CN112921071A - 一种猫体液样本处理试剂、检测试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猫体液样本处理试剂、检测试剂盒及应用，涉及生物化学技术领域。本发明提供了一种猫体液样本处理试剂，其包括质量体积浓度为1‑20％的三氯乙酸和水。利用三氯乙酸可以与样本中的蛋白反应生成蛋白质盐不溶物，同时三氯乙酸又作为蛋白质变性剂可以促使蛋白质的构象发生改变，从而使得蛋白质暴露出较多的疏水性基团，有利于蛋白质聚集沉淀，从而提升样本中核酸的纯度。

Description

一种猫体液样本处理试剂、检测试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，具体而言，涉及一种猫体液样本处理试剂、检测试剂盒及应用。
背景技术
猫冠状病毒(Feline Covronavirus，FCoV)的感染在猫群中极为普遍，目前，猫冠状病毒有两种表现型：引起猫传染性腹膜炎的变异型(Feline Infectious Peritonitis，FIP)和普通猫冠状病毒。FCoV感染后一般引起较轻的胃肠道症状；FIP的临床表现主要分为渗出型和非渗出型两类，渗出型FIP以腹膜炎、大量腹水聚集为主要症状，非渗出型FIP以眼部以及神经症状为主，致死率非常高。临床上一般用猫胸腹水样本来检测猫冠状病毒(FCoV)的核酸，快速、准确地诊断FCoV，对该病的临床诊断及治疗有着重要的意义。
一般可使用磁珠法提取核酸及实时荧光定量PCR法检测猫粪便、直肠拭子、胸水、腹水等样本中的猫冠状病毒。
其中，磁珠法核酸提取是指利用可结合核酸分子的磁性微粒为载体，样品在与裂解液、磁性微粒混合后，核酸吸附在磁性微球表面。这种特定的吸附作用使DNA在外加磁场的作用下与样本中的其它组分分离。在简单的清洗和洗脱后，即可得到高纯度的核酸。
而实时荧光定量PCR是指在PCR扩增过程中，高温变性，核酸双链解离为单链；退火时，病毒的引物探针与靶核酸特异性地结合；在延伸阶段，模板-引物的结合物在聚合酶、dNTP等的作用下开始进行互补链的延伸，同时聚合酶的外切活性将探针上的荧光基团剪切下来，使其远离于探针另一端的淬灭基团，发出荧光。这样，荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。通过仪器监测荧光信号即可完成对PCR过程的实时监控。内参是指选用与靶核酸无关联的外源非竞争性内参质粒。在实验过程中，内参样品跟随待测样品同时进行核酸提取与扩增，最终内参结果为阳性，即可证明实验结果的有效性。
目前，用磁珠法提取蛋白总量较多的猫胸腹水样本核酸时存在以下缺点：直接将猫胸腹水样本用磁珠法核酸提取时容易发生磁珠聚集，洗涤过程中磁珠难以混匀，提取后的核酸纯度较差，不能满足荧光定量PCR对核酸纯度的要求。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猫体液样本处理试剂、检测试剂盒及应用以解决上述技术问题。
发明人发现，磁珠法核酸提取试剂盒里的蛋白酶K很难充分消化黏蛋白，裂解不充分，导致核酸的杂蛋白含量较高，从而抑制了实时荧光定量PCR。特提供了一种样本处理试剂。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种猫体液样本处理试剂，其包括质量体积(g/ml)浓度为1-20％的三氯乙酸溶液，样本为猫胸腹水。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂包括质量体积浓度为1-10％的三氯乙酸溶液；
优选地，猫体液样本处理试剂包括质量体积浓度为1.5％的三氯乙酸溶液；
优选地，三氯乙酸溶液的溶剂为DEPC处理水。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本处理试剂还包括表面活性剂和螯合剂；
优选地，表面活性剂为SDS、Tween 20、Triton X-100、NP-40和十二烷基肌氨酸钠中的至少一种；
优选地，螯合剂为有机螯合剂或无机螯合剂；
优选地，有机螯合剂为EDTA-二钠、双硫腙、8-羟基喹啉、邻菲咯啉、酒石酸钾钠或柠檬酸铵，无机螯合剂为多磷酸盐。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本处理试剂还包括体积百分比为3-10％的Triton X-100、质量体积百分比为0.5-4％的SDS和1-20mM的EDTA-二钠。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本处理试剂还包括体积百分比为5％的Triton X-100、质量体积百分比为2％的SDS和5mM的EDTA-二钠。
本发明还提供了一种检测试剂盒，其包括上述的猫体液样本处理试剂。
本发明还提供了一种使用上述的猫体液样本处理试剂进行核酸提取的方法，其包括如下步骤：将待提取核酸的样本与猫体液样本处理试剂混合，取上清液进行核酸提取。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述待提取核酸的样本与猫体液样本处理试剂的混合体积比例为(0.5-2):1。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述核酸提取为磁珠法核酸提取。
本发明还提供了一种猫体液样本处理试剂在制备荧光定量PCR检测猫冠状病毒试剂盒中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种猫体液样本处理试剂，利用三氯乙酸可以与样本中的蛋白反应生成蛋白质盐不溶物，同时三氯乙酸又作为蛋白质变性剂可以促使蛋白质的构象发生改变，从而使得蛋白质暴露出较多的疏水性基团，有利于蛋白质聚集沉淀，从而提升样本中核酸的纯度。上述的猫体液样本处理试剂解决了临床上猫腹水中球蛋白或胆红素浓度较高样本提取的核酸纯度低、抑制实时荧光定量PCR的问题，有利于提高猫冠状病毒核酸检测阳性率，为临床医生诊断猫冠状病毒感染提供了可靠的依据。上述的猫体液样本处理试剂可以用于制备检测试剂盒从而提升核酸检测的阳性率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实验例1猫腹水核酸的实时荧光定量PCR曲线图；
图2为实验例2猫腹水核酸的实时荧光定量PCR曲线图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
本发明提供了一种猫体液样本处理试剂，其包括质量体积浓度为1-20％的三氯乙酸溶液。样本为猫胸腹水。三氯乙酸可以与蛋白反应生成蛋白质盐不溶物，同时三氯乙酸又作为蛋白质变性剂可以促使蛋白质的构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使蛋白质更容易聚集沉淀，从而提升了待测样本中的核酸纯度。
通过三氯乙酸去除蛋白酶K很难充分消化的黏蛋白，使得裂解更为充分，降低了核酸的杂蛋白含量，有助于解除样本的核酸对实时荧光定量PCR的抑制。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂包括质量体积浓度为1-10％的三氯乙酸和水。
可选的，上述试剂中三氯乙酸的质量体积浓度为1％，1.5％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％或10％。在实际应用时，可以根据需要设置试剂中三氯乙酸的质量体积浓度。
优选地，猫体液样本处理试剂包括质量体积浓度为1.5％的三氯乙酸溶液；
优选地，三氯乙酸溶液的溶剂为DEPC处理水(焦碳酸二乙酯处理后水)。DEPC水以避免核酸酶对样本中核酸的降解。在其他实施方式中，也可选择其他工艺脱除核酸酶的水作为溶剂。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本处理试剂还包括表面活性剂和螯合剂。表面活性剂以使得蛋白质发生变性，使得蛋白与核酸发生分离，螯合剂可以防止细胞破碎后核酸酶降解核酸，通过表面活性剂与螯合剂的配合协同提升蛋白的去除效率和核酸的纯度。
优选地，表面活性剂为SDS、Tween 20、Triton X-100、NP-40和十二烷基肌氨酸钠中的至少一种。
可选的，上述表面活性剂由SDS、Tween 20和Triton X-100组成；可选的，上述表面活性剂由十二烷基肌氨酸钠、Tween 20和Triton X-100组成；可选的，上述表面活性剂由Triton X-100、NP-40和十二烷基肌氨酸钠组成。
在其他实施方式中，表面活性剂也可以选择其他的阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂。阳离子表面活性剂可以为季铵化合物，两性离子表面活性剂可以是卵磷脂、氨基酸型或甜菜碱型，非离子表面活性剂可以是烷基葡糖苷、脂肪酸甘油酯、司盘等。
螯合剂为有机螯合剂或无机螯合剂；
优选地，有机螯合剂为EDTA-二钠、双硫腙、8-羟基喹啉、邻菲咯啉、酒石酸钾钠或柠檬酸铵，无机螯合剂为多磷酸盐。
在其他实施方式中，上述的螯合剂还可以是氨羧络合剂。络合剂中的配位原子可以是氧、硫、氮、磷、砷或硒。根据配位原子数目可以为二啮、三啮、四啮、六啮螯合剂。
需要说明的是，上述的螯合剂仅为本发明列举的几种螯合剂，在其他实施方式中，螯合剂中种类还可以根据需要进行自适应调整。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本处理试剂还包括体积百分比为3-10％的Triton X-100、质量体积百分比为0.5-4％的SDS和1-20mM的EDTA-二钠。
在一种实施方式中，猫体液样本处理试剂中Triton X-100的体积浓度为3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％或10％。SDS的质量体积百分比为0.5，1％，1.5％，2％，3％或4％。EDTA-二钠的摩尔浓度为1mM，2mM，3mM，5mM，10mM或20mM。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述猫体液样本处理试剂还包括体积百分比为5％的Triton X-100、质量体积百分比为2％的SDS和5mM的EDTA-二钠。
本发明还提供了一种检测试剂盒，其包括上述的猫体液样本处理试剂。在其他实施方式中，上述的检测试剂盒还包括检测猫冠状病毒的缓冲液以及荧光标记液。可选的，合成检测猫冠状病毒的引物，采用上述检测试剂盒实现猫冠状病毒的检测。
本发明还提供了一种使用上述的猫体液样本处理试剂进行核酸提取的方法，其包括如下步骤：将待提取核酸的样本与猫体液样本处理试剂混合，取上清液进行核酸提取。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述待提取核酸的样本与猫体液样本处理试剂的混合体积比例为(0.5-2):1。混合后进行离心获得上清。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述核酸提取为磁珠法核酸提取。
本发明还提供了一种猫体液样本处理试剂在制备荧光定量PCR检测猫冠状病毒试剂盒中的应用。上述应用可以是制备冻干粉状的样本处理试剂，也可以是液态的处理试剂。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种猫体液样本处理试剂，其包括质量体积浓度为1.5％的三氯乙酸(即为TCA)，溶剂为DEPC处理水。
上述的猫体液样本处理试剂可以室温保存1年。
实施例2
本实施例提供了一种猫体液样本处理试剂，其包括质量体积浓度为2％的三氯乙酸(即为TCA)，溶剂为DEPC处理水。
上述的猫体液样本处理试剂可以室温保存1年。
实施例3
本实施例提供了一种猫体液样本处理试剂，其包括质量体积浓度为10％的三氯乙酸(即为TCA)，溶剂为DEPC处理水。
上述的猫体液样本处理试剂可以室温保存1年。
实施例4
本实施例提供了一种猫体液样本处理试剂，其包括质量体积浓度为18％的三氯乙酸(即为TCA)，溶剂为DEPC处理水。
上述的猫体液样本处理试剂可以室温保存1年。
实施例5
本实施例提供了一种猫体液样本处理试剂，其包括质量体积浓度为1.5％的三氯乙酸(即为TCA)、体积浓度为5％的Triton-X100、质量体积浓度为2％的SDS、5mM的EDTA-二钠。溶剂为DEPC处理水。
实施例6
本实施例提供了一种猫体液样本处理试剂，其包括质量体积浓度为1.5％的三氯乙酸(即为TCA)、体积浓度为5％的Triton-X100、质量体积浓度为2％的十二烷基肌氨酸钠、5mM的EDTA-二钠。溶剂为DEPC处理水。
实验例1
本实验例提供了样本的前处理以及核酸提取实验，提取后的核酸进行核酸纯度和荧光定量PCR检测。同时设置对照组，区别仅在于，样本前处理步骤不添加猫胸腹水样本处理试剂，其余的核酸提取差值步骤和核酸检测步骤相同。
对照组是指生理盐水与胸腹水样本等体积充分混合后，静置2min，12000rpm离心1min，留取上清液。用磁珠法病毒核酸提取试剂盒提取上清液的核酸，然后使用猫冠状病毒核酸检测试剂盒进行检测，根据扩增曲线图，判读样本的Ct，Ct≦39为阳性。
1.样本前处理。
向1.5ml离心管里用加200ul实施例1的猫体液样本处理试剂，加200ul胸腹水(来源于宠物医院的馈赠)涡旋混匀，静置2min，然后在12000rpm下离心1min，留取上清液。
2.核酸提取操作步骤，采用市售的磁珠法病毒核酸提取试剂盒(厂商GNEFINE，型号Y502)进行核酸提取：
(1)向1.5ml的离心管中再依次加入步骤(1)的200ul上清液，200μl裂解液、22μl蛋白酶K液(含内参，冻干状态的蛋白酶K需加30ul水溶解后，取22ul作为蛋白酶K液)；
(2)涡旋震荡混匀，70℃孵育10min，期间颠倒混匀3次。水浴结束后，加入300ul异丙醇，25ul磁珠室温颠倒混匀5min；
(3)将离心管放置在磁力架上静置，磁吸90s，待磁珠完全吸附时小心移去液体；
(4)将离心管小心从磁力架上取下，加入500μl的洗涤液A，摇匀；放置磁力架上磁吸90s，待磁珠完全吸附时小心移去液体；
(5)将离心管小心从磁力架上取下，加入500μl洗涤液B，摇匀；放置磁力架上磁吸90sec，待磁珠完全吸附时小心移去液体。重复步骤(5)一次；
(6)将离心管放在磁力架上，加入350μl洗涤液C，颠倒2次磁力架，磁吸60sec，待磁珠完全吸附时小心移去液体。
(7)将离心管从磁力架上取下，加入100ul～200μl洗脱液，吹吸混匀，56℃孵育5min。
(8)将离心管放置于磁力架上90s，待磁珠完全吸附时小心转移核酸溶液至新的离心管中，-20℃保存或进入下一步实验。
3.测定核酸纯度。
使用NanoDrop超微量分光光度计测定纯度。
表1为高纯度核酸样本的标准吸光度值(来源于NanoDrop超微量分光光度计使用手册)。表2为核酸纯度的测定值。A1是使用猫胸腹水前处理液的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的纯度；A2是未经过前处理的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的纯度值。
表1高纯度核酸样本的标准吸光度值。
Figure BDA0002949574530000101
表2为核酸纯度的测定值。
编号 A260 A280 A230 A260/A280 A260/A230 浓度(ng/ul)
A1 0.179 0.095 0.09 1.88 1.99 5.001
A2 0.149 0.19 0.171 0.78 0.87 6.316
4.测定样本Ct。
使用猫冠状病毒核酸实时荧光PCR检测试剂盒进行检测，根据扩增曲线图，判读样本的Ct，Ct≦39为阳性。猫冠状病毒核酸检测试剂盒，主要包含FCoV的冻干Mix和MiX溶解液。实时荧光PCR所采用的引物序列与专利名称为“一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的核酸组合物及其试剂盒和应用”中所使用的引物相同。
使用猫冠状病毒核酸实时荧光PCR检测试剂盒检测，体系配置和实时扩增条件设定见表3和表4。
表3为模板加样量和PCR反应体系配置方法。
Figure BDA0002949574530000111
表4实时扩增条件。
Figure BDA0002949574530000112
图1为实时荧光定量PCR曲线图，A1是使用猫胸腹水前处理液的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的检测曲线，Ct为19.23；A2是未经过前处理的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的检测曲线，Ct为25.45。可以看出未使用猫体液样本处理试剂提取的核酸对实时荧光定量PCR有明显的抑制，导致Ct滞后。
实验例2
本实验例提供了样本的前处理以及核酸提取实验，提取后的核酸进行核酸纯度和荧光定量PCR检测。同时设置对照组，区别仅在于，样本前处理步骤不添加猫体液样本处理试剂，其余的核酸提取差值步骤和核酸检测步骤相同。
对照组是指生理盐水与胸腹水样本等体积充分混合后，静置2min，12000rpm离心1min，留取上清液。用磁珠法病毒核酸提取试剂盒提取上清液的核酸，然后使用猫冠状病毒核酸检测试剂盒进行检测，根据扩增曲线图，判读样本的Ct，Ct≦39为阳性。
1.样本前处理。
向1.5ml离心管里用加200ul实施例5的猫体液样本处理试剂，加200ul胸腹水(来源于宠物医院的馈赠)涡旋混匀，静置2min，然后在12000rpm下离心1min，留取上清液。
2.核酸提取操作步骤，采用市售的磁珠法病毒核酸提取试剂盒(同实验例1)进行核酸提取：
(1)向1.5ml的离心管中再依次加入步骤(1)的200ul上清液，200μl裂解液、22μl蛋白酶K液(含内参，冻干状态的蛋白酶K需加30ul水溶解后，取22ul作为蛋白酶K液)；
(2)涡旋震荡混匀，70℃孵育10min，期间颠倒混匀3次。水浴结束后，加入300ul异丙醇，25ul磁珠室温颠倒混匀5min；
(3)将离心管放置在磁力架上静置，磁吸90s，待磁珠完全吸附时小心移去液体；
(4)将离心管小心从磁力架上取下，加入500μl的洗涤液A，摇匀；放置磁力架上磁吸90s，待磁珠完全吸附时小心移去液体；
(5)将离心管小心从磁力架上取下，加入500μl洗涤液B，摇匀；放置磁力架上磁吸90sec，待磁珠完全吸附时小心移去液体。重复步骤(5)一次；
(6)将离心管放在磁力架上，加入350μl洗涤液C，颠倒2次磁力架，磁吸60sec，待磁珠完全吸附时小心移去液体。
(7)将离心管从磁力架上取下，加入100ul～200μl洗脱液，吹吸混匀，56℃孵育5min。
(8)将离心管放置于磁力架上90s，待磁珠完全吸附时小心转移核酸溶液至新的离心管中，-20℃保存或进入下一步实验。
3.测定核酸纯度。
使用NanoDrop超微量分光光度计测定纯度。
表5为核酸纯度的测定值。A3是使用猫胸腹水前处理液的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的纯度；A4是未经过前处理的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的纯度值。
表5为核酸纯度的测定值。
编号 A260 A280 A230 A260/A280 A260/A230 浓度(ng/ul)
A3 0.167 0.086 0.083 1.94 2.01 6.914
A4 0.241 0.124 0.12 1.94 2.01 10.320
4.测定样本Ct。
使用猫冠状病毒核酸实时荧光PCR检测试剂盒进行检测，根据扩增曲线图，判读样本的Ct，Ct≦39为阳性。猫冠状病毒核酸检测试剂盒，主要包含FCoV的冻干Mix和MiX溶解液。检测引物与实验例1中的引物序列相同。
使用猫冠状病毒核酸实时荧光PCR检测试剂盒检测，体系配置和实时扩增条件设定同表3和表4。
图2为实时荧光定量PCR曲线图，A3是使用猫胸腹水前处理液的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的检测曲线，Ct为25.34；A4是未经过前处理的猫胸腹水中猫冠状病毒核酸的检测曲线，Ct为25.69。可以看出未使用猫体液样本处理试剂提取的核酸对实时荧光定量PCR无明显差异。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猫体液样本处理试剂，其特征在于，其包括质量体积浓度为1-20％的三氯乙酸溶液，所述猫体液样本为猫胸腹水或痰液。
2.根据权利要求1所述的猫体液样本处理试剂，其特征在于，其包括质量体积浓度为1-10％的三氯乙酸溶液；
优选地，所述猫体液样本处理试剂包括质量体积浓度为1.5％的三氯乙酸溶液；
优选地，所述三氯乙酸溶液的溶剂为DEPC处理水。
3.根据权利要求1或2所述的猫体液样本处理试剂，其特征在于，所述猫体液样本处理试剂还包括表面活性剂和螯合剂；
优选地，所述表面活性剂为SDS、Tween 20、Triton X-100、NP-40和十二烷基肌氨酸钠中的至少一种；
优选地，所述螯合剂为有机螯合剂或无机螯合剂；
优选地，所述有机螯合剂为EDTA-二钠、双硫腙、8-羟基喹啉、邻菲咯啉、酒石酸钾钠或柠檬酸铵，所述无机螯合剂为多磷酸盐。
4.根据权利要求3所述的猫体液样本处理试剂，其特征在于，所述猫体液样本处理试剂还包括体积百分比为3-10％的Triton X-100、质量体积百分比为0.5-4％的SDS和1-20mM的EDTA-二钠。
5.根据权利要求4所述的猫体液样本处理试剂，其特征在于，所述猫体液样本处理试剂还包括体积百分比为5％的Triton X-100、质量体积百分比为2％的SDS和5mM的EDTA-二钠。
6.一种检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的猫体液样本处理试剂。
7.一种使用权利要求1-5任一项所述的猫体液样本处理试剂进行核酸提取的方法，其特征在于，其包括如下步骤：将待提取核酸的样本与所述猫体液样本处理试剂混合，取上清液进行核酸提取。
8.根据权利要求7所述的核酸提取的方法，其特征在于，所述待提取核酸的样本与所述猫体液样本处理试剂的混合体积比例为(0.5-2):1；
优选地，将待提取核酸的样本与所述猫体液样本处理试剂混合后，进行离心，取上清进行核酸提取。
9.根据权利要求7所述的核酸提取的方法，其特征在于，所述核酸提取为磁珠法核酸提取。
10.一种如权利要求1-5任一项所述的猫体液样本处理试剂在制备荧光定量PCR检测猫冠状病毒试剂盒中的应用。
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