CN105596491A - 一种利用黑曲霉提高陈皮黄酮含量的方法 - Google Patents

一种利用黑曲霉提高陈皮黄酮含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高陈皮黄酮含量的方法，它是采用黑曲霉处理陈皮。本发明利用黑曲霉处理陈皮的方法，可以在短时间内显著提高陈皮中的总黄酮含量以及柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素四种黄酮的含量，能够促进陈皮抗氧化活性的提高，应用前景良好。

Description

一种利用黑曲霉提高陈皮黄酮含量的方法
技术领域
本发明涉及一种利用黑曲霉提高陈皮黄酮含量的方法。
背景技术
陈皮为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，始载于《神农本草经》，列为上品，具有理气健脾，燥湿化痰之功。为常用药食两用品，用途广、用量大。陈皮气香，微苦，主治脘腹胀满，食少吐泻，咳嗽痰多等症状。药理学研究表明，陈皮在心血管系统、免疫、抗氧化以及抗肿瘤等方面具有良好的药用价值。
陈皮的化学成分以黄酮类化合物为主，还含有挥发油、柠檬苦素类、生物碱类等物质。黄酮化合物具有抗氧化、消除自由基的能力，陈皮黄酮提取物具有良好的抗氧化活性。而且，许多研究发现，陈皮的黄酮类物质含量的增加可以提高其药效，如，研究表明广陈皮的总黄酮含量与其抗氧化活性成正比。
因此，提高陈皮的黄酮含量的意义显著，然而，目前均是通过长时间放置的方式来提高陈皮中黄酮含量，这也是陈皮“陈久者良”的重要原因，但是长时间放置需要的时间太长，成本太高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种快速提高陈皮的黄酮含量的方法。
本发明提高陈皮黄酮含量的方法，它是采用黑曲霉处理陈皮，具体地，它是采用黑曲霉的菌丝体和/或孢子处理陈皮。
优选地，所述方法的步骤如下：
(1)取陈皮，灭菌；
(2)加入黑曲霉的孢子悬液，共同培养，即可。
其中，步骤(1)中，所述灭菌的方法是紫外线灭菌。优选地，所述灭菌的方法是：对陈皮的两面分别紫外线照射30min；优选地，所述紫外线的强度不低于70μW/CM2，进一步优选为70～90μW/CM2；优选地，照射距离为25～30cm。
其中，步骤(2)中，所述黑曲霉是保藏编号为CGMCCNo.3.315的黑曲霉和/或保藏编号为CGMCCNo.3.6189的黑曲霉(Aspergillusniger)。
其中，步骤(2)中，所述孢子悬液的浓度为1×106～1×108CFU/mL。优选地，所述孢子悬液的浓度为1×107。
其中，步骤(2)中，共同培养的温度为25～35℃。优选地，共同培养的温度为30℃。
其中，步骤(2)中，共同培养的时间为不低于4天。优选地，共同培养的时间为4～8天。进一步优选地，共同培养的时间为5天。
其中，步骤(2)中，加入的黑曲霉的孢子悬液的量为：每15g陈皮中，加入的孢子悬浮液1mL。
本发明还提供了前述方法制备得到的陈皮。
本发明利用黑曲霉处理陈皮的方法，可以在短时间内显著提高陈皮中的总黄酮含量以及柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素四种黄酮的含量，能够促进陈皮抗氧化活性的提高，本发明方法制得的陈皮黄酮含量高，抗氧化活性强，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1陈皮污染真菌的形态及显微特征图，其中，b：朱黄青霉(Penicilliumminioluteum)；c：桔青霉(Penicilliumcitrinu)；d：黄曲霉(Aspergillusflavus)；e：黑曲霉(Aspergillusniger)；
图2基于ITS序列K2P遗传距离的聚类NJ树。a1～a8为普通青霉(P.commune)；b1为朱黄青霉(P.minioluteum)；c1～c8为桔青霉(P.citrinum)；d1～d2为黄曲霉(A.flavus)；e1～e6为黑曲霉(A.niger)；序列KC341973、KJ028000、KP940599、LN482513、JQ675308、KP296143、KR012904、KP216967、KP216956、KM277958、KP329704、KP329703、KP329702、JF910284、EU833222下载于NCBI数据库。
具体实施方式
实施例1本发明提高陈皮黄酮含量的方法
一、样品与材料
1样品信息
样品信息见表1。实验所用样品经成都中医药大学严铸云教授鉴定，为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。
表1实验样品信息
样品编号 品种名 拉丁名 来源 采集时间
CCPR1 大红袍 Citrus reticulata‘Dahongpao’ 四川金堂 2014.11
CCPR2 大红袍a Citrus reticulata Dahongpao’ 四川蒲江 2014.11
CCPR3 大红袍 Citrus reticulata Dahongpao’ 四川青白江 2014.11
CCPR4 大红袍 Citrus reticulata Dahongpao’ 四川眉山 2009.05
CCPR5 茶枝柑 Citrus reticulata‘Chachi’ 广东新会 -
CCPR6 大红袍 Citrus reticulata Dahongpao’ 四川蒲江 2013.11
CCPR7 大红袍 Citrus reticulate Dahongpao’ 四川青白江 2013.12
CCPR8 大红袍 Citrus reticulata Dahongpao’ 四川仁寿 2010.01
注:“-”表示采集时间不明确；“a”代表该样品用于真菌菌株反接实验.
2仪器与试剂
RetschMM400球磨仪(德国莱驰公司)；PTC200PCR仪(美国BIO-Rad公司)；GelDoxXR凝胶成像系统(美国BIO-Rad公司)；DYY-8C电泳仪(北京六一仪器厂)；BI3730XL测序仪(美国AppliedBio-systems公司)；KRQ-300P人工气候箱(重庆英博试验仪器)。植物DNA提取试剂盒(TiangenBiotechCo.，China)；2×TaqPCRMasterMix(TiangenBiotechCo.，China)；引物由上海生工(SangonCo.，China)合成。ShimadzuLC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；DM4000M显微镜(德国徕卡)，Agilent8453紫外可见分光光度计(安捷伦科技公司)；芸香柚皮苷对照品(批号MUST-12041206)，橙皮苷对照品(批号MUST-14081916)，川陈皮素对照品(批号MUST-14100814)，橘皮素对照品(批号MUST-14112410)，以上4种对照品均购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度＞98.0％。其他试剂均为分析纯。
二、陈皮中真菌的分离
1方法
1.1陈皮霉变样品的制备
取各批次样品约100.0g，放入无菌培养盒内，并置于人工气候箱中(T＝30℃、RH＝95％)。培养一定时间后(约5天)，将霉变后的陈皮样品进行分装。
1.2陈皮表面污染真菌的分离与纯化
取各批次未霉变样品样品各5.0g，置于无菌的50mL离心管中，加入30mL0.1％聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20)，剧烈振荡3min，再用塞有无菌棉花的一次性注射器过滤，收集滤液，5000r·min-1离心10min，弃上清，沉淀加入300μL无菌40％甘油重悬，再依次稀释成浓度为1×10-4的菌液，分别取100μL涂布于PDA板上(含氯霉素0.1g·L-1)，30℃恒温培养3d。观察培养基上生长出菌落后，用接种环转移到新的PDA(含氯霉素0.1g·L-1)平板上继续培养、转接，待纯化后转移到PDA斜面试管中保存，用于菌种鉴定。
1.3显微鉴别
在超净工作台中，于PDA培养基上斜插盖玻片，并用接种环接种相应纯化菌株，于培养箱中30℃培养3天。用刀片刮除盖玻片下端培养基，在载玻片中央滴1滴蒸馏水，然后加上盖玻片。置于显微镜下，先用低倍镜观察，再换高倍镜观察，并拍照。参考《真菌鉴定手册》中形态描述进行鉴定(魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科技出版社，1979)。
1.4分子鉴别
1.4.1样品DNA的提取、扩增和测序采用DNA提取试剂盒提取样品DNA；ITS序列扩增使用DNA条形码通用引物ITS1/ITS4。PCR反应条件及扩增程序同候典云等.ITS/ITS2条形码序列在花椒药材鉴定中的应用[J].中国中药杂志,2014,4(7)：534-537。PCR产物纯化后，双向测序。
1.4.2数据处理测序所得的峰图采用CodonCodeAlignerV5.0.2软(CodonCodeCo.，USA)对序列峰图进行校对拼接，去除引物区和低质量的序列。用Maga5.1软件构建邻接(Neighbor-joining，NJ)系统发育树，利用Bootstrap(BS)检验各分支的支持率。利用相似性搜索法进行鉴定分析。
2结果
2.1陈皮表面污染真菌的分离与显微鉴定
本实验对8批次陈皮样品进行了侵染真菌的分离和显微鉴别，结果分离到了25株菌株，分属于2属5种，均属于青霉属与曲霉属二类，分别为普通青霉、朱黄青霉、桔青霉、黄曲霉和黑曲霉，其中优势菌为黑曲霉，部分菌株的形态及其显微图见图1。
由表2可知，8批次陈皮样品均受到真菌的侵染，侵染率为100％，不同批次样品侵染真菌数为2～4株，桔青霉与普通青霉为所有样品共有侵染真菌，各批次样品受侵染真菌类型相似度较高。此外，有6批次样品侵染黑曲霉，2批次样品侵染黄曲霉，1批次样品侵染朱黄青霉。由实验结果可知，陈皮样品受真菌侵染类群较为固定，主要为青霉属与曲霉属二类，桔青霉与普通青霉为8批次样品共有侵染真菌，黑曲霉、朱黄青霉、黄曲霉为差异侵染真菌。
表2不同陈皮样品侵染真菌类群
注：“+”代表受到相应真菌侵染；“-”代表未受到相应真菌侵染。
2.2陈皮表面侵染真菌的分子鉴定
由于普通青霉、桔青霉、朱黄青霉在显微结构相似度较大，为了更准确鉴定青霉属真菌，本实验对各批次样品中分离出的25株真菌进行DNA提取，PCR扩增及测序实验。所有真菌菌株DNA提取、PCR扩增并测序成功，将测序结果进行Blast检索，结果表明，25株真菌均属于青霉属或曲霉属。同时构建邻(Neighbor-joining，NJ)系统发育树(图2)可以很好的区别各株真菌，普通青霉、桔青霉、黑曲霉、朱黄青霉与黄曲霉与相应NCBI下载序列聚为一支，很好的验证了性状与显微鉴别的准确性。
实验结果说明，陈皮中含有黑曲霉、朱黄青霉、黄曲霉、桔青霉与普通青霉5种真菌。
三、利用分离的黑曲霉处理陈皮
2.1霉变处理方法
取15克陈皮样品平铺于培养皿底部，紫外线灭菌30min，翻面，继续照射30min。将灭菌处理后的陈皮样品分为控制组与侵染组。
侵染组：每皿精密加入1mL前述步骤分离得到的黑曲霉的孢子悬浮液(孢子悬浮液中的孢子的浓度为1×107CFU/mL)，编号标记；控制组:精密加入1mL无菌水，编号标记。将两组样品均置于30℃恒温培养，培养5天。
每个样品3个平行。
2.2检测
对控制组与侵染组霉变前、霉变后样品进行4种黄酮类成分及总黄酮成分进行含量测定，测定方法如下：
2.2.1陈皮霉变前后4种黄酮类物质的含量测定
2.2.1.1色谱条件色谱条件如下：色谱柱为HypersilBDSC18(4.6×200mm,5μm)；流动相：0.05％磷酸水-乙腈，按以下梯度程序洗脱：时间：0～5min，乙睛：20％～25％；时间：5～10min，乙睛：25％～30％；时间：10～20min，乙睛：30％～50％；时间：20～30min，乙睛：50％～60％；时间：30～35min，乙睛：60％～90％；时间：35～40min，乙睛：90％～100％；柱温：30℃；流速：0.7mL·min-1；检测波长：283nm及335nm；进样量：5.0μL。
2.2.1.2供试品溶液的制备取霉变前后陈皮样品粉末(粗粉)约0.2g，精密称定，加入甲醇25mL，称重，在75℃下水浴回流1h，冷却，再次称重，用溶剂补足重量，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
2.2.1.3对照品溶液的制备称取芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素适量，精密称定，加入甲醇定容至25mL容量瓶中配制成对照品浓度为芸香柚皮苷0.0544mg·mL-1、橙皮苷0.1348mg·mL-1、川陈皮素0.1128mg·mL-1和橘皮素0.0540mg·mL-1的混合对照品溶液。
2.2.1.4样品中4种黄酮类物质的含量测定取霉变前后陈皮样品粉末(粗粉)约0.2g，精密称定，按供试品溶液方法制备样品溶液，按选定的色谱条件测定各批次陈皮药材中4种黄酮类成分的含量，每批次样品平行测定3次，测定值取平均值。
2.2.1陈皮的总黄酮含量的测定
2.2.1.1对照品溶液的制备取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇定容至10mL容量瓶中配成浓度为0.36mg·mL-1的橙皮苷对照品贮备液。
2.2.1.2供试品溶液的制备取霉变前后陈皮样品粉末(粗粉)约0.2g，精密称定，加入甲醇25mL，称重，在75℃下水浴回流1h，冷却，再次称重，用溶剂补重，过滤，即得供试品溶液。
2.2.1.3标准曲线的绘制精密量取橙皮苷对照品溶液0.25，0.50，1.0，1.2，1.5，2.0mL，置于25mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，以橙皮苷对照品浓度为横坐标(X)，吸光度值为纵坐标(Y)，作线性回归，得回归方程为Y＝0.0297X+0.0257，R2＝0.9996。
2.2.1.4样品中总黄酮的含量测定取陈皮样品粉末(粗粉)约0.2g，精密称定，按供试品溶液方法制备样品溶液，精密量取0.5mL置于25mL容量瓶中加甲醇稀释至刻度，于283nm下测定吸光度，每批次样品平行测定3次，测定值取平均值，计算各批次陈皮药材中总黄酮含量。
统计方法：spss软件，t检验分析。
2.3检测结果
检测结果如表3所示：
表3对陈皮中黄酮类成分含量影响
注：“-”代表未霉变，“+”代表发生霉变。
由表3可以看出，空白组陈皮样品中4种黄酮总量及总黄酮均未发生变化；而采用黑曲霉处理后，陈皮样品的总黄酮含量以及柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素四种黄酮含量均显著提高。
试验结果说明，本发明用黑曲霉处理陈皮的方法可以有效提高陈皮的总黄酮含量以及柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素四种黄酮含量。
实施例2本发明提高陈皮黄酮含量的方法(黑曲霉)
1样品与材料
1.1陈皮
大红Citrusreticulata
CCPR2袍aDahongpao’四川蒲江2014.11
样品经成都中医药大学严铸云教授鉴定，为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。
1.2菌株
黑曲霉CGMCCNo.3.315、黑曲霉CGMCCNo.3.6189，均来自CGMCC(中国普通微生物菌种保藏管理中心)。
2、霉变处理方法
灭菌：取15克陈皮样品平铺于培养皿底部，紫外线(所述紫外线的强度为90μW/CM2；照射距离为25～30cm)灭菌30min，翻面，继续照射30min。
将灭菌处理后的陈皮样品分为控制组与侵染组：侵染组1：每皿加入1mL黑曲霉CGMCCNo.3.315的孢子悬浮液(孢子悬浮液中的孢子的浓度为个1×107CFU/mL)，编号标记；侵染组2：每皿加入1mL黑曲霉CGMCCNo.3.6189的孢子悬浮液(孢子悬浮液中的孢子的浓度为个1×107CFU/mL)，编号标记；控制组：加入1mL无菌水，编号标记。
将样品置于30℃恒温培养，同时培养5天。每个样品3个平行。
3样品的含量测定
分别按照实施例1第三项中2.2节的方法对控制组与侵染组霉变前、霉变后样品进行4种黄酮类成分及总黄酮成分进行含量测定。
统计方法：spss软件，t检验分析。
4、检测结果
检测结果如表4所示：
表4对陈皮中黄酮类成分含量影响
注：″-″代表未霉变，″+″代表发生霉变。
由表4可以看出，空白组陈皮样品中4种黄酮总量及总黄酮均未发生变化；而采用两种黑曲霉处理后，陈皮样品的总黄酮含量以及柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素四种黄酮含量均显著提高。
试验结果说明，本发明用黑曲霉处理陈皮的方法可以有效提高陈皮的总黄酮含量以及柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素四种黄酮含量。
实施例3本发明提高陈皮黄酮含量的方法
1样品与材料
1.1陈皮
大红Citrusreticulata
CCPR2袍aDahongpao’四川蒲江2014.11
样品经成都中医药大学严铸云教授鉴定，为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。
1.2菌株
黑曲霉CGMCCNo.3.315、黑曲霉CGMCCNo.3.6189，均来自CGMCC(中国普通微生物菌种保藏管理中心)。
2、霉变处理方法
灭菌：取15克陈皮样品平铺于培养皿底部，紫外线(所述紫外线的强度为70μW/CM2；照射距离为25～30cm)灭菌30min，翻面，继续照射30min。
将灭菌处理后的陈皮样品分为控制组与侵染组：侵染组1：每皿加入1mL黑曲霉CGMCCNo.3.315的孢子悬浮液(孢子悬浮液中的孢子的浓度为个1×106CFU/mL)，编号标记；侵染组2：每皿加入1mL黑曲霉CGMCCNo.3.6189的孢子悬浮液(孢子悬浮液中的孢子的浓度为个1×106CFU/mL)，编号标记；控制组：加入1mL无菌水，编号标记。
将样品置于35℃恒温培养，同时培养4天。每个样品3个平行。
3样品的含量测定
分别按照实施例1第三项中2.2节的方法对控制组与侵染组霉变前、霉变后样品进行4种黄酮类成分及总黄酮成分进行含量测定。
统计方法：spss软件，t检验分析。
4、检测结果
检测结果如表5所示：
注：″-″代表未霉变，″+″代表发生霉变。
由表5可以看出，空白组陈皮样品中4种黄酮总量及总黄酮均未发生变化；而采用两种黑曲霉处理后，陈皮样品的总黄酮含量以及柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素四种黄酮含量均显著提高。
试验结果说明，本发明用黑曲霉处理陈皮的方法可以有效提高陈皮的总黄酮含量以及柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素四种黄酮含量。
实施例4本发明提高陈皮黄酮含量的方法
1样品与材料
1.1陈皮
CCPR2大红Citrusreticulata四川蒲江2014.11
袍aDahongpao’
样品经成都中医药大学严铸云教授鉴定，为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。
1.2菌株
黑曲霉CGMCCNo.3.315、黑曲霉CGMCCNo.3.6189，均来自CGMCC(中国普通微生物菌种保藏管理中心)。
2、霉变处理方法
灭菌：取15克陈皮样品平铺于培养皿底部，紫外线(所述紫外线的强度为90μW/CM2；照射距离为25～30cm)灭菌30min，翻面，继续照射30min。
将灭菌处理后的陈皮样品分为控制组与侵染组：侵染组1：每皿加入1mL黑曲霉CGMCCNo.3.315的孢子悬浮液(孢子悬浮液中的孢子的浓度为个1×108CFU/mL)，编号标记；侵染组2：每皿加入1mL黑曲霉CGMCCNo.3.6189的孢子悬浮液(孢子悬浮液中的孢子的浓度为个1×108CFU/mL)，编号标记；控制组：加入1mL无菌水，编号标记。
将样品置于25℃恒温培养，同时培养8天。每个样品3个平行。
3样品的含量测定
分别按照实施例1第三项中2.2节的方法对控制组与侵染组霉变前、霉变后样品进行4种黄酮类成分及总黄酮成分进行含量测定。
统计方法：spss软件，t检验分析。
4、检测结果
检测结果如表6所示：
注：″-″代表未霉变，″+″代表发生霉变。
由表6可以看出，空白组陈皮样品中4种黄酮总量及总黄酮均未发生变化；而采用两种黑曲霉处理后，陈皮样品的总黄酮含量以及柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素四种黄酮含量均显著提高。
试验结果说明，本发明用黑曲霉处理陈皮的方法可以有效提高陈皮的总黄酮含量以及柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素四种黄酮含量。
综上，本发明利用黑曲霉处理陈皮的方法，可以在短时间内显著提高陈皮中的总黄酮含量以及柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素四种黄酮的含量，能够促进陈皮抗氧化活性的提高，应用前景良好。

Claims (10)

1.一种提高陈皮黄酮含量的方法，其特征在于：它是采用黑曲霉的菌丝体和/或孢子处理陈皮。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤如下：
(1)取陈皮，灭菌；
(2)加入黑曲霉的孢子悬液，共同培养，即可。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述灭菌的方法是紫外线灭菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述灭菌的方法是紫外线灭菌；优选地，紫外线灭菌的方法是：对陈皮的两面分别紫外线照射30min；紫外线的强度不低于70μW/CM2，进一步优选为70～90μW/CM2；紫外线照射的照射距离为25～30cm。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述黑曲霉是保藏编号为CGMCCNo.3.315的黑曲霉和/或保藏编号为CGMCCNo.3.6189的黑曲霉。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述孢子悬液的浓度为1×106～1×108CFU/mL；优选地，所述孢子悬液的浓度为1×107CFU/mL。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，共同培养的温度为25～35℃；优选地，所述共同培养的温度为30℃。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，共同培养的时间为不低于4天；优选地，共同培养的时间为4～8天；进一步优选地，共同培养的时间为5天。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，加入的黑曲霉孢子悬液的量为：每15g陈皮中，加入的孢子悬液1mL。
10.权利要求1～9任意一项所述的方法制备得到的陈皮。
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