CN112322453A - 一种用于核酸提取、扩增及检测的微流控芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸分析领域,利用微流控芯片技术实现核酸的提取、扩增和检测的一体化。微流控芯片采用微加工技术,在微米级的面积上制作出微通道,可以在微米尺度空间对流体进行操控,具有将实验室的基本功能微缩到一个平方厘米级的芯片上的能力,这样就可以将多项反应步骤集成于一体,而且快速、高效、低耗,很适合用于现场检测。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测分析领域,利用微流控芯片技术实现核酸的提取、扩增和检测的一体化。
背景技术
如何快速准确地检测病情一直是人类医学研究中的一个棘手问题。核酸检测由于其取样简单快捷,结果准确率较高,已经被世界所公认,目前已有很多相关技术,微控流原理是其中较为常见的一种。现有微流控核酸芯片,大多只能完成杂交、提取、扩增或信号读出中的某一项,没有实现集成化。比如在完整的核酸检测过程中,需要有核酸提取、核酸扩增及信号读出等多个步骤,但由于每个步骤都涉及多个操作环节,因此集成化难度较大。虽然在中国专利文献CN 105316224 B涉及全自动核酸提取与PCR扩增微流控芯片及其应用方法,其中集成了核酸提取和核酸扩增,但是由于其采用的是蝶式芯片技术,利用离心力推动液体在微通道内流动,对于配套仪器的转速控制要求较高。中国专利文献CN 104946510B涉及集核酸扩增和微阵列检测于一体的微流控装置,以及CN 107129930B中涉及一种全集成核酸检测微流控芯片及其使用方法,虽然都可以集成核酸提取和核酸扩增,但是芯片设计复杂,大量使用泵阀结构,增加了芯片制作的难度和成本。
因此,需要进一步开发一种成本较低、容易制作且能有效捕获和提取核酸的产品。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种用于核酸提取、扩增及检测的微流控芯片。
本发明的微流控芯片由上下两层结构组成。芯片上层,材质为塑料或橡胶,包含但不限于环烯烃类共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)或聚二甲基硅氧烷(PDMS)等。上层的厚度约为3-10mm,上层包括有试剂池、微流控通道、核酸扩增池和控制孔等。试剂池为圆柱体或长方体结构的通孔,联通大气,底部与芯片的下层紧密贴合,形成用于储存试剂的小室,用于注入或混合试剂、样本等液体。试剂池的大小可以根据实际需要进行设计。微流控通道位于芯片上层的底部,与芯片的下层紧密贴合,用于引导液体在芯片内的流动,其宽度为0.05-2.0mm,高度为0.5-2.0mm,可以根据需要设计成不同的图案。核酸扩增池位于芯片上层的底部,可以为圆柱体、椭圆柱体、长方体或正方体等多种形状,与芯片的下层紧密贴合,为核酸扩增区域。
本发明的微流控芯片下层,材质为塑料或橡胶,包含但不限于环烯烃类共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)或聚二甲基硅氧烷(PDMS)等。芯片下层厚度可以为0.1-5.0mm,设有对应于微流控通道区域的磁珠固定区,所述磁珠固定区内形成微腔结构,其是芯片下层上形成的向微流控通道开口的凹陷空间,以作为磁珠的容纳空间,用于实现核酸的提取。每个微腔结构:可以是长方体、正方体、圆柱体或者不规则的形状,但是空间内只允许容纳一个磁珠。例如正方体,边长要大于磁珠直径,小于两倍磁珠直径;长方体,长和宽要大于磁珠直径,小于两倍磁珠直径,同时深度要大于磁珠直径,小于两倍磁珠直径;圆柱体,直径要大于磁珠直径,小于两倍磁珠直径,同时深度要大于磁珠直径,小于两倍磁珠直径。优选地,是多个微腔结构形成微腔结构阵列,其可以是矩形阵列、圆形阵列或者不规则阵列。
微腔结构可以进一步通过修饰来增强其限制磁珠的能力,比如:在微腔阵列结构区域内,可以使用电解、蒸镀或其他方法均匀地附着铁、钴、镍等可以传导磁场的物质,这样能够进一步强化磁场效应,限制磁珠运动;也可以通过化学修饰的方法增强其亲水性,这样可以使磁珠更容易进入微腔结构内。
本发明采用的是微腔结构阵列分布,可以解决平面结构表面上不能将磁珠单独隔开,在磁场作用下可能会发生聚集的问题;也可以解决采用增大表面粗糙度的方式时,形成微沟壑,形态没有规律,可能发生磁珠聚集的问题。
具体来说,本发明创造性的使用微腔结构固定磁珠来提取核酸。使用表面修饰的磁珠是本领域技术人员在核酸提取过程中经常使用的材料,通过与磁铁配合使用,可以一定程度上限制磁珠运动,实现核酸的提取。但是,如果单独使用磁珠,可能使磁珠在微流控通道内空间分布不均,堵塞通道;可能出现磁珠摆脱磁力束缚,随液体流动;还可能造成磁珠在磁场作用下相互聚集,集结成块。因此,本发明将磁珠固定在微腔结构内,通过与磁场共同作用,可以有效防止上述情况发生:每个微腔结构空间内只能容纳一个磁珠,因此可以有效的将磁珠分开,避免磁珠聚集;微腔结构可以有效降低流体对磁珠的冲击速度,与磁场共同作用,固定磁珠,防止被流体冲走;通过微腔的微阵方式分布,可以在阵列内分布大量的磁珠,实现核酸的有效捕获和提取。
本发明在微流控芯片中设计有微腔结构,利用微腔结构和永磁铁的共同作用限制磁珠的运动,固定磁珠,通过磁珠实现核酸的提取;在微流控芯片中还设计有核酸扩增区域,可以实现核酸扩增。这样就可以集成核酸提取与核酸扩增,实现在微流控芯片上完成核酸检测的全部过程,使用方便快捷。
附图说明
图1为本发明微流控芯片透视图及磁珠固定区和微腔结构放大示意图;
图2为本发明微流控芯片侧视图;
图3为本发明微流控芯片上层俯视图;
图4为本发明微流控芯片下层俯视图及部分放大图;
图5为本发明微流控芯片实验效果图(其中,横坐中的1为本发明的方法,2为磁珠方法,3为阴性对照)。
图中附图标记:1、芯片上层,2、芯片下层,3、试剂池,4、微流控通道,5、核酸扩增池,6、控制孔,7、磁珠固定区,8、微腔结构。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一
请参考图1、图2和图3,本发明的微流控芯片由芯片上层1和芯片下层2组成。其中芯片上层1的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS),厚度为3mm,上层包括有试剂池3、微流控通道4、核酸扩增池5和控制孔6。试剂池3为圆柱体通孔,直径为7mm,联通大气,底部与芯片下层2紧密贴合,形成用于储存试剂的小室,用于注入或混合试剂、样本等液体。微流控通道4位于芯片上层的底部,与芯片下层2紧密贴合,用于引导液体在芯片内的流动。宽度为0.5mm,高度为0.5mm。核酸扩增池5位于芯片上层1的底部,为椭圆形柱体,长轴为10mm,短轴为5mm,高度为1mm,与芯片下层2紧密贴合。微流控通道4一端与试剂池3相联通,另一端与控制孔6联通,中途连通经过核酸扩增池5。
如图4所示,芯片下层2的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS),芯片下层2厚度为0.5mm,其上相应于微流控通道4的区域设有磁珠固定区7,磁珠固定区域7内设有均匀排布的微腔结构8用于核酸的提取,微腔结构8是芯片下层2形成的向微流控通道4开口的凹陷。微腔结构8仅能容纳一个磁珠,在一个具体实施方式中,其为正方体,边长为8μm,深度为8μm。多个微腔结构8阵列为矩形阵列,行间距及列间距均为20μm。其中,在一个具体实施方式中,微腔结构采使用电解以其内均匀地附着镍,并通过化学修饰的方法增强其亲水性,以使磁珠更容易进入微腔结构内。
实施例二
下面提供一个利用本发明的微流控芯片用于核酸扩增及检测方法步骤说明。
所需实验试剂为:(1)直径5μm且表面有羟基修饰的磁珠;(2)细胞样品:人乳腺癌细胞HCC1954;(3)PCR引物:用扩增目的基因片段NM001289936.17/31,引物序列如下:
正向引物为:5’-CCAGTAGAATGGCCAGGACAA-3’
反向引物为:5’-TGGCTGCCAGGGTCTGA-3’。
通过以下步骤实现核酸提取与扩增:
(1)组装芯片:芯片上层1与芯片下层2通过等离子清洗剂处理后,共价交联,组装成为完整的微流控芯片。
(2)填充磁珠:在试剂池3中注入磁珠悬浮液,将医用注射器插入控制孔6中,吸取悬浮液至磁珠固定区域7,在磁珠固定区域7下部施加磁场,将磁珠固定于微腔结构8内,完成后将溶剂推回到试剂池3中,吸出弃掉。
(3)活化磁珠:在试剂池3中注入磁珠活化试剂,将磁珠活化试剂吸入微流控通道4内,磁珠固定区上方,活化磁珠。完成后,将试剂推回到试剂池3内,吸出弃掉。
(4)核酸提取:在试剂池3中注入细胞溶液、细胞裂解液和蛋白酶K,混合,反应。将其吸入微流控通道4内,磁珠固定区的上方,往复流动,使其充分反应,提取核酸,完成后,利用医用注射器将溶液推回到试剂池内,吸出。
(5)核酸洗脱:在试剂池3中注入核酸洗脱液,利用医用注射器将核酸洗脱液吸入微流控通道4内,磁珠固定区上方,往复流动,使其充分反应,洗脱核酸,完成后,利用医用注射器将样本核酸提取液推回到试剂池内。
(6)核酸扩增及检测:在试剂池3中注入核酸扩增相关试剂,与样本核酸提取液进行混合,利用医用注射器将混合液吸入核酸扩增池5内。撤出医用注射器,使用密封胶封闭控制孔和试剂池。将芯片放置于PCR仪器内,完成核酸扩增。其后,进行检测。
实验同时设置阴性对照,以及设置磁珠法作为对比实验。
磁珠法实验步骤如下:在离心管中加入细胞溶液、细胞裂解液、磁珠和蛋白酶K,混合,室温孵育。将离心管放置于磁力架上静置,待磁珠完全吸附时去除液体。将离心管从磁力架上取下,加入漂洗液,振荡混匀。将离心管放置于磁力架上静置,吸去液体。将离心管从磁力架上取下,再次加入漂洗液振荡混匀。将离心管放置于磁力架上静置,吸去液体。将离心管置于磁力架上,56℃晾干5分钟。将离心管从磁力架上取下,加入超纯水,56℃振荡混匀。将离心管放置于磁力架上静置,待磁珠完全吸附后,将核酸溶液转移至一个新离心管。在新离心管中加入核酸扩增相关试剂,进行PCR过程,完成核酸扩增后进行检测。
阴性对照实验:用超纯水代替细胞溶液,实验步骤与微流控芯片法相同。
结果如图5所示,经过40轮热循环过程后,通过荧光信号强度分析实验数据,观察到使用芯片时荧光强度得到了明显地提升,反应结束时荧光强度为单独使用磁珠方法的3倍,由此判断本发明的微流控通道可以有效提取并扩增核酸片段,而且效率高于磁珠法。
本发明使用微腔结构及磁力共同限制磁珠在芯片特定区域内,利用磁珠实现核酸提取;使用医用注射器抽动和推动微流控通道内液体,实现试剂的注入和废液的取出;利用芯片内的核酸扩增池扩增核酸。该芯片将核酸提取与扩增集成于一张芯片,方便操作,提高了核酸检测效率。
Claims (9)
1.一种微流控芯片,包括芯片上层(1)、芯片下层(2),芯片上层(1)与芯片下层(2)连接组装微完整的芯片,其特征在于:所述芯片上层(1)包括试剂池(3)、微流控通道(4)、核酸扩增池(5)和控制孔(6),所述微流控通道(4)一端与所述试剂池(3)相联通,另一端与所述控制孔(6)联通,中途连通经过所述核酸扩增池(5);
所述试剂池(3)为芯片上层(1)上的通孔,底部与所述芯片下层(2)贴合,形成用于储存试剂的小室;所述微流控通道(4)位于所述芯片上层(1)的底部,与所述芯片下层(2)贴合,形成引导液体在芯片内的流动通道;所述核酸扩增池(5)位于所述芯片上层(1)的底部,与所述芯片下层(2)贴合,形成核酸扩增区域;所控制孔(6)与所述核酸扩增池(5)联通,并且在所述芯片上层(1)形成开口;
所述芯片下层(2)对应于微流控通道(4)区域设置有磁珠固定区(7),所述磁珠固定区(7)内形成微腔结构(8),其是芯片下层(2)上形成的向微流控通道(4)开口的凹陷空间,以作为磁珠的容纳空间,微腔结构(8)处用于实现核酸的提取。
2.如权利要求1所述的一种微流控芯片,其特征在于,所述芯片上层(1)材料为塑料或橡胶,上层的厚度为3-10mm;优选地,所述芯片上层(1)材料为环烯烃类共聚物(COC)、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)或聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
3.如权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述试剂池(3)为圆柱体或长方体结构的;所述核酸扩增池(5)的形状为圆柱体、椭圆柱体、长方体或正方体形状。
4.如权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述芯片下层(2)的材质为塑料或橡胶,厚度为0.1-5.0mm;优选地,所述芯片下层(2)的材质为环烯烃类共聚物、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯或聚二甲基硅氧烷。
5.如权利要求1所述的微流控芯片,其特征在于,所述微腔结构(8)是长方体、正方体、圆柱体或者不规则的形状,所述微腔结构(8)仅能容纳一个磁珠;优选地,多个所述微腔结构(8)形成微腔结构阵列,所述微腔结构阵列是矩形阵列、圆形阵列或者不规则阵列。
6.如权利要求1至5任一项所述的微流控芯片,其特征在于,微腔结构通过修饰来增强其限制磁珠的能力,优选地通过使其内部均匀地附着传导磁场的物质,和/者通过化学修饰的方法增强其亲水性。
7.如权利要求1至5任一项所述的微流控芯片,其特征在于,芯片上层(1)与芯片下层(2)是通过等离子清洗处理后,经共价交联组装成微流控芯片。
8.一种利用权利要求1-7任意之一所述的微流控芯片用于核酸扩增及检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)填充磁珠:在试剂池中注入磁珠悬浮液,将注射器插入控制孔中,吸取悬浮液至磁珠固定区域,在磁珠固定区域下部施加磁场,将磁珠固定于微腔结构内,完成后将溶剂推回到试剂池中,吸出弃掉;
(2)活化磁珠:试剂池中注入磁珠活化试剂,将磁珠活化试剂吸入微流控通道内,磁珠固定区上方,活化磁珠,完成后,将试剂推回到试剂池内,吸出弃掉;
(3)核酸提取:在试剂池中注入细胞样品溶液、细胞裂解液和蛋白酶K,混合进行反应;将其吸入微流控通道内,磁珠固定区的上方,往复流动,充分反应提取核酸,完成后利用注射器将溶液推回到试剂池内,吸出;
(4)核酸洗脱:在试剂池中注入核酸洗脱液,利用注射器将核酸洗脱液吸入微流控通道内,磁珠固定区上方,往复流动,使其充分反应,洗脱核酸,完成后利用医用注射器将样本核酸提取液推回到试剂池内;
(5)核酸扩增:在试剂池中注入核酸扩增相关试剂,与样本核酸提取液进行混合,利用注射器将混合液吸入核酸扩增池内;撤出注射器,使用密封胶封闭控制孔和试剂池;将芯片放置于PCR仪器内,完成核酸扩增后。
9.一种利用权利要求8所述的方法,其特征在于,还包括检测步骤。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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