CN114940987A - 一种无差别适用于真菌、革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸提取裂解液及其应用 - Google Patents
一种无差别适用于真菌、革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸提取裂解液及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114940987A CN114940987A CN202210409160.6A CN202210409160A CN114940987A CN 114940987 A CN114940987 A CN 114940987A CN 202210409160 A CN202210409160 A CN 202210409160A CN 114940987 A CN114940987 A CN 114940987A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- gram
- lysate
- metapolyzyme
- fungi
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种无差别适用于真菌、革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸提取裂解液及其应用，所述裂解液包括：lytic enzyme solution和MetaPolyzyme。本发明采用的裂解液能够无差别适用于真菌，革兰氏阳性菌及阴性菌核酸提取；并且与常规的珠打法相比较，本发明的裂解液能够更好的保持所提取基因组的完整性，克服了常规珠打法将基因组过度片段化的不足，从而大大提高了与病原菌无差别裂解与宏基因组分析的适配性，也激发了基于分子生物学方法的病原体全面无偏好检测的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体的说，涉及一种无差别适用于真菌、革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸提取裂解液。
背景技术
众所周知，尿路感染在没有及时诊断和治疗的情况下会显著降低患者的康复机会，还会导致更严重甚至危及生命的后果。临床上用于鉴定尿路感染病原体的金标准依然是培养法，这种方法敏感性差，周转时间长，在种水平鉴定上缺乏特异性。以荧光定量PCR和高通量测序技术为代表的基于核酸检测的分子诊断技术，凭借其快速灵敏的巨大优势已经被越来越多的应用于病原体鉴定。然而由于真菌及某些革兰氏阳性菌细胞壁较厚，常规的裂解液难以使其充分裂解，极大影响病原体核酸提取的效率，从而影响分子诊断的有效性。
真菌及革兰氏阳性菌等厚壁菌核酸提取的金标准是机械裂解法，机械破壁被认为是一种对厚壁菌无差别的高效的破壁方法，然而，高速震动的珠子不仅会冲破病原菌厚厚的细胞壁，也容易过度打断脆弱的基因组甚至破坏一些感兴趣的基因，对后续的QPCR反应或者测序造成极其不利的影响，将直接降低检出效果。因此，直接从尿液对病原体进行分子诊断一直受到限制。所以，机械裂解法并不是一个理想的金标准。因此，既高效又温和的病原体破壁方法及分离到可以应用于分子诊断方法的核酸将有效提高尿路感染病原体的检出率，及时为医生针对性用药及治疗提供合理指导，同时给病人争取到黄金治疗时间，减少病人住院时间，提高病人康复率。
本发明提供一种临床样本(尿液)中高效无偏倚的厚壁菌(真菌和革兰氏阳性菌)裂壁方法及核酸提取试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无差别适用于真菌、革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸提取裂解液及其应用。
本发明提供一种裂解液在无差别适用于真菌，革兰氏阳性菌及阴性菌核酸提取中的应用，所述裂解液包括：lytic enzyme solution和MetaPolyzyme。
其中，所述裂解液中lytic enzyme solution和MetaPolyzyme溶液的体积比为1:1～3。
其中，所述MetaPolyzyme溶液为将5mg MetaPolyzyme溶解在750μl中得到的溶液。
其中，所述裂解液中lytic enzyme solution和MetaPolyzyme溶液的体积比为1:2。
本发明提供一种无差别适用于真菌，革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸裂解液，所述裂解液包括：lytic enzyme solution和MetaPolyzyme。
其中，所述裂解液中lytic enzyme solution和MetaPolyzyme溶液的体积比为1:1～3。
其中，所述MetaPolyzyme溶液为将5mg MetaPolyzyme溶解在750μl中得到的溶液。
其中，所述裂解液中lytic enzyme solution和MetaPolyzyme溶液的体积比为1:2。
本发明提供一种无差别适用于真菌，革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸提取方法，其特征在于，包括使用所述的裂解液的步骤。
其中，所述方法包括：
1)将检测样本的离心，病原体进行富集；
2)将步骤1)中富集的病原体中加入所述的裂解液和PBS缓冲液，温和翻转混匀；
3)将步骤2)中混匀的样品在震荡孵育，得到裂解病原体细胞。
其中，所述步骤2)中裂解液与缓冲液的体积比为3:250。
其中，所述步骤3)中的震荡孵育时间为1小时，震荡孵育温度为37℃。
本发明的有益效果在于，本发明采用的裂解液能够无差别适用于真菌，革兰氏阳性菌及阴性菌核酸提取；并且与常规的珠打法相比较，本发明的裂解液能够更好的保持所提取基因组的完整性，克服了常规珠打法将基因组过度片段化的不足，从而大大提高了与病原菌无差别裂解与宏基因组分析的适配性，也激发了基于分子生物学方法的病原体全面无偏好检测的潜力。
附图说明
图1为20份样本核酸浓度对比图。
图2为20份样本酶解法和珠打法提取核酸测序reads长度对比图。
图3为20份样本酶解法和珠打法提取核酸测序目的病原菌reads占比图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的尿液样本均来自北京中医药大学东方医院，耳念珠菌、金黄色葡萄球菌均购自北京中源合聚生物科技有限公司。PBS溶液购自北京索莱宝科技有限公司。
本发明公开了一种无差别适用于真菌，革兰氏阳性菌及阴性菌核酸提取裂解液，以及一种核酸提取试剂盒，提取的核酸可适合QPCR及二代和三代测序等多种分子诊断方法，操作仪器设备要求不高，只需金属浴和离心机等实验室常规配置即可满足操作要求。具体的，裂解液包括以下组分：lytic enzyme solution(Qiagen，158928)，MetaPolyzyme(Sigma,MAC4L-5MG)；核酸提取试剂盒包括以下组分：lytic enzyme solution(Qiagen，158928)，MetaPolyzyme(Sigma,MAC4L-5MG)，IndiSpin Pathogen Kit(IndicalBioscience)。
实施例1
1.取20份随机抽取的尿液样本，每种样本分成两组(每组设3个重复实验)，分别用珠打法和本发明的裂解液进行酶解，具体方法为：
(1)珠打法：取1ml尿液置于1.5ml EP管中，18000×g离心5分钟对病原体进行富集，弃800μl上清至管中剩余200μl。将50μl缓冲液ATL(含试剂DX)加入含有glass beads的病原体裂解管中，将200μl尿液沉淀重悬并全部转移到病原体裂解管中。将病原体裂解管放在带有Microtube Foam Insert的涡旋器上，并以最大速度涡旋振荡5-10分钟。后将罐子取下并10000g离心1分钟，取200μl上清至一个新的ep管中。
(2)酶解法：取1ml尿液置于1.5ml EP管中，18000×g离心5分钟对病原体进行富集，弃800μl上清至管中剩余200μl。然后，加入5μl的lytic enzyme solution(Qiagen)和10μl的MetaPolyzyme的PBS溶液(即先将5mg MetaPolyzyme溶于750μl PBS再取10μl)，温和翻转混匀6次。混合样品在37℃震荡孵育1h，裂解病原体细胞。
2、核酸提取和浓度测量：根据IndiSpin Pathogen Kit商业试剂盒说明书操作，最后用100μl无核酸酶的水洗脱两遍。DNA纯度和浓度用NanoDrop 2000c分光光度计(ThermoFisher Scientific)和Qubit 4.0荧光光度计(Thermo Fisher Scientific)结合dsDNA HSAssay kit进行分析。
3、QPCR：对每个样本使用下表1中的引物探针，按照下表2中的反应体系进行QPCR检测。每个样本三个重复。每次实验严格设置阴性对照。
表1引物探针
表2反应体系(25μl)
反应程序
4、建库测序：根据牛津纳米孔技术公司SQK-PBK004试剂盒操作说明进行建库，用MinION结合R9.4.1芯片进行测序。使用ONT MinKNOW GUI软件(version 4.2.8)收集原始测序数据并进行实时basecalling。
表3：部分样本QPCR结果CT值对比表
表4：测序reads占比对比
结合表和图中的结果可以看出，本发明采用的裂解液能够无差别适用于真菌，革兰氏阳性菌及阴性菌核酸提取；并且与常规的珠打法相比较，本发明的裂解液能够更好的保持所提取基因组的完整性，克服了常规珠打法将基因组过度片段化的不足，从而大大提高了与病原菌无差别裂解与宏基因组分析的适配性，也激发了基于分子生物学方法的病原体全面无偏好检测的潜力。
实施例2
以耳念珠菌(真菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性细菌)为实验菌株，分别用PDB液体培养基(耳念)和TSB液体培养基(金葡)培养，之后分别用本发明的裂解液及对照溶剂进行裂解后，提取核酸，结果如表5所示。具体实验方法为：
1、挑单菌落于液体培养基过夜培养，金黄色葡萄球菌置于37度摇床，耳念珠菌置于30度静置。
2、菌液准备
转二代菌，待菌液浑浊，取1ml于1.5ml的ep管中，8000g离心3min，弃上清，用无菌PBS洗一遍。用1ml无菌PBS重悬，涡旋混匀30s。分装180μl到四个1.5ml的ep管中(尽量保证每管菌量相同)。
3、一管不加任何酶处理作为对照，一管只加5μl的Lytic enzyme solution，一管只加10μl的MetaPolyzyme。一管加50微升Lytic enzyme solution和10μlMetaPolyzyme，四管同时置于37度摇床酶解1小时。
4、用IndiSpin Pathogen Kit进行核酸提取。用Nanodrop进行DNA浓度测量。
5、取等体积的DNA进行建库测序，统计相同测序时间下目的菌reads数及占比。
表5不同裂解液的核酸提取效果
由表5可看出，分别只加Lytic enzyme solution和MetaPolyzyme从DNA浓度，目的菌reads数和目的菌reads占比来看都不占优，尤其是对于耳念珠菌(真菌)DNA的提取，双酶共同作用可以将提取效率提升3-5倍，这潜在提高了基于分子方法的低生物量样本的病原菌检出能力，具有广泛的应用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种无差别适用于真菌、革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸提取裂解液及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtataaggg atcaaaaatg agagcca 27
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctctgaggc cttgctcctg 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgatggcctt ggttgaga 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctgtttgag cgtcrttt 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcctccgctt attgatat 18
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgagcgaact agacttt 17
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cttggtattt tgcatgytgc tctc 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcagaggct ataacacaca gcag 24
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcgtttacc gggcca 16
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcgccccttg cctctc 16
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccagggcta taacactcta cacc 24
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgggcttggg actct 15
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgcagataat tcacgcccag 20
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acccgctgga cgccat 16
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgctcatctg tttcgc 16
Claims (10)
1.一种裂解液在无差别适用于真菌，革兰氏阳性菌及阴性菌核酸提取中的应用，所述裂解液包括：lytic enzyme solution和MetaPolyzyme。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述裂解液中lytic enzyme solution和MetaPolyzyme溶液的体积比为1:1～3，所述MetaPolyzyme溶液为将5mg MetaPolyzyme溶解在750μl中得到的溶液。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述裂解液中lytic enzyme solution和MetaPolyzyme溶液的体积比为1:2。
4.一种无差别适用于真菌，革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸裂解液，其特征在于，所述裂解液包括：lytic enzyme solution和MetaPolyzyme。
5.根据权利要求4所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液中lytic enzyme solution和MetaPolyzyme溶液的体积比为1:1～3；所述MetaPolyzyme溶液为将5mgMetaPolyzyme溶解在750μl中得到的溶液。
6.根据权利要求5所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液中lytic enzyme solution和MetaPolyzyme溶液的体积比为1:2。
7.一种无差别适用于真菌，革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸提取方法，其特征在于，包括使用权利要求4-6任一所述的裂解液的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)将检测样本的离心，病原体进行富集；
2)将步骤1)中富集的病原体中加入权利要求4-6任一所述的裂解液和PBS缓冲液，温和翻转混匀；
3)将步骤2)中混匀的样品在震荡孵育，得到裂解病原体细胞。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中裂解液与缓冲液的体积比为3:250。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的震荡孵育时间为1小时，震荡孵育温度为37℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210409160.6A CN114940987A (zh) | 2022-04-19 | 2022-04-19 | 一种无差别适用于真菌、革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸提取裂解液及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210409160.6A CN114940987A (zh) | 2022-04-19 | 2022-04-19 | 一种无差别适用于真菌、革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸提取裂解液及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114940987A true CN114940987A (zh) | 2022-08-26 |
Family
ID=82907350
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210409160.6A Pending CN114940987A (zh) | 2022-04-19 | 2022-04-19 | 一种无差别适用于真菌、革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸提取裂解液及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114940987A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106399295A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-15 | 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 | 一种快速提取革兰氏阳性菌基因组dna的方法和试剂盒 |
| CN110093359A (zh) * | 2018-01-29 | 2019-08-06 | 华南生物医药研究院 | 含cd3启动子序列和car序列的可分离的核酸及应用 |
| CN114941036A (zh) * | 2022-04-19 | 2022-08-26 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种基于宏基因组纳米孔测序的尿路感染病原体试剂盒及其应用 |
-
2022
- 2022-04-19 CN CN202210409160.6A patent/CN114940987A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106399295A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-15 | 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 | 一种快速提取革兰氏阳性菌基因组dna的方法和试剂盒 |
| CN110093359A (zh) * | 2018-01-29 | 2019-08-06 | 华南生物医药研究院 | 含cd3启动子序列和car序列的可分离的核酸及应用 |
| CN114941036A (zh) * | 2022-04-19 | 2022-08-26 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种基于宏基因组纳米孔测序的尿路感染病原体试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ELI L MOSS等: "Complete, closed bacterial genomes from microbiomes using nanopore sequencing", NAT BIOTECHNOL * |
| LEI ZHANG等: "Comparison Analysis of Different DNA Extraction Methods on Suitability for Long-Read Metagenomic Nanopore Sequencing", FRONT CELL INFECT MICROBIOL * |
| SCOTT TIGHE等: "Genomic Methods and Microbiological Technologies for Profiling Novel and Extreme Environments for the Extreme Microbiome Project (XMP)", J BIOMOL TECH * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7488246B2 (ja) | ビーズ破砕用チューブならびに微生物からデオキシリボ核酸および／またはリボ核酸を抽出する方法 | |
| JP2798499B2 (ja) | 感染症診断用プローブ | |
| AU2019204844A1 (en) | Methods and kits for detecting cell-free pathogen-specific nucleic acids | |
| CN112094847B (zh) | 幽门螺旋杆菌检测用核酸适配体与筛选检测方法及用途 | |
| CN109913445B (zh) | 一步洗涤磁珠法血液dna提取试剂盒 | |
| JP5714291B2 (ja) | 抗酸菌ｄｎａの抽出精製法 | |
| KR20190108211A (ko) | 규조토를 이용한 미생물 농축 방법 및 핵산 추출 방법 | |
| CN112680541B (zh) | 一种LNA-Taqman-多重荧光PCR技术及其在念珠菌快速检测中的应用 | |
| Rotureau et al. | Trypanosomatid protozoa: a simplified DNA isolation procedure | |
| CN114645330A (zh) | 一种病原体宏转录组测序文库的制备方法、试剂盒及筛选感染病原体的方法和装置 | |
| CN111718927A (zh) | 一种提高核酸稳定性的保存液及其应用 | |
| CN116144811B (zh) | 用于检测脑脊液病原的多重引物组、方法和试剂盒 | |
| CN110272898B (zh) | 一种通用型微生物病原体裂解液及其应用 | |
| CN108866220B (zh) | 一种用于鼻腔菌群检测的方法及检测试剂盒 | |
| CN114940987A (zh) | 一种无差别适用于真菌、革兰氏阳性菌及阴性菌的核酸提取裂解液及其应用 | |
| CN114941036A (zh) | 一种基于宏基因组纳米孔测序的尿路感染病原体试剂盒及其应用 | |
| CN113249375A (zh) | 一种快速高效富集粪便病毒的高通量检测方法 | |
| CN110819624A (zh) | 一种用于粪便中细菌dna快速提取的裂解液及方法 | |
| CN102250879B (zh) | 一种临床血液样品中病原菌dna的制备方法和试剂盒 | |
| JP5599013B2 (ja) | 血液検体からの微生物核酸の抽出方法 | |
| Al-Talib et al. | A quadriplex PCR assay for rapid detection of diarrhoea-causing parasitic protozoa from spiked stool samples. | |
| CN116926065B (zh) | 一种适用于病原微生物和宿主残留检测的核酸提取试剂盒及其提取方法 | |
| CN113186308B (zh) | 一种检测布鲁氏菌阿米卡星耐药性rt-pcr试剂盒及其使用方法 | |
| CN112391291B (zh) | 细胞内微生物的富集方法及试剂 | |
| JP7216652B2 (ja) | ビーズ破砕用チューブ並びに微生物からデオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸を抽出する方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |