CN110616142A - 一种用于便携设备的核酸检测芯片及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于便携设备的核酸检测芯片及其使用方法。该芯片可实现样品核酸的自动化提取、扩增和检测过程。该芯片不需要复杂结构和微阀，大大降低了成本及批量生产的难度，同时降低外部控制系统的复杂度。芯片内部预装核酸纯化、扩增和检测试剂，常温保存，封闭式操作，可避免样本交叉污染和扩增产物气溶胶污染。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取、扩增检测技术领域，具体涉及一种微流控芯片及其使用方法。
背景技术
核酸是生命最基本的遗传物质，广泛存在于所有动植物、微生物细胞内。随着核酸分析技术的飞速发展，越来越多的学科领域把核酸的纯化、检测和分析作为主要技术手段。例如传染性疾病的预防、控制和诊疗，生物恐怖因子、食源性致病因子和突变基因成分鉴定，口岸卫生和有害生物防御性检疫。常用的核酸提取、纯化方法包括酚氯仿抽提法、离心柱法、磁珠法。提取过程复杂，操作繁琐，耗时长，还可能使用有毒试剂，降低了纯化核酸的得率、纯度及操作的安全性、一致性和重复性。
核酸扩增分析是核酸纯化后的主要检测技术之一，包括变温扩增和等温扩增。变温扩增又称聚合酶链式反应（PCR），是最早的核酸扩增技术，通过温度循环实现特异性引物探针与模版DNA之间的变性-复性而得到指数扩增的DNA片段。等温扩增技术可以在恒定温度下实现DNA分子的指数级扩增，摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了良好的应用前景。但是，由于核酸提取过程的复杂性和扩增检测技术的灵敏性，导致容易产生交叉污染，尤其是气溶胶污染，直接导致检测结果错误。
微流控芯片技术是在微尺度空间下，利用高度集成的功能单元实现多步骤的生化反应过程，减少人工操作，实现样品入-结果出（Sample in- Answer out），为生物医学诊断、分析化学、生命科学等领域提供自动化解决方案。微流控芯片的优势在于减小反应体系和所需试剂用量，大幅缩短样品处理时间，全封闭的芯片-试剂体系避免交叉污染，自动化控制减少人工操作过程，提高操作的一致性。利用微流控芯片集成核酸样本提取和检测分析等过程是近年来研究的热点。目前市场上缺少集成核酸纯化、扩增检测的微流控芯片产品，现有的微流控芯片研究主要集中在科研领域，集成度较高，芯片上设计大量微阀或精密结构，加大了芯片制作工艺的复杂度，批量生产困难，成本偏高，且外部控制系统复杂。
发明内容
为了克服上述技术中的缺陷，本发明提供了一种用于便携设备的核酸检测芯片，将核酸的提取、扩增和检测集成在微流控芯片上。芯片设计简单化，不需要复杂结构和微阀，易于实现量产。芯片上的液体流动用负压实现，简化外部控制系统。
同时，还提供所述核酸检测芯片的使用方法。
本发明第一个方面提供一种用于便携设备的核酸检测芯片。
本发明第一个方面所述的用于便携设备的核酸检测芯片由外功能区和内功能区两部分组成。其中，外功能区包含纯化试剂存储单元、废液单元和扩增检测单元；纯化试剂存储单元包含至少1个仓室及连通管道；废液单元至少包括一个废液室；扩增检测单元包含冻干珠室、干燥剂室、扩增反应室和连通管道。内功能区为圆形，内功能区包含核酸提取单元；核酸提取单元包含至少1个纯化室、至少1个入口和至少1个出口。外功能区和内功能区之间有密封圈，密封圈上设计有凸起式微通道。外功能区和内功能区可在外力作用下发生相对转动；其中，相对转动包括外功能区固定，内功能区旋转；内功能区固定，外功能区旋转；二者反向同时旋转。
优选的，上述用于便携设备的核酸检测芯片预装核酸纯化和扩增检测所需的反应试剂。
优选的，芯片表面平滑、透明，制作材料选用玻璃、硅、PMMA、环氧树脂、PTFE、PS、PC、COC、COP或PDMS的一种或多种组合。
优选的，纯化试剂存储单元含有1种以上核酸纯化试剂；扩增检测单元的冻干珠室内置可常温保存的核酸扩增反应试剂冻干珠；核酸提取单元内置超顺磁纳米磁珠。
优选的，连接外功能区和内功能区的密封圈材质包括硅胶、橡胶。
优选的，核酸提取纯化后的检测方法包括PCR扩增、RT-PCR扩增、等温扩增。
优选的，废液室与所述检测芯片外部的注射器相连，利用负压驱动液流。
优选的，废液室内含有吸水性材料，包括海绵、吸水树脂。
本发明第二个方面提供了上述用于便携设备的核酸检测芯片的使用方法，包括以下步骤:
1）将适量样品加入处理液中，混匀后注入上述芯片的相应仓室；
2）将所述芯片放置在配套的便携设备上；
3）注射器驱动含有样品的处理液匀速流经核酸提取单元，核酸被磁珠吸附；
4）电机驱动内功能区旋转，将入口连通至下一个仓室；
5）注射器驱动洗涤液匀速流经核酸提取单元，去除残留杂质；
6）电机驱动内功能区旋转，将入口连通至下一个仓室；
7）注射器驱动洗脱液匀速流经核酸提取单元，洗脱目的核酸并直接注入扩增检测单元；
8）含目的核酸的洗脱液流经冻干珠室时溶解核酸扩增反应试剂冻干珠并直接注入扩增反应室；
9）电机驱动内功能区旋转至初始位置，实现扩增反应室的密封；
10）进行扩增反应，同时读取荧光数据。
优选的，在进行步骤1）之前，用预处理液浸润核酸提取单元的纯化室和管道。
本发明所述的用于便携设备的核酸检测芯片集核酸提取、扩增和检测为一体，可实现样品核酸的自动化提取、扩增和检测过程，其有益效果在于：
A）核酸检测芯片设计简单化，不需要复杂结构和微阀，降低成本及批量生产的难度；
B）核酸检测芯片的废液室通过废液室连通孔与外部的注射器连接，通过负压配合内功能区的旋转进行液路控制，降低外部控制系统的复杂度，易于实现便携化；
C）芯片内部预装核酸纯化、扩增和检测试剂，常温保存，封闭式操作，可避免样本交叉污染和扩增产物气溶胶污染。
附图说明
图1为本发明用于便携设备的核酸检测芯片的结构示意图。
图2为本发明用于便携设备的核酸检测芯片中密封圈的结构示意图。
其中附图标记为：1、预处理液室，2、样品室，3、洗涤液I室，4、洗涤液II室，5、脱醇液室，6、洗脱液室，7、通气孔，8、储液室管道，9、外功能区限位槽，10、废液室，11、海绵，12、废液室管道，13、扩增反应室，14、冻干珠室，15、扩增反应室出口通道，16、废液室连通孔，17、U型管道，18、密封圈，19、纯化室入口，20、纯化室出口，21、纯化室，22、干燥剂室，23、凸起式微通道。
具体实施方式
接下来将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是示例性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
同时，为了便于描述，附图中所示的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。
实施例1。
如图1所示，本发明公开的用于便携设备的核酸检测芯片由外功能区和内功能区两部分组成。其中，外功能区为圆形，可以通过外功能区限位槽（9）进行位置固定，外功能区包含纯化试剂存储单元、废液单元和扩增检测单元。
纯化试剂存储单元依次包含预处理液室（1），样品室（2），洗涤液I室（3），洗涤液II室（4），脱醇液室（5），洗脱液室（6），每一个储液室均含有通气孔（7）用于注入试剂或与外界通气。
纯化试剂存储单元的储液室依次装有核酸纯化试剂，预处理液室（1）含有预处理液，样品室（2）用于存放含有样品的处理液，洗涤液I室（3）含有洗涤液I，洗涤液II室（4）含有洗涤液II，脱醇液室（5）含有脱醇液，洗脱液室（6）含有洗脱液。
废液单元包含废液室（10）、废液室管道（12）和废液室连通孔（16），其中废液室（10）内含有一块海绵（11）用于吸附注入废液室的液体避免倒流。
扩增检测单元包含冻干珠室（14）、干燥剂室（22）、扩增反应室（13）和扩增反应室出口通道（15）。其中，扩增检测单元的冻干珠室（14）内置可常温保存的核酸扩增反应试剂冻干珠和特异性引物探针冻干珠。干燥剂室（22）装有干燥剂用于避免核酸扩增反应试剂冻干珠和特异性引物探针冻干珠吸湿而降低活性。
内功能区为圆形，可通过旋转实现与外功能区相应管道和腔室的连通或封闭。内功能区主要包含核酸提取单元。
核酸提取单元包含纯化室（21）、纯化室入口（19）、纯化室出口（20）和U型管道（17），其中U型管道（17）的功能是在特定位置连通扩增检测单元的扩增反应室出口通道（15）和废液室管道（12），以利于扩增反应液注入扩增反应室（13）。
纯化室（21）为蛇形结构，可以降低液体表面张力，有利于液体控制。
纯化室入口（19）和纯化室出口（20）呈180度角。
纯化室（21）内装有超顺磁纳米磁珠。其制作方法为用0.2M海藻糖，10mM Tris，1mMEDTA，ph7.5的缓冲液洗涤200nm单分散超顺磁纳米磁珠3次；用缓冲液回溶超顺磁纳米磁珠至终浓度25mg/ml；取50ul磁珠液注入纯化室（21）中央；65度烘干，可室温保存。
外功能区与圆形的内功能区通过密封圈（18）连接，密封圈上设计有凸起式微通道（23）。密封圈（18）上设计的部分凸起式微通道（23）与纯化试剂存储单元的储液室管道（8）位置对应。
密封圈（18）采用橡胶材质，注塑而成，用环氧树脂胶固定于外功能区和内功能区之间交汇处。该密封圈（18）是实现芯片液路控制的关键，其上的凸起式微通道（23）在内功能区转动过程中因挤压变形可实现外功能区和内功能区之间的封闭或连通。
上述用于便携设备的核酸检测芯片表面平滑、透明，选用COC材料，芯片制作过程如下：
通过注塑法分别制作内功能区和外功能区结构部件；
利用热压封装技术分别制成内功能区和外功能区；
将橡胶材质的密封圈（18）粘在外功能区中心内侧相应位置；
将内功能区嵌入外功能区中心位置。
核酸提取纯化后用PCR扩增技术进行扩增和实时荧光定量检测。
上述用于便携设备的核酸检测芯片的废液室（10）通过废液室连通孔（16）与芯片外部的注射器相连，利用负压驱动液流。具体操作原理是，当内功能区旋转到特定位置，内功能区的纯化室入口（19）与纯化试剂存储单元的储液室对应，此时密封圈（18）上相应的凸起式微通道（23）处于松弛状态，管道畅通。同时纯化室出口（20）与废液室管道对应。此时抽吸注射器，利用负压将储液室的试剂抽到纯化室（21）并最终进入废液室（10）。同理，当内功能区旋转到下一个特定位置，内功能区的纯化室入口（19）与纯化试剂存储单元的储液室错位，同时纯化室出口（20）与废液室管道也发生错位，导致此时密封圈（18）上相应的凸起式微通道（23）处于变形状态，管道封闭。
实施例2。
用于便携设备的核酸检测芯片的结构同实施例1。该芯片的使用方法如下:
1）将等量样品加入处理液中，混匀后注入上述芯片的样品室（2）；
2）将所述芯片放置在配套的便携设备上；设备初始化，内功能区连接预处理液室（1）和废液室（10），用预处理液浸润核酸提取单元的纯化室（21）和相应管道，并复溶干粉状的超顺磁纳米磁珠，开启外加磁场吸附磁珠后，将预处理液抽吸入废液室（10）；
3）电机旋转内功能区，连通样品室（2）、纯化室（21）和废液室（10）；
4）注射器抽吸含有样品的处理液匀速流经纯化室（21），核酸被磁珠吸附；
5）电机旋转内功能区，连通洗涤液I室（3）、纯化室（21）和废液室（10）；
6）注射器抽吸洗涤液I匀速流经纯化室（21），去除残留杂质；
7）电机旋转内功能区，连通洗涤液II室（4）、纯化室（21）和废液室（10）；
8）注射器抽吸洗涤液II匀速流经纯化室（21），进一步去除残留杂质和残留洗涤液I；
9）电机旋转内功能区，连通脱醇液室（5）、纯化室（21）和废液室（10）；
10）注射器抽吸脱醇液快速流经纯化室（21），去除残留洗涤液II；
11）电机旋转内功能区，连通洗脱液室（6）、纯化室（21）和废液室（10）；
12）注射器抽吸洗脱液匀速流经纯化室（21），洗脱目的核酸后流经冻干珠室（14）并最终到达扩增反应室（13）；
13）电机旋转内功能区至初始位置，封闭所有腔室管道；
14）进行PCR扩增反应，实时读取荧光信号。
上述附图及实施例仅用于说明本发明，在由本发明权利要求所限定的发明实质和范围内对本发明进行细微的改变均落在本发明的保护范围内。如微流控芯片的材质、形状及尺寸，腔室的形状、尺寸，各类功能性及连接性通道的形状、尺寸等。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于便携设备的核酸检测芯片，其特征在于，所述芯片由外功能区和内功能区组成；所述外功能区包含纯化试剂存储单元、废液单元和扩增检测单元；所述内功能区为圆形；所述内功能区包含核酸提取单元；所述核酸提取单元包含至少1个纯化室、至少1个入口和至少1个出口；所述废液单元至少包括一个废液室；所述外功能区和内功能区之间有密封圈；更具体的是：
所述纯化试剂存储单元包含至少1个仓室及连通管道；
所述扩增检测单元包含冻干珠室、干燥剂室、扩增反应室和连通管道；
所述密封圈上设计有凸起式微通道；
所述外功能区和内功能区可在外力作用下发生相对转动；
所述相对转动包括外功能区固定，内功能区旋转；内功能区固定，外功能区旋转；二者反向同时旋转；
所述芯片预装核酸纯化和扩增检测所需的反应试剂。
2.如权利要求1所述的用于便携设备的核酸检测芯片，其特征在于，所述芯片表面平滑、透明，制作材料选用玻璃、硅、PMMA、环氧树脂、PTFE、PS、PC、COC、COP或PDMS的一种或多种组合。
3.如权利要求1所述的用于便携设备的核酸检测芯片，其特征在于，纯化试剂存储单元含有1种以上核酸纯化试剂；扩增检测单元的冻干珠室内置可常温保存的核酸扩增反应试剂冻干珠；核酸提取单元内置超顺磁纳米磁珠。
4.如权利要求1所述的用于便携设备的核酸检测芯片，其特征在于，所述密封圈材质包括硅胶、橡胶。
5.如权利要求1所述的用于便携设备的核酸检测芯片，其特征在于，核酸检测方法包括PCR扩增、RT-PCR扩增、等温扩增。
6.如权利要求1所述的用于便携设备的核酸检测芯片，其特征在于，所述废液室与所述芯片外部的注射器相连，负压驱动液体流动。
7.如权利要求1所述的用于便携设备的核酸检测芯片，其特征在于，废液室内含有吸水性材料，包括海绵、吸水树脂。
8.一种使用如权利要求1～7任一项所述的用于便携设备的核酸检测芯片的使用方法，其特征在于，包括以下步骤:
1）将适量样品加入处理液中，混匀后注入所述芯片的相应仓室；
2）将所述芯片放置在配套的便携设备上；
3）注射器驱动含有样品的处理液匀速流经核酸提取单元，核酸被磁珠吸附；
4）电机驱动内功能区旋转，将入口连通至下一个仓室；
5）注射器驱动洗涤液匀速流经核酸提取单元，去除残留杂质；
6）电机驱动内功能区旋转，将入口连通至下一个仓室；
7）注射器驱动洗脱液匀速流经核酸提取单元，，洗脱目的核酸并直接注入扩增检测单元；
8）含目的核酸的洗脱液流经冻干珠室时溶解核酸扩增反应试剂冻干珠并直接注入扩增反应室；
9）电机驱动内功能区旋转至初始位置，实现扩增反应室的密封；
10）进行扩增反应，同时读取荧光数据。
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