被核酸酶降解，不影响后续检测拭子样本保存液，此外，该复合缓冲液还无害化病毒表面的 蛋白使之不能与细胞受体结合，并能直接用于核酸样本的提取和纯化浓缩，适于临床和科研 的广泛使用。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的， 而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例 仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按 照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子 克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明 生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
实施例1
本实施例中，使用该本发明实施例的复合缓冲液稀释保存RNA病毒样本，具体如下：
1、实验样本：
本实施例保存的样本为FNV-SARS-CoV-2-abEN假病毒。通过化学合成的方法获得FNV-SARS-CoV-2部分ORF1a/b基因序列、E Gene和N Gene编码区序列，并克隆构建 至逆转录病毒载体，在293T细胞内进行假病毒的制备，所获得的假病毒为逆转病毒外膜包 裹部分RF1a/b基因序列、E Gene和N Gene编码区序列，具体序列如下：
ORF1 a/b序列：
ATCGTGTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCA AATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTAC AAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTAC ACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAA GGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGC TTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGC GGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCA CTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAA TGATAAAGTAGCTGGTTTTGCTAAATTCCTAAAAACTAAT TGTTGTCGCTTCCAAGAAAAGGACGAAGATGACAATTTAA TTGATTCTTACTTTGTAGTTAAGAGACACACTTTCTCTAA CTACCAACATGAAGAAACAATTTATAATTTACTTAAGGAT TGTCCAGCTGTTGCTAAACAT(SEQ ID NO：1)
E Gene：
ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAG TTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTT GCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGT GCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAAC CTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAA(SEQ ID NO：2)
N Gene ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCC GCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACTGGCAGTAA CCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGT CGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCA CCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCC TCGAGGACAAGGCGTTCCAATTAACACCAATAGCAGTCCA GATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAA TTCGTGGTGGTGACGGTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAG ATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGA CTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTG CAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGG CACCCGCAATCCTGCTAACAATGCTGCAATCGTGCTACAA CTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAG AAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTC ATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGC AGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATG GCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATT GAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAA CAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGG CTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGC ATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAA CAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGAC AAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATT TGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATT GGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACA CAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAA AGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATAC AAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGA AGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAA GAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTG GATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCCTAA(SEQ ID NO：3)
2、实验试剂：
该复合缓冲液是由异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二 硫苏糖醇(DTT)、异丙醇、Tween 20及RNase-free去离子水组成。复合缓冲液的配制方法如下：
取RNase-free的50ml离心管，加5ml，依次加如下组分：
Figure BDA0002418650080000071
对照保存液一：RNAwait(非冻型组织RNA保存液)(索莱宝公司提供)
对照保存液二：非冻型拭子病毒保存液(上海恪敏生物科技有限公司提供)
2、实验流程：
(a)复合缓冲液
(1)将500μl复合缓冲液分装至RNase-free的1.5ml离心管。
(2)在生物安全柜中将洁净的拭子浸入培养有转染了逆转录病毒载体的293T细胞的 上清，沾取包含有FNV-SARS-CoV-2-abEN假病毒的培养液。
(3)将拭子头浸入含500μl样本保存液的管中，尾部弃去，旋紧盖管。将样本密封，室温保存。
(b)对照保存液一
(1)将500μl RNA样本保存液分装至RNase-free的1.5ml离心管。
(2)将沾取了假病毒培养液的拭子头完全浸入含500μl样本保存液的管中，尾部弃去， 旋紧盖管。
(3)将样本密封，4℃保存过夜后，室温保存。
(c)对照保存液二：
(1)将500μl非冻型拭子病毒保存液分装至RNase-free的1.5ml离心管。
(2)将沾取了假病毒培养液的拭子头完全浸入含500μl样本保存液的管中，尾部弃去， 旋紧盖管。
(3)将样本密封，4℃保存。
4、实验结果：
与对照保存液一和对照保存液二相比，保存在本发明实施例的复合缓冲液中的RNA病 毒样本，室温7天RNA基因组保持较完整的状态，结果详见图1。
实施例2
本实施例中，对保存在实施例1的复合缓冲液中的RNA病毒样本进行病毒感染力检测， 具体如下：
1、实验样本：
实施例1中制备获得的FNV-SARS-CoV-2-abEN假病毒标准品(活性)
2、实验材料：
细胞基质：Vero细胞，
细胞培养液：MEM，含0.03％谷氨酰胺、0.17％碳酸氢钠和10％牛血清
病毒维持液：MEM，含0.03％谷氨酰胺、0.24％碳酸氢钠和5％牛血清
实施例1的复合缓冲液
固定液：0.1％甲醛
过氧化氢溶液：3％H2O2
FNV-SARS-CoV-2-abEN假病毒的单克隆抗体
辣根过氧化物酶标记的二抗：羊抗人IgG-HRP
显色剂：3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)
3、实验流程：
本实施例的所有操作均在生物安全柜中进行，具体如下：
(1)细胞培养：Vero细胞按1:2分种率接种96孔板，在5％CO2培养箱于37℃培养过夜，式细胞长成单层细胞。
(2)病毒感染、培养：用等体积的病毒维持液和实施例1的复合缓冲液稀释等量的FNV-SARS-CoV-2-abEN假病毒标准品，混匀，制作相同原始浓度的病毒悬液：复合缓冲液 稀释的病毒悬液(1)，病毒维持液稀释的病毒悬液(2)。将病毒悬液(1)和(2)用病毒维持 液按10倍系列分别稀释8个梯度，感染去培养液的微孔板细胞，每个稀释度感染6孔。每 孔0.1ml，摇匀后，置于5％CO2培养箱于37℃培养过夜。
(3)培养物固定：弃去96孔板的病毒维持液，用0.1％甲醛灭活固定培养物，0.1ml/孔，33℃灭活固定26小时。
(4)过氧化氢处理固定后的细胞：弃去细胞上清液，用1×PBST洗涤固定后的细 胞2次后，加3％H2O2，1ml/孔，室温避光孵育15分钟。
(5)酶联免疫检测：将FNV-SARS-CoV-2-abEN假病毒的单克隆抗体用病毒维持液按1:50稀释后，加入96孔板中，0.1ml/孔，37℃孵育60分钟；1×PBST洗涤5次， 加入HRP标记的二抗(羊抗人IgG-HRP)，37℃孵育360分钟；1×PBST洗涤5次， 加入AEC显色液，1ml/孔，37℃显色不少于10分钟。
4、结果判定与分析
AEC在HRP催化下生成红色不溶性物质沉积在病毒感染增殖位置，肉眼计每稀释度生 成红色斑点的孔数，实施例1的复合缓冲液稀释的病毒悬液(1)的病毒滴度测定结果如表1， 病毒维持液稀释的病毒悬液(2)的病毒滴度测定结果如表2
表1
10<sup>0</sup> 10<sup>-1</sup> 10<sup>-2</sup> 10<sup>-3</sup> 10<sup>-4</sup> 10<sup>-5</sup> 10<sup>-6</sup> 10<sup>-7</sup>
+ + － － － － － －
+ － － － － － － －
－ － － － － － － －
－ － － － － － － －
－ － － － － － － －
－ － － － － － － －
表2
10<sup>0</sup> 10<sup>-1</sup> 10<sup>-2</sup> 10<sup>-3</sup> 10<sup>-4</sup> 10<sup>-5</sup> 10<sup>-6</sup> 10<sup>-7</sup>
+ + + + + + + －
+ + + + + + + －
+ + + + + + － －
+ + + + + + － －
+ + + + + － － －
+ + + + + － － －
注：“+”表示有红褐色斑点产生，“－”表示无红褐色斑点产生。
实验数据用Karber法分析，计算用复合缓冲液和病毒维持液制作的假病毒悬液的病毒 滴度TCID50(50％tissue culture infective dose，组织细胞半数感染量)。TCID50指能引起半数 细胞病变或死亡(cytopathic effect,CPE)所需的病毒量，表示引起50％的接种细胞出现CPE的 病毒的稀释度。LgTCID50＝L+d(1/2-S)，L为每孔都有细胞病变(红褐色斑点)的病毒最大稀 释度的对数，d为组距，d＝log10稀释度，10倍系列稀释时d为1，S为阳性比率之和(从每 孔都有细胞病变的病毒最大稀释度始)。
该发明复合缓冲液保存的病毒悬液(1)的病毒滴度：
LgTCID50/0.1ml＝L+d(1/2-S)＝L+[0.5-(2+1)/6)]＝L，因未出现每孔都有细胞病变的病毒稀 释度，因此每孔都有细胞病变的病毒悬液(1)的稀释度小于100，也即引起50％接种细胞出现CPE的为浓缩液，那么L＞0为正数，即LgTCID50/0.1ml＞0，则病毒悬液(1)TCID50＞ 10-1*100/ml，即病毒悬液(1)引起50％接种细胞出现CPE的稀释度高于10-1，即稀释小于10 倍，甚至需要浓缩。
病毒维持液保存的病毒悬液(2)的病毒滴度：
LgTCID50/0.1ml＝L+d(1/2-S)＝-4+[0.5-(6+4+2)/6)]＝-5.5(由实验结果可见引起50％接种 细胞出现CPE的病毒悬液(2)的稀释度介于10-5和10-6之间)，TCID50/0.1ml＝10-5.5，则每ml 病毒悬液(2)TCID50＝10-1*10-5.5/ml，即病毒悬液(2)引起50％接种细胞出现CPE的的稀释度为 106.5倍。
病毒滴度TCID50结果表明，与病毒维持液保存的病毒样本活性相比，实施例1复合缓 冲液中的RNA病毒样本灭活率可达到99.99％。
实施例3
对保存在实施例1复合缓冲液中的RNA病毒样本进行提取纯化，具体如下：
1、实验样本：
实施例1中，室温保存了7天的分别保存在该发明实施例1复合缓冲液中、对照保存液 一和对照保存液二中的FNV-SARS-CoV-2-abEN假病毒样本。
2、实验试剂：
市售的美基核酸提取或纯化试剂(产品编号：IVD5412)进行样本提取纯化。试剂盒成 分MagBind Particles、Carrier RNA、Proteinase K、Protease Dissolve Buffer、Buffer MLB、 Buffer MW1、Buffer MW2和Nuclease Free Water。
3、实验流程：
该试剂盒可进行手工提取和机器提取，本实施例采用手工提取纯化方案，实验操作均在 生物安全柜中进行。
(1)向RNase-free的1.5ml离心管中，加入2μl协载RNA(1μg/μl)、20μl ProteinaseK(20mg/ml)、20μl MagBind Particles和450μl Buffer MLB(使用前颠倒混匀10～20次让磁 珠充分分散)。
(2)吸取200μl实施例1复合缓冲液中的假病毒样本溶液至含蛋白酶K的离心管中，涡旋混匀15秒。室温颠倒混匀10～15分钟。保存在该发明实施例1复合缓冲液中的样本可直接吸取进行提取，保存于对照保存液一和对照保存液二的假病毒样本需高速离心去除上清 保存液，加500μl TE混匀后吸取200μl进行提取。
(3)转移至磁力架上，静置5～10分钟吸附磁珠。吸弃所有溶液。
(4)加入500μl Buffer MW1(含无水乙醇)，涡旋混匀15秒。
(5)转移至磁力架上，静置2分钟吸附磁珠。小心吸弃所有溶液。
(6)加入500μl Buffer MW2(含无水乙醇)，涡旋混匀15秒。
(7)转移至磁力架上，静置2分钟吸附磁珠。小心吸弃所有溶液。
(8)重复第6-7步一次。
(9)短暂离心，收集管壁上的液滴，转移至磁力架上，小心吸弃所有溶液，空气干燥10分钟。
(10)加50μl RNase-free Water，涡旋打散磁珠。室温放置5～10分钟，其间轻轻振荡 1～2次加速溶解。
(11)转移至磁力架上，静置3分钟。转移上清溶液至新的1.5ml RNase-free的离心管 中。
(12)按上述步骤重复提取纯化实施例1中的对照保存液一和对照保存液二中的RNA 样本。
4、实验结果：
与对照保存液相比，室温7天保存在本发明实施例1的复合缓冲液中的RNA病毒样本， RNA基因组保持较完整的状态。通过新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(多重荧 光RT-PCR法)检测，保存在本发明实施例的复合缓冲液中的RNA病毒样本的Ct值较小，说明该发明实施例的复合缓冲液可提高RNA病毒样本检测的灵敏度。
假病毒样本 本发明的复合缓冲液 对照保存液一 对照保存液二
RT-PCR检测Ct值 30 38 40
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指 的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个 或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本 发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的 范围由权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 浙江安诺优达生物科技有限公司
安诺优达（义乌）医学检验有限公司
安诺优达生命科学研究院
<120> 适于冠状病毒提取、纯化和保存的复合缓冲液和试剂盒
<130> 2002
<141> 2020-03-20
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 501
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atcgtgttgt ctgtactgcc gttgccacat agatcatcca aatcctaaag gattttgtga 60
cttaaaaggt aagtatgtac aaatacctac aacttgtgct aatgaccctg tgggttttac 120
acttaaaaac acagtctgta ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatggct gtagttgtga 180
tcaactccgc gaacccatgc ttcagtcagc tgatgcacaa tcgtttttaa acgggtttgc 240
ggtgtaagtg cagcccgtct tacaccgtgc ggcacaggca ctagtactga tgtcgtatac 300
agggcttttg acatctacaa tgataaagta gctggttttg ctaaattcct aaaaactaat 360
tgttgtcgct tccaagaaaa ggacgaagat gacaatttaa ttgattctta ctttgtagtt 420
aagagacaca ctttctctaa ctaccaacat gaagaaacaa tttataattt acttaaggat 480
tgtccagctg ttgctaaaca t 501
<210> 2
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60
cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt 120
gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct 180
cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt cctgatcttc tggtctaa 228
<210> 3
<211> 1260
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60
tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120
cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180
aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240
gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300
atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360
cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660
ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840
caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900
tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960
ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020
gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080
aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140
gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200
gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

Claims (13)

1.一种复合缓冲液，其特征在于，包括：
2.05-2.4M变性剂、2-10体积％增溶剂、1-7mM有机还原剂、40-100mM两性离子缓冲液、1-6mM非离子螯合剂和0.01-0.05质量/体积％非离子型表面活性剂，且pH＝7.0-8.0。
2.根据权利要求1所述的复合缓冲液，其特征在于，所述变性剂为选自异硫氰酸胍和盐酸胍中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的复合缓冲液，其特征在于，所述增溶剂为选自异丙醇和乙醇中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的复合缓冲液，其特征在于，所述有机还原剂为选自二硫苏糖醇盐和三(2-羧乙基)膦盐中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的复合缓冲液，其特征在于，所述两性离子缓冲液为选自Tris缓冲液、MOPS缓冲液、PIPES缓冲液和HEPES缓冲液中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的复合缓冲液，其特征在于，所述非离子螯合剂为选自乙二胺四乙酸、柠檬酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸和次氮基三乙酸三钠盐一水合物中的至少一种，优选地，为乙二胺四乙酸。
7.根据权利要求1所述的复合缓冲液，其特征在于，所述非离子型表面活性剂为选自吐温-20-80、乙基苯基聚乙二醇、异辛醇聚氧乙烯聚氧丙烯醚和聚乙二醇辛基苯基醚中的至少一种，优选地，为吐温-20-80。
8.根据权利要求1所述的复合缓冲液，其特征在于，pH＝7.0-7.5。
9.根据权利要求1所述的复合缓冲液，其特征在于，包括：
2.05-2.3M异硫氰酸胍、4-8体积％异丙醇、3-6mM二硫苏糖醇、40-80mM Tris缓冲液、1-6mM乙二胺四乙酸和0.01-0.05质量/体积％吐温-20-80，且pH＝7.0-7.5。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-9任一项所述的复合缓冲液。
11.权利要求1-9任一项所述复合缓冲液用于核酸提取、纯化和保存的用途。
12.权利要求10所述的试剂盒用于核酸检测的用途。
13.权利要求10所述的试剂盒用于病原微生物核酸检测的用途，优选地，所述病原微生物为冠状病毒。
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