CN111334503A - 一种核酸保存液 - Google Patents

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殷剑峰
王春香
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA

Abstract

本发明提供了一种核酸保存液，由核酸酶抑制剂、蛋白变性剂、稳定剂、抑菌剂和Tricine缓冲液组成，其中核酸酶抑制剂浓度为5‑20mg/ml、蛋白变性剂浓度为20‑80mg/ml，稳定剂浓度为30‑90mg/ml，抑菌剂浓度为100‑500mg/ml，Tricine缓冲液的浓度为20‑120mM，本发明的有益效果：本发明的提供的核酸保存液可以在常温下有效防止核酸的降解，为核酸提供稳定的环境，延长核酸的保存时间，能够保证采集、运输、检测的安全性，同时能够灭活病原微生物，具有制备成本低、性能稳定和易保存等优点。

Description

一种核酸保存液
技术领域
本发明涉及核酸技术领域，具体是一种核酸保存液。
背景技术
呼吸道感染（Respiratory tract infection，RTI）是人类最常见的一类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发生，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道疾病是由细菌、病毒和其他的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。临床上常见的呼吸道病原体包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道感染肠道病毒（肠道病毒/鼻病毒）、肺炎支原体、肺炎衣原体、冠状病毒、博卡病毒、嗜肺军团菌等。
目前，检测呼吸道病原体的核酸检测方法主要包扩基因芯片法、核酸等温扩增法和实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。基于上述方法已研发出了多种呼吸道病原体基因检测试剂盒，但是目前市面上并没有经济、有效、稳定和多种呼吸道病原体基因检测试剂盒的质控品销售，且现有的核酸质控品类产品多具有不稳定、易降解和不易保存等缺点，而质控品又是衡量和评估一款试剂盒检测准确性和稳定性等性能的重要方法和质量指标。因此，急需提供一种可稳定保存的核酸质控品。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种核酸保存液，具体技术方案如下：
一种核酸保存液，由核酸酶抑制剂、蛋白变性剂、稳定剂、抑菌剂和Tricine缓冲液组成，其中核酸酶抑制剂浓度为5-20mg/ml、蛋白变性剂浓度为20-80mg/ml，稳定剂浓度为30-90mg/ml，抑菌剂浓度为100-500mg/ml，Tricine缓冲液的浓度为20-120mM。
作为进一步的改进，其特征在于：所述核酸酶抑制剂为EDTA、CDTA、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉中的一种或多种。
作为进一步的改进，其特征在于：所述蛋白变性剂为SDS、胍盐、尿素、DTT中的一种或多种。
作为进一步的改进，其特征在于：所述稳定剂为甘氨酸、甘露糖、乙酸钠中的一种或多种。
作为进一步的改进，其特征在于：所述抑菌剂为乙醇或山梨酸钾。
本发明的有益效果：本发明的提供的核酸保存液可以在常温下有效防止核酸的降解，为核酸提供稳定的环境，延长核酸的保存时间，能够保证采集、运输、检测的安全性，同时能够灭活病原微生物，具有制备成本低、性能稳定和易保存等优点。核酸主要包括唾液核酸、口腔脱落细胞核酸、宫颈细胞核酸、宫颈病原微生物核酸、人呼吸道病原体的核酸等。
附图说明
图1-3为实施例4中核酸的Ct-d线条图。
图4为实施例4中鸡胚的病变结果图。
图5为实施例4中尿囊液病毒检测结果图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合附图和实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对保护范围构成限定。
实施例1
一种核酸保存液，包括5mg/ml核酸酶抑制剂、40mg/ml蛋白变性剂、50mg/ml稳定剂、100mg/ml抑菌剂、80mM Tricine盐缓冲液。其中，核酸酶抑制剂为EDTA、CDTA、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉中的一种或多种，蛋白变性剂为SDS、胍盐、尿素、DTT中的一种或多种，稳定剂为甘氨酸、甘露糖、乙酸钠中的一种或多种，抑菌剂为乙醇或山梨酸钾。
实施例2
一种核酸保存液，包括10mg/ml核酸酶抑制剂、60mg/ml蛋白变性剂、60mg/ml稳定剂、200mg/ml抑菌剂、80mM Tricine盐缓冲液。其中，核酸酶抑制剂为EDTA、CDTA、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉中的一种或多种，蛋白变性剂为SDS、胍盐、尿素、DTT中的一种或多种，稳定剂为甘氨酸、甘露糖、乙酸钠中的一种或多种，抑菌剂为乙醇或山梨酸钾。
实施例3
一种核酸保存液，包括20mg/ml核酸酶抑制剂、80mg/ml蛋白变性剂、80mg/ml稳定剂、200mg/ml抑菌剂、100mM Tricine盐缓冲液。其中，核酸酶抑制剂为EDTA、CDTA、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉中的一种或多种，蛋白变性剂为SDS、胍盐、尿素、DTT中的一种或多种，稳定剂为甘氨酸、甘露糖、乙酸钠中的一种或多种，抑菌剂为乙醇或山梨酸钾。
实施例4
核酸放入上述三个实施例对应的三种保存液中，进行观察。
采用鸡传染性支气管炎病毒（IBV），该病毒与新型冠状病毒（SARS-CoV-2）同为套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属成员，两者基因组长度相近、病毒外壳的蛋白组成和结构也类似。安全性方面，IBV 是弱毒株，只能感染鸡，对人等其他物种无感染能力。
实验方法
样品制备
（1）准备实施例1-3的保存液，分别加入20μl IBV（鸡传染性支气管炎病毒），上下颠倒混匀。
（2）分别置于37℃，常温，-20℃保存，每天取样进行检测，见表1。
表1
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE002AA
提取效果检测
一、检测方法（使用康为世纪CW3023试剂盒）
（1）取1.5 ml离心管（自备），加入20μl Proteinase K，加入200 μl样本，200 μlBuffer RLT， 300 μl 异丙醇，涡旋震荡5 s后，置于室温，1200 rpm的恒温混匀仪震荡10min。
（2）将步骤（1）所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中。12,000 rpm （~13,400xg）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（3）向吸附柱中加入500 μl Buffer PGWT，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（4）向吸附柱中加入500 μl Buffer GWT2，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中。
（5）12,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。
（6）将吸附柱置于室温2分钟，晾干。
将吸附柱置于新的收集管（RNase-Free Centrifuge Tube）中，向吸附柱膜的中间部位悬空加入30 μl RNase-Free Water，室温放置2分钟，12,000 rpm离心1 min， 收集核酸溶液。
实时荧光定量检测（使用康为世纪CW2207试剂盒）
（1）引物和探针序列，见表2
表2
引物和探针 序列5’—3’
IBV-F GCTTTTGAGCCTAGCGTT
IBV-R GCCATGTTGTCACTGTCTATTG
IBV-P CACCACCAGAACCTGTCACCTC
（2）反应体系，见表3
表3
组成 体积
2×GoldStar Probe OneStep Buffer 12.5µl
Forward Primer（10µM） 0.5µl
Reverse Primer（10µM） 0.5µl
Probe（10 µM） 0.5µl
GoldStar Probe OneStep EnzymeMix 1µl
水 5µl
上述提取产物 5µl
（3）实验条件，见表4
表4
Figure RE-436703DEST_PATH_IMAGE003
结果：分别见表5-7
表5
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE005A
根据以上数据描绘成图1。
表6
Figure RE-947319DEST_PATH_IMAGE006
根据以上数据描绘成图2。
表7
Figure RE-8947DEST_PATH_IMAGE007
根据以上数据描绘成图3。
根据以上三个表和对应的图，可以看出，由于实施例1-3中的保存液保存的核酸的Ct值与0天时的Ct值差别不大，即说明核酸基本没有降解，可以在一定时间内平稳保存。
灭活能力检测
1.1 材料
1.1.1 SPF鸡胚 购自济南斯帕法斯，并自行孵化至10日龄。
1.1.2鸡传染性支气管炎病毒 IBV。
1.1.3 稀释液 生理盐水（0.9% NaCl）。
1.1.4 配方一样品、配方二样品、配方三样品
1.1.5 RNA提取试剂盒（使用康为世纪CW3023试剂盒）
1.2 方法
1.2.1 初步研究不同灭活保存液灭活效果
将制备好的鸡传染性支气管炎病毒QXL87株种毒添加至灭活液中，按1（病毒原液）：10（灭活液）比例，置室温18-26℃灭活45min；将灭活好的病毒液接种SPF鸡胚进行灭活检验，同时对收获尿囊液进行鸡传染性支气管炎病毒核酸检测，参照GB/T 23197-2008 鸡传染性支气管炎诊断技术，使用康为世纪RNA提取试剂盒提取RNB，并使用一步法RTqPCR进行病毒检测。具体见表8。
表8
Figure DEST_PATH_IMAGE012
1.2.2 验证研究保存液灭活效果
根据1.2.1研究结果，选择合适的灭活保存液对病毒进行灭活，按兽药典要求进行灭活检验。将灭活好样品按尿囊腔接种方式接种10日龄SPF鸡胚，每个样品接种10枚鸡胚，0.1mL/枚，置于37℃培养箱中培养144 h，弃去24 h死亡的鸡胚，观察记录24-144 h鸡胚死亡情况和接种后有病变的活胚数的数量。观察鸡胚病变，同时收获尿囊液进行PCR检测。
实验结果：鸡胚病变结果：见图4，从图的左至右分别为组1-7，其中组4样本病变。
取尿囊液病毒检测结果见图5，结果见表9。
表9
组别 组1 组2 组3 组4 组5 组6 组7
Ct值 Undetermined Undetermined Undetermined 23.01 Undetermined Undetermined Undetermined
根据以上实验数据，得知，用实例1、2、3中的保存液接种鸡胚后，组5、6、7显示对鸡胚生长无抑制，加入病毒后，实例1、2、3中的保存液进行接种之后，组1、2、3显示鸡胚生长正常，而组4加入病毒，仅用生理盐水，鸡胚病变。说明实例1、2、3中的保存液能够灭活病毒。

Claims (5)

1.一种核酸保存液，其特征在于：由核酸酶抑制剂、蛋白变性剂、稳定剂、抑菌剂和Tricine缓冲液组成，其中核酸酶抑制剂浓度为5-20mg/ml、蛋白变性剂浓度为20-80mg/ml，稳定剂浓度为30-90mg/ml，抑菌剂浓度为100-500mg/ml，Tricine缓冲液的浓度为20-120mM。
2.根据权利要求1所述的一种核酸保存液，其特征在于：所述核酸酶抑制剂为EDTA、CDTA、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种核酸保存液，其特征在于：所述蛋白变性剂为SDS、胍盐、尿素、DTT中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种核酸保存液，其特征在于：所述稳定剂为甘氨酸、甘露糖、乙酸钠中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种核酸保存液，其特征在于：所述抑菌剂为乙醇或山梨酸钾。
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