CN117050985A - 一种全血核酸提取试剂及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全血核酸提取试剂，包括：裂解液、磁珠、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液、蛋白酶K；其中裂解液包括：非离子表面活性剂、核酸沉淀剂、胍类化合物、pH缓冲液；所述核酸沉淀剂包括：聚乙二醇、NP‑40中的一种或组合。本发明通过裂解液中的非离子表面活性剂破坏细胞的膜结构，起到现有技术中前处理的效果，即细胞破损释放细胞核中的DNA；省略了现有技术中复杂的前处理操作；同时，裂解液中的核酸沉淀剂起到了现有技术中异丙醇的作用，核酸沉淀剂中的聚乙二醇或NP‑40在常温环境中挥发量小，相较于异丙醇，本发明公开的核酸沉淀剂降低了操作人员的操作要求、减少实验试剂挥发对操作人员的影响。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别是涉及全血核酸提取试剂。
背景技术
在分子生物学技术发展的大环境中，核酸提取是样本处理最基本且最重要的环节，其核酸的产量、纯度及完整性直接关系到下游的PCR扩增、基因测序、构建基因组文库。随着现代疾病诊断技.术和精准医疗的蓬勃发展，需要处理的样品量日益增多，因此高效、可靠、高通量的提取方法成为相关研究领域的迫切需求。
血液是人体重要的体液组成部分，与人的生理和病理变化密切相关，常作为核酸样本的来源。目前，常见有几种血液提取核酸方法，如酚氯仿抽提法、盐酸胍裂解过柱法、磁珠法，这些方法各有优缺点：
酚氯仿抽提法除去未消化的蛋白质，氯仿有助于水相和有机相分离和除去核酸溶液中的酚；但用到的酚和氯仿都是剧毒物质，长期使用对实验人员造成不利影响；
盐酸胍裂解过柱法利用高浓度盐酸胍使细胞破裂和蛋白质变性，再经过无水乙醇沉淀核酸，通过高速离心或负压方式使核酸与杂质分离，得到纯化后的核酸；但是过柱法需要人工操作转移过滤清液，难以满足自动化工作的需求；
磁珠法多采用异丙醇裂解细胞、结合核酸沉淀；然而异丙醇在使用的过程中，需要先用异丙醇沉淀DNA，后用乙醇清洗，然而异丙醇对眼、呼吸道的黏膜有刺激作用，能损伤视网膜及视神经，挥发性吸入时给人带来恶心难受感觉。其毒性、麻醉性以及对上呼吸道黏膜的刺激都比乙醇强，影响实验人员安全。
以上研究的全血DNA提取试剂盒种类繁多，但提取时存在诸多缺点：如样本需要前处理且处理时间长、提取过程复杂、提取过程耗时较长、易造成样本间的交叉污染等；如部分试剂中含有的接触高浓度蒸气出现头痛、倦睡以及眼、鼻、喉刺激症状。
发明内容
本发明公开一种全血核酸提取试剂，旨在省去现有技术中提取全血样本核酸时前处理过程，同时使用毒性低或无毒性的试剂提取核酸，降低对实验人员的操作要求。
本发明通过以下技术方案实现的：
一种全血核酸提取试剂，包括：裂解液、磁珠、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液、蛋白酶K；
所述裂解液包括：非离子表面活性剂、核酸沉淀剂、胍类化合物、pH缓冲液；
所述洗涤液I包括：非离子表面活性剂、核酸沉淀剂、胍类化合物、稳定剂、pH缓冲液；
所述洗涤液II包括：乙醇水溶液；
所述洗脱液包括：pH缓冲液；
所述核酸沉淀剂包括：聚乙二醇、NP-40中的一种或组合。
进一步的，所述裂解液包括：质量分数为18％～25％的所述核酸沉淀剂、质量分数为5％～7％的所述胍类化合物、体积分数为2％～2.5％的所述非离子表面活性剂。
进一步的，所述裂解液还包括：稳定剂，所述稳定剂为EDTA、柠檬酸钠中的一种或组合。
进一步的，所述非离子表面活性剂为Triton X-100、Tween-20中的一种或组合。
进一步的，所述聚乙二醇具体为PEG-8000。
进一步的，所述胍类化合物为盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或组合。
进一步的，所述pH缓冲液为三羟甲基氨基甲烷水溶液，所述裂解液、所述洗涤液I的pH值范围为7.0～8.0。
进一步的，所述洗涤液II为体积分数为70％～100％的乙醇水溶液。
一种全血核酸提取方法，包括：
步骤1：将全血、蛋白酶K、裂解液、磁珠混合，孵育反应后，分离磁珠；
步骤2：将分离出的磁珠依次经洗涤液I、洗涤液II洗涤后，以洗脱液洗脱；
步骤3：分离磁珠，去上层清液，获得全血DNA溶液。
进一步的，所述步骤1具体为：
将全血200μL、裂解液400μL、蛋白酶K 20μL混合；
在50～70℃环境下震动溶液15分钟至1小时。
本发明的有益效果在于：
本发明通过裂解液中的非离子表面活性剂破坏细胞的膜结构，使细胞在裂解液中即达到现有技术中前处理的效果，即细胞破损释放细胞核中的DNA；省略了现有技术中复杂的前处理操作；同时，裂解液中的核酸沉淀剂起到了现有技术中异丙醇的作用，核酸沉淀剂中的聚乙二醇或NP-40在常温环境中挥发量小，相较于异丙醇，本发明公开的核酸沉淀剂降低了操作人员的操作要求、减少实验试剂挥发对操作人员的影响。
具体实施方式
为了使本申请所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本发明公开了一种全血核酸提取试剂，包括：裂解液、磁珠、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液、蛋白酶K。
所述裂解液包括：非离子表面活性剂、核酸沉淀剂、胍类化合物、pH缓冲液。其中：
所述非离子表面活性剂用于破坏全血样本中的细胞膜结构，释放细胞核内的DNA；本发明的公开的所述全血核酸提取试剂的一个可实现的实施例中，所述非离子表面活性剂为Triton X-100、Tween-20中的一种或组合；
所述核酸沉淀剂用于降低DNA在裂解液中的溶解度，使DNA结合在磁珠上，现有技术中的异丙醇即为一种核酸沉淀剂，本发明公开的所述全血核酸提取试剂通过聚乙二醇或NP-40中的一种或组合代替异丙醇；
胍类化合物用于使蛋白质变性，以分离蛋白质与DNA链，充分有效地裂解细胞，使细胞中的核酸能够充分释放，得到浓度更高的核酸，有利于提高核酸的质量，保证后续操作的准确性。本发明的公开的所述全血核酸提取试剂的一个可实现的实施例中，所述胍类化合物为盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或组合；
pH缓冲液为三羟甲基氨基甲烷水溶液，具体可以为Tris-HCl水溶液；本发明公开的所述全血核酸提取试剂的一个可实现的实施例中，利用Tris-HCl缓冲体系将裂解液的pH值调节在7.0～8.0的范围内，优选的，所述裂解液的pH值为7。
在本发明的一个可实现的实施例中，所述裂解液中还包括稳定剂，所述稳定剂为EDTA、柠檬酸钠中的一种或组合，所述稳定剂用于抑制DNA酶，防止细胞破损后DNA酶降解DNA。
所述洗涤液I包括：非离子表面活性剂、核酸沉淀剂、胍类化合物、稳定剂、pH缓冲液。细胞在裂解液中破损释放DNA后，DNA沉淀固定在磁珠上，将磁珠从裂解液吸取后，磁珠上还会残留有部分蛋白质，所述洗涤液I中含有的胍类化合物用以清洗残留在磁珠上的蛋白质。
所述洗涤液II包括：乙醇水溶液。所述洗涤液II用于将洗除蛋白质后的磁珠进行进一步清洗，洗除磁珠上洗涤液I及裂解液的组分，目的是仅保留磁珠及磁珠上的DNA。
所述洗脱液包括：pH缓冲液。
应用本发明公开的所述全血核酸提取试剂和现有技术中使用异丙醇的试剂对等体积的全血样本进行核酸提取试验，实验数据如下所示：
1.裂解液筛选不同的的核酸沉淀剂：
| 核酸沉淀剂 | 扩增荧光PCR-Ct值 |
| 2％PEG-6000 | 22.36 |
| 2％Tween-20 | 24.47 |
| 2％Triton X-100 | 25.02 |
| 异丙醇 | 21.21 |
从上述表中可知，对等体积的全血样本进行核酸提取试验，使用同一浓度的核酸沉淀剂，PEG-6000最接近现有技术。Tween-20及Triton X-100的核酸提取量与现有技术中使用异丙醇的使用效果差异较大。其中Ct值为扩增产物达到荧光信号设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数，Ct值越小则说明达到阈值所需的扩增轮数越小，提取产物中的DNA量越多，提取效果越佳。
2.基于上述实验基础上，本发明针对同浓度聚乙二醇种类进行筛选，其中浓度为质量分数：
| 聚乙二醇类别 | 扩增荧光PCR-Ct值 |
| 2％PEG-1000 | 25.47 |
| 2％PEG-2000 | 25.02 |
| 2％PEG-4000 | 24.58 |
| 2％PEG-6000 | 24.12 |
| 2％PEG-8000 | 23.57 |
| 2％PEG-12000 | 24.12 |
| 2％PEG-20000 | 23.99 |
从上表中可知，在选用同浓度的聚乙二醇是，PEG-8000的提取量最佳。
3.基于上述实验基础上，本发明针对不同浓度的PEG-8000的全血核酸提取试剂进行实验，其中浓度为质量分数：
因而，在本发明的一个可是现在实施方式中，所述全血核酸提取试剂的具体成分如下：
所述裂解液包括：质量分数为18％～25％的所述核酸沉淀剂、质量分数为5％～7％的所述胍类化合物、体积分数为2％～2.5％的所述非离子表面活性剂、Tris-HCl缓冲液。
进一步的，所述核酸沉淀剂为聚乙二醇具体为PEG-8000。
所述洗涤液I具体包括：质量分数为9％～20％的所述核酸沉淀剂、质量分数为2～4％的胍类化合物、体积分数为1％～2％的所述非离子表面活性剂、Tris-HCl缓冲液。
所述洗涤液II为体积分数为70％～100％的乙醇水溶液。
所述洗脱液为pH值为7.0～9.0的Tris-HCl缓冲液。
基于上述的全血核酸提取试剂，本发明还公开了一种全血核酸提取方法，所述方法包括：
预先将裂解液、洗涤液I、洗涤液II及洗脱液加入深孔板不同孔道中。
步骤1：将全血200μL、蛋白酶K20μL、裂解液400μL、磁珠混合，在50～70℃环境下震动溶液15分钟至1小时。充分反应后，通过磁棒将磁珠从裂解液所在孔位中吸取分离出。
步骤2：将分离出的磁珠依次散入洗涤液I(500μL)孔位、洗涤液II(500μL)洗涤1～3分钟后，在洗脱液(100μL)孔道内洗脱5～10分钟；
步骤3：将磁珠上提取的DNA溶解至保存或检测溶液环境中，洗净并提取磁珠，完成全血DNA提取。
本发明通过裂解液中的非离子表面活性剂破坏细胞的膜结构，使细胞在裂解液中即达到现有技术中前处理的效果，即细胞破损释放细胞核中的DNA；省略了现有技术中复杂的前处理操作；同时，裂解液中的核酸沉淀剂起到了现有技术中异丙醇的作用，核酸沉淀剂中的聚乙二醇或NP-40在常温环境中挥发量小，相较于异丙醇，本发明公开的核酸沉淀剂降低了操作人员的操作要求、减少实验试剂挥发对操作人员的影响。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种全血核酸提取试剂，其特征在于，包括：裂解液、磁珠、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液、蛋白酶K；
所述裂解液包括：非离子表面活性剂、核酸沉淀剂、胍类化合物、pH缓冲液；
所述洗涤液I包括：非离子表面活性剂、核酸沉淀剂、胍类化合物、稳定剂、pH缓冲液；
所述洗涤液II包括：乙醇水溶液；
所述洗脱液包括：pH缓冲液；
所述核酸沉淀剂包括：聚乙二醇、NP-40中的一种或组合。
2.根据权利要求1所述的全血核酸提取试剂，其特征在于，所述裂解液包括：质量分数为18％～25％的所述核酸沉淀剂、质量分数为5％～7％的所述胍类化合物、体积分数为2％～2.5％的所述非离子表面活性剂。
3.根据权利要求1所述的全血核酸提取试剂，其特征在于，所述裂解液还包括：稳定剂，所述稳定剂为EDTA、柠檬酸钠中的一种或组合。
4.根据权利要求1所述的全血核酸提取试剂，其特征在于，所述非离子表面活性剂为Triton X-100、Tween-20中的一种或组合。
5.根据权利要求1所述的全血核酸提取试剂，其特征在于，所述聚乙二醇具体为PEG-8000。
6.根据权利要求1所述的全血核酸提取试剂，其特征在于，所述胍类化合物为盐酸胍、异硫氰酸胍中的一种或组合。
7.根据权利要求1所述的全血核酸提取试剂，其特征在于，所述pH缓冲液为三羟甲基氨基甲烷水溶液，所述裂解液、所述洗涤液I的pH值范围为7.0～8.0。
8.根据权利要求1所述的全血核酸提取试剂，其特征在于，所述洗涤液II为体积分数为70％～100％的乙醇水溶液。
9.一种全血核酸提取方法，其特征在于，包括：
步骤1：将全血、蛋白酶K、裂解液、磁珠混合，孵育反应后，分离磁珠；
步骤2：将分离出的磁珠依次经洗涤液I、洗涤液II洗涤后，以洗脱液洗脱；
步骤3：分离磁珠，去上层清液，获得全血DNA溶液。
10.根据权利要求9所述的全血核酸提取方法，其特征在于，所述步骤1具体为：
将全血200μL、裂解液400μL、蛋白酶K 20μL混合；
在50～70℃环境下震动溶液15分钟至1小时。
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