CN114561448B

CN114561448B - 病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用

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Publication number: CN114561448B
Application number: CN202210456780.5A
Authority: CN
Inventors: 郭弘妍; 王辉; 李雅婷; 赵建晴; 程京
Original assignee: CapitalBio Corp; Guangzhou National Laboratory
Current assignee: CapitalBio Corp; Guangzhou National Laboratory
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-04-28
Also published as: CN114561448A

Abstract

本发明涉及核酸提取领域，尤其涉及病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用。本发明提供了样品处理液，其中组分1包括液化缓冲液：0.5~1.5 mg/mL蛋白酶K；组分2包括样品保存液：Tris‑HCl 10~25 mM，Triton X‑100 0.1~0.5%（v/v），DTT 1~10 mM，BSA 0.5~1 mg/mL，DMSO 0.2~0.5%（v/v），乙酰半胱氨酸0.1~0.2 M，TCEP‑HCl 2.5~10 mM。本发明病毒核酸提取无NaOH液化步骤，不降解或破坏病毒RNA核酸，回收纯化的核酸，可用于后续检测，具有病毒核酸回收率高、用时少、操作方便、易于临床推广的特点。

Description

病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用

技术领域

本发明涉及核酸提取领域，尤其涉及病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用。

背景技术

痰是人体呼吸道的分泌物，它是通过支气管纤毛运动上皮纤毛的运动，从肺部向上呼吸道推动，最后，通过人的正常咳嗽反射从气管内咳出排出体外，当气管、支气管和肺受到有害因素的刺激或致病菌感染而发生炎症时，呼吸道的粘膜充血、水肿，大量炎性细胞浸润，血管扩张，渗出增加，粘液分泌增多，产生一些变性坏死组织细胞，滞留支气管内，粘液和这些变性坏死的组织细胞就构成了痰。正常人一般不咳痰或者仅有少量泡沫样痰或粘液痰。当呼吸道病变，呼吸道粘膜收到刺激，分泌物增多，痰也增多。痰液中的细菌病毒等病原微生物核酸是呼吸道感染等疾病分子诊断的重要标本。从呼吸道痰液脱落细胞中提取的病原微生物核酸通过分子生物学检测手段进行基因检测，可用于呼吸道感染的快速诊断。

肺泡灌洗液是应用纤维支气管镜对支气管以下肺段和亚肺段进行灌洗后，采集肺泡表面衬液可获得肺泡灌洗液，对其进行实验室检查可为临床诊断、鉴别诊断、治疗效果评价和判断预后提供参考。当肺部感染或发生病变时，肺泡灌洗液含有大量的血细胞、脓液或粘液。

传统的痰液或含痰肺泡灌洗液病原体核酸提取方法为：用氢氧化钠消化痰液，然后高速离心收集沉淀，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，离心收集菌体，再利用高温煮沸，裂解核酸，然后高速离心，取上清为致病的核酸。此过程需要反复离心，操作复杂，在消化和提取的过程中损失大量核酸，同时杂质去除率低。而且这种方法不适用于痰液中病原体RNA的提取，不具有通用性，限制了临床上通过痰液或含痰肺泡灌洗液进行呼吸道感染等疾病的临床诊断。

此外，含痰样本中的核酸(尤其是RNA)极不稳定，通常在温室条件下数小时就被降解。然而在临床检测中，往往不能及时处理和检测痰液样本中的核酸，因此发明一种能够快速充分液化痰液同时有效保护样本核酸的方法十分必要。目前已公开的关于痰液液化及核酸保护的发明较多。然而，这些方法普遍存在成分复杂、成本高、样本混匀及液化不充分等问题。

含痰样本具有粘度大、蛋白多、不易液化、易成团等特点，将痰液加入常规液体保护剂后，痰液易与保护剂分层，保护剂与痰液样本接触面有限，液化时间长。有些专利涉及的保护剂成分比较复杂，如含有防腐剂、缓冲剂、螯合剂、酶抑制剂、固定剂等，保护剂成分多且成本高，不适合临床广泛使用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用。本发明相比较于传统痰液的病毒提取方法，本方法痰液病毒核酸提取无NaOH液化步骤，不对病毒RNA核酸产生降解或破坏。本发明痰液病毒核酸提取方法，回收纯化的核酸，可用于病毒核酸的检测，包括PCR、NASBA、LAMP、RPA等，相比较于传统痰液病毒核酸提取方法，具有病毒核酸回收率高、用时少、操作方便、易于临床推广的特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了样品处理液，包括组分1和组分2；

上述组分1包括液化缓冲液，上述液化缓冲液包括：0.5~1.5 mg/mL蛋白酶K；

上述组分2包括样品保存液，上述样品保存液包括如下组分：

Tris-HCl 10~25 mM

Triton X-100 0.1~0.5%（v/v）

DTT 1~10 mM

BSA 0.5~1 mg/mL

DMSO 0.2~0.5%（v/v）

乙酰半胱氨酸 0.1~0.2 M

TCEP-HCl 2.5~10 mM。

在本发明的一些实施方案中，组分1具有液化痰液、组分2具有保存病毒核酸的作用。

本发明还提供了提取试剂，包括组分3至组分6；

上述组分3包括oligodT_14-20磁珠和无oligodT_14-20磁珠；上述oligodT_14-20磁珠与上述无oligodT_14-20磁珠的体积比为3:1；

上述组分4包括裂解保护液，上述裂解保护液包括如下组分：

十二烷基硫酸锂 0.01~0.05 %（w/w）

异硫氰酸胍 0.5~1.5 M

Tris 0.01~0.1 M

NaCl 0.1~0.2 M

TritonX-100 0.5~3 %（v/v）；

上述组分5包括清洗液，上述清洗液包括：0.05~0.2 %(v/v) Triton X-100、0.05~0.2 M KCl；

上述组分6包括洗脱液，上述洗脱液包括10~100 mM Tris、1~10 mM EDTA。

本发明还提供了病毒核酸提取试剂，包括上述的样品处理液和/或上述的提取试剂。

本发明还提供了病毒核酸的提取方法，以上述的病毒核酸提取试剂与待测样本混合；

上述混合不包括NaOH液化和/或乙醇清洗。

在本发明的一些实施方案中，上述的提取方法中上述混合包括：

S1：取上述待测样本与上述的组分1混合，孵育，离心后，与上述的组分2混合，得到样品；

S2：取S1中获得的上述样品与上述的组分3和组分4混合，孵育后，与上述的组分5和组分6混合。

在本发明的一些实施方案中，上述的提取方法S1中上述待测样本、上述组分1和上述组分2的体积比为3:3:1。

在本发明的一些实施方案中，上述的提取方法S1中上述孵育的温度为37~42℃，S2中上述孵育的温度为20~25℃。

本发明还提供了，上述的样品处理液、上述的提取试剂和/或上述的病毒核酸提取试剂在制备病毒核酸提取和/或检测试剂盒中的应用；上述病毒包括新型冠状病毒COVID-19。

本发明还提供了病毒提取和/或检测的试剂盒，包括上述的样品处理液、上述的提取试剂和/或上述的病毒核酸提取试剂以及可接受的助剂或载体。

在本发明的一些实施方案中，上述的试剂盒还包括：引物组、探针组和/或病毒扩增试剂中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括如下引物探针组合中的一种或两者以上：

引物组合一：根据COVID-19的N基因序列获得的RT-LAMP的引物组合

（1）、N1-F3：具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和

（2）、N1-B3：具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和

（3）、N1-FIP：具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和

（4）、N1-BIP：具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和

（5）、N1-LF：具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和

（6）、N1-LB：具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；或

（7）、如（1）~（6）任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（1）~（6）任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（8）、与（1）~（6）任一项所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；和/或

探针组合一：COVID-19 N基因荧光探针

（9）、N-BHQ1：具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；和

（10）、N-ROX：具有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；或

（11）、如（9）或（10）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（9）或（10）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（12）、与（9）或（10）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；和/或

引物组合二：根据COVID-19的ORF基因序列获得的RT-LAMP的引物组合

（13）、19cov-ORF-1-F3：具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；和

（14）、19cov-ORF-1-B3：具有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；和

（15）、19cov-ORF-1-FIP：具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；和

（16）、19cov-ORF-1-BIP：具有如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；和

（17）、19cov-ORF-1-LF：具有如SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；和

（18）、19cov-ORF-1-LB：具有如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；或

（19）、如（13）~（18）任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（13）~（18）任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（20）、与（13）~（18）任一项所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；和/或

探针组合二：COVID-19 ORF基因荧光探针

（21）、ORF-BHQ1：具有如SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；和

（22）、ORF-FAM：具有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；或

（23）、如（21）或（22）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（21）或（22）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（24）、与（21）或（22）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；和/或

引物组合三：内参基因GAPDH基因RT-LAMP引物组合

（25）、GAPDH-F3-5p：具有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列；和

（26）、GAPDH-B3-5p：具有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；和

（27）、GAPDH-LF-5p：具有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列；和

（28）、GAPDH-LB-5p：具有如SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；和

（29）、GAPDH-FIP-5p：具有如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列；和

（30）、GAPDH-BIP-5p：具有如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列；或

（31）、如（25）~（30）任一项所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（25）~（30）任一项所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（32）、与（25）~（30）任一项所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；和/或

探针组合三：GAPDH基因探针

（33）、GAPDH-BHQ1：具有如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列；和

（34）、GAPDH-HEX：具有如SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；或

（35）、如（33）或（34）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（33）或（34）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；

（36）、与（33）或（34）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括病毒扩增的RT-LAMP试剂，包括如下组分：

Tris-HCl 10 mM~20 mM

(NH₄)₂SO₄5 mM~20 mM

KCl 25 mM~100 mM

Tween 20 0.05 %~0.5%（v/v）

Bst聚合酶 0.25 U/μL~0.5 U/μL

耐高温逆转录酶 1 U/μL~5 U/μL

Mg²⁺6mM~10 mM

牛磺酸 25 mM~100 mM

PEG35000 0.5%~2%（w/v）

在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒单管同时检测新型冠状病毒COVID-19 N和ORF基因以及人源内参基因GAPDH的。

本发明提供了样品处理液，包括组分1和组分2；

上述组分2包括样品保存液，上述样品保存液包括如下组分：

Tris-HCl 10~25 mM

Triton X-100 0.1~0.5%（v/v）

DTT 1~10 mM

BSA 0.5~1 mg/mL

DMSO 0.2~0.5%

乙酰半胱氨酸 0.1~0.2 M

TCEP-HCl 2.5~10 mM。

本发明相比较于传统痰液的病毒提取方法，本方法痰液病毒核酸提取无NaOH液化步骤，不对病毒RNA核酸产生降解或破坏。本发明痰液病毒核酸提取方法，回收纯化的核酸，可用于病毒核酸的检测，包括PCR、NASBA、LAMP、RPA等，相比较于传统痰液病毒核酸提取方法，具有病毒核酸回收率高、用时少、操作方便、易于临床推广的特点。且本发明提供的试剂盒本单管同时检测新型冠状病毒COVID-19 N和ORF基因以及人源内参基因GAPDH的等温扩增引物、探针组合序列和反应缓冲液，该体系特异性好，灵敏度高，特异性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示不同样品稀释液处理后样品提取的病毒核酸检测结果；

其中：A示对比样品稀释液；B示本发明样品稀释液；

图2示不同液化温度下提取病毒核酸的检测结果；

图3示不同磁珠提取病毒核酸的检测结果。

具体实施方式

本发明公开了病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。

本发明病毒核酸的提取试剂、核酸提取和对比试验中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 病毒核酸的提取试剂

具体组分配置可按照以下组成：

组分1为液化缓冲液，其组成为含有蛋白酶K（终浓度1.0 mg/mL）；

组分2为样品保存液，其组成为Tris-HCl(10 mM，pH8.0)、Triton X-100（0.1 %(v/v)）、BSA(0.5 mg/mL)、DMSO(0.2 %)、DTT(5 mM)、TCEP-HCl(5 mM)、乙酰半胱氨酸的液化缓冲液（终浓度0.15 M）；

组分3为含有oligodT14-20的磁珠与羧基修饰磁珠的混合物，体积比为3：1；

组分4为裂解保护液，其组成为：十二烷基硫酸锂 0.02%（w/w）、Triton X-1002.78%（v/v）、异硫氰酸胍（终浓度0.83M）、Tris pH=8.0（终浓度0.04 M）、NaCl（终浓度0.2M）；

组分5为清洗液，其组成为：Triton X-100(0.1 %(v/v)、KCl（0.1 M）；

组分6为洗脱液，其组成为：Tris终浓度(100 mM)、EDTA终浓度(10 mM)。

实施例2 病毒核酸的提取试剂

具体组分配置可按照以下组成：

组分1为液化缓冲液，其组成为含有蛋白酶K（终浓度1.5 mg/mL）；

组分2为样品保存液，其组成为Tris-HCl(25 mM，pH8.0)、Triton X-100（0.5 %(v/v)）、BSA(1 mg/mL)、DMSO(0.5 %)、DTT(10 mM)、TCEP-HCl(10 mM)、乙酰半胱氨酸的液化缓冲液（终浓度0.2 mM）；

组分4为裂解保护液，其组成为：十二烷基硫酸锂 0.01 %（w/w）、Triton X-100 3%（v/v）、异硫氰酸胍（终浓度0.5 M）、Tris pH=8.0（终浓度0.1 M）、NaCl（终浓度0.1 M）；

组分5为清洗液，其组成为：Triton X-100(0.05 %(v/v)、KCl（0.2 M）；

组分6为洗脱液，其组成为：Tris终浓度(10 mM)、EDTA终浓度(10 mM)。

实施例3 病毒核酸的提取试剂

具体组分配置可按照以下组成：

组分1为液化缓冲液，其组成为含有蛋白酶K（终浓度0.5 mg/mL）；

组分2为样品保存液，其组成为Tris-HCl(15 mM，pH8.0)、Triton X-100（0.25 %(v/v)）、BSA(1 mg/mL)、DMSO(0.3 %)、DTT(5 mM)、TCEP-HCl(2.5 mM)、乙酰半胱氨酸的液化缓冲液（终浓度0.2 M）；

组分4为裂解保护液，其组成为：十二烷基硫酸锂 0.015 %（w/w）、Triton X-1001.64 %（v/v）、异硫氰酸胍（终浓度1.0 M）、Tris pH=8.0（终浓度0.04 M）、NaCl（终浓度0.2M）；

组分6为洗脱液，其组成为：Tris终浓度(50 mM)、EDTA终浓度(5 mM。

实施例4 病毒核酸的提取试剂

具体组分配置可按照以下组成：

组分2为样品保存液，其组成为Tris-HCl(10 mM，pH8.0)、Triton X-100（0.1%(v/v)）、BSA(0.5 mg/mL)、DMSO(0.2 %)、DTT(1 mM)、TCEP-HCl(5 mM)、乙酰半胱氨酸的液化缓冲液（终浓度0.1 M）；

组分4为裂解保护液，其组成为：十二烷基硫酸锂 0.02%（w/w）、Triton X-1000.5%（v/v）、异硫氰酸胍（终浓度1.5M）、Tris pH=8.0（终浓度0.01 M）、NaCl（终浓度0.15M）；

组分5为清洗液，其组成为：Triton X-100(0.2 %(v/v)、KCl（0.05 M）；

组分6为洗脱液，其组成为：Tris终浓度(100 mM)、EDTA终浓度(1 mM)。

实施例5 肺泡灌洗液样本和粘稠含痰样本的病毒核酸的提取方法

按照实施例1至实施例4的配方，分别制备病毒核酸的提取试剂，步骤如下：

（1）混合磁珠从4 ℃冰箱取出后，室温放置30 min后使用；

（2）取1 mL肺泡灌洗液样本或粘稠含痰样本，分别加入稀释后的假病毒，加入1 mL的液化缓冲液，震荡15 s后10000 rpm离心5 min,取上清至新离心管中，37 ℃孵30 min,10000 rpm离心2 min后取上清300 μL加入100 μL样品保存液，共400 μL；

（3）400 μL上述样品，加入470 μL裂解保护液和20 μL捕获磁珠，室温孵育5~10min；

（4）磁力磁吸1~2 min，弃上清。

（5）于磁力架上继续加入600 μL清洗液后，弃掉上清，加入36 μL Elution Buffer重悬磁珠，70 ℃孵育1~3 min用洗脱液洗脱病毒RNA，静置1 min磁力磁吸1~2 min，收集上清。

实施例6 肺泡灌洗液样本和粘稠含痰样本的病毒核酸提取

（1）样本制备

取含大量血液的肺泡灌洗液样本和粘稠含痰样本，分别加入稀释后的假病毒，制备300 cp/mL的肺泡灌洗液样本和300 cp/mL的粘稠含痰样本。

（2）核酸提取

将上述样本分别采用2种方法进行提取。方法1采用本发明实施例1提供的病毒核酸提取方法。方法2不加入100 μL样本保存液，具体提取方法为：

取200 μL肺泡灌洗液样本或粘稠含痰样本，加入200 μL的液化缓冲液，震荡15 s后10000 rpm离心5 min，取上清至新离心管中，37 ℃孵育30 min。之后10000 rpm离心2min，取上清400 μL。加入470 μL裂解保护液和20 μL捕获磁珠，室温孵育4~10 min。磁力磁吸1~2 min，弃上清。加入600 μL清洗液后，弃掉上清。加入36 μL Elution Buffer重悬磁珠，70 ℃孵育1~3 min用洗脱液洗脱病毒RNA，静置1 min磁力磁吸1~2 min，收集上清。

（3）核酸扩增

提取后的核酸，采用RT-LAMP扩增试剂和扩增方法进行检测。RT-LAMP体系、引物及探针体系配置RT-LAMP反应体系如下。65 ℃，25 min扩增。具体体系配置如下：

表1 反应体系

（4）实验结果

采用本发明提供的核酸提取方法实施例1提取500 cp/mL的肺泡灌洗液样本、300cp/mL的肺泡灌洗液样本和300 cp/mL的粘稠含痰样本，能够成功的检测到COVID-19 ORF基因。而对比方法（方法2）提取的300 cp/mL的粘稠含痰样本核酸，无法检测到ORF基因。而且N基因和ORF基因的扩增效果均比本发明提供的核酸提取方法差，对比样品稀释液提取的核酸检出的ct值明显比本发明样品稀释液大（表2），对比样品稀释液提取的核酸的N基因和ORF基因扩增曲线出峰时间较晚，如图1所示。

表2 不同稀释液提取核酸的检测曲线的CT值

实施例7 不同液化温度的对比

（1）样本制备

取含粘稠含痰样本，分别加入稀释后的假病毒，制备300 cp/mL和150 cp/mL的模拟样本；

（2）核酸提取

将上述样本分为3份，分别采用本发明实施例2提供的病毒核酸试剂进行提取。具体提取方法为取150 μL粘稠含痰样本，加入150 μL的液化缓冲液，震荡15 s后10000 rpm离心5 min，取上清至新离心管中，分别在37 ℃、32 ℃和42 ℃，孵育30 min。之后10000 rpm离心2 min，取上清300 μL，加入100 μL样品保存液混匀。之后加入470 μL裂解保护液和20μL捕获磁珠，室温孵育4~10 min。磁力磁吸1~2 min，弃上清。加入600 μL清洗液后，弃掉上清。加入36 μL Elution Buffer重悬磁珠，70 ℃孵育1~3 min用洗脱液洗脱病毒RNA，静置1min磁力磁吸1~2 min，收集上清；

（3）核酸扩增

提取后的核酸，采用RT-LAMP增试剂和扩增方法进行检测。RT-LAMP体系、引物及探针体系配置RT-LAMP反应体系如下。65 ℃，25 min扩增。具体体系配置如下：

表3 反应体系

（4）实验结果

结果显示，当加入液化缓冲液后37 ℃孵育30 min提取的核酸，其扩增效果最好，具体表现为在37 ℃孵育30 min的条件下，300 cp/mL和150 cp/mL的样本，其N基因和ORF基因均能有效扩增，且其出峰时间及信号强度，均好于32℃孵育30min的条件和42℃孵育30min的条件，如表4和图2所示。

表4 不同条件下样品检出CT值

实施例8 不同磁珠的对比

（1）样本制备

（2）核酸提取

将上述样本分为3份，分别采用本发明实施例3提供的病毒核酸方法进行提取。

其中方法1采用本发明实施例3提供的磁珠，具体含有oligodT_14-20的磁珠与不含oligodT_14-20的羧基修饰快速磁珠的混合物，比例为3：1；

方法2采用含有oligodT_14-20的磁珠；

方法3采用不含有oligodT_14-20的磁珠；

（3）核酸扩增

表5 反应体系

（4）实验结果

结果如表6和图3所示，采用方法1所核酸提取的核酸，ORF基因的ct值为20.36，N基因的ct值为24.1，而方法2提取的核酸ORF基因的ct值为21.69，N基因的ct值为为28.32，显示采用方法1提取核酸的浓度更高，其出峰时间更早。而方法3在N基因和ORF基因上均没有检测到有效的ct值。因此方法1所用的磁珠提取的病毒核酸扩增效果最好。

表6 采用不同磁珠的核酸提取方法的检测结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 博奥生物集团有限公司

广州国家实验室

<120> 病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用

<130> MP21026895

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgcaaattg cacaattt 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctttttagg ctctgttggt g 21

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgtaggtca accacgttcc ccttcagcgt tcttcggaat 40

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agctgccatc aaattggatg acgttttgta tgcgtcaata tgctt 45

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgtgacttc catgccaatg c 21

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaatttcaaa gatcaagtca ttttgc 26

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtgtaggtca accacgttcc ccttcagcgt tcttcggaat 40

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggaacgtggt tgacctacac 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atcgtgttgt ctgtactg 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gttcgcggag ttgatcaca 19

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caagttgtag gtatttgtac atacgttgcc acatagatca tccaaat 47

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaccctgtgg gttttacact taatacagcc ataacctttc cacata 46

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agtcacaaaa tcctttag 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acagtctgta ccgtctgc 18

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaccctgtgg gttttacact taatacagcc ataacctttc cacata 46

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttaagtgtaa aacccacagg gtc 23

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggactcatga ccacagtcca 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcttcccgtt cagctcag 18

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggaggggcca tccacagtc 19

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcctctactg gcgctgc 17

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cggccatcac gccacagttt ccatcactgc cacccaga 38

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggggctctcc agaacatcat ccgatgacct tgcccacagc 40

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggggctctcc agaacatcat ccgatgacct tgcccacagc 40

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gatgatgttc tggagagccc c 21

Claims

1.病毒核酸提取试剂，其特征在于，包括样品处理液和提取试剂；

所述样品处理液包括组分1和组分2；

所述组分1包括液化缓冲液，所述液化缓冲液包括：0.5~1.5 mg/mL蛋白酶K；

所述组分2包括样品保存液，所述样品保存液包括如下组分：

Tris-HCl 10~25 mM

Triton X-100 0.1~0.5%（v/v）

DTT 1~10 mM

BSA 0.5~1 mg/mL

DMSO 0.2~0.5%（v/v）

乙酰半胱氨酸 0.1~0.2 M

TCEP-HCl 2.5~10 mM；

所述提取试剂包括组分3至组分6；

组分3包括oligodT_14-20磁珠和无oligodT_14-20的羧基修饰磁珠；所述oligodT_14-20磁珠与所述无oligodT_14-20的羧基修饰磁珠的体积比为3:1；

组分4包括裂解保护液，所述裂解保护液包括如下组分：

十二烷基硫酸锂 0.01~0.05%（w/w）

异硫氰酸胍 0.5~1.5 M

Tris 0.01~0.1 M

NaCl 0.1~0.2 M

TritonX-100 0.5~3%（v/v）；

组分5包括清洗液，所述清洗液包括：0.05~0.2 %(v/v) Triton X-100、0.05~0.2 MKCl；

组分6包括洗脱液，所述洗脱液包括10~100 mM Tris、1~10 mM EDTA；

所述病毒核酸提取试剂不包括NaOH和乙醇。

2.病毒核酸的提取方法，其特征在于，以如权利要求1所述的病毒核酸提取试剂与待测样本混合；

所述混合不包括NaOH液化和乙醇清洗；

所述混合包括：

S1：取所述待测样本与所述的组分1混合，孵育，离心后，与所述的组分2混合，得到样品；

S2：取S1中获得的所述样品与所述的组分3和组分4混合，孵育后，与所述的组分5和组分6混合；

S1中所述待测样本、所述组分1和所述组分2的体积比为3:3:1；

S1中所述孵育的温度为37℃ ，30min；S2中所述孵育的温度为25℃。

3.如权利要求1所述的病毒核酸提取试剂在制备病毒核酸提取和/或检测试剂盒中的应用；所述病毒包括新型冠状病毒COVID-19。

4.病毒提取和/或检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的病毒核酸提取试剂以及可接受的助剂或载体。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括：引物组、探针组和/或病毒扩增试剂中的一种或多种。