CN114371065A - 一种生物样本液体活检样本的处理方法（磁珠分离法）及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种生物样本液体活检样本的处理方法(磁珠分离法)及其应用，涉及质谱法、光谱法测定用液体活检样本中蛋白、多肽以及代谢产物的前处理方法。通过使用经过表面修饰的固相萃取磁珠，对液体活检样本中待检测物质进行吸附结合，再使用洗脱溶液对这种强烈的结合进行破坏，以获得分离富集的待测物质，可用于质谱、色谱、光谱等检测用仪器对慢性疾病的辅助诊断。
Description
技术领域
本发明涉及液体活检样本的前处理方法，具体涉及分子诊断技术对疾病检测用液体活检样本的处理方法。
背景技术
随着分析仪器技术的发展以及人工智能技术的日益成熟，体外诊断技术（introdiagnostic）已成为人类疾病预防、诊断及治疗的重要组成部分，也为人类健康及社会和谐提供了重要保障，其中分子诊断技术更是具有极大的潜力，也是诊断技术未来发展的关键方向。
血液、尿液、淋巴液、组织液等生物液体活检样本中的蛋白、多肽和代谢产物有可能作为从正常状态到疾病状态进展的可靠指标。分子诊断技术主要包括使用质谱、光谱、色谱等检测仪器，对生物液体活检样本中的蛋白、多肽以及代谢产物等物质含量的分析检测，能够精准地对肿瘤、高血压、冠心病等慢性疾病的患病情况进行诊断，并对临床寻找慢性疾病的患病原因具有极大的帮助。
生物液体活检样本中盐、脂质和高浓度蛋白质的存在会对仪器的分析产生不利影响，因为所有这些部分都会阻碍诊断生物标志物的检测。传统多级分馏方法中的几种使用色谱柱吸附剂的预分馏策略已被用于对样品进行脱盐并去除丰富的蛋白质，但存在柱子层析介质制备复杂、价格昂贵以及不适用于大规模临床使用等缺陷，本发明在实验过程中，经过不断优化实验步骤及试剂比例，达到了富集和纯化蛋白、多肽、代谢产物等目标物质的目的，并极大地提高了分离效果和重现性，降低了制造成本，更加适用于高通量和临床环境，从而更适用于精确的疾病筛查。
现有技术文献
非专利文献
Serum Peptide Profifi ling using MALDI Mass Spectrometry .，PracticalProteomics (2007) 1:77。
发明内容
发明要解决的技术问题
分子诊断技术使用的液体活检样本中存在大量的盐类、基因碎片、脂类、大分子蛋白质及细胞碎片，对仪器检测产生严重的干扰。传统的解决方法主要是在血清、尿液等液体活检样本中加入甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等有机溶剂，使高丰度蛋白变性而聚集沉淀并通过离心进行分离，获得含有蛋白、多肽、代谢产物等待检测物质的上清液。但该方法存在干扰物质分离不彻底、干扰检测结果等缺点。
解决问题的手段
为了解决上述问题，本发明提供一种色谱法、光谱法及质谱法测定液体活检样本中蛋白、多肽以及代谢产物的前处理方法，建立一种准确性良好的、样品消耗量低的、高通量检测的一种的非侵袭性诊断疾病的方法，大大降低了样本中干扰物质的浓度，提高了诊断的准确率。本方法通过使用经过表面修饰的固相萃取磁珠，对样本中的蛋白、多肽、代谢产物等待检测物质进行吸附结合，再使用洗脱溶液对这种强烈的结合进行破坏，以获得分离富集的待测物质，后续通过检测仪器对洗脱液进行检测，可以筛查出包括肿瘤、冠心病、高血压、糖尿病等慢性疾病。
具体而言，本发明包含以下实施方式。
1、一种样本处理方法，其包括下述步骤：
步骤一、将磁珠混合摇匀；
步骤二、将样本进行酸化；
步骤三、将磁珠进行磁性分离；
步骤四、将磁珠润湿；
步骤五、使步骤四的润湿的磁珠吸附步骤二的酸化样本；
步骤六、使用冲洗液冲洗步骤五的磁珠；
步骤七、使用洗脱液冲洗步骤六的磁珠；
步骤八、收集洗脱液，使用仪器进行检测。
2、步骤一所述磁珠选自使用疏水基团表面修饰的Fe3O4固相萃取磁珠，磁珠的修饰基团包括但不限于C3丙基修饰、C4丁基修饰、C8辛烷基修饰、C12十二烷基修饰、C18十八烷基修饰。
3、步骤一所述的磁珠混合摇匀为斡旋磁珠悬浮液20~100次，移取10~50μL到离心管内备用。
4、步骤一所述的磁珠混合摇匀为斡旋磁珠悬浮液20次，移取的备用体积20μL到离心管内。
5、所述步骤二中的样本选自血浆、血清、尿液、组织液、唾液、关节液、脑脊液中的任意一种。
6、所述步骤二中的酸化试剂选自三氟乙酸、三氟丙酸、甲酸、乙酸中的一种及以上有机酸的水溶液。
7、所述步骤二中的酸化试剂为体积浓度0.1%~4%的有机酸的水溶液。
8、所述步骤二中的酸化试剂为体积浓度2%的有机酸的水溶液。
9、所述步骤三中使用的方法为将离心管放在磁铁上10~60秒，当离心管保持在磁铁上时，用移液管抽吸出上清液。
10、所述步骤三中使用的方法为将离心管放保持在磁铁上的磁性分离时间为20秒。
11、步骤四中磁珠润湿方法包括以下2个步骤：
S1：在骤三获得的磁珠内加入润洗溶液1，混合摇匀，将磁珠进行磁性分离，吸取上清液，舍弃；
S2：在S1获得的磁珠内加入润洗溶液2，混合摇匀，将磁珠进行磁性分离，吸取上清液，舍弃。
12、所述步骤四中使用的润湿溶液1选自乙腈、甲醇、乙醇、丙酮中的一种及以上有机试剂的水溶液。
13、所述步骤四中使用的润湿溶液1为体积浓度30%~70%的有机溶剂的水溶液。
14、所述步骤四中的使用的润湿溶液1为体积浓度50%的有机溶剂的水溶液。
15、所述步骤四中使用的润湿溶液2选自三氟乙酸、三氟丙酸、乙酸、甲酸中的一种及以上有机酸的水溶液。
16、所述步骤四中使用的润湿溶液2为体积浓度0.05%~0.5%的有机酸的水溶液。
17、所述步骤四中的使用的润湿溶液2为体积浓度0.1%的有机酸的水溶液。
18、所述步骤五的磁珠吸附酸化样本方式为斡旋磁珠悬浮液20~100次，磁性分离时间10~60秒。
19、所述步骤五的磁珠吸附酸化样本方式为斡旋磁珠悬浮液50次，磁性分离时间30秒。
20、所述步骤六的冲洗溶液为混合溶液，溶质1为三氟乙酸、三氟丙酸、乙酸、甲酸中的一种及以上有机酸，溶质2为乙腈、甲醇、乙醇、丙酮中的一种及以上有机试剂，溶剂为水。
21、所述步骤六的冲洗溶液为混合溶液，溶质1的体积浓度为0.05%~0.5%，溶质2的体积浓度为2%~10%。
22、所述步骤六的冲洗溶液为溶质1体积浓度0.1%、溶质2体积浓度5%的水溶液。
23、所述步骤六的磁珠冲洗方式为斡旋磁珠悬浮液20~100次，磁性分离时间10~60秒。
24、所述步骤六的磁珠冲洗方式为斡旋磁珠悬浮液20次，磁性分离时间30秒。
25、所述步骤七的洗脱溶液为混合溶液，溶质1为三氟乙酸、三氟丙酸、甲酸、乙酸中的一种及以上有机酸，溶质2为乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇中的一种及以上有机试剂，溶剂为水。
26、所述步骤七的洗脱溶液为混合溶液，溶质1的体积浓度为0.05%~0.5%，溶质2的体积浓度为30%~95%。
27、所述步骤六的洗脱溶液为溶剂1体积浓度0.1%、溶剂2体积浓度90%的水溶液。
28、所述步骤六的磁珠洗脱方式为斡旋磁珠悬浮液20~100次，磁性分离时间10~60秒。
29、所述步骤六的磁珠洗脱方式为斡旋磁珠悬浮液80次，磁性分离时间30秒。
本发明取得的有益效果是：产业上的实用性，基于蛋白、多肽、代谢产物的液体活检样本的液体组织检查作为一种无创且灵敏的检查方法，在慢性疾病的诊断方面表现出巨大的潜力。由于在液体活检样本中存在大量的盐类、高丰度蛋白、细胞碎片、基因碎片等，对仪器检测产生严重的干扰。经过本发明的液体活检样本处理方法处理后的液体活检样本，分离了干扰物质，富集了待测物质，提高了诊断的准确率，可用于质谱、色谱、光谱等现行的各种液体活检样本检测用仪器的定量，定性及半定量检测，进而对多种慢性疾病进行诊断，包括但不限于心血管疾病、产科风险评估、肿瘤相关疾病等。
附图说明
图1是实施例1的操作流程示意图。
定义
除非上下文另有说明，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包含”或“包括”应以开放的含义来理解，即“包括但不限于”。
本申请所用术语“样本”、“生物样本”、“液体活检样本”是指任何离体的人体的体液，包括但不限于尿、血、唾液、胆汁、胃液、淋巴液及生物体的其他分泌液等。
具体实施方式
本发明一个方面涉及质谱法测定液体活检样本中蛋白、多肽以及代谢产物的前处理方法，包括下述步骤：
步骤一、将磁珠混合摇匀，移取至离心管内备用，优选地，所述磁珠选自使用疏水基团表面修饰的Fe3O4固相萃取磁珠，优选地，所述的表面修饰的疏水基团选自C3丙基修饰、C4丁基修饰、C8辛烷基修饰、C12十二烷基修饰、C18十八烷基修饰中的一种，优选地，所述的表面修饰的疏水基团使用C18十八烷基修饰。优选地，所述的磁珠混合摇匀为斡旋磁珠悬浮液10~50次，优选地，磁珠混合摇匀为斡旋磁珠悬浮液20次，优选地，移取10~50μL到离心管内备用，优选地，移取20μL到离心管内备用；
步骤二、使用将样本与酸化试剂混合，优选地，将样本与有机酸溶液混合，所述有机酸选自三氟乙酸、三氟丙酸、甲酸、乙酸的一种以上，优选地使用三氟乙酸；优选地，有机酸溶液中的有机酸的体积浓度为0.1%~4%，优选2%；优选地，所述酸化试剂为三氟乙酸的水溶液，更优选体积浓度为0.1%的三氟乙酸水溶液优选地；
步骤三、在离心管内移入适量的步骤一的磁珠，将磁珠进行磁性分离，吸取上清液，舍弃，优选地，所述的磁性分离方法为将加入磁珠的离心管放在磁铁上保持1~10分钟。优选5分钟；
步骤四、将骤三获得的使磁珠润湿，优选地，分为两个步骤，S1：在骤三获得的磁珠内加入润洗溶液1，混合均匀，将磁珠进行磁性分离，吸取上清液，舍弃，重复该操作2~10次；S2：加入润洗溶液2，混合均匀，将磁珠进行磁性分离，吸取上清液，舍弃，重复该操作2~10次。
优选地，润洗溶液1取选自乙腈、甲醇、乙醇、丙酮中的一种及以上的水溶液中，优选乙腈水溶液，优选地，乙腈的体积浓度为30-70%，更优选40-60%，进一步优选50%；优选地，润洗溶液2取选自三氟乙酸、三氟丙酸、乙酸、甲酸中的一种及以上的水溶液中，优选三氟乙酸水溶液，优选地，三氟乙酸的体积浓度为0.05%~0.2%，更优选0.08%~0.15%，进一步优选0.1%；
步骤五、在步骤四获得的磁珠内加入步骤二获得的酸化样本溶液，混合摇匀，磁性分离，吸取上清液，舍弃，重复此步骤；优选地，所述的磁珠吸附酸化样本方式为斡旋磁珠悬浮液20~100次，优选50次，优选地，磁性分离时间为10~60秒，优选30秒；
步骤六、在步骤五获得的磁珠内加入冲洗溶液，混合摇匀，磁性分离，吸取上清液，舍弃，重复此步骤；优选地，所述冲洗溶液为溶剂为水的混合溶液，优选地，溶质1为三氟乙酸、三氟丙酸、甲酸、乙酸中的一种及以上有机酸，优选三氟乙酸，优选地，相对于冲洗液的总量，三氟乙酸的体积浓度为0.05%~0.5%，更优选0.1%；溶质2为乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇中的一种及以上有机试剂，优选乙腈，优选地，相对于冲洗液的总量，乙腈的体积浓度为2%~10%，更优选5%；
优选地，所述的磁珠吸附冲洗方式为斡旋磁珠悬浮液20~100次，优选30次，优选地，磁性分离时间为10~60秒，优选30秒；
步骤七、在步骤五获得的磁珠内加入洗脱溶液，混合摇匀，磁性分离，吸取上清液，舍弃，重复此步骤；优选地，所述冲洗溶液为溶剂为水的混合溶液，优选地，溶质1为三氟乙酸、三氟丙酸、甲酸、乙酸中的一种及以上有机酸，优选三氟乙酸，优选地，相对于冲洗液的总量，三氟乙酸的体积浓度为0.05%~0.5%，更优选0.1%；溶质2为乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇中的一种及以上有机试剂，优选乙腈，优选地，相对于冲洗液的总量，乙腈的体积浓度为30%~95%，更优选90%；
优选地，所述的磁珠吸附冲方式为斡旋磁珠悬浮液20~100次，优选80次，优选地，磁性分离时间为10~60秒，优选30秒；
步骤八、收集洗脱液，按照通常的方法，使用质谱仪进行检测。
本发明一个方面涉及色谱法测定液体活检样本中蛋白、多肽以及代谢产物的前处理方法，包括下述步骤：
步骤一、将磁珠混合摇匀，移取至离心管内备用，优选地，所述磁珠选自使用疏水基团表面修饰的Fe3O4固相萃取磁珠，优选地，所述的表面修饰的疏水基团选自C3丙基修饰、C4丁基修饰、C8辛烷基修饰、C12十二烷基修饰、C18十八烷基修饰中的一种，优选地，所述的表面修饰的疏水基团使用C12十二烷基修饰。优选地，所述的磁珠混合摇匀为斡旋磁珠悬浮液10~50次，优选地，磁珠混合摇匀为斡旋磁珠悬浮液20次，优选地，移取10~50μL到离心管内备用，优选地，移取20μL到离心管内备用；
步骤二、使用将样本与酸化试剂混合，优选地，将样本与有机酸溶液混合，所述有机酸选自三氟乙酸、三氟丙酸、甲酸、乙酸的一种以上，优选地使用三氟乙酸；优选地，有机酸溶液中的有机酸的体积浓度为0.1%~4%，优选2%；优选地，所述酸化试剂为三氟乙酸的水溶液，更优选体积浓度为0.1%的三氟乙酸水溶液优选地；
步骤三、在离心管内移入适量的步骤一的磁珠，将磁珠进行磁性分离，吸取上清液，舍弃，优选地，所述的磁性分离方法为将加入磁珠的离心管放在磁铁上保持1~10分钟。优选5分钟；
步骤四、将骤三获得的使磁珠润湿，优选地，分为两个步骤，S1：在骤三获得的磁珠内加入润洗溶液1，混合均匀，将磁珠进行磁性分离，吸取上清液，舍弃，重复该操作2~10次；S2：加入润洗溶液2，混合均匀，将磁珠进行磁性分离，吸取上清液，舍弃，重复该操作2~10次。
优选地，润洗溶液1取选自乙腈、甲醇、乙醇、丙酮中的一种及以上的水溶液中，优选乙腈水溶液，优选地，乙腈的体积浓度为30-70%，更优选40-60%，进一步优选50%；优选地，润洗溶液2取选自三氟乙酸、三氟丙酸、乙酸、甲酸中的一种及以上的水溶液中，优选三氟乙酸水溶液，优选地，三氟乙酸的体积浓度为0.05%~0.2%，更优选0.08%~0.15%，进一步优选0.1%；
步骤五、在步骤四获得的磁珠内加入步骤二获得的酸化样本溶液，混合摇匀，磁性分离，吸取上清液，舍弃，重复此步骤；优选地，所述的磁珠吸附酸化样本方式为斡旋磁珠悬浮液20~100次，优选50次，优选地，磁性分离时间为10~60秒，优选30秒；
步骤六、在步骤五获得的磁珠内加入冲洗溶液，混合摇匀，磁性分离，吸取上清液，舍弃，重复此步骤；优选地，所述冲洗溶液为溶剂为水的混合溶液，优选地，溶质1为三氟乙酸、三氟丙酸、甲酸、乙酸中的一种及以上有机酸，优选三氟乙酸，优选地，相对于冲洗液的总量，三氟乙酸的体积浓度为0.05%~0.5%，更优选0.1%；溶质2为乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇中的一种及以上有机试剂，优选乙腈，优选地，相对于冲洗液的总量，乙腈的体积浓度为2%~10%，更优选5%；
优选地，所述的磁珠吸附冲洗方式为斡旋磁珠悬浮液20~100次，优选30次，优选地，磁性分离时间为10~60秒，优选30秒；
步骤七、在步骤五获得的磁珠内加入洗脱溶液，混合摇匀，磁性分离，吸取上清液，舍弃，重复此步骤；优选地，所述冲洗溶液为溶剂为水的混合溶液，优选地，溶质1为三氟乙酸、三氟丙酸、甲酸、乙酸中的一种及以上有机酸，优选三氟乙酸，优选地，相对于冲洗液的总量，三氟乙酸的体积浓度为0.05%~0.5%，更优选0.1%；溶质2为乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇中的一种及以上有机试剂，优选乙腈，优选地，相对于冲洗液的总量，乙腈的体积浓度为30%~95%，更优选90%；
优选地，所述的磁珠吸附冲方式为斡旋磁珠悬浮液20~100次，优选80次，优选地，磁性分离时间为10~60秒，优选30秒；
步骤八、收集洗脱液，按照通常的方法，使用质谱仪进行检测。
实施例
下表中显示了本申请中使用的化合物的英文简写所对应的中文名。
| 化合物英文简写 | 化合物中文名 | 化合物英文简写 | 化合物中文名 |
| TFA | 三氟乙酸 | CAN | 乙腈 |
| C18 | 十八烷基修饰 | C3 | 丙基修饰 |
| C4 | 丁基修饰 | C8 | 辛烷基修饰 |
| C12 | 十二烷基修饰 |
下述实施例中，除非另有限定，否则“%v/v”表示体积百分比。
实施例1
步骤一、斡旋磁珠悬浮液20次，所述磁珠为使用疏水基团表面修饰的Fe3O4磁珠，修饰基团为C18基团；
步骤二、移取血清50μL、的酸化试剂（2%v/v TFA）50μL，混合摇匀；
步骤三、在离心管内移入10μL的步骤一的磁珠，将磁珠进行磁性分离20s，吸取上清液，舍弃；
步骤四、在步骤三获得的磁珠内加入30µL润洗溶液1（50%v/v ACN），斡旋20次，磁性分离20s，吸取上清液，舍弃；加入30µL润洗溶液2（0.1%v/v TFA），斡旋20次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃；
步骤五、在步骤四获得的磁珠内加入20µL步骤二获得的酸化样本溶液，斡旋50次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃，重复此步骤5次；
步骤六、在步骤六获得的磁珠内加入20µL冲洗溶液（0.1%v/v TFA，5%v/v ACN），斡旋20次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃，重复此步骤3次；
步骤七、在步骤七获得的磁珠内加入10µL洗脱溶液（0.1%v/v TFA，70%v/v ACN），斡旋50次，磁性分离30s，吸取上清液，保留，重复此步骤10次；
步骤八、收集步骤七的洗脱液。
实施例2
步骤一、将磁珠混合摇匀10次，所述磁珠为使用疏水基团表面修饰的Fe3O4磁珠，修饰基团为C4基团；
步骤二、移取尿液60μL、的酸化试剂（4%v/v 乙酸）60μL，混合摇匀；
步骤三、在离心管内移入20μL的步骤一的磁珠，将磁珠进行磁性分离30s，吸取上清液，舍弃；
步骤四、在步骤三获得的磁珠内加入30µL润洗溶液1（70%v/v甲醇），斡旋10次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃；加入30µL润洗溶液2（0.5%v/v乙酸），混合摇匀10次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃；
步骤五、在步骤四获得的磁珠内加入40µL步骤二获得的酸化样本溶液，斡旋100次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃，重复此步骤3次；
步骤六、在步骤六获得的磁珠内加入30µL冲洗溶液（0.1%v/v TFA，10%v/v ACN），斡旋10次，磁性分离20s，吸取上清液，舍弃，重复此步骤1次；
步骤七、在步骤七获得的磁珠内加入10µL洗脱溶液（0.1%v/v TFA，90%v/v 甲醇），斡旋80次，磁性分离30s，吸取上清液，保留，重复此步骤10次；
步骤八、收集步骤七的洗脱液。
实施例3
步骤一、将磁珠混合摇匀20次，所述磁珠为使用疏水基团表面修饰的Fe3O4磁珠，修饰基团为C12基团；
步骤二、移取血浆50μL、的酸化试剂（3%v/v 三氟丙酸）50μL，混合摇匀；
步骤三、在离心管内移入10μL的步骤一的磁珠，将磁珠进行磁性分离30s，吸取上清液，舍弃；
步骤四、在步骤三获得的磁珠内加入30µL润洗溶液1（50%v/v 丙酮），斡旋20次，磁性分离20s，吸取上清液，舍弃；加入30µL润洗溶液2（0.5%v/v 乙酸），斡旋20次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃；
步骤五、在步骤四获得的磁珠内加入30µL步骤二获得的酸化样本溶液，斡旋10次，磁性分离50s，吸取上清液，舍弃，重复此步骤2次；
步骤六、在步骤六获得的磁珠内加入20µL冲洗溶液（0.5%v/v 乙酸，10%v/v 乙醇），斡旋10次，磁性分离60s，吸取上清液，舍弃，重复此步骤3次；
步骤七、在步骤七获得的磁珠内加入20µL洗脱溶液（0.5%v/v 乙酸，50%v/v 丙酮），斡旋50次，磁性分离30s，吸取上清液，保留，重复此步骤5次；
步骤八、收集步骤七的洗脱液。
实施例4
步骤一、将磁珠混合摇匀20次，所述磁珠为使用疏水基团表面修饰的Fe3O4磁珠，修饰基团为C8基团；
步骤二、移取关节液50μL、的酸化试剂（3%v/v 甲酸）50μL，混合摇匀；
步骤三、在离心管内移入20μL的步骤一的磁珠，将磁珠进行磁性分离30s，吸取上清液，舍弃；
步骤四、在步骤三获得的磁珠内加入30µL润洗溶液1（50%v/v乙醇），斡旋10次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃；加入30µL润洗溶液2（0.5%v/v甲酸），斡旋10次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃；
步骤五、在步骤四获得的磁珠内加入20µL步骤二获得的酸化样本溶液，斡旋50次，磁性分离60s，吸取上清液，舍弃，重复此步骤5次；
步骤六、在步骤六获得的磁珠内加入30µL冲洗溶液（0.5%v/v 甲酸，10%v/v 乙醇），斡旋20次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃，重复此步骤2次；
步骤七、在步骤七获得的磁珠内加入10µL洗脱溶液（0.5%v/v 甲酸，70%v/v 乙醇），斡旋100次，磁性分离30s，吸取上清液，保留，重复此步骤5次；
步骤八、收集步骤七的洗脱液。
实施例5
步骤一、将磁珠混合摇匀20次，所述磁珠为使用疏水基团表面修饰的Fe3O4磁珠，修饰基团为C3基团；
步骤二、移取唾液50μL、的酸化试剂（3%v/v 甲酸）50μL，混合摇匀；
步骤三、在离心管内移入30μL的步骤一的磁珠，将磁珠进行磁性分离30s，吸取上清液，舍弃；
步骤四、在步骤三获得的磁珠内加入50µL润洗溶液1（50%v/v丙酮），斡旋10次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃；加入30µL润洗溶液2（0.5%v/v乙酸），斡旋20次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃；
步骤五、在步骤四获得的磁珠内加入20µL步骤二获得的酸化样本溶液，斡旋80次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃，重复此步骤5次；
步骤六、在步骤六获得的磁珠内加入30µL冲洗溶液（0.5%v/v 甲酸，10%v/v 乙醇），斡旋10次，磁性分离30s，吸取上清液，舍弃，重复此步骤2次；
步骤七、在步骤七获得的磁珠内加入10µL洗脱溶液（0.5%v/v ，30%v/v 丙酮），斡旋80次，磁性分离30s，吸取上清液，保留，重复此步骤5次；
步骤八、收集步骤七的洗脱液。
Claims (29)
1.一种样本处理方法，其特征在于，包括下述步骤：
步骤一、将磁珠混合摇匀；
步骤二、将样本进行酸化；
步骤三、将磁珠进行磁性分离；
步骤四、将磁珠润湿；
步骤五、使步骤四的润湿的磁珠吸附步骤二的酸化样本；
步骤六、使用冲洗液冲洗步骤五的磁珠；
步骤七、使用洗脱液冲洗步骤六的磁珠；
步骤八、收集洗脱液，使用仪器进行检测。
2.根据权利要求1所述的样本处理方法，其特征在于，步骤一所述磁珠选自使用疏水基团表面修饰的Fe3O4固相萃取磁珠，磁珠的修饰基团包括但不限于C3丙基修饰、C4丁基修饰、C8辛烷基修饰、C12十二烷基修饰、C18十八烷基修饰。
3.根据权利要求1~2所述的样本处理方法，其特征在于，步骤一所述的磁珠混合摇匀为斡旋磁珠悬浮液20~100次，移取10~50μL到离心管内备用。
4.根据权利要求3所述的样本处理方法，其特征在于，步骤一所述的磁珠混合摇匀为斡旋磁珠悬浮液20次，移取的备用体积20μL到离心管内。
5.根据根据权利要求1中所述的样本处理方法，其特征在于，所述步骤二中的样本选自血浆、血清、尿液、组织液、唾液、关节液、脑脊液中的任意一种。
6.根据权利要求1中所述的样本处理方法，其特征在于，所述步骤二中的酸化试剂选自三氟乙酸、三氟丙酸、甲酸、乙酸中的一种及以上有机酸的水溶液。
7.根据权利要求6所述的样本处理方法，其特征在于，所述步骤二中的酸化试剂为体积浓度0.1%~4%的有机酸的水溶液。
8.根据权利要求7所述的样本处理方法，其特征在于，所述步骤二中的酸化试剂为体积浓度2%的有机酸的水溶液。
9.根据权利要求1所述的磁性分离处理方法，其特征在于，所述步骤三中使用的方法为将离心管放在磁铁上10~60秒，当离心管保持在磁铁上时，用移液管抽吸出上清液。
10.根据权利要求9所述的样本处理方法，其特征在于，所述步骤三中使用的方法为将离心管放保持在磁铁上的磁性分离时间为20秒。
11.根据权利要求1磁珠润湿的方法，其中，步骤四中磁珠润湿方法包括以下2个步骤：
S1：在骤三获得的磁珠内加入润洗溶液1，混合摇匀，将磁珠进行磁性分离，吸取上清液，舍弃；
S2：在S1获得的磁珠内加入润洗溶液2，混合摇匀，将磁珠进行磁性分离，吸取上清液，舍弃。
12.根据权利要求11所述的磁珠润湿方法，其特征在于，所述步骤四中使用的润湿溶液1选自乙腈、甲醇、乙醇、丙酮中的一种及以上有机试剂的水溶液。
13.根据权利要求11中所述的磁珠润湿方法，其特征在于，所述步骤四中使用的润湿溶液1为体积浓度30%~70%的有机溶剂的水溶液。
14.根据权利要求13所述的磁珠润湿方法，其特征在于，所述步骤四中的使用的润湿溶液1为体积浓度50%的有机溶剂的水溶液。
15.根据权利要求11所述的磁珠润湿方法，其特征在于，所述步骤四中使用的润湿溶液2选自三氟乙酸、三氟丙酸、乙酸、甲酸中的一种及以上有机酸的水溶液。
16.根据权利要求11中任一项所述的磁珠润湿方法，其特征在于，所述步骤四中使用的润湿溶液2为体积浓度0.05%~0.5%的有机酸的水溶液。
17.根据权利要求16所述的磁珠润湿方法，其特征在于，所述步骤四中的使用的润湿溶液2为体积浓度0.1%的有机酸的水溶液。
18.根据权利要求1所述的磁珠吸附方法，其特征在于，所述步骤五的磁珠吸附酸化样本方式为斡旋磁珠悬浮液20~100次，磁性分离时间10~60秒。
19.根据权利要求18所述的磁珠吸附方法，其特征在于，所述步骤五的磁珠吸附酸化样本方式为斡旋磁珠悬浮液50次，磁性分离时间30秒。
20.根据权利要求1所述的磁珠冲洗方法，其特征在于，所述步骤六的冲洗溶液为混合溶液，溶质1为三氟乙酸、三氟丙酸、乙酸、甲酸中的一种及以上有机酸，溶质2为乙腈、甲醇、乙醇、丙酮中的一种及以上有机试剂，溶剂为水。
21.根据权利要求20所述的磁珠冲洗方法，其特征在于，所述步骤六的冲洗溶液为混合溶液，溶质1的体积浓度为0.05%~0.5%，溶质2的体积浓度为2%~10%。
22.根据权利要求20所述的磁珠冲洗方法，其特征在于，所述步骤六的冲洗溶液为溶质1体积浓度0.1%、溶质2体积浓度5%的水溶液。
23.根据权利要求1中任一项所述的磁珠冲洗方法，其特征在于，所述步骤六的磁珠冲洗方式为斡旋磁珠悬浮液20~100次，磁性分离时间10~60秒。
24.根据权利要求23所述的磁珠冲洗方法，其特征在于，所述步骤六的磁珠冲洗方式为斡旋磁珠悬浮液20次，磁性分离时间30秒。
25.根据权利要求1所述的磁珠洗脱方法，其特征在于，所述步骤七的洗脱溶液为混合溶液，溶质1为三氟乙酸、三氟丙酸、甲酸、乙酸中的一种及以上有机酸，溶质2为乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇中的一种及以上有机试剂，溶剂为水。
26.根据权利要求25所述的磁珠洗脱方法，其特征在于，所述步骤七的洗脱溶液为混合溶液，溶质1的体积浓度为0.05%~0.5%，溶质2的体积浓度为30%~95%。
27.根据权利要求25所述的磁珠洗脱方法，其特征在于，所述步骤六的洗脱溶液为溶剂1体积浓度0.1%、溶剂2体积浓度90%的水溶液。
28.根据权利要求1中所述的磁珠洗脱方法，其特征在于，所述步骤六的磁珠洗脱方式为斡旋磁珠悬浮液20~100次，磁性分离时间10~60秒。
29.根据权利要求28所述的磁珠冲洗方法，其特征在于，所述步骤六的磁珠洗脱方式为斡旋磁珠悬浮液80次，磁性分离时间30秒。
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