CN112501253A - 一种具有保存能力的病毒保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有保存能力的病毒保存液，病毒保存液包括如下组分：硫酸镁0.1~0.9g、氯化钙2.0~3.6g、氯化钾0.7~1.5g、氯化钠6.0~10.0g、D‑葡萄糖0.5~2.5g、磷酸二氢钾0.01~0.23g、十二水合磷酸氢二钠0.05~0.15g、牛血清白蛋白0.5~1.5g、双抗3.0~8.0mL、甘油50~90mL、苯酚红5.0~7.0mg、消泡剂0.1~0.3mL、L‑谷氨酸0.28~2.95g、HEPES‑Na 2.0~6.0g；本发明的病毒样本保存液，安全无毒，使用简单，可4℃运输保存病毒样本长达3天，可在室温情况下稳定保存病毒样本2天，有高效保存病毒的能力，并且实现了在较宽的温度范围内维持病毒的活性，降低病毒分解速度，提升病毒分离的阳性率。该保存液能保持病毒样本的原始性，利于对病毒样本的全面分析研究，适用于流行病毒样本采集，具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及抗菌防腐领域，具体涉及一种具有保存能力的病毒保存液及其制备方法。
背景技术
病毒是一种没有细胞结构的特殊生物，它们的结构非常简单，由蛋白质外壳和内部的遗传物质组成，遗传物质为DNA或RNA，病毒体型极其微小，需要在活的宿主细胞中才能得以复制繁殖。病毒可感染人、动物、植物、细菌和真菌，可引起宿主生病，尤其是呼吸道传染的病毒例如SARS、甲型H1N1及冠状病毒等，传染性强，对人们的健康造成极大危害。
为了确定是否被病毒感染，通常需要取样来进行分析测定，取样后短时间内保持病毒的活性，既可用于病毒的分子生物学检测，又可用于病毒的分离培养。
现在通常是通过病毒保存液对所采集病毒样本进行保护，在使用过程中，病毒保存液中会滋生细菌和真菌，细菌和真菌的滋生会导致病毒保存液中的PH值下降，当pH值小于7.4时，病毒稳定性下降，病毒的分解速度加快，使得病毒难以长时间保存。为了延长病毒样本的保存时间，通常采用在低温下进行保存，增加了成本。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种具有保存能力的病毒保存液，本病毒保存液可同时满足样本收集、样本短时间保存及样本运输需求，且可在较宽的温度范围内维持病毒的活性，降低病毒分解速度，提升病毒分离的阳性率。
为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种具有保存能力的病毒保存液，病毒保存液包括如下组分：
硫酸镁0.1~0.9g、氯化钙2.0~3.6g、氯化钾0.7~1.5g、氯化钠6.0~10.0g、D-葡萄糖0.5~2.5g、磷酸二氢钾0.01~0.23g、十二水合磷酸氢二钠0.05~0.15g、牛血清白蛋白0.5~1.5g、双抗3.0~8.0mL、甘油50~90mL、苯酚红5.0~7.0mg、消泡剂0.1~0.3mL、L-谷氨酸0.28~2.95g、HEPES-Na 2.0~6.0g。
作为一种优化方案，所述病毒保存液各组分为：
硫酸镁0.1g、氯化钙2.0g、氯化钾0.7g、氯化钠6.0g、D-葡萄糖0.5g、磷酸二氢钾0.01g、十二水合磷酸氢二钠0.05g、牛血清白蛋白0.5g、双抗3.0mL、甘油50mL、苯酚红5.0mg、消泡剂0.1mL、L-谷氨酸0.28g、HEPES-Na 2.0g。
作为一种优化方案，所述病毒保存液各组分为：
硫酸镁0.9g、氯化钙3.6g、氯化钾1.5g、氯化钠10.0g、D-葡萄糖2.5g、磷酸二氢钾0.23g、十二水合磷酸氢二钠0.15g、牛血清白蛋白1.5g、双抗8.0mL、甘油90mL、苯酚红7.0mg、消泡剂0.3mL、L-谷氨酸2.95g、HEPES-Na 6.0g。
作为一种优化方案，所述病毒保存液各组分为：
硫酸镁0.5g、氯化钙2.8g、氯化钾1.1g、氯化钠8.0g、D-葡萄糖1.5g、磷酸二氢钾0.12g、十二水合磷酸氢二钠0.10g、牛血清白蛋白1.0g、双抗5.5mL、甘油70mL、苯酚红6.0mg、消泡剂0.2mL、L-谷氨酸1.62g、HEPES-Na 4.0g。
作为一种优化方案，所述双抗包括青霉素和链霉素，每毫升双抗包含10000单位青霉素和 10000 µg链霉素。
一种具有保存能力的病毒保存液的制备方法，将硫酸镁0.1~0.9g、氯化钙2.0~3.6g、氯化钾0.7~1.5g、氯化钠6.0~10.0g、D-葡萄糖0.5~2.5g、磷酸二氢钾0.01~0.23g、十二水合磷酸氢二钠0.05~0.15g、牛血清白蛋白0.5~1.5g、双抗3.0~8.0mL、甘油50~90mL、苯酚红5.0~7.0mg、消泡剂0.1~0.3mL、L-谷氨酸0.28~2.95g、HEPES-Na 2.0~6.0g混合均匀，加入少量去离子水将试剂溶解，再用大量去离子水定容至1000mL，摇匀，调节保存液pH值为7.2~7.8。
本发明采取以上技术方案，具有以下优点：
（1）配方中添加了L-谷氨酸，作为营养增补剂可防止病毒老化；配方中添加了牛血清白蛋白、抗生素，这些成分可以稳定病毒形态，所以本发明提供的保存液能够较大程度的保持病毒形态的完整性，可以提高病毒提取率。
（2）配方中添加的抗生素可以有效的抑制细菌和真菌的生长，避免细菌和真菌等微生物对病毒形态的破坏，延长了本病毒保存液对病毒的保存时间。
（3）配方中加入苯酚红作为指示剂，用来指示病毒的保存效果的变化，有效对病毒的保存进行监控。
（4）本发明的病毒样本保存液，安全无毒，使用简单，可4℃运输保存病毒样本长达3天，可在室温情况下稳定保存病毒样本2天，有高效保存病毒的能力，并且实现了在较宽的温度范围内维持病毒的活性，降低病毒分解速度，提升病毒分离的阳性率。该保存液能保持病毒样本的原始性，利于对病毒样本的全面分析研究，适用于流行病毒样本采集，具有很好的应用价值。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一种具有保存能力的病毒保存液，所述病毒保存液包括如下组分：
硫酸镁0.1g、氯化钙2.0g、氯化钾0.7g、氯化钠6.0g、D-葡萄糖0.5g、磷酸二氢钾0.01g、十二水合磷酸氢二钠0.05g、牛血清白蛋白0.5g、双抗3.0mL、甘油50mL、苯酚红5.0mg、消泡剂0.1mL、L-谷氨酸0.28g、HEPES-Na 2.0g。
所述双抗包括青霉素和链霉素，每毫升双抗包含 10000 单位青霉素（碱）和10000 µg 链霉素（碱）。
实施例2：一种具有保存能力的病毒保存液，所述病毒保存液包括如下组分：
硫酸镁0.9g、氯化钙3.6g、氯化钾1.5g、氯化钠10.0g、D-葡萄糖2.5g、磷酸二氢钾0.23g、十二水合磷酸氢二钠0.15g、牛血清白蛋白1.5g、双抗8.0mL、甘油90mL、苯酚红7.0mg、消泡剂0.3mL、L-谷氨酸2.95g、HEPES-Na 6.0g。
所述双抗包括青霉素和链霉素，每毫升双抗包含 10000 单位青霉素（碱）和10000 µg 链霉素（碱）。
实施例3：一种具有保存能力的病毒保存液，所述病毒保存液包括如下组分：
硫酸镁0.5g、氯化钙2.8g、氯化钾1.1g、氯化钠8.0g、D-葡萄糖1.5g、磷酸二氢钾0.12g、十二水合磷酸氢二钠0.10g、牛血清白蛋白1.0g、双抗5.5mL、甘油70mL、苯酚红6.0mg、消泡剂0.2mL、L-谷氨酸1.62g、HEPES-Na 4.0g。
所述双抗包括青霉素和链霉素，每毫升双抗包含 10000 单位青霉素（碱）和10000 µg 链霉素（碱）。
实施例4：一种具有保存能力的病毒保存液的制备方法，按照实施例1-3其中之一的实施例称量量混合均匀，加入少量去离子水将试剂溶解，再用大量去离子水定容至1000mL，摇匀，调节保存液pH值为7.2-7.8即可得到具有保存能力的病毒保存液。
抗菌实验：
将实施例1、实施例2、实施例3配制所得的保存液进行抗菌效果比较。
待验证病毒样本：EB病毒。
验证方案：
方案一：
1）将EB病毒质粒作为阳性对照，取50微升EB病毒质粒置于1mL本病毒保存液中，同时取3个EB病毒阳性样本分别加入到配方1、配方2和配方3对应的病毒保存液中进行保存，置于4℃冰箱中保存；
2）分别于第0h、第24h、第48h、第72h时，取200μL保存液样本，选用达伯药业的核酸提取纯化试剂盒（磁珠法）提取病毒DNA，洗脱体积为100μL。
3）RT-qPCR检测病毒保存液中病毒样本的变化，选用圣湘生物 EB病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行检测，测定其Ct值。
4）Qubit检测dsDNA浓度，选用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(InvitrogenTMQ32852)，于Qubit 4 .0上检测第0h、第24h、第48h、第72h时的病毒DNA样本浓度。
方案二：
1）将EB病毒质粒作为阳性对照，取50微升EB病毒质粒置于1mL本病毒保存液中，同时取3个EB病毒阳性样本分别加入到配方1、配方2和配方3对应的病毒保存液中，置于25℃恒温培养箱中保存。
2）分别于第0h、第24h、第48h、第72h，200μL保存液样本，选用达伯药业的核酸提取纯化试剂盒（磁珠法）提取病毒DNA，洗脱体积为100μL。
3）RT-qPCR检测病毒保存液中病毒样本的变化，选用圣湘生物 EB病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行检测，测定其Ct值。
4）Qubit检测dsDNA浓度，选用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(InvitrogenTMQ32852)，于Qubit 4.0上检测第0h、第24h、第48h、第72h的病毒DNA样本浓度。
方案一检测结果如下：
1）置于4℃冰箱中保存检测Ct值结果
2）
3）样本浓度测定结果（ng/μL）
方案二检测结果如下：
1）置于25℃恒温培养箱中保存检测Ct值结果
2）样本浓度测定结果（ng/μL）
结果，本发明提供的保存液在4℃保存的病毒样品，其DNA浓度在三天内保持相对稳定，没有发生降解，qPCR检测结果Ct值也保持相对稳定，表明本发明提供的保存液可在4℃情况下稳定保存病毒样本至少3天；本发明提供的保存液室温保存的病毒样品，在三天内随着保存时间增长，其DNA浓度迅速降低，同时qPCR检测结果Ct值也越来越大，表明保存液液室温保存的病毒样品不稳定，可在室温情况下稳定保存病毒样本2天，易随时间增长而降解。
综上，本发明的病毒样本保存液，安全无毒，使用简单，可4℃运输保存病毒样本长达3天，可在室温情况下稳定保存病毒样本2天，有高效保存病毒的能力。该保存液能保持病毒样本的原始性，利于对病毒样本的全面分析研究，适用于流行病毒样本采集，具有很好的应用价值。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种具有保存能力的病毒保存液，其特征在于：病毒保存液包括如下组分：
硫酸镁0.1~0.9g、氯化钙2.0~3.6g、氯化钾0.7~1.5g、氯化钠6.0~10.0g、D-葡萄糖0.5~2.5g、磷酸二氢钾0.01~0.23g、十二水合磷酸氢二钠0.05~0.15g、牛血清白蛋白0.5~1.5g、双抗3.0~8.0mL、甘油50~90mL、苯酚红5.0~7.0mg、消泡剂0.1~0.3mL、L-谷氨酸0.28~2.95g、HEPES-Na 2.0~6.0g。
2.如权利要求1所述的一种具有保存能力的病毒保存液，其特征在于：所述病毒保存液各组分为：
硫酸镁0.1g、氯化钙2.0g、氯化钾0.7g、氯化钠6.0g、D-葡萄糖0.5g、磷酸二氢钾0.01g、十二水合磷酸氢二钠0.05g、牛血清白蛋白0.5g、双抗3.0mL、甘油50mL、苯酚红5.0mg、消泡剂0.1mL、L-谷氨酸0.28g、HEPES-Na 2.0g。
3.如权利要求1所述的一种具有保存能力的病毒保存液，其特征在于：所述病毒保存液各组分为：
硫酸镁0.9g、氯化钙3.6g、氯化钾1.5g、氯化钠10.0g、D-葡萄糖2.5g、磷酸二氢钾0.23g、十二水合磷酸氢二钠0.15g、牛血清白蛋白1.5g、双抗8.0mL、甘油90mL、苯酚红7.0mg、消泡剂0.3mL、L-谷氨酸2.95g、HEPES-Na 6.0g。
4.如权利要求1所述的一种具有保存能力的病毒保存液，其特征在于：所述病毒保存液各组分为：
硫酸镁0.5g、氯化钙2.8g、氯化钾1.1g、氯化钠8.0g、D-葡萄糖1.5g、磷酸二氢钾0.12g、十二水合磷酸氢二钠0.10g、牛血清白蛋白1.0g、双抗5.5mL、甘油70mL、苯酚红6.0mg、消泡剂0.2mL、L-谷氨酸1.62g、HEPES-Na 4.0g。
5. 如权利要求1-4任一项所述的一种具有保存能力的病毒保存液，其特征在于：所述双抗包括青霉素和链霉素，每毫升双抗包含10000单位青霉素和 10000 µg链霉素。
6. 一种具有保存能力的病毒保存液的制备方法，其特征在于：将硫酸镁0.1~0.9g、氯化钙2.0~3.6g、氯化钾0.7~1.5g、氯化钠6.0~10.0g、D-葡萄糖0.5~2.5g、磷酸二氢钾0.01~0.23g、十二水合磷酸氢二钠0.05~0.15g、牛血清白蛋白0.5~1.5g、双抗3.0~8.0mL、甘油50~90mL、苯酚红5.0~7.0mg、消泡剂0.1~0.3mL、L-谷氨酸0.28~2.95g、HEPES-Na 2.0~6.0g混合均匀，加入少量去离子水将试剂溶解，再用大量去离子水定容至1000mL，摇匀，调节保存液pH值为7.2~7.8。
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