CN112176025A - 一种核酸保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种核酸保存液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核酸保存液及其制备方法和应用，属于生物制品技术领域。本发明公开的核酸保存液所用原料的成本较低，组分数量较少，制备方式简便、快速，在更准确控制添加物用量的同时降低了生产成本；该核酸保存液在0‑50℃运输条件下样本核酸可稳定保存15天，不影响后续样本DNA/RNA提取与检测实验，保存效果好；该核酸保存液在0‑50℃运输条件下可稳定保存2年，不影响后续样本DNA/RNA提取与检测实验，保存时间长。

Description

一种核酸保存液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，更具体的说是涉及一种核酸保存液及其制备方法和应用。
背景技术
核酸是由许多核苷酸合成的生物大分子化合物，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸根据化学组成不同，可分为核糖核酸(DNA)和脱氧核糖核酸(RNA)。
准确的检测核酸是分子生物学样品分析的一个重要方面，核酸检测的高成本和高专业性使得样本的获得和检测通常相分离，需要检测的样本大多需要经过短途或者长途的运输才能进入到检测流程。但作为生物遗传信息携带者，核酸的性能不稳定，在外界物理因素如温度、湿度、紫外线等；化学因素如PH值、水解反应、氧化反应等；生物因素如酶解和微生物侵染等容易造成核酸的降解变性，这就需要对样本的运输时间做严格限制，大大增加了运输过程中样品保存的困难度。
目前，保存样品的方式主要为样品采集后直接低温保存，这种方法有较大的局限性，一是低温保存成本较高，需要特殊设备如液氮罐等。二是将样本置于超低温长期保存，容易使核酸的状态和结构发生改变，导致检测结果不准确。基于此，有必要开发一种在运输条件下能够为样品提供稳定环境，防止细胞破裂，核酸降解的保存液，以消除对后续检验检测的不利影响。
因此，提供一种核酸保存液及其制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种核酸保存液及其制备方法和应用，该核酸保存液具有在常温运输条件下保持核酸稳定性的优点。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种核酸保存液，按重量百分比计，由以下成分组成：柠檬酸13％-35％，吐温200.50％-2.50％，EDTA二钠13％-40％，硫酸钠35％-70％，聚乙二醇辛基苯基醚0.50％-2.50％，余量为DEPC水。
进一步，一种核酸保存液，按重量百分比计，由以下成分组成：柠檬酸21％，吐温201.50％，EDTA二钠35.9％，硫酸钠40％，聚乙二醇辛基苯基醚1.50％，余量为DEPC水。
进一步，所述核酸保存液的pH为4.5-6。
进一步，一种核酸保存液的制备方法，具体步骤如下：
(1)按比重称量柠檬酸、吐温20、EDTA二钠、硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚，溶于DEPC水；
(2)将溶解的溶液用pH计调节pH至4.5-6；
(3)将调节pH后的溶液过0.22μM水系滤膜除菌，得核酸保存液。
进一步，一种核酸保存液的制备方法，还包括步骤(4)将所配制的核酸保存液无菌无酶分装至取样管，0-50℃用于短期存储、测试；如果长期储存存放于4℃。
进一步，所述的核酸保存液在保存和运输生物样本中的应用，保存和运输温度为0-50℃。
进一步，保存和运输温度为25℃。
进一步，所述生物样本为人和除人以外的哺乳动物的血液，尿液，粪便，痰液，唾液及咽喉拭子采集液。
进一步，所述的核酸保存液在保存和运输生物样本中的应用，用于保存冠状病毒核酸。
若试剂偏酸性，用NaOH调pH；若偏碱性，则用浓HCl调pH。
使用方法为：取新鲜样本，立即放入本发明核酸保存液中，4-25℃条件下保存即可。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种核酸保存液及其制备方法和应用，该核酸保存液所用原料的成本较低，组分数量较少，制备方式简便、快速，在更准确控制添加物用量的同时降低了生产成本；该核酸保存液在0-50℃运输条件下样本核酸可稳定保存15天，不影响后续样本DNA/RNA提取与检测实验，保存效果好；该核酸保存液在0-50℃运输条件下可稳定保存2年，不影响后续样本DNA/RNA提取与检测实验，保存时间长。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1的RNA电泳图；
其中，泳道1为样本不加保存液立即提取结果；泳道2-4为样本室温保存1天后提取结果；泳道5-7为样本室温保存3天后提取结果；泳道8-10为样本室温保存7天后提取结果；泳道11-13为样本室温保存14天后提取结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例所用人免疫细胞为从人外周血自行分离培养的人免疫细胞，冷冻保存；使用前活化培养。所用阳性质控购自中山大学达安基因股份有限公司；新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(DA0931)，批号：2020026，冷冻保存。
实施例1
取配方量的以下各组分加入到灭菌后的容器中：21％的柠檬酸、1.50％的吐温20、35.90％的EDTA二钠、40％的硫酸钠、1.50％的聚乙二醇辛基苯基醚；加入DEPC水使其溶解；将溶解的溶液用pH计调节pH(温度范围为18-25℃)，调至pH为5.0-5.5；将上述溶液过0.22μM水系滤膜除菌即得。
实施例2
取配方量的以下各组分加入到灭菌后的容器中：13％的柠檬酸、0.50％的吐温20、13％的EDTA二钠、35％的硫酸钠、0.50％的聚乙二醇辛基苯基醚；加入DEPC水使其溶解；将溶解的溶液用pH计调节pH(温度范围为18-25℃)，调至pH为4.5-4.8；将上述溶液过0.22μM水系滤膜除菌即得。
实施例3
取配方量的以下各组分加入到灭菌后的容器中：30％的柠檬酸、2.50％的吐温20、15％的EDTA二钠、45％的硫酸钠、2.50％的聚乙二醇辛基苯基醚；加入DEPC水使其溶解；将溶解的溶液用pH计调节pH(温度范围为18-25℃)，调至pH为5.7-6.0；将上述溶液过0.22μM水系滤膜除菌即得。
对实施例1-3制备得到的核酸保存液进行性能测试，按照如下方案进行：
(一)保存液性能测试
1.实验分别按照下列5种条件进行核酸保存和提取：
将107个人免疫细胞加入2mL生理盐水或者核酸保存液中。
(1)不加保存液立即提取：将细胞加入生理盐水后，立即进行RNA提取；
(2)放置1天后提取：将细胞加入核酸保存液后，25℃保存1天后进行RNA提取；
(3)放置3天后提取：将细胞加入核酸保存液后，25℃保存3天后进行RNA提取；
(4)放置7天后提取：将细胞加入核酸保存液后，25℃保存7天后进行RNA提取；
(5)放置14天后提取：将细胞加入核酸保存液后，25℃保存14天后进行RNA提取。
2.RNA提取采用广东南芯医疗科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂盒(病毒RNA快速提取试剂盒——柱提法)，具体方法如下：
(1)取200μL加入核酸保存液后的样品于1.5mL无核酸酶离心管中。
(2)加入560μL BufferVL工作液，10μL蛋白酶K(20mg/mL)，涡旋15s。
(3)室温(15-25℃)孵育10min；或者70℃孵育5min。
(4)短暂离心，以收集管壁上的液滴。
(5)加入560μL无水乙醇(96％-100％)，涡旋混匀15s，短暂离心。
(6)取630μL上述混合液于纯化柱中，8000rpm离心1min，弃滤液。
(7)重复步骤6，至混合液完全转移。
(8)加入500μL W1于纯化柱中，8000rpm离心1min，弃滤液。
(9)加入500μL W2于纯化柱中，12,000rpm离心3min，弃滤液。
(10)将纯化柱置于新的2mL无核酸酶Ep管中，12,000rpm离心1min。
(11)将纯化柱置于新的1.5mL无核酸酶Ep管中，打开盖子，室温静置5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(12)往吸附柱膜中间悬空加入50μL 65℃预热的BufferVE，室温静置1min。
(13)12,000rpm离心2min洗脱。
(14)进行RNA定量。
(15)进行qPCR定量(采用中山大学达安基因股份有限公司的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，N基因探针采用FAM标记，ORF1ab基因探针采用VIC标记，内标基因探针采用Cy5标记)。
(二)保存液稳定性测试
1.加速稳定性：将同一批次保存液分成5部分，分别置于4℃，16℃，25℃，37℃，45℃条件下1个月，分别往每管含有人免疫细胞的EP管中加入于每个温度放置了1天，3天，7天，14天和28天的实验液体2mL，并在25℃储存1天后取核酸进行检测。
2.实时稳定性：选择一定数量三个批次保存液保存在25℃干燥阴凉环境中。自生产日期起，放置到有效期结束后1个月，共25个月。分别把放置了1、2、3、6、9、12、18、24和25个月的2mL保存液加入人免疫细胞后于25℃放置一天后提取核酸进行检测。
3.温度影响：取正常保存条件下有效期内的同一批保存液在实验室温湿度环境下(温度为25±2℃，湿度为60±2％R.H)放置6小时后，置于40℃，90％R.H温湿度试验箱内放置72小时，根据产品的可接受破损限度观察产品的损坏情况，如果判定产品有破损，则没有通过试验；否则进入压力影响测试。
4.压力影响：取正常保存条件下有效期内的同一批保存液，置于压力机压板的中心位置，以0.5in/min(13mm/min)的速率均匀加压并使压力达到17.57in后(模拟海拔4267米的低气压)，保持压力1小时，根据产品的可接受破损限度观察产品的损坏情况，如果判定产品有破损，则没有通过试验；否则进入震荡试验。
5.震荡影响：取正常保存条件下有效期内的同一批保存液，在频率为1Hz，4Hz，100Hz和200Hz中选择随机震荡的方式，将产品正常置于震荡台上震荡30min，翻转放置(即顶面朝下)震荡10min，正面(或背面)朝下震荡10min，侧面朝下震荡10min，停止震荡后根据产品的可接受破损限度观察产品的损坏情况，如果判定产品有破损，则没有通过试验；否则进入跌落试验。
6.跌落影响：取正常保存条件下有效期内的同一批保存液，把样本置于32inches高度，不同角度跌落产品，根据产品的可接受破损限度观察产品的损坏情况，如果判定产品有破损，则没有通过试验。
利用实施例1制备得到的核酸保存液对2019新型冠状病毒阳性质控进行性能测 试，按照如下方案进行：
实验分别按照下列4种条件进行核酸保存和提取：
(1)不加保存液立即提取：将400μL阳性质控加入2mL生理盐水后，立即进行RNA提取；
(2)加保存液立即提取：将400μL阳性质控加入2mL核酸保存液后，25℃保存1天后进行RNA提取；
(3)放置3天后提取：将400μL阳性质控加入2mL核酸保存液后，25℃保存3天后进行RNA提取。
(4)放置7天后提取：将400μL阳性质控加入2mL核酸保存液后，25℃保存7天后进行RNA提取。
实施例1制备的核酸保存液性能测试结果
(1)人免疫细胞加到实施例1制备得到的核酸保存液在常温下保存1、3、7、14天后提取RNA后测定其纯度及浓度，试验重复3次，结果见表1。
表1 RNA浓度及纯度
Figure BDA0002720594730000071
(2)人免疫细胞加到实施例1制备得到的核酸保存液在常温下保存1、3、7、14天后提取RNA，琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
(3)人免疫细胞加到实施例1制备得到的核酸保存液在常温下保存1、3、7、14天后，提取RNA进行qPCR定量分析，试验重复3次，结果见表2。
表2 RNA qPCR结果Ct值
Figure BDA0002720594730000072
(4)加速稳定性结果见表3，具体为实施例1制备得到的核酸保存液在不同温度下放置后加入人免疫细胞后提取的RNA测得纯度、浓度及完整度。
表3加速稳定性结果
Figure BDA0002720594730000081
(5)3个批次的保存液实时稳定性结果见表4.1、表4.2、表4.3，具体为实施例1制备得到的核酸保存液在常温下保存1、2、3、6、9、12、18、24、25个月后加入人免疫细胞后提取的RNA测得纯度、浓度及完整度。
表4.1第一批次实时稳定性结果
Figure BDA0002720594730000082
Figure BDA0002720594730000091
表4.2第二批次实时稳定性结果
Figure BDA0002720594730000092
表4.3第二批次实时稳定性结果
Figure BDA0002720594730000093
(6)运输稳定性中温度影响结果见表5，具体为实施例1制备得到的核酸保存液在不同温度、不同温湿度下包装完整度。
表5温度影响结果表
Figure BDA0002720594730000094
(7)运输稳定性中压力影响结果见表6，具体为实施例1制备得到的核酸保存液在不同压力下包装完整度。
表6压力影响结果
Figure BDA0002720594730000101
(8)运输稳定性中震荡影响结果见表7，具体为实施例1制备得到的核酸保存液在不同频率下包装完整度。
表7震荡影响结果
Figure BDA0002720594730000102
(9)运输稳定性中跌落影响结果见表8，具体为实施例1制备得到的核酸保存液在不同方向下包装完整度。
表8跌落影响结果
Figure BDA0002720594730000103
(10)2019新型冠状病毒阳性质控加到实施例1制备得到的核酸保存液在常温下保存3、7天后提取RNA进行qPCR定量分析，试验重复3次，结果见表9。
表9新冠阳性质控病毒RNA qPCR结果Ct值
Figure BDA0002720594730000104
Figure BDA0002720594730000111
实施例2制备的核酸保存液性能测试结果
(1)人免疫细胞加到实施例2制备得到的核酸保存液在常温下保存1、3、7、14天后提取RNA后测定其纯度及浓度，试验重复3次，结果见表10。
表10 RNA浓度及纯度
Figure BDA0002720594730000112
(2)人免疫细胞加到实施例2制备得到的核酸保存液在常温下保存1、3、7、14天后，提取RNA进行qPCR定量分析，试验重复3次，结果见表11。
表11 RNA qPCR结果Ct值
Figure BDA0002720594730000113
Figure BDA0002720594730000121
(3)加速稳定性结果见表12，具体为实施例2制备得到的核酸保存液在不同温度下放置后加入人免疫细胞后提取的RNA测得纯度、浓度及完整度。
表12加速稳定性结果
Figure BDA0002720594730000122
(4)3个批次的保存液实时稳定性结果见表13.1、表13.2、表13.3，具体为实施例2制备得到的核酸保存液在常温下保存1、2、3、6、9、12、18、24、25个月后加入人免疫细胞后提取的RNA测得纯度、浓度及完整度。
表13.1第一批次实时稳定性结果
Figure BDA0002720594730000131
表13.2第二批次实时稳定性结果
Figure BDA0002720594730000132
表13.3第二批次实时稳定性结果
Figure BDA0002720594730000133
(5)运输稳定性中温度影响结果见表14，具体为实施例2制备得到的核酸保存液在不同温度、不同温湿度下包装完整度。
表14温度影响结果表
Figure BDA0002720594730000141
(6)运输稳定性中压力影响结果见表15，具体为实施例2制备得到的核酸保存液在不同压力下包装完整度。
表15压力影响结果
Figure BDA0002720594730000142
(7)运输稳定性中震荡影响结果见表16，具体为实施例2制备得到的核酸保存液在不同频率下包装完整度。
表16震荡影响结果
Figure BDA0002720594730000143
(8)运输稳定性中跌落影响结果见表17，具体为实施例2制备得到的核酸保存液在不同方向下包装完整度。
表17跌落影响结果
Figure BDA0002720594730000144
Figure BDA0002720594730000151
实施例3制备的核酸保存液性能测试结果
(1)人免疫细胞加到实施例3制备得到的核酸保存液在常温下保存1、3、7、14天后提取RNA后测定其纯度及浓度，试验重复3次，结果见表18。
表18RNA浓度及纯度
Figure BDA0002720594730000152
(2)人免疫细胞加到实施例3制备得到的核酸保存液在常温下保存1、3、7、14天后，提取RNA进行qPCR定量分析，试验重复3次，结果见表19。
表19 RNA qPCR结果Ct值
Figure BDA0002720594730000153
(3)加速稳定性结果见表20，具体为实施例3制备得到的核酸保存液在不同温度下放置后加入人免疫细胞后提取的RNA测得纯度、浓度及完整度。
表20加速稳定性结果
Figure BDA0002720594730000161
(4)3个批次的保存液实时稳定性结果见表21.1、表21.2、表21.3，具体为实施例3制备得到的核酸保存液在常温下保存1、2、3、6、9、12、18、24、25个月后加入人免疫细胞后提取的RNA测得纯度、浓度及完整度。
表21.1第一批次实时稳定性结果
Figure BDA0002720594730000162
Figure BDA0002720594730000171
表21.2第二批次实时稳定性结果
Figure BDA0002720594730000172
表21.3第二批次实时稳定性结果
Figure BDA0002720594730000173
(5)运输稳定性中温度影响结果见表22，具体为实施例3制备得到的核酸保存液在不同温度、不同温湿度下包装完整度。
表22温度影响结果表
Figure BDA0002720594730000174
(6)运输稳定性中压力影响结果见表23，具体为实施例3制备得到的核酸保存液在不同压力下包装完整度。
表23压力影响结果
Figure BDA0002720594730000181
(7)运输稳定性中震荡影响结果见表24，具体为实施例3制备得到的核酸保存液在不同频率下包装完整度。
表24震荡影响结果
Figure BDA0002720594730000182
(8)运输稳定性中跌落影响结果见表25，具体为实施例3制备得到的核酸保存液在不同方向下包装完整度。
表25跌落影响结果
Figure BDA0002720594730000183
从上述结果可知，在常温条件下，实施例1-3制备得到的核酸保存液能稳定保存样本核酸14天且保存液在有效期25个月内，各项性能指标均符合质量要求，经过不同温湿度、压力、震荡频率、跌落方向测试后，产品与包装无明显破损。实施例1制备得到的核酸保存液效果最优。
本发明无需保证样本中的细胞存活，只需保证经过保存后的组织样品中能提取出稳定、质量有保障的核酸即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种核酸保存液，其特征在于，按重量百分比计，由以下成分组成：柠檬酸13％-35％，吐温20 0.50％-2.50％，EDTA二钠13％-40％，硫酸钠35％-70％，聚乙二醇辛基苯基醚0.50％-2.50％，余量为DEPC水。
2.根据权利要求1所述的一种核酸保存液，其特征在于，按重量百分比计，由以下成分组成：柠檬酸21％，吐温20 1.50％，EDTA二钠35.9％，硫酸钠40％，聚乙二醇辛基苯基醚1.50％，余量为DEPC水。
3.根据权利要求1或2所述的一种核酸保存液，其特征在于，所述核酸保存液的pH为4.5-6。
4.根据权利要求3所述的一种核酸保存液的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)按比重称量柠檬酸、吐温20、EDTA二钠、硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚，溶于DEPC水；
(2)将溶解的溶液用pH计调节pH至4.5-6；
(3)将调节pH后的溶液过0.22μM水系滤膜除菌，得核酸保存液。
5.根据权利要求4所述的一种核酸保存液的制备方法，其特征在于，还包括步骤(4)将所配制的核酸保存液无菌无酶分装至取样管，0-50℃用于短期存储、测试；如果长期储存存放于4℃。
6.权利要求1-5任一项所述的核酸保存液在保存和运输生物样本中的应用，其特征在于，保存和运输温度为0-50℃。
7.根据权利要求6所述的核酸保存液在保存和运输生物样本中的应用，其特征在于，保存和运输温度为25℃。
8.根据权利要求6所述的核酸保存液在保存和运输生物样本中的应用，其特征在于，所述生物样本为人和除人以外的哺乳动物的血液，尿液，粪便，痰液，唾液及咽喉拭子采集液。
9.根据权利要求6所述的核酸保存液在保存和运输生物样本中的应用，其特征在于，用于保存冠状病毒核酸。
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