CN112481080A - 一种微流控芯片、微流控芯片制备方法及核酸提取方法 - Google Patents

一种微流控芯片、微流控芯片制备方法及核酸提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供的一种微流控芯片、微流控芯片制备方法及核酸提取方法，基于微流控技术，设计并制备一种特征为微柱阵列结构的微流控芯片，结合表面改性修饰化学基团，利用微柱微小尺寸所提供的比表面积大的特性，在临床液体样本如血液、尿液、唾液等流经时，以共价结合、静电吸附等作用捕获样本中的核酸分子。经过洗涤液将其余杂质排除后，通过合适的洗脱缓冲液将微柱上捕获的核酸分子洗脱、收集。同时，微流控技术的特性，允许低至微升级别的样本在微尺度下充分与微柱吸附载体接触，从而提取足量的核酸分子以进行下游的生化检测流程。

Description

一种微流控芯片、微流控芯片制备方法及核酸提取方法
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，特别涉及一种微流控芯片、微流控芯片制备方法及核酸提取方法。
背景技术
生物标志物作为生物学过程、病理过程或治疗干预药理学反应的指示因子，在生命健康领域吸引了海量的科学研究，其围绕生物标志物的发现、筛选、验证及应用等环节而延伸的相关产业也在不断发展。其中，核酸作为生物标志物，相比其他类型的生物标志物如糖类、蛋白类等更具敏感性和特异性，其检测成本也更低。同时，核酸标志物也更能反映细胞动态和调控过程，对于研究疾病的基因调制、免疫调控通路机制具有重大的意义。
在研究核酸标志物的过程中，尤其在早期疾病诊断方面，存在如单一标志物可信度差、特异性标志物丰度低等问题。现阶段多以测序或基因芯片等技术进行检测及下游的分析研究，成本高，耗时长，且具有一定错误率，极大限制了其市场的应用推广。归根到底，尤其在临床检测中，对微量样本中的低含量核酸进行有效提取、富集成为研究核酸的重要前提。
传统的核酸提取方式主要分为液相和固相两种方式。液相方法通过使用化学试剂指向性分离液体样本中的核酸分子，如密度梯度离心法、苯酚-氯仿、热裂解碱法等。液相提取法耗时长，提取效率低，分离不完全致使有害化学物质残余，逐渐被以固相吸附支持物为基础的方法所替代。常见的固相材料有硅胶柱、磁珠等。在固相提取过程中，在适当的缓冲液中核酸分子与固相支持物产生交联、吸附，在去除液相杂质后，再将吸附在固相支持物上的核酸分子进行洗脱、收集。硅胶柱法纯化核酸的纯度、回收效率较优，但样本耗费量较大，且需要快速离心、抽滤等步骤，不便于高通量、自动化操作；而磁珠法利用磁场代替离心分离，容易实现自动化、标准化流程，在对于自动化高通量需求日益增长的临床分子诊断、疾病检测等场景显现优势，但其提取核酸的纯度、回收效率往往不如硅胶柱法。
另外，上述传统的核酸提取方式涉及多个不同的仪器及反应体系，大量步骤需要在专业实验室中由专业人员进行人手操作，成本高，标准化程度低。在床旁检测需求日益提升的现下，能够对微量临床样本进行核酸有效提取、分离的微型化、自动化芯片逐渐成为了业界的一大发展方向。
发明内容
鉴于此，有必要提供一种能够对微量临床样本进行核酸有效提取、分离的微型化及集成化程度高的筛选效率高的微流控芯片。
为解决上述问题，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了一种微流控芯片，包括至少一层芯片单元，所述芯片单元包括进样口、核酸提取单元及出样口，包括核酸分子的液体样本由所述进样口通入所述芯片单元，所述核酸提取单元包括微柱阵列，所述微柱阵列吸附所述核酸分子，所述出样口收集所述核酸分子，所述圆柱状直径为1～1000微米，相邻圆柱间距为0.5～500微米，所述芯片单元的深度为10～2000微米，宽度为10～5000微米。
在其中一些实施例中，所述微柱阵列呈圆柱状或方形或菱形。
在其中一些实施例中，所述液体样本的种类为血液或尿液或唾液。
第二方面，本发明还提供了一种所述的微流控芯片的制备方法，包括下述步骤：
在衬底上形成一层正性光刻胶，利用相应的微柱阵列掩膜版曝光形成微柱阵列阳膜，作为下一步刻蚀的牺牲层；
以所述微柱阵列阳膜层为掩膜，刻蚀所述的牺牲层，形成了最终的微柱阵列，并去除剩余的微柱阵列阳膜层；
对带有微柱阵列结构的芯片进行表面化学处理，实现芯片表面的亲水化处理，所述微流控芯片包括进样口、核酸提取单元及出样口，包括核酸分子的液体样本由所述进样口通入所述芯片单元，所述核酸提取单元包括微柱阵列，所述微柱阵列吸附所述核酸分子，所述出样口收集所述核酸分子。
在其中一些实施例中，所述衬底包括玻璃材料或硅基材料；所述玻璃材料为石英，所述硅基材料为氧化硅或氮化硅。
在其中一些实施例中，所述阳膜牺牲层为光刻胶，所述光刻胶包括正性光刻胶或负性光刻胶。
在其中一些实施例中，在以所述微柱阵列阳膜层为掩膜，刻蚀所述的牺牲层，形成了最终的微柱阵列，并去除剩余的微柱阵列阳膜层的步骤中，所述刻蚀包括等离子体刻蚀、深硅刻蚀以及湿法刻蚀，所述去除工艺包括采用浓硫酸或双氧水清洗以去除剩余的微柱阵列阳膜层。
在其中一些实施例中，在对带有微柱阵列结构的芯片进行表面化学处理，实现芯片表面的活化处理的步骤中，具体为：
所采用3-氨丙基三乙氧基硅烷对带有微柱阵列结构的芯片进行表面化学处理，实现芯片表面的胺化处理，所述表面化学处理包括熏蒸或浸泡或喷涂。
第三方面，本发明还提供了一种所述的微流控芯片实现片上核酸提取方法，包括下述步骤：
在所述微流控芯片的进样口加入液体样本；
所述液体样本在外源压力驱动下，通过所述微柱阵列结构，所述液体样本里的核酸分子会不断吸附于所述微柱阵列结构上；
在所述微流控芯片的进样口加入洗涤缓冲液，以使所述微流控芯片上仅存被所述微柱阵列所吸附的核酸分子；
在所述微流控芯片的进样口加入洗脱缓冲液，被所述微柱阵列所吸附的核酸分子会被洗脱，最后经由所述微流控芯片的出样口进行收集。
在其中一些实施例中，还包括：在将所述微流控芯片的进样口加入液体样本的步骤之前，还包括对所述液体样本进行预处理的步骤，所述预处理包括：使所述液体样本中的细胞裂解，从而释放出目的核酸；或者将所述液体样本中的细胞去除，获得含有游离核酸的液态样本。采用上述技术方案，本发明实现的技术效果如下：
第一方面，本发明提供的微流控芯片，包括至少一层芯片单元，所述芯片单元包括进样口、核酸提取单元及出样口，包括核酸分子的液体样本由所述进样口通入所述芯片单元，所述核酸提取单元包括微柱阵列，所述微柱阵列吸附所述核酸分子，所述出样口收集所述核酸分子，本发明提供的微流控芯片，通过微柱阵列能够实现对微量临床样本(如血液、尿液、唾液)进行有效的核酸提取，在集成化、微小型化的床旁即时检测领域展现巨大的应用潜力。
第二方面，本发明提供的微流控芯片的制备方法，此方法简便、快速。
第三方面，本发明提供了一种所述的微流控芯片实现片上核酸提取方法，利用微柱阵列结构的微流控芯片，结合表面改性修饰化学基团，利用微柱微小尺寸所提供的比表面积大的特性，在临床液体样本如血液、尿液、唾液等流经时，以共价结合、静电吸附等作用捕获样本中的核酸分子，经过洗涤液将其余杂质排除后，通过合适的洗脱缓冲液将微柱上捕获的核酸分子洗脱、收集。同时，微流控技术的特性，允许低至微升级别的样本在微尺度下充分与微柱吸附载体接触，从而提取足量的核酸分子以进行下游的生化检测流程，且在后期可以结合精密机械制件，光电单元，先进算法等模块，有利于发展便携式、自动化、标准化的床旁快速核酸提取卡盒仪器。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的微柱阵列的结构俯视图；
图2为本发明实施例1提供的微柱阵列结构的侧视图；
图3为本发明实施例2提供的微流控芯片的制备方法的步骤流程图；
图4为本发明实施例3提供的微流控芯片实现片上核酸提取方法的步骤流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明提供的一种微流控芯片、微流控芯片制备方法及核酸提取方法，基于微流控技术，设计并制备一种特征为微柱阵列结构的微流控芯片，结合表面改性修饰化学基团，利用微柱微小尺寸所提供的比表面积大的特性，在临床液体样本如血液、尿液、唾液等流经时，以共价结合、静电吸附等作用捕获样本中的核酸分子。经过洗涤液将其余杂质排除后，通过合适的洗脱缓冲液将微柱上捕获的核酸分子洗脱、收集。同时，微流控技术的特性，允许低至微升级别的样本在微尺度下充分与微柱吸附载体接触，从而提取足量的核酸分子以进行下游的生化检测流程。
此外，由于采取微流控技术，本发明中所述的片上核酸提取流程能够结合精密机械制件、光电模块、先进算法等实现小型化、集成化的核酸提取/检测卡盒，在未来智能化、自动化的个人医疗健康领域展现潜力。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
请参阅图1及图2，为本发明一实施方式提供的微流控芯片100的结构示意图，包括至少一层芯片单元，所述芯片单元包括进样口(图未示)、核酸提取单元110及出样口(图未示)，所述核酸提取单元110包括微柱阵列111，所述圆柱状直径为1～1000微米，相邻圆柱间距为0.5～500微米，所述芯片单元的深度为10～2000微米，宽度为10～5000微米。上述微流控芯片的工作方式如下：包括核酸分子的液体样本由所述进样口通入所述芯片单元，所述核酸提取单元110的微柱阵列111吸附所述核酸分子，所述出样口收集所述核酸分子。
可以理解，微柱阵列提供的大比表面积特性，提供大量的核酸捕获位点，有效吸附大量的核酸(捕获总量)/有效捕获液体样本中游离的稀少核酸(低浓度)。
可以理解，微柱阵列111大小尺寸和相邻间距可设计为不同尺寸。需要说明的是，一般来说，微柱尺寸越小，相邻间距越小，比表面积越大，即能有效吸附核酸分子的表面面积越大；但随着微柱阵列特征尺寸缩小，根据输入样本的种类不同(血液、尿液、唾液等)，存在尺寸不一的细胞、细菌、固形物等成分可能会被小尺寸的微柱阵列所过滤，造成堵塞，抑或经过吸附、洗涤、洗脱等过程后其组成成分作为杂质掺杂在富集提取的核酸分子中，造成污染。
可以理解，上述微流控芯片入口不局限于一个进样口，可以设计为多个入口，结合液体样本的不同加入相应的如细胞裂解液、蛋白酶等缓冲液，优化对液体样本进行核酸提取的芯片上预处理步骤。
在其中一些实施例中，所述液体样本的种类为血液或尿液或唾液。可以理解，液体样本并不局限上述种类。
在其中一些实施例中，所述微柱阵列111呈圆柱状或方形或菱形，实际中并不局限上述形状，只要满足特征尺寸不小于实验所需分离对象即可。
可以理解，任意一层所述芯片单元通过微柱阵列结构的高比表面积，针对于尤其是微量液体样本中的核酸分子进行高效地捕获、吸附，最终能被提取、收集到足够量的核酸分子用于下游的检测。
需要说明的是，在微柱阵列111特征尺寸不变的情况下，芯片上的微柱阵列尺寸越大，微柱阵列的实用面积越大，对核酸分子的提取容量越大，能够处理核酸含量更高的样本；另一方面，尺寸越大的微柱阵列会导致芯片的样本消耗量增大，耗时也会增大，因此根据不同场合所需求的不同侧重点，微柱阵列的宽度与深度可设计为不同尺寸，使最终芯片实现不同的应用要求。
进一步地，上述芯片结构不局限于单层结构，也可以结合不同的液路控制以及生化实验片上模块拓展为多层结构或者与微柱阵列分别位于不同的基底层，只要满足微柱阵列结构和微柱阵列能互相结合即可。
可以理解，上述芯片结构具有可拓展性，芯片中微柱阵列的尺寸、数量、间距、圈数、空间排布可以根据不同的生物分离对象、分离效率、通量要求进行设计。
本发明提供的微流控芯片，通过微柱阵列能够实现对微量临床样本(如血液、尿液、唾液)进行有效的核酸提取，在集成化、微小型化的床旁即时检测领域展现巨大的应用潜力。
实施例2
请参阅图3，为本发明实施例2提供的所述的微流控芯片的制备方法，包括下述步骤：
步骤S110：在衬底上形成一层正性光刻胶，利用相应的微柱阵列掩膜版曝光形成微柱阵列阳膜，作为下一步刻蚀的牺牲层。
可以理解，本发明中所述衬底可以是能够被微纳加工方法制造的材料，如单晶硅、氧化硅、氮化硅等硅基材料，如石英等玻璃材料，如聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl methacrylate,PMMA)等高分子材料都在保护范围内。
步骤S120：以所述微柱阵列阳膜层为掩膜，刻蚀所述的牺牲层，形成了最终的微柱阵列，并去除剩余的微柱阵列阳膜层。
在其中一些实施例中，所述阳膜牺牲层为光刻胶，所述光刻胶包括正性光刻胶或负性光刻胶。
步骤S130：对带有微柱阵列结构的芯片进行表面化学处理，实现芯片表面的亲水化处理，所述微流控芯片包括进样口、核酸提取单元及出样口，包括核酸分子的液体样本由所述进样口通入所述芯片单元，所述核酸提取单元包括微柱阵列，所述微柱阵列吸附所述核酸分子，所述出样口收集所述核酸分子。
进一步地，所述刻蚀包括等离子体刻蚀、深硅刻蚀以及湿法刻蚀，所述去除工艺包括采用浓硫酸或双氧水清洗以去除剩余的微柱阵列阳膜层。
在其中一些实施例中，在对带有微柱阵列结构的芯片进行表面化学处理，实现芯片表面的亲水化处理的步骤中，具体为：所采用3-氨丙基三乙氧基硅烷((3-aminopropyl)triethoxysilane,APTES)对带有微柱阵列结构的芯片进行表面化学处理，实现芯片表面的亲水化处理，所述表面化学处理包括熏蒸或浸泡或喷涂。
进一步地，芯片表面化学处理试剂不局限于APTES，还可以采用琥珀酸酐、戊二醛等试剂对表面进行羧基化、醛基化等处理。
进一步地，芯片表面化学处理方法不局限于浸泡、熏蒸、喷涂等化学方法，还可以采用电化学、热加工、气相沉积等方法。
可以理解，芯片表面化学处理方式具有简单和设计灵活的特点，可根据不同的液体样本所需要不同的杂质分离条件，实现对核酸分子不同的吸附效果(比如静电吸附、共价结合等方式)。
本发明上述实施例2提供的微流控芯片的制备方法，工艺简单，经表面处理后的芯片表面活化，使芯片表面嫁接相应的功能基团，通过共价结合、静电吸附等方式对样本中的核酸分子进行捕获；提高芯片表面物化性质的均一性和稳定性，以阻隔基底对血液中细胞、蛋白的非特异性吸附，使全血样品通过时不容易发生粘附、停滞。
实施例3请参阅图4，为本发明实施例3提供的所述的微流控芯片实现片上核酸提取方法，包括下述步骤：
步骤S210：在所述微流控芯片的进样口加入液体样本。
在本实施例中，芯片所实现的全血分离所用对象可以是未经处理的血液、经过抗凝处理的血液、稀释过的血液等。
进一步地，还包括：在将所述微流控芯片的进样口加入液体样本的步骤之前，还包括对所述液体样本进行预处理的步骤，所述预处理包括：使所述液体样本中的细胞裂解，从而释放出目的核酸；或者将所述液体样本中的细胞去除，获得含有游离核酸的液态样本。
步骤S220：所述液体样本在外源压力驱动下，通过所述微柱阵列结构，所述液体样本里的核酸分子会不断吸附于所述微柱阵列结构上。
步骤S230：在所述微流控芯片的进样口加入洗涤缓冲液，以使所述微流控芯片上仅存被所述微柱阵列所吸附的核酸分子。
可以理解，完成液体样本的注入后，在芯片进样口加入洗涤缓冲液，芯片中残留的细胞、蛋白等杂质会被清洗，芯片上仅存被微柱阵列所吸附的核酸分子。
步骤S240：在所述微流控芯片的进样口加入洗脱缓冲液，被所述微柱阵列所吸附的核酸分子会被洗脱，最后经由所述微流控芯片的出样口进行收集。可以理解，本发明实施例中的芯片不局限于全血/血浆分离，也可以用于分离、富集溶液体系中不同层次的生物对象如细胞层面的循环肿瘤细胞，如亚细胞层面的细胞外囊泡、脂质体等。
本发明上述实施例3提供了一种所述的微流控芯片实现片上核酸提取方法，利用微柱阵列结构的微流控芯片，结合表面改性修饰化学基团，利用微柱微小尺寸所提供的比表面积大的特性，在临床液体样本如血液、尿液、唾液等流经时，以共价结合、静电吸附等作用捕获样本中的核酸分子，经过洗涤液将其余杂质排除后，通过合适的洗脱缓冲液将微柱上捕获的核酸分子洗脱、收集。同时，微流控技术的特性，允许低至微升级别的样本在微尺度下充分与微柱吸附载体接触，从而提取足量的核酸分子以进行下游的生化检测流程，且在后期可以结合精密机械制件，光电单元，先进算法等模块，有利于发展便携式、自动化、标准化的床旁快速核酸提取卡盒仪器。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，仅具体描述了本发明的技术原理，这些描述只是为了解释本发明的原理，不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处解释，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进，及本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其他具体实施方式，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种微流控芯片，其特征在于，包括至少一层芯片单元，所述芯片单元包括进样口、核酸提取单元及出样口，所述核酸提取单元包括微柱阵列，包括核酸分子的液体样本由所述进样口通入所述芯片单元，所述微柱阵列吸附所述核酸分子，所述出样口收集所述核酸分子，所述圆柱状直径为1～1000微米，相邻圆柱间距为0.5～500微米，所述芯片单元的深度为10～2000微米，宽度为10～5000微米。
2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微柱阵列呈圆柱状或方形或菱形。
3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述液体样本的种类包括但不限于血液或尿液或唾液。
4.一种如权利要求1所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
在衬底上形成一层正性光刻胶，利用相应的微柱阵列掩膜版曝光形成微柱阵列阳膜，作为下一步刻蚀的牺牲层；
以所述微柱阵列阳膜层为掩膜，刻蚀所述的牺牲层，形成了最终的微柱阵列，并去除剩余的微柱阵列阳膜层；
对带有微柱阵列结构的芯片进行表面化学处理，实现芯片表面的活化处理，所述微流控芯片包括进样口、核酸提取单元及出样口，包括核酸分子的液体样本由所述进样口通入所述芯片单元，所述核酸提取单元包括微柱阵列，所述微柱阵列吸附所述核酸分子，所述出样口收集所述核酸分子。
5.如权利要求4所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述衬底包括玻璃材料或硅基材料；所述玻璃材料为石英，所述硅基材料为氧化硅或氮化硅。
6.如权利要求5所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述阳膜牺牲层为光刻胶，所述光刻胶包括正性光刻胶或负性光刻胶。
7.如权利要求6所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，在以所述微柱阵列阳膜层为掩膜，刻蚀所述的牺牲层，形成了最终的微柱阵列，并去除剩余的微柱阵列阳膜层的步骤中，所述刻蚀包括等离子体刻蚀、深硅刻蚀以及湿法刻蚀，所述去除工艺包括采用浓硫酸或双氧水清洗以去除剩余的微柱阵列阳膜层。
8.如权利要求4所述的微流控芯片的制备方法，其特征在于，在对带有微柱阵列结构的芯片进行表面化学处理，实现芯片表面的活化处理的步骤中，具体为：
所采用3-氨丙基三乙氧基硅烷对带有微柱阵列结构的芯片进行表面化学处理，实现芯片表面的胺化处理，所述表面化学处理包括熏蒸或浸泡或喷涂。
9.一种如权利要求1所述的微流控芯片实现片上核酸提取方法，其特征在于，包括下述步骤：
在所述微流控芯片的进样口加入液体样本；
所述液体样本在外源压力驱动下，通过所述微柱阵列结构，所述液体样本里的核酸分子会不断吸附于所述微柱阵列结构上；
在所述微流控芯片的进样口加入洗涤缓冲液，以使所述微流控芯片上仅存被所述微柱阵列所吸附的核酸分子；
在所述微流控芯片的进样口加入洗脱缓冲液，被所述微柱阵列所吸附的核酸分子会被洗脱，最后经由所述微流控芯片的出样口进行收集。
10.如权利要求9所述的微流控芯片实现片上核酸提取方法，其特征在于，还包括：在将所述微流控芯片的进样口加入液体样本的步骤之前，还包括对所述液体样本进行预处理的步骤，所述预处理包括：使所述液体样本中的细胞裂解，从而释放出目的核酸；或者将所述液体样本中的细胞去除，获得含有游离核酸的液态样本。
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