CN112931487A - 一种病毒保存液及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种病毒保存液，所述病毒保存液由蛋白酶、离液剂、二硫苏糖醇、酸性缓冲液组成。所述蛋白酶为蛋白酶K，所述离液剂为硫氰酸盐、异硫氰酸盐、高氯酸盐、氯化胍、尿素其中的一种或其任意组合。所述酸性缓冲液为2‑(N‑吗啉)乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠‑柠檬酸缓冲液、柠檬酸‑氢氧化钠‑盐酸缓冲液、磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液、柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液、乙酸‑乙酸钠缓冲液或磷酸氢二钠缓冲液其中的一种或其任意组合。所述保存液中蛋白酶的浓度为1‑20mg/mL，离液剂的浓度为0.1‑1.5M，酸性缓冲液的浓度为5‑40mM，二硫苏糖醇的浓度为0‑40mM，保存液的pH范围为4‑6。另外，本发明还提供了所述病毒保存液在病毒核酸提取中的应用及其病毒保存液的使用方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种病毒保存液及其应用。
背景技术
病毒是一种个体微小，结构简单的非细胞型生物病毒，它由一个核酸长链(DNA或者RNA)和蛋白质外壳构成。病毒在自然界分布广泛，可感染人，动物，植物和细菌。由于病毒感染宿主的初始阶段浓度较低且病毒可以在宿主体内呈指数增长的繁殖，病毒此时处于潜伏期且宿主不会表现出被感染症状。这使得部分病毒可以在人群中广泛传播，如麻疹病毒、流感病毒、2003年爆发的SARS病毒，2015年流行的ZIKV病毒以及2020年在全球大流行的新型冠状病毒等均具有此特性。鉴定病毒特有的核酸是病毒种属的判定方法之一。由于部分环境中病毒浓度含量极低，通常需要借助核酸扩增技术将核酸数目放大，以方便后续的定性或定量检测。核酸扩增技术通常为PCR扩增技术或者等温扩增技术，此类技术对核酸样本有一定的纯度和浓度要求，尤其是包括新冠病毒在内的可以在人群中广泛传播的病毒，此类病毒的人体采集样本通常为血液、血浆、血清、唾液、痰液、咽拭子或鼻拭子等，含有大量的可以影响核酸扩增效率的杂质，因此需要专门的核酸提取试剂盒将核酸纯化、浓缩。
现代核酸检验中，由于检测仪器位于中心实验室，所以通常是将待测人员的样本收集并单独存放，随后送往中心实验室进行检验，从采样到检验的间隔时间在数小时到数天不等。病毒离开宿主环境中无法独立生存，会出现病毒颗粒破裂及核酸释放到外界溶液环境中的情况，使得核酸可能会因为自身结构不稳定，或者因为自然环境中广泛存在的核糖核酸酶导致的核酸降解，从而造成核酸检测假阴性的结果。所以采集后的人源样本通常置于病毒保存液中，病毒保存液需要具有稳定保持核酸样本，避免核酸样本因为降解导致后续核酸检测出现假阴性。
目前市场上已有病毒保存液可以满足以上需求，比如第一代病毒保存液Hank’s液、PBS溶液，此类溶液通常包含生理盐水、钙离子、镁离子和葡萄糖，其目的是提供一种可以让病毒颗粒维持生命活性的环境，最大可能的降低病毒颗粒破裂的可能性。但是这些病毒保存液通常具有一定的缺陷，如此类保存液在随后的核酸提取过程中需要作为样本溶液与提取试剂盒中的液体混合，造成了样本浓度被进一步稀释，可能导致检测失败，原因是后续核酸扩增过程的核酸初始量较低。随后试剂厂商又开发了新型的保存液，在此类保存液中病毒可以被部分或者完全灭活，从而确保病毒运输过程中的安全，甚至可以直接将加入的样本中的病毒裂解并释放核酸。比如上海思路迪医学检验所有限公司递交的CN111172239A专利，以及广州东盛生物科技有限公司递交的CN111690640A专利就涵盖了此方法。此类保存液相当于提前进行了样本裂解，从而节省了后续的核酸提取步骤的时间。但是此类保存液通常是含有高浓度的离液剂(盐酸胍、异硫氰酸胍等)、乙醇或者碱性缓冲液的核酸提取试剂盒，其机理是在高浓度的离液剂和乙醇的环境下，硅基磁珠或薄膜通过氢键作用吸附核酸。
但是，上述的新型保存液无法兼容依靠可电离基团在特定pH条件下(往往是相对较低的pH)产生静电(往往是正电荷)富集核酸，并在较高的pH下释放核酸，实现核酸的分离的核酸提取方法或试剂盒。而此类方法往往需要在酸性水溶液环境、无乙醇溶液环境或低浓度盐离子环境下，依赖带静电的材质表面和负电荷的核酸之间的静电作用进行核酸提取。此类试剂盒包括Invitrogen公司的Chargeswitch系列的核酸提取试剂盒，该款试剂盒是利用修饰了特定基团的磁珠，在酸性溶液环境(低于修饰的基团的pKa)、低中浓度盐或离液剂、无酒精的缓冲液下依靠磁珠与核酸之间的正负电荷之间的静电作用富集核酸，从而实现对核酸的提取纯化。此外还包括一些基于带正电的内表面、纤维素、薄膜，磁珠的核酸提取方法，此类材料通常含有伯、仲、叔胺基团，或者是季铵盐基团，在酸性溶液中利用带静电的吸附介质与带负电的核酸结合，并利用中性或碱性的缓冲液洗脱核酸，从而实现核酸纯化。比如Qiagen GmbH公司在专利US8816063B2提及了一种采用伯、仲、叔胺基团在低盐浓度(<1M)下的核酸纯化方法专利。因此，需要一种既可以裂解液病毒，也可以需要在酸性、低中浓度盐溶液的条件才可以进行核酸提取的核酸提取试剂盒或方法的病毒保存液。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种兼具保存与裂解能力、可以室温保存及运输、能与依靠可电离基团在特定pH条件下产生静电富集核酸，并在较高的pH下释放核酸，实现核酸的分离的核酸提取方法或试剂盒兼容的病毒保存液。
第一方面，本发明提供了一种病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液由蛋白酶、离液剂、二硫苏糖醇、酸性缓冲液组成。
具体地，所述蛋白酶为蛋白酶K，所述离液剂为硫氰酸盐、异硫氰酸盐、高氯酸盐、氯化胍、尿素其中的一种或其任意组合。
具体地，所述酸性缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液或磷酸氢二钠缓冲液其中的一种或其任意组合。
进一步具体地，所述保存液中蛋白酶的浓度为1-20mg/mL，离液剂的浓度为0.1-1.5M，酸性缓冲液的浓度为5-40mM，二硫苏糖醇的浓度为0-40mM，保存液的pH范围为4-6。
第二方面，本发明提供了第一方面所述病毒保存液在病毒核酸提取中的应用。
第三方面，本发明提供了第一方面所述病毒保存液的使用方法，其特征在于，直接将拭子样本或液体样本加入到一定体积的病毒保存液中，持续温浴，以充分灭活病毒。
具体地，所述拭子样本或液体样本与病毒保存液的优选混合比例为1:5-2:1，温浴的温度范围为50-70，℃温浴时间范围为5-30min。
进一步具体地，所述拭子样本包括唾液、咽拭子、鼻拭子、痰液、血清、血浆、全血、人体皮肤表层以及物体表面拭子。
本发明的有益效果是：
1.本发明公开的病毒保存液属于灭活型，病毒可以在20min内被完全灭活、裂解，游离至溶液的RNA可以在保存液的作用下避免被核糖核酸酶降解，从而实现对含有病毒核酸的样本稳定保存。
2.本发明公开的病毒保存液，可以使得人源性的样本中可能含有的病毒在常温或加热下被灭活、裂解，并且可以有效的保护其中存在的核酸片段，并且相对容易的进行后续的分子诊断实验。
3.本发明公开的病毒保存液，保存的样本可以在常温进行存储，无需置于4℃、-20℃或者更低的温度进行存储，且其中的核酸可以在一段时间内保持稳定。
4.本发明的病毒保存液具有相对较低的离液剂浓度，且不含有任何有机溶剂，保存液在经过一定倍数的稀释后，可以无需核酸提取过程直接进行RT-PCR扩增。
5.本发明的病毒保存液为酸性、低中离液剂浓度的液体环境。高浓度的离液剂会破坏水溶液中的氢键，从而降低溶液中核酸和羟基磁珠之间负电荷的排斥力，使得核酸和磁珠通过疏水作用力结合，但是该高浓度离液剂不适合基于静电吸附的核酸提取方法，即利用正电荷的磁珠或多孔膜富集负电荷的核酸，本申请比较了含有不同浓度离液剂的保存液中的核酸，在被同样条件的壳聚糖(一种具有静电吸附提取核酸能力的聚合物材料)改性的微流控芯片腔体进行核酸提取时，高浓度的离液剂表现出了较差的效果，扩增Ct值靠后，且表现出扩增抑制；而低浓度的离液剂具有较好的效果，扩增Ct值靠前，且无扩增抑制。本说明书提出的病毒保存液采用0.1-1.5M的异硫氰酸胍是为了保证不但让保存液一定程度上具有抑制RNA降解酶的效果，而且相比于含有高浓度离液剂或含有有机溶剂的病毒保存液，本说明书提出的病毒保存液中的离液剂浓度相对较低，使得该病毒保存液适合静电吸附为主的核酸提取试剂盒或核酸提取方法，从而可以有效兼容包括Invitrogen公司的Chargeswitch系列的核酸提取试剂盒在内的、以静电吸附为主的核酸提取试剂盒或核酸提取方法。
附图说明
图1为病毒保存液混入RNA后，稀释液的扩增Ct值随时间的变化情况；
图2为病毒保存液裂解拭子样本后，稀释液的扩增Ct值随时间的变化情况；
图3为病毒保存液裂解痰液样本后，稀释液的扩增Ct值随时间的变化情况；
图4为用含有不同浓度的异硫氰酸胍保存液裂解痰液样本后，注入具有静电吸附功能的微流控芯片腔体，观察扩增Ct值随时间的变化情况。
具体实施方式
下述内容结合附图和实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，下属所列举的实施例并未列出了本专利的所有特征，本发明的保护范围本领域的从业人员可以轻易对本说明书描述的方法进行重新排列组合或添加步骤操作，但这依旧处于本说明书的保护范围内。
在本说明书中，病毒保存液的配方中蛋白酶K的主要作用在于，消化病毒外部的蛋白质，释放核酸，使得保存液起到了核酸裂解的效果。
需要说明的是，尽管本发明的初衷是提供一种病毒保存液，该保存液可以兼容基于正负电荷原理的核酸提取方法或试剂盒，但是本发明本身对核酸提取方法没有加以限制。只要采用本发明的第一部分的保存液组合配方并且将样本保存至其中，以实现核酸提取和纯化的目的均视为本说明书的保护范围内。
实施例1纯核酸样本的保存
病毒保存液制备：将蛋白酶K，尿素，乙酸-乙酸钠缓冲液，二硫苏糖醇与蒸馏水混合，配制成10mL的混合溶液。其中蛋白酶K浓度为2mg/mL，异硫氰酸胍浓度为0.8M，乙酸-乙酸钠缓冲液浓度为20mM，二硫苏糖醇的浓度为30mM。取配制好的溶液，将溶液分装到2mL的离心管中。所有溶液置于4℃冰箱待用。
RNA提取：利用Qiagen的RNA提取试剂盒对一定浓度的假病毒颗粒进行核酸提取，并得到纯化的RNA，提取步骤参照生产说明书的操作步骤。
样本保存：将纯化后的RNA分别按照1:9的比例加入到病毒保存液和去离子水中，并震荡混匀15s，分别命名为样本1和样本2，使得纯化后的RNA均匀分布于病毒保存液和去离子水中。由于本实验的去离子水是长期开盖置于实验室中的，意味着去离子水中可能含有一定的RNA降解酶。随后将样本1和样本2置于室温下静置48h，中途取样并扩增以验证RNA的稳定性。
RT-PCR扩增：从样本1和样本2取出一部分液体，均用去离子水稀释5倍。其余的保存液置于室温下存放。用Takara的RNA扩增试剂按照生产说明书的操作步骤，对稀释后的样本1和样本2进行扩增。其中扩增试剂体积为18μL，病毒保存液稀释液的加样体积为2μL。随后分别在1h，4h，16h，48h后，将置于室温下的保存液取出一部分液体，稀释5倍，并且按照RT-PCR的扩增程序对稀释后的样本保存液进行扩增。选用的仪器为罗氏的LC96核酸扩增检测仪。
如图1所示的结果表明，样本1中的RNA在不同时间段取出的液体在稀释5倍后进行扩增均有着稳定的Ct值，而样本2中的RNA随着时间变化而降解，在第48h后，无法得到有效的Ct值，意味着其中的RNA在无保护的情况下，48h几乎被完全降解。本实施例证明了，本发明的病毒保存液可以有效的防止RNA在常温下的降解，这也使得保存液中的RNA即使是在非冷冻的环境中放置数日，也可以在后续的RT-PCR过程中检测到结果较为准确的Ct值。
实施例2拭子样本的裂解及保存
保存液制备：将蛋白酶K，尿素，乙酸-乙酸钠缓冲液，二硫苏糖醇与蒸馏水混合，配制成10mL的混合溶液。其中蛋白酶K浓度为1mg/mL，盐酸胍浓度为0.6M，乙酸-乙酸钠缓冲液浓度为10mM，二硫苏糖醇的浓度为10mM。取配制好的溶液，将溶液分装到2mL的离心管中。所有溶液置于4℃冰箱待用。
拭子样本制备：选取高浓度的假病毒原液作为待测样本，该假病毒内含有特定的已知RNA片段。将假病毒原液分装成三份，每份体积为800μL。将3个拭子分别放入分装的假病毒原液中浸泡5min，随后取出拭子样本，完成拭子样本的制备。
病毒灭活及裂解：将吸附了假病毒颗粒的拭子样本分别放入3个单独的盛有2mL保存液的离心管中。随后将离心管放在55℃下加热10min，用于灭活及裂解病毒。随后将离心管置于常温下静置120h，中途取样并扩增以验证内部的RNA稳定性。
RT-PCR扩增：从三个病毒保存液取出一部分液体，并用无菌水稀释10倍，随后将稀释后的液体95℃加热5min以完全灭活蛋白酶K。随后三个病毒保存液置于室温下存放。用Takara的RNA扩增试剂按照生产说明书的操作步骤，对稀释后的病毒保存液进行扩增。其中扩增试剂体积为18μL，病毒保存液稀释液的加样体积为2μL。随后分别在1h，4h，16h，48h，72h，96h和120h后，将置于室温下的保存液取出一部分并用无菌水稀释10倍，随后加热95℃5min，并且按照RT-PCR的扩增程序对稀释后的样本保存液进行扩增。选用的仪器为罗氏的LC96核酸扩增检测仪。
如图2所示的结果表明，在不同时间段取出的病毒保存液稀释10倍后，随着样本静置时间越长，扩增的Ct值略有提前，说明RNA的浓度不降反升。本实施例证明了，本发明的病毒保存液可以有效的裂解病毒颗粒并释放RNA，而无需经过核酸提取；此外，释放到病毒保存液中的RNA在常温下也具有较好的稳定性，不会被RNA酶降解。同时，由于本实施例中病毒保存液采用的蛋白酶K和离液剂浓度在说明书中申明的浓度中属于较低的范围，可能导致裂解过程在55℃10min的加热过程后依然继续持续(未能完全裂解)，使得后续的扩增中Ct值反而提前。但是即便如此，病毒保存液中的RNA在120h未出现明显的降解，意味着即便病毒保存液中离液剂浓度相对较低(0.6M)，也具有较好的RNA保护作用。
实施例3.痰液样本的裂解及保存
病毒保存液制备：将蛋白酶K，盐酸胍，乙酸-乙酸钠缓冲液，二硫苏糖醇与蒸馏水混合，配制成10mL的混合溶液。其中蛋白酶K浓度为4mg/mL，尿素浓度为1.2M，乙酸-乙酸钠缓冲液浓度为15mM，二硫苏糖醇的浓度为20Mm。取配制好的溶液，将溶液分装到2mL的离心管中。所有溶液置于4℃冰箱待用。
痰液样本制备：选取200μL高浓度的假病毒原液作为待测样本，并用去离子水将假病毒稀释至1mL。将稀释后的假病毒溶液通过注射器注入含有3mL的病毒保存液中，并将样本充分混合。
病毒灭活及裂解：将装有病毒保存液和假病毒的混合溶液置于水浴锅中65℃加热10min，随后在95℃下加热5min，用于消化痰液以及裂解病毒。随后将离心管置于常温下静置96h，中途取样并扩增以验证内部的RNA稳定性。
RT-PCR扩增：将病毒保存液取出一部分液体，并用无菌水稀释5倍。其余的病毒保存液置于室温下存放。用Takara的RNA扩增试剂按照生产说明书的操作步骤，对稀释后的病毒保存液进行扩增。其中扩增试剂体积为18μL，病毒保存液稀释液的加样体积为2μL。随后分别在1h，4h，16h，48h，72h，96h后，将置于室温下的病毒保存液取出一部分液体，稀释5倍，并且按照RT-PCR的扩增程序对稀释后的病毒保存液进行扩增。选用的仪器为罗氏的LC96核酸扩增检测仪。
如图3所示的结果表明，在不同时间段取出的病毒保存液稀释10倍后，对溶液中的RNA进行扩增均有着接近的Ct值，即RNA在样本中的浓度在常温下静置96h后依旧保持稳定。本实施例证明了本发明的病毒保存液可以有效的消化含有糖蛋白的痰液并释放其中含有的假病毒的RNA，而无需经过核酸提取；此外，尽管痰液中可能会含有大量的RNA降解酶，但是释放到病毒保存液中的RNA在常温下也具有较好的稳定性。
实施例4.用含有不同浓度异硫氰酸胍的保存液中裂解痰液样本后，注入具有静电吸附功能的微流控芯片进行核酸提取和扩增检测
病毒保存液1制备：将蛋白酶K，异硫氰酸胍，乙酸-乙酸钠缓冲液，二硫苏糖醇与蒸馏水混合，配制成10mL的混合溶液。其中蛋白酶K浓度为10mg/mL，异硫氰酸胍浓度为1.0M，乙酸-乙酸钠缓冲液浓度为30mM，二硫苏糖醇的浓度为40mM。配制好的病毒保存液1置于4℃冰箱待用。
病毒保存液2制备：将蛋白酶K，异硫氰酸胍，乙酸-乙酸钠缓冲液，二硫苏糖醇与蒸馏水混合，配制成10mL的混合溶液。其中蛋白酶K浓度为10mg/mL，异硫氰酸胍浓度为1.5M，乙酸-乙酸钠缓冲液浓度为30mM，二硫苏糖醇的浓度为40mM。配制好的病毒保存液1置于4℃冰箱待用。
病毒保存液3制备：将蛋白酶K，异硫氰酸胍，乙酸-乙酸钠缓冲液，二硫苏糖醇与蒸馏水混合，配制成10mL的混合溶液。其中蛋白酶K浓度为10mg/mL，异硫氰酸胍浓度为5M，乙酸-乙酸钠缓冲液浓度为30mM，二硫苏糖醇的浓度为40mM。配制好的病毒保存液1置于4℃冰箱待用。
假病毒溶液样本制备：选取300μL高浓度的假病毒原液作为待测样本，并加入600μL无菌水，随后用去离子水将假病毒稀释至900μL。分别吸取稀释后的假病毒溶液300μL，并分注入含有600μL病毒保存液1，病毒保存液2和病毒保存液3的样本保存管中，并将3管假病毒溶液-病毒保存液充分混合。随后分别将三个混合溶液命名为样本溶液1，样本溶液2和样本溶液3。
病毒灭活及裂解：将3管假病毒溶液-病毒保存液混合溶液置于水浴锅中65℃加热20min，随后在95℃下加热5min，用于消化溶液的蛋白质以及裂解病毒。
静电吸附微流控芯片制备：利用0.1％(w/w)的乙酸溶液配制浓度为0.1％(w/w)的壳聚糖(一种电荷转换功能性聚合物材料)溶液。将壳聚糖溶液注入Chip shop公司的微流控芯片的腔体中，以对腔体内部进行表面正电荷修饰，并置于25℃温度下持续24h。随后吸出腔体内部的壳聚糖溶液，并用去离子水充分清洗，以移除未被固定在芯片腔体内表面的壳聚糖分子。此时微流控芯片腔体内部粘附了一层壳聚糖分子，并且在酸性、低中浓度离液剂的缓冲液条件下带正电。
核酸的纯化与扩增：吸取样本溶液1、样本溶液2和样本溶液3各20μL，分别注入3个独立的、经过壳聚糖改性的微流控芯片腔体，并且静置3min，目的是在酸性溶液环境下，让负电荷的核酸被正电荷的芯片腔体吸附。随后对三个腔体通入50μL去离子水，目的是清洗芯片内的病毒保存液杂质。随后注入核酸扩增试剂，开始进行PCR扩增。
如图4所示的结果表明，盐酸胍浓度为1M的病毒保存液通入壳聚糖改性微流控芯片后，扩增Ct值相对提前；而盐酸胍浓度为5M的病毒保存液扩增Ct值靠后，意味着采用高浓度异硫氰酸胍的病毒保存液通过静电吸附作用富集的核酸浓度较低。该实施例说明本说明书报道的病毒保存液相比于含有高浓度离液剂的病毒保存液而言，更适合基于正负电荷吸附的核酸提取方法。
Claims (8)
1.一种病毒保存液，其特征在于：所述病毒保存液由蛋白酶、离液剂、二硫苏糖醇、酸性缓冲液组成。
2.如权利要求1所述的病毒保存液，其特征在于：所述蛋白酶为蛋白酶K，所述离液剂为硫氰酸盐、异硫氰酸盐、高氯酸盐、氯化胍、尿素其中的一种或其任意组合。
3.如权利要求1或2所述的病毒保存液，其特征在于：所述酸性缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液或磷酸氢二钠缓冲液其中的一种或其任意组合。
4.如权利要求1-3任一所述的病毒保存液，其特征在于：所述保存液中蛋白酶的浓度为1-20mg/mL，离液剂的浓度为0.1-1.5M，酸性缓冲液的浓度为5-40mM，二硫苏糖醇的浓度为0-40mM，保存液的pH范围为4-6。
5.权利要求1-4任一所述的病毒保存液在病毒核酸提取中的应用。
6.权利要求1-4任一所述病毒保存液的使用方法，其特征在于：直接将拭子样本或液体样本加入到一定体积的病毒保存液中，持续温浴，以充分灭活病毒。
7.如权利要求6所述的病毒保存液的使用方法，其特征在于：所述拭子样本或液体样本与病毒保存液的优选混合比例为1:5-2:1，温浴的温度范围为50-70，℃温浴时间范围为5-30min。
8.如权利要求6-7任一所述的病毒保存液的使用方法，其特征在于：所述拭子样本包括唾液、咽拭子、鼻拭子、痰液、血清、血浆、全血、人体皮肤表层以及物体表面拭子。
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