CN117264945A - 基于磁珠法的核酸提取试剂盒及其应用、核酸提取方法 - Google Patents
基于磁珠法的核酸提取试剂盒及其应用、核酸提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117264945A CN117264945A CN202311559326.3A CN202311559326A CN117264945A CN 117264945 A CN117264945 A CN 117264945A CN 202311559326 A CN202311559326 A CN 202311559326A CN 117264945 A CN117264945 A CN 117264945A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid extraction
- magnetic beads
- magnetic
- lysate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 130
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 130
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 130
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 239000011324 bead Substances 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 58
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 33
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 38
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 23
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 20
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 20
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 15
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 12
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 11
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 5
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 4
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 7
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 3
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 6
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 4
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002156 adsorbate Substances 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 3
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical class NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000009364 mariculture Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229960000999 sodium citrate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及核酸提取技术领域，具体涉及一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒及其应用、核酸提取方法。所述核酸提取试剂盒包括以下组分：裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K，各组分pH值调至8.0±0.1；其中裂解液、洗涤液1的主要成分为异硫氰酸胍，是强有力的蛋白质变性剂，能迅速地将蛋白质溶解，使得细胞结构破碎；添加异丙醇既增强了裂解液中高浓度盐主导的磁珠吸附核酸的作用，也可以降低异硫氰酸胍的含量来降低成本。磁珠、裂解液、样本同时混合进行反应，裂解与结合步骤一步完成。该核酸提取试剂盒配合自动化核酸提取仪对病毒核酸的提取效果良好，实现了快速高效、高通量的核酸提取。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，具体涉及一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒及其应用、核酸提取方法。
背景技术
由于近年过度捕捞、环境污染等原因导致的海洋水产资源的减少，我国水产行业重心往养殖方面偏移，使得我国海水养殖行业快速发展。在高密度、集约化的养殖条件下，各种病害也随之频繁发生并广泛传播，成为困扰水产养殖业的主要因素。建立快速、准确的检测技术，实现致病菌的早期诊断和基层的即时检测，对于病害监控和有效预防具有重要意义。快速、高效的核酸提取是监控、诊断海水养殖致病菌的首要环节。
磁珠法核酸提取法运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用二氧化硅包被的纳米磁性微球的超顺磁性，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA。相较于传统的核酸提取方法，磁珠法核酸提取配合自动化核酸提取仪，可实现自动化、大批量操作，更加符合对核酸提取快速高效、高通量的要求。
磁珠法核酸提取纯化试剂盒主要由裂解液、结合液、洗涤液、洗脱液、纳米磁珠等组成。中国专利申请CN202111374962公开了一种核酸提取试剂盒及其应用、核酸提取方法，所述试剂盒包括：裂解液、蛋白酶K、核酸吸附物、清洗液及洗脱液；其中，所述裂解液包括：57.3%±5%(m/v)的胍盐、1.16%±0.1%(m/v)的NaCl和0.29%±0.03%(m/v)的EDTA，所述核酸吸附物包括磁微粒，所述胍盐为盐酸胍或者异硫氰酸胍；所述清洗液包括第一清洗液，所述第一清洗液包括1%±0.1%(m/v)的SDS、2.32%±0.2%(m/v)的NaCl和0.58%±0.05%(m/v)的EDTA；所述清洗液还包括第二清洗液，所述第二清洗液包括超纯水、去离子水及DEPC处理水中至少一种；所述洗脱液为DEPC处理水。采用上述核酸提取试剂盒提取待测样本中的核酸，具体步骤为：将所述待测样本与所述裂解液、所述蛋白酶K混匀、反应，得到裂解后样本； 将所述裂解后样本和所述核酸吸附物混合、反应，得到吸附后的所述磁微粒； 采用所述清洗液清洗吸附后的所述磁微粒，得到清洗后的所述磁微粒；采用所述洗脱液处理所述清洗后的所述磁微粒，分离所述磁微粒，得到所述核酸。上述专利存在以下几个缺点：一、试剂配方中裂解液中胍盐含量为57.3%±5%(m/v)，胍盐含量太高导致使用成本太高；二、胍盐含量太高导致后续洗涤步骤胍盐清洗的不彻底，使提取产物不纯；三、待测样本需与裂解液反应裂解后，再与核酸吸附物进行混合，所需步骤复杂、时间较长。
发明内容
针对现有的磁珠法核酸提取纯化试剂盒的裂解液胍盐含量过高、裂解与结合所需时间较长的技术问题，本发明提供一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒及其应用、核酸提取方法。
第一方面，本发明提供一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒，包括以下组分：裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K，各组分pH值调至8.0±0.1；
裂解液含有如下组分：1~2M硫氰酸胍、10~20mM Tris、30~50mM二水合柠檬酸三钠、40%~50%（m/v）异丙醇、10%~20%（m/v）无水乙醇和纯化水；
洗涤液1含有如下组分：1~2M硫氰酸胍、3~6mM EDTA、10~20mM Tris、30~50mM二水合柠檬酸三钠、10%~30%（m/v）异丙醇、40%~50%（m/v）无水乙醇和纯化水；
洗涤液2含有如下组分：60%~80%（m/v）无水乙醇、10~20mM Tris、3~6mM EDTA和纯化水。
进一步的，洗脱液含有如下组分：10~20mM Tris、3~6mM EDTA和纯化水。
进一步的，磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁珠，磁珠粒径为100~400nm。
进一步的，蛋白酶K浓度是15.0~30.0mg/mL。
第二方面，本发明提供一种上述核酸提取试剂盒在提取生物样本中的核酸方面的应用。
第三方面，本发明还提供一种使用上述核酸提取试剂盒的核酸提取方法，包括以下步骤：
（1）裂解与结合：将待提取样本与蛋白酶K混匀，然后加入磁珠和裂解液混匀、反应，移除上清液得到吸附核酸的磁珠；
（2）洗涤：先用洗涤液1清洗吸附核酸的磁珠，除去上清液；然后用洗涤液2清洗吸附核酸的磁珠，除去上清液，保证无液体残留；
（3）洗脱：加入洗脱液处理洗涤后的磁珠，收集上清液即得到核酸提取产物。
进一步的，手动人工操作的具体过程为：
（1）裂解与结合：向15mL Nuclease-free低吸附EP管中加入200μL待提取样本，加入20μL蛋白酶K，轻微涡旋后上下颠倒混匀；加入20μL磁珠和400μL裂解液，涡旋振荡混匀15s，室温裂解5min，期间上下颠倒混匀两次；瞬时离心，置于磁力架上静置1min，用移液器移除上清液，得到吸附核酸的磁珠；
（2）洗涤：向盛有吸附核酸的磁珠的EP管中加入600μL洗涤液1，涡旋15s混匀，瞬时离心，置于磁力架上静置1min，除尽上清液；再加入600μL洗涤液2，涡旋15s混匀，瞬时离心，置于磁力架上静置1min，除尽上清液；再次瞬时离心，置于磁力架上静置1min，除尽上清液；开盖，于室温下晾置3~5min，直至磁珠表面无反光；
（3）洗脱：加入100μL洗脱液，温和混匀15s，室温静置3min，期间振荡混匀2次；瞬时离心后，置于磁力架上静置1min，吸取上清液至Nuclease-free离心管，得到核酸提取产物，用于后续检测或低温保存。
进一步的，采用自动核酸提取仪进行提取。
进一步的，采用新华医疗NAE 9600全自动核酸提取仪进行提取，具体步骤如下：
（1）将400μL裂解液、600μL洗涤液1、600μL洗涤液2、100μL洗脱液依次均匀加入96深孔板的第1列、第3列、第4列、第6列孔位中，将20μL磁珠以及20μL蛋白酶K混匀后加入至第1列；
（2）取200μL待提取样本加入96深孔板的第1列，然后将96深孔板放入自动核酸提取仪中，将磁棒搅拌套插入磁棒架中，关闭仓门，打开仪器操作软件，按照如下参数设置并执行程序：
本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的基于磁珠法的核酸提取试剂盒中，裂解液、洗涤液1的主要成分为异硫氰酸胍，是强有力的蛋白质变性剂，能迅速地将蛋白质溶解，使得细胞结构破碎；添加异丙醇既增强了裂解液中高浓度盐主导的磁珠吸附核酸的作用，也可以降低异硫氰酸胍的含量来降低成本。磁珠、裂解液、样本同时混合进行反应，无需等待样本与裂解液先反应后再与磁珠混合，裂解与结合步骤一步完成。
2、本发明提供的核酸提取试剂盒中，裂解液、洗涤液1和洗涤液2的乙醇可以去除杂质，对核酸进行漂洗，使残留的杂质溶解于乙醇，提高了核酸提取产物的纯度。洗涤液中的EDTA作为金属离子螯合剂，可防止金属离子激活蛋白酶，从而减少金属离子对核酸质量的影响。而二水合柠檬酸钠不仅能够提供可充当电桥的钠离子，还具有水溶性好、洗涤性强的优点，有助于提高核酸纯度。
3、本发明提供的核酸提取试剂盒配合自动化核酸提取仪对病毒核酸的提取效果良好，实现了快速高效、高通量的核酸提取。该提取方法搭配实时荧光定量PCR试剂盒进行检测，最低检测限可达500Copies/mL，适用于微量病毒样本的核酸提取。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒
一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒，包括以下组分：裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K，各组分具体成分如下：
裂解液含有1M硫氰酸胍、10mM Tris、30mM二水合柠檬酸三钠、40%（m/v）异丙醇、10%（m/v）无水乙醇和纯化水；
洗涤液1含有1M硫氰酸胍、3mM EDTA、10mM Tris、30mM二水合柠檬酸三钠、10%（m/v）异丙醇、40%（m/v）无水乙醇和纯化水；
洗涤液2含有60%（m/v）无水乙醇、10mM Tris、3mM EDTA和纯化水；
洗脱液含有10mM Tris、3mM EDTA和纯化水；
磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁珠，磁珠粒径为100nm；
蛋白酶K浓度为15.0mg/mL；
各组分pH值调至8.0。
实施例2一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒
一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒，包括以下组分：裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K，各组分具体成分如下：
裂解液含有2M硫氰酸胍、20mM Tris、50mM二水合柠檬酸三钠、50%（m/v）异丙醇、20%（m/v）无水乙醇和纯化水；
洗涤液1含有2M硫氰酸胍、6mM EDTA、20mM Tris、50mM二水合柠檬酸三钠、30%（m/v）异丙醇、50%（m/v）无水乙醇和纯化水；
洗涤液2含有20mM Tris、6mM EDTA和80%（m/v）无水乙醇和纯化水；
洗脱液含有20mM Tris、6mM EDTA和纯化水；
磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁珠，磁珠粒径为400nm；
蛋白酶K浓度为30.0mg/mL；
各组分pH值调至7.9。
实施例3一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒
一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒，包括以下组分：裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K，各组分具体成分如下：
裂解液含有1.5M硫氰酸胍、15mM Tris、40mM二水合柠檬酸三钠、45%（m/v）异丙醇、15%（m/v）无水乙醇和纯化水；
洗涤液1含有1.5M硫氰酸胍、4mM EDTA、15mM Tris、40mM二水合柠檬酸三钠、20%（m/v）异丙醇、45%（m/v）无水乙醇和纯化水；
洗涤液2含有70%（m/v）无水乙醇、15mM Tris、5mM EDTA和纯化水；
洗脱液含有15mM Tris、4mM EDTA和纯化水；
磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁珠，磁珠粒径为200nm；
蛋白酶K浓度是25.0mg/mL；
各组分pH值调至8.1。
实施例4 人工手动提取病毒样本中的核酸
1、操作方法
使用实施例1的基于磁珠法的核酸提取试剂盒和市面在售的核酸提取或纯化试剂A（购自圣湘生物科技股份有限公司），分别提取10000Copies/mL新型冠状病毒假病毒P1（购自苏州复百奥生物医药科技有限公司，货号：FNRV2596）、甲型流感病毒液体质控品P2（购自广州邦德盛生物科技有限公司，货号：BDS-IQC-130）、乙型流感病毒液体质控品P3（购自广州邦德盛生物科技有限公司，货号：BDS-IQC-073）中的核酸。
使用市面在售的核酸提取或纯化试剂A，按照其说明书操作。
使用实施例1的基于磁珠法的核酸提取试剂盒，具体操作方法如下：
（1）裂解与结合：向15mL Nuclease-free低吸附EP管中加入200μL待提取样本，加入20μL蛋白酶K，轻微涡旋后上下颠倒混匀；加入20μL磁珠和400μL裂解液，涡旋振荡混匀15s，室温裂解5min，期间上下颠倒混匀两次；瞬时离心，置于磁力架上静置1min，用移液器移除上清液，得到吸附核酸的磁珠。
（2）洗涤：向盛有吸附核酸的磁珠的EP管中加入600μL洗涤液1，涡旋15s混匀，瞬时离心，置于磁力架上静置1min，除尽上清液；再加入600μL洗涤液2，涡旋15s混匀，瞬时离心，置于磁力架上静置1min，除尽上清液；再次瞬时离心，置于磁力架上静置1min，除尽上清液；开盖，于室温下晾置3~5min，直至磁珠表面无反光。
（3）洗脱：加入100μL洗脱液，温和混匀15s，室温静置3min，期间振荡混匀2次；瞬时离心后，置于磁力架上静置1min，吸取上清液至Nuclease-free离心管，得到核酸提取产物，置于-20±5℃保存备用。
2、分光光度法检测核酸提取产量和纯度
使用微量分光光度仪测定实施例4得到的核酸提取物中的核酸RNA浓度和核酸提取物纯度（OD260/OD280），每种核酸提取物重复三次，结果如表1所示。
表1 核酸提取产物的浓度和纯度
由表1数据可知，相对于市面在售的核酸提取或纯化试剂，使用本发明提供的基于磁珠法的核酸提取试剂盒人工手动提取病毒核酸，得到的核酸提取产物浓度高，纯度更好。
实施例5 采用新华医疗NAE 9600全自动核酸提取仪提取病毒样本中的核酸
1、操作方法
将实施例2制备的裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液依次均匀的加入96深孔板的第1列、第3列、第4列、第6列，将磁珠以及蛋白酶K混匀后加入至第1列。分别取200μL500Copies/mL和10000Copies/mL的新型冠状病毒假病毒P1、甲型流感病毒液体质控品P2、乙型流感病毒液体质控品P3，加入至96深孔板第1列中，然后将96深孔板放入自动化核酸提取仪中，将磁棒搅拌套插入磁棒架中（注意插到底），关闭仓门，打开仪器操作软件，按表1中的参数进行设置，并执行程序。
表1 自动化核酸提取仪反应程序
程序结束后，先取磁棒套，后取深孔板，第6列中的液体即为核酸提取产物，将其保存于-20±5℃备用。
2、实时荧光定量PCR检测
采用ABI QS5实时荧光定量PCR仪和适用于荧光PCR法的新型冠状病毒2019-nCoV、甲型流感病毒、乙型流感病毒核酸检测试剂盒（购自圣湘生物科技股份有限公司），分别检测实施例5得到的核酸提取产物和实施例4中采用的市面在售的核酸提取或纯化试剂A得到的核酸提取产物的Ct値，每种核酸提取产物检测重复10次，结果如表2、表3所示。
表2 10000Copies/mL病毒的核酸提取产物的Ct值
表3 500Copies/mL病毒的核酸提取产物的Ct值
由表2、表3的实验结果可知，本发明提供的基于磁珠法的核酸提取试剂盒配合全自动核酸提取仪，分别提取200μL 500Copies/mL和10000Copies/mL的新型冠状病毒假病毒P1、甲型流感病毒液体质控品P2、乙型流感病毒液体质控品P3，其Ct值的标准偏差和CV都优于市面在售的核酸提取或纯化试剂A。说明本发明提供的基于磁珠法的核酸提取试剂盒配合自动化核酸提取仪对病毒核酸的提取效果良好，实现了快速高效、高通量的核酸提取。而且上述提取方法搭配实时荧光定量PCR试剂盒进行检测，最低检测限可达500Copies/mL，表明该方法能够适用于微量病毒样本的核酸提取。与现有磁珠法核酸提取方法中磁珠在裂解完成之后才能加入反应溶液中进行核酸结合相比，本发明提供的核酸提取试剂盒及核酸提取方法更适用于全自动化核酸提取应用。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于磁珠法的核酸提取试剂盒，其特征在于，包括以下组分：裂解液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、磁珠、蛋白酶K，各组分pH值调至8.0±0.1；
裂解液含有如下组分：1~2M硫氰酸胍、10~20mM Tris、30~50mM二水合柠檬酸三钠、质量体积分数为40%~50%的异丙醇、质量体积分数为10%~20%的无水乙醇和纯化水；
洗涤液1含有如下组分：1~2M硫氰酸胍、3~6mM EDTA、10~20mM Tris、30~50mM二水合柠檬酸三钠、质量体积分数为10%~30%的异丙醇、质量体积分数为40%~50%的无水乙醇和纯化水；
洗涤液2含有如下组分：质量体积分数为60%~80%的无水乙醇、10~20mM Tris、3~6mMEDTA和纯化水。
2. 如权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，洗脱液含有如下组分：10~20mMTris、3~6mM EDTA和纯化水。
3.如权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁珠，磁珠粒径为100~400nm。
4.如权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，蛋白酶K浓度是15.0~30.0mg/mL。
5.一种如权利要求1-4任一项所述核酸提取试剂盒在提取生物样本中的核酸方面的应用。
6.一种使用如权利要求1-4任一项所述核酸提取试剂盒的核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）裂解与结合：将待提取样本与蛋白酶K混匀，然后加入磁珠和裂解液混匀、反应，移除上清液得到吸附核酸的磁珠；
（2）洗涤：先用洗涤液1清洗吸附核酸的磁珠，除去上清液；然后用洗涤液2清洗吸附核酸的磁珠，除去上清液，保证无液体残留；
（3）洗脱：加入洗脱液处理洗涤后的磁珠，收集上清液即得到核酸提取产物。
7.如权利要求6所述的核酸提取方法，其特征在于，手动人工操作的具体过程为：
（1）裂解与结合：向15mL Nuclease-free低吸附EP管中加入200μL待提取样本，加入20μL蛋白酶K，轻微涡旋后上下颠倒混匀；加入20μL磁珠和400μL裂解液，涡旋振荡混匀15s，室温裂解5min，期间上下颠倒混匀两次；瞬时离心，置于磁力架上静置1min，用移液器移除上清液，得到吸附核酸的磁珠；
（2）洗涤：向盛有吸附核酸的磁珠的EP管中加入600μL洗涤液1，涡旋15s混匀，瞬时离心，置于磁力架上静置1min，除尽上清液；再加入600μL洗涤液2，涡旋15s混匀，瞬时离心，置于磁力架上静置1min，除尽上清液；再次瞬时离心，置于磁力架上静置1min，除尽上清液；开盖，于室温下晾置3~5min，直至磁珠表面无反光；
（3）洗脱：加入100μL洗脱液，温和混匀15s，室温静置3min，期间振荡混匀2次；瞬时离心后，置于磁力架上静置1min，吸取上清液至Nuclease-free离心管，得到核酸提取产物。
8.如权利要求6所述的核酸提取方法，其特征在于，采用自动核酸提取仪进行提取。
9. 如权利要求8所述的核酸提取方法，其特征在于，采用新华医疗NAE 9600全自动核酸提取仪进行提取，具体步骤如下：
（1）将400μL裂解液、600μL洗涤液1、600μL洗涤液2、100μL洗脱液依次均匀加入96深孔板的第1列、第3列、第4列、第6列孔位中，将20μL磁珠以及20μL蛋白酶K混匀后加入至第1列；
（2）取200μL待提取样本加入96深孔板的第1列，然后将96深孔板放入自动核酸提取仪中，将磁棒搅拌套插入磁棒架中，关闭仓门，打开仪器操作软件，按照如下参数设置并执行程序：
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311559326.3A CN117264945A (zh) | 2023-11-22 | 2023-11-22 | 基于磁珠法的核酸提取试剂盒及其应用、核酸提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311559326.3A CN117264945A (zh) | 2023-11-22 | 2023-11-22 | 基于磁珠法的核酸提取试剂盒及其应用、核酸提取方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117264945A true CN117264945A (zh) | 2023-12-22 |
Family
ID=89218150
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311559326.3A Pending CN117264945A (zh) | 2023-11-22 | 2023-11-22 | 基于磁珠法的核酸提取试剂盒及其应用、核酸提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117264945A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117535283A (zh) * | 2024-01-08 | 2024-02-09 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种磁珠法提取血液基因组dna的试剂盒及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109022417A (zh) * | 2018-08-13 | 2018-12-18 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种磁珠法核酸提取转化试剂盒及其使用方法 |
| CN110669869A (zh) * | 2019-07-03 | 2020-01-10 | 福建省肿瘤医院（福建省肿瘤研究所、福建省癌症防治中心） | 一种磁珠法核酸提取结合荧光pcr检测血浆eb病毒dna的方法 |
| CN113913421A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-01-11 | 苏州海狸生物医学工程有限公司 | 全血dna提取试剂及提取方法 |
| CN116064503A (zh) * | 2023-04-07 | 2023-05-05 | 深圳市梓健生物科技有限公司 | 一种不含蛋白酶的快速磁珠法核酸提取试剂盒及核酸的提取及纯化方法 |
| CN116121237A (zh) * | 2022-08-03 | 2023-05-16 | 南京中科拜尔医学技术有限公司 | 一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法 |
-
2023
- 2023-11-22 CN CN202311559326.3A patent/CN117264945A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109022417A (zh) * | 2018-08-13 | 2018-12-18 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种磁珠法核酸提取转化试剂盒及其使用方法 |
| CN110669869A (zh) * | 2019-07-03 | 2020-01-10 | 福建省肿瘤医院（福建省肿瘤研究所、福建省癌症防治中心） | 一种磁珠法核酸提取结合荧光pcr检测血浆eb病毒dna的方法 |
| CN113913421A (zh) * | 2021-12-07 | 2022-01-11 | 苏州海狸生物医学工程有限公司 | 全血dna提取试剂及提取方法 |
| CN116121237A (zh) * | 2022-08-03 | 2023-05-16 | 南京中科拜尔医学技术有限公司 | 一种磁珠法无醇核酸提取试剂盒及其提取方法 |
| CN116064503A (zh) * | 2023-04-07 | 2023-05-05 | 深圳市梓健生物科技有限公司 | 一种不含蛋白酶的快速磁珠法核酸提取试剂盒及核酸的提取及纯化方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 新华医疗: "DNA/RNA提取平台再创佳绩", 《产品简介》, pages 1 * |
| 李海洋 等: "硅羟基磁珠的制备及全基因组DNA提取优化", 《生物技术通报》, vol. 33, no. 06, pages 223 - 229 * |
| 贾连群等: "《现代基础医学理论与技术进展》", vol. 1, 31 August 2015, 中国医药科技出版社, pages: 39 * |
| 郭睿: "《男性生殖基础与实验室研究》", vol. 1, 30 June 2009, 军事医学科学出版社, pages: 143 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117535283A (zh) * | 2024-01-08 | 2024-02-09 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种磁珠法提取血液基因组dna的试剂盒及其应用 |
| CN117535283B (zh) * | 2024-01-08 | 2024-03-29 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种磁珠法提取血液基因组dna的试剂盒及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107663521B (zh) | 血浆游离核酸提取试剂盒及其应用 | |
| CN109722431B (zh) | 一种基于磁珠法的无醇病毒核酸提取试剂盒 | |
| CN107937391B (zh) | 人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液及其制备方法和应用 | |
| CN117264945A (zh) | 基于磁珠法的核酸提取试剂盒及其应用、核酸提取方法 | |
| CN113151397B (zh) | 一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒 | |
| CN111484991B (zh) | 用于病毒核酸高通量全自动化提取的试剂盒及提取方法 | |
| JP5824141B2 (ja) | 生体試料よりｒｎａを分離精製する方法 | |
| CN106591297A (zh) | 一种磁珠法核酸提取方法 | |
| CN109022420B (zh) | 一种基于磁珠的dna提取方法、裂解液及试剂盒 | |
| CN106754890B (zh) | 一种病毒rna的提取试剂盒和提取方法 | |
| CN114058616B (zh) | 一种基于磁珠法快速提取血浆游离核酸的试剂盒 | |
| CN110904097A (zh) | 一种用于血液游离dna提取的试剂盒 | |
| CN108642048A (zh) | 一种可应用于从动物组织中高通量提取基因组dna的试剂盒及提取方法 | |
| CN112899266A (zh) | 一种核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用 | |
| CN108070585A (zh) | 一种基于磁珠技术提取血液基因组dna的试剂盒及其方法 | |
| CN113699145A (zh) | 基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液及其产品与应用 | |
| CN110938624A (zh) | 一种用于基因组dna提取的试剂盒及其应用 | |
| CN110387369A (zh) | 一种能够满足微量核酸生物样本提取纯化要求的试剂盒及其使用方法 | |
| CN107119039A (zh) | 一种组织不研磨直接提取核酸的方法 | |
| CN113088515A (zh) | 用于ffpe组织样本dna提取的试剂盒、方法及其应用 | |
| EP1570077A1 (de) | Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren | |
| CN112048503A (zh) | 一种高通量快速磁珠法提取植物基因组dna的试剂盒及提取法 | |
| CN116162618A (zh) | 一种从核酸溶液中分离dna和rna的方法及试剂组合 | |
| CN116064503A (zh) | 一种不含蛋白酶的快速磁珠法核酸提取试剂盒及核酸的提取及纯化方法 | |
| CN112725412A (zh) | 一种生物制品的痕量dna提取方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |