CN108102881A - 具有微结构阵列的微流控芯片及核酸固相纯化提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有微结构阵列的微流控芯片及核酸固相纯化提取方法。所述微流控芯片包括微流道以及分布于所述微流道内的微结构阵列，所述微结构阵列包括阵列排布的复数个微柱，其中复数个微柱表面还连接有吸附剂，所述吸附剂用于吸附核酸。相比于现有技术，本发明以具有有序微结构阵列的微流控芯片为基础，通过在其微流道中修饰可物理吸附核酸的试剂，实现对核酸的吸附与洗脱，操作流程简便、快速、高效，易于与下游核酸扩增微流控芯片等集成构建芯片实验室，尤其适用于现场快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种微流控芯片，具体涉及一种含有微阵列结构的微流控芯片及基于该芯片的核酸固相提取方法，属于固相萃取领域。
背景技术
生物分子核酸的提取技术是进行分子生物学各方面研究的基础，是生命科学研究与应用的关键技术。核酸的提取主要是指将其与蛋白质、多糖、脂类等生物大分子物质分离，并且保证核酸分子的完整性。在20世纪90年代初期，核酸的提取纯化技术还是一项耗时且繁琐的技术，同时，需要有毒试剂的使用。随着固相萃取技术的出现和商业化试剂盒的有效性及实用性对于核酸的提取有着较快速及可靠的帮助，从而推动了能够从全血、血清、唾液、尿液等生物样本中提取出高质量的核酸技术的发展。
直到近些年来，随着微流控技术也叫微流控芯片实验室(Lab-on-a-chip)的迅猛发展，基于微流控芯片的核酸固相提取技术得到了较为显著的进展。微流控芯片(Microfluidic Chip)是二十一世纪最为重要的前沿技术之一，由于其在诸多领域的巨大潜力，微流控技术已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。微流控技术以芯片为操作平台，同时以分析化学为基础，以MEMS为依托，以管道网络为结构特征，以生命科学为目前主要应用对象，是当前微全分析系统领域发展的重点。最初，全分析系统的概念涉及到的硅芯片，基于硅芯片的样品预处理、反应、分离以及为满足后续的生物医学检测等工作，从而带动了核酸提取技术的发展。
传统的微流控芯片提取核酸的方法是通过二氧化硅固定在芯片内壁，以及将硅胶、硅藻土、玻璃珠、多孔聚合物、磁珠等基质填充在微流控芯片通道内，进行吸附核酸，从而达到其他物质与核酸进行分离的效果。操作过程中通常包括4个步骤：首先采用变性剂、蛋白酶K等将细胞裂解；细胞裂解后释放出核酸，采用苯酚、氯仿等进行萃取；洗涤；低盐洗脱后得到核酸。传统的核酸提取方法有诸多缺点，例如：程序复杂繁琐、耗时、成本高、提取效率低，同时需要使用了抑制核酸扩增反应的试剂等。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种具有微结构阵列的微流控芯片及核酸固相纯化提取方法，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种具有微结构阵列的微流控芯片，其包括微流道以及分布于所述微流道内的微结构阵列，所述微结构阵列包括阵列排布的复数个微柱，其中复数个微柱表面还连接有吸附剂，所述吸附剂用于吸附核酸。
进一步地，所述吸附剂与核酸通过物理作用，例如静电作用结合。
进一步地，所述吸附剂通过化学修饰方式固定于所述微柱表面。
当然，在一些实施方案中，还可以在所述微流道的内壁上修饰所述的吸附剂。
本发明实施例还提供了一种核酸固相纯化提取方法，其包括：
提供所述的微流控芯片；
向所述微流控芯片的微流道内输入包含有核酸的液态样品，使其中至少部分的核酸被吸附剂吸附；以及
向所述微流道内输入洗脱液，将被吸附的核酸从所述微流道内洗脱。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
(1)本发明所使用的具有微结构阵列的微流控芯片，不仅能够增大样品中核酸与芯片流道的接触面积，而且通过壳聚糖等作为吸附剂，能够实现其对核酸的特异性吸附，以及能够实现将吸附的核酸无损地洗脱下来，提取效率保持稳定性，成本低廉，为更深入的研究及生产应用创造可能。
(2)本发明的具有微阵列结构的微流控芯片易于制备，成本较低，且利用其进行核酸纯化提取的操作流程简易，成本低，效率高。
附图说明
图1是本发明一典型实施方案中利用具有微结构阵列的微流控芯片对核酸进行提取及纯化的程图；
图2是本发明一实施例中利用未经壳聚糖和经过壳聚糖修饰的微流控芯片对核酸的吸附效果图；
图3是本发明一实施例中利用经过壳聚糖修饰的微流控芯片考察对不同细胞系样品进行核酸的提取及纯化能力测试图。
具体实施方式
如前所述，现有技术中缺乏易于与下游核酸扩增等微流控芯片集成而构建芯片实验室的通用核酸固相萃取技术，为此，本发明提供了一种含有微阵列结构的微流控芯片及基于该芯片的核酸固相提取方法，其能满足多种因素，诸如：设备的有效性、以及试剂和样本与流速之间的平衡性以及核酸的提取效率和质量等，尤其适用于现场快速检测。
进一步地讲，本发明实施例提供的一种具有微结构阵列的微流控芯片包括微流道以及分布于所述微流道内的微结构阵列，所述微结构阵列包括阵列排布的复数个微柱，其中复数个微柱表面还连接有吸附剂，所述吸附剂用于吸附核酸。
优选地，所述微柱的直径为0.1微米至1毫米。
进一步地，所述微结构阵列是有序的。
进一步地，所述微柱的径向截面形状包括圆形或多边形等，且不限于此。
前述的有序微结构阵列，可以提供更多的吸附剂吸附位点，亦可以使微流道内与流体有效接触的面积更大，并且还可在不堵塞液流通道的情况下对流体进行进一步的扰动，使其中的核酸能更充分的与吸附剂接触。
进一步地，所述微流控芯片的材质包括玻璃、硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或塑料等，且不限于此。
进一步地，所述吸附剂与核酸通过静电作用结合。例如，所述吸附剂可以包括3-氨丙基三乙氧基硅烷或壳聚糖等，且不限于此。优选的，所述吸附剂选用壳聚糖。
进一步地，所述吸附剂通过化学修饰方式直接固定于所述微柱表面。
进一步地，所述吸附剂与修饰于微柱表面的交联试剂共价键合。
本发明实施例提供的一种核酸固相纯化提取方法包括：
提供所述的微流控芯片；
向所述微流控芯片的微流道内输入包含有核酸的液态样品，使其中至少部分的核酸被吸附剂吸附；以及
向所述微流道内输入洗脱液，将被吸附的核酸从所述微流道内洗脱。
进一步地，所述液态样品包括细胞裂解液或血清等，且不限于此。
进一步地，所述的核酸固相纯化提取方法还包括：对原始样品进行预处理，从而获得所述液态样品。
进一步地，所述的预处理可以包括：使原始样品中的细胞裂解，从而释放出目的核酸，形成所述液态样品；或者，将原始样品中的血细胞去除，获得含有游离核酸的液态样品，所述原始样品为全血，所述液态样品为血清。
更进一步地，所述的预处理还可以包括：将包含有细胞的原始样品离心、去除上清液，再加入磷酸缓冲液重悬沉淀，之后进行细胞的裂解。
在本发明的一更为具体的实施方案中，一种核酸的固相纯化提取方法包括如下步骤：
(1)利用微加工工艺(如MEMS工艺等)制造具有微结构阵列的微流控芯片；
(2)将吸附剂修饰到微流控芯片的微流道中，特别是组成微阵列的微柱表面；
(3)在所述微流控芯片的微流道中通入含有核酸的样品(例如细胞裂解液样品)，进行核酸的吸附；
(4)在所述微流控芯片的微流道中通入选定的洗脱液对吸附于微流道内的核酸进行洗脱。
在一些实施方式中，步骤(2)中可以利用所述微流道内修饰的交联试剂与吸附剂之间的交联作用，使吸附剂固定于微流道内。或者，也可以通过使吸附剂与修饰于微柱表面或微柱自具的活性基团(例如氨基)反应，从而实现吸附剂的化学修饰。
在一实施方式中，步骤(3)包括：利用所述吸附剂对核酸进行静电吸附，实现对核酸的提取。在一些实施方案中，前述吸附剂可以优选为壳聚糖。壳聚糖于溶液中表现出典型的弱阳离子即带正电的高分子化合物的特征，用酸性缓冲液作为核酸样品的溶剂以及通过核酸自身携带负电荷的属性，能够很好地实现二者的吸附。通过利用二者的静电吸附原理，能够进一步使微流控芯片具有更高吸附效率以及灵敏度，具有更广阔的应用前景。
在一实施方式中，在进行步骤(3)之前，还可在经过步骤(2)处理后的微流控芯片的微流道中通入一定浓度的核酸样品以验证其吸附核酸的功能。
在一实施方式中，在步骤(3)之前还可对细胞裂解液样品等进行预处理，例如可以包括将含有目的核酸的细胞样本进行裂解等步骤。
在一实施方式中，可以在对细胞样品裂解之前，对原始样品进行至少一次离心处理，之后去除上清液，再加入磷酸缓冲液重悬沉淀，其后进行细胞的裂解。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的保护范围并不限于此。
请参阅图1所示，本发明一具体实施例中提供的一种利用具有微结构阵列的微流控芯片对核酸进行提取及纯化的方法包括如下步骤：
步骤S1：制备含有微阵列结构的微流控芯片，例如，可以将PDMS前聚体与固化剂以质量比10:1混合，搅拌均匀，对其混合物置于真空干燥器内进行抽真空，至气泡被完全除净，再将其缓慢浇注于含有微柱阵列结构的硅模具中，控制厚度约为5mm，再次将其置于真空干燥器内进行抽真空以排除气泡，直至气泡被完全除净。90℃固化1h。取出后，冷却至室温，用切刀切出PDMS芯片，在流道出口和进口处通过打孔器进行打孔。用胶带将PDMS表面处理干净，将洗净的载玻片和PDMS块放入PLASMACleaner中，进行共价键合的一面朝上放置，打开PLASMA，默认电压为700v，作用30s后取出，将PDMS芯片与载玻片贴合，轻压，并置于干燥箱90℃烘烤5分钟使之永久键合，取出，芯片制作完毕。
步骤S2：将吸附剂修饰到微流控芯片的微柱阵列上。例如，可以在室温条件下以20μL/min的流速向微流道内通入2％(v/v)氨基硅烷试剂的乙醇溶液修饰30min，以20μL/min的流速通入乙醇溶液清洗30min，将芯片中的液体吹干后置于干燥箱110℃烘烤1h。待芯片冷却至室温后以20μL/min的流速通入戊二醛反应液1小时(戊二醛反应液配制：50％戊二醛50μL,PBS 0.95mL,硼氢化钠2mg,pH值＝7.4)，再以20μL/min的流速通入去离子水清洗30min，将芯片中的液体吹干后，通入1mL 1％的壳聚糖溶液以16.6μL/min的流速反应1h(壳聚糖溶液配制：0.01g壳聚糖，pH为9.5的NaOH溶液1mL)。其中，所述硅烷试剂选自3-氨丙基三乙氧基硅烷。
步骤S3：在经过步骤S2修饰后的微流控芯片的微流道中通入一定量的核酸样品以验证其吸附核酸的功能。例如，可以将一定量的核酸标准样品通过2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液稀释形成所述的核酸样品。具体而言，该步骤可以包括：以2μL/min的流速在上述经壳聚糖修饰的微流控芯片流道中通入10mM，pH值＝5.0，2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液清洗流道，直至收集到的清洗液中无壳聚糖为止。再以2μL/min的流速在流道中通入核酸样品。
步骤S4：对细胞样品进行预处理：将原始的细胞样品进行细胞裂解，使得其中的核酸释放出来。本步骤还可以包括在对细胞样品裂解之前，离心、去除上清液，再加入PBS重悬沉淀的步骤。例如，可以取原始的细胞样品离心，去除上清液，再加入PBS重悬沉淀，再次离心，去除上清液。加入细胞裂解液，50mM MES缓冲液，pH值＝5.0，涡旋1min，56℃，10min。步骤S5：在所述微流控芯片的微流道中通入上述细胞样品，进行核酸的吸附。
例如，可以利用带正电荷的壳聚糖与带负电荷的核酸之间的静电吸附作用，可以实现二者的吸附。具体的，可以用2μL/min的流速将细胞样品通入微流控芯片流道中，在流道出口处每5min收集一次流出液，收集5管。最后以2μL/min的流速用10mM MES清洗流道，2uL/min，每5min收集一次流出液，收集5管以洗去没有被吸附的核酸。
在一对照组中，可以参考前述的步骤S1制作具有微柱阵列结构的微流控芯片，但不进行步骤S2的修饰。
参阅图2所示，对照组中未经壳聚糖修饰的微流控芯片对核酸的吸附效率几乎为零，而本发明中经过壳聚糖修饰的微流控芯片对核酸有较好的吸附作用。
步骤S6：在具有微阵列结构的微流控芯片的微流道中通入洗脱液对所述可被吸附的核酸进行洗脱，实现对被吸附核酸的洗脱。例如，可以用2uL/min的流速向微流道内通入10mM Tris(50mM KCl)，pH值＝9.0溶液，在微流道出口处每3min收集一次流出液，收集8管。Nanodrop下对各收集管中的核酸浓度进行测量。
如图3示出了利用前述经壳聚糖修饰的微流控芯片对不同细胞系进行核酸的提取及洗脱实验的测试结果，由于通过对微流控芯片的微流道进行修饰，从而实现了对核酸的吸附及洗脱全过程，且对核酸的提取效率相近，进一步说明该修饰芯片对核酸的提取具有一定的稳定性。综上所述，本发明以微加工制造具有微阵列结构的微流控芯片为基础，通过在微流道中修吸吸附剂(更确切地讲，是其中的微结构阵列上修饰吸附剂)，实现对核酸的固相提取与洗脱，操作流程简便，高效，便于后期对核酸进行下游扩增等操作，且在微流控芯片集成构建芯片实验室以及现场快速检测等应用领域具有广阔的应用前景。
应当指出，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种具有微结构阵列的微流控芯片，包括微流道，其特征在于还包括分布于所述微流道内的微结构阵列，所述微结构阵列包括阵列排布的复数个微柱，其中复数个微柱表面还连接有吸附剂，所述吸附剂用于吸附核酸。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微柱的直径为0.1微米至1毫米；和/或，所述微柱的径向截面形状包括圆形或多边形；和/或，所述微流控芯片的材质包括玻璃、硅、聚二甲基硅氧烷或塑料。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述吸附剂与核酸通过静电作用结合。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于：所述吸附剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷或壳聚糖。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述吸附剂通过化学修饰方式直接固定于所述微柱表面；或者，所述吸附剂与修饰于微柱表面的交联试剂共价键合。
6.一种核酸固相纯化提取方法，其特征在于包括：
提供权利要求1-5中任一项所述的微流控芯片；
向所述微流控芯片的微流道内输入包含有核酸的液态样品，使其中至少部分的核酸被吸附剂吸附；以及
向所述微流道内输入洗脱液，将被吸附的核酸从所述微流道内洗脱。
7.根据权利要求6所述的核酸固相纯化提取方法，其特征在于：所述液态样品包括细胞裂解液或血清。
8.根据权利要求6所述的核酸固相纯化提取方法，其特征在于还包括：对原始样品进行预处理，从而获得所述液态样品。
9.根据权利要求6所述的核酸固相纯化提取方法，其特征在于，所述的预处理包括：使原始样品中的细胞裂解，从而释放出目的核酸，形成所述液态样品；或者，将原始样品中的血细胞去除，获得含有游离核酸的液态样品，所述原始样品为全血，所述液态样品为血清。
10.根据权利要求9所述的核酸固相纯化提取方法，其特征在于，所述的预处理还包括：将包含有细胞的原始样品离心、去除上清液，再加入磷酸缓冲液重悬沉淀，之后进行细胞的裂解。
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