CN107254463B

CN107254463B - 用于提取丙型肝炎病毒rna的试剂盒

Info

Publication number: CN107254463B
Application number: CN201710492564.5A
Authority: CN
Inventors: 刘春晖; 杨文秀; 杨丽; 廖世玉; 李莹
Original assignee: Mike Biological Ltd By Share Ltd
Current assignee: Mike Biological Ltd By Share Ltd
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2017-06-20
Publication date: 2018-11-20
Anticipated expiration: 2037-06-20
Also published as: CN107254463A

Abstract

本发明涉及用于提取丙型肝炎病毒RNA的试剂盒。本发明属于生物医学检测领域，涉及核酸纯化技术，特别是提取丙型肝炎病毒RNA的技术。本发明的试剂盒通过盐酸胍与柠檬酸缓冲体系的组合，实现了以高安全性、高灵敏度、高稳定性对样品中丙型肝炎病毒RNA进行高效提取的技术效果。

Description

用于提取丙型肝炎病毒RNA的试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，涉及核酸纯化技术，特别是提取丙型肝炎病毒RNA的技术。

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis virus C，HCV)感染引起的病毒性肝炎。由于目前尚未确立丙型肝炎的预防方法，并且部分丙型肝炎患者可发展为肝硬化甚至肝癌，所以HCV感染的早期发现与早期治疗非常重要。

目前临床上常用的HCV检测方法主要有两类：免疫学方法测定抗HCV或HCV编码蛋白，PCR法检测丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV-RNA)。免疫学方法存在其自身的局限性：窗口期长(50-70天)，而且只代表既往感染，可在病毒清除后仍长时间存在。血清中的HCV-RNA是病毒复制和肝炎进程的确切标志，因此与免疫学诊断相比，核酸诊断具有更高的灵敏度和特异性，大大缩短了检测的窗口期，同时漏检概率极大缩小。

由于HCV感染者血清病毒滴度通常很低，而且病毒核酸极易降解，所以RNA 提取方法对丙型肝炎病毒RNA定量检测的效果有较大的影响。因此，能够从微量样本中高效回收HCV病毒RNA的方法能够进一步改善样本中HCV-RNA的定量检测灵敏度。另外，经典的RNA提取方法往往会用到有毒试剂如异硫氰酸胍、苯酚、氯仿等，这也是其难以避免的固有缺陷之一。

发明内容

本发明提供了一种具有高安全性、高灵敏度、高稳定性的丙型肝炎病毒核酸(HCV-RNA)高效提取试剂盒。

本发明的试剂盒主要包含以下组分：

核酸提取试剂2(裂解液)：盐酸胍40-70g/100mL，曲拉通(TX-100) 2％-20％(v/v)，柠檬酸0-2g/L，柠檬酸钠0-15g/L，pH 4.0-7.0，优选的，盐酸胍50-60g/100mL，曲拉通10-20％(v/v)，柠檬酸1-2g/L，柠檬酸钠10- 15g/L，pH 4.0-6.0；

核酸提取试剂4(洗涤液I)：盐酸胍10-50g/100mL，柠檬酸0-2g/L，柠檬酸钠0-20g/L，异丙醇20％-60％(v/v)，pH 4.0-7.0，优选的，盐酸胍20- 40g/100mL，柠檬酸1-2g/L，柠檬酸钠10-20g/L，异丙醇30％-50％(v/v)， pH 4.0-6.0；

核酸提取试剂5(洗涤液II)：氯化钠5-20g/L，曲拉通(TX-100)0- 5％(v/v)，优选的，氯化钠5-15g/L，曲拉通(TX-100)0-3％(v/v)。

配制得到的试剂均为无色透明液体，2℃-8℃保存，效期18个月。根据需要，可向核酸提取试剂5中添加生物防腐剂，优选PC-300，最优选 200μL/L PC-300。

本发明人惊讶地发现，通过上述盐酸胍与柠檬酸缓冲体系的组合，提供了对HCV-RNA的高安全性、高灵敏度、高稳定性的提取。

本发明的试剂盒还可包含核酸提取试剂3：磁珠，10-50mg/mL，优选的25mg/mL。

另外，本发明的试剂盒还可包含以下组分：

核酸提取试剂1：蛋白酶K 10-40mg/mL，优选的20mg/mL；

核酸提取试剂6：矿物油50-100％(v/v)，优选的，矿物油70-100％(v/v)；

核酸提取试剂7：Tris(pH 8.0)1-50mM，EDTA(pH 8.0)1-20mM，优选的，Tris(pH8.0)5-20mM，EDTA(pH 8.0)1-10mM。

根据需要，可向核酸提取试剂1中添加生物防腐剂，优选叠氮化钠，最优选 1mg/mL叠氮化钠。根据需要，可向核酸提取试剂3和6中添加生物防腐剂，优选 PC-300，最优选200μL/L PC-300。

相应地，使用所述试剂盒提取HCV-RNA的流程如下：

I.试剂准备(在试剂准备区进行)

取出试剂盒各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，涡旋混匀，转移至样本处理区备用。

II.样本处理(在样本处理区进行)

a.根据样本数量，取1.5mL或2.0mL离心管分别标记，每管加入10μL核酸提取试剂1；

b.每管加入200μL待测样本，盖上管盖，振荡混匀5秒，瞬时离心；

c.每管加入600μL核酸提取试剂2以及5μL核酸提取试剂3，盖上管盖，振荡混匀10秒，室温静置10分钟；

d.瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，3分钟后缓慢将溶液吸出(注意不要碰到吸附于管壁的棕色物)；

e.每管加入800μL核酸提取试剂4，振荡混匀5秒，瞬时离心后将离心管再次置于磁性分离器上，3分钟后缓慢将溶液吸出(注意不要碰到吸附于管壁的棕色物)；

f.每管加入700μL核酸提取试剂5和100μL核酸提取试剂6，振荡混匀5秒，瞬时离心后将离心管再次置于磁性分离器上；

g.约3分钟后，上清液分为两层，将吸头伸入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃；瞬时离心30秒后将离心管置于磁性分离器上；

h.约3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃；

i.每管加入35μL核酸提取试剂7，振荡混匀使离心管壁的棕色残留物完全洗脱于溶液中，60℃温浴10分钟；

j.瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上静置3分钟，上清液用于后续实验。

若不及时使用，应将提取的核酸保存于-20℃以下。

本发明的试剂盒中使用盐酸胍与柠檬酸缓冲体系的组合进行HCV-RNA的高效提取，避免了有毒试剂如异硫氰酸胍、苯酚、氯仿等的使用，安全性更高。另外，本发明的试剂盒在灵敏度、稳定性方面也有长足的进步和提高。

实施方式

本文包括以下的实施例，用于以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。本领域技术人员根据本文的公开应当理解，可以在所公开的特定的实施方式中进行许多改变但是仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的思想和范围。本发明的具体实施方式仅用于解释本发明，而非意图通过任何方式限制本发明。

实施例1

血浆HCV提取试剂的制备

制备以下四种配方，用于提取血浆HCV。

配方A：本发明的试剂盒

核酸提取试剂1：蛋白酶K 20mg/mL；

核酸提取试剂2(裂解液)：盐酸胍573.18g/L，曲拉通(TX-100)200ml/L，柠檬酸1.68g/L，柠檬酸钠7.35g/L，pH为4.4±0.1；

核酸提取试剂3：磁珠，100％；

核酸提取试剂4(洗涤液I)：盐酸胍382.12g/L，柠檬酸1.05g/L，柠檬酸钠11.76g/L，异丙醇400mL/L，pH为5.4±0.1；

核酸提取试剂5(洗涤液II)：氯化钠5.84g/L，曲拉通(TX-100)10ml/L；

核酸提取试剂6：矿物油100％(v/v)；

核酸提取试剂7：1MTris(pH 8.0)10ml/L，0.5M EDTA(pH 8.0)2mL/L。

配制过程中需要注意：

1.裂解液：DEPC处理水为配液溶剂；盐酸胍体积偏大，加入DEPC水需缓慢少量加入，以免超过溶液体积；盐酸胍较难溶，可以使用超声或温浴帮助溶解。

2.洗涤液I：DEPC处理水为配液溶剂；盐酸胍体积偏大，加入DEPC水需缓慢少量加入，以免超过溶液体积；盐酸胍较难溶，可以使用超声或温浴帮助溶解；异丙醇有刺激性气味，操作时需注意。

3.洗涤液II：DEPC处理水为配液溶剂。

配方B：市售丙型肝炎病毒(HCV)核酸定量检测试剂盒(购自圣湘生物)

配方C：根据名为《一种利用一步法实时荧光定量RT-qPCR检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒》的中国发明专利申请CN106119415A中的公开内容，配制病毒核酸提取试剂

配方D：根据名为《一种提取动物组织样品中病原核酸的试剂》的中国发明专利申请CN102417905A中的公开内容，配制病毒核酸提取试剂

配方E：

核酸提取试剂1：蛋白酶K 20mg/mL；

核酸提取试剂2(裂解液)：盐酸胍573.18g/L，曲拉通(TX-100)200ml/L，Tris12.11g/L，盐酸调pH至4.4±0.1；

核酸提取试剂3：磁珠，100％；

核酸提取试剂4(洗涤液I)：盐酸胍382.12g/L，Tris12.11g/L，异丙醇400 mL/L，盐酸调pH至5.4±0.1；

核酸提取试剂6：矿物油100％(v/v)；

核酸提取试剂7：1MTris(pH 8.0)10ml/L，0.5M EDTA(pH 8.0)2mL/L。

实施例2

不同配方提取效率的比较

使用浓度为5E5IU/mL的HCV血浆样本，采用实施例1中的各种配方，分别进行RNA提取实验。

配方A和配方E对应的提取方法如下：

a.取1.5mL离心管分别标记，每管加入10μL核酸提取试剂1；

h.约3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃；

配方C、D对应的提取方法以实施例1中所列的相应专利申请文件或其商业产品说明书为准。

采用荧光定量PCR对提取得到的RNA产物进行扩增，检测得到的Ct值，结果如下表1：

上述结果表明，本发明的试剂盒(配方A)具有明显优于配方E、C的提取效率。试剂D可能不适用于血清/血浆样本，提取失败。

实施例3

提取灵敏度及稳定性检测

选取HCV阳性血浆样本E1，从中取出一部分一式三份进行10倍稀释，分别得到10倍稀释的样本E2、E3和E4。

使用实施例1中所述配方B(圣湘生物HCV核酸定量检测试剂盒)测定样本E1、E2、E3和E4的核酸浓度，得到表2数据。

表2：配方B测定值

	E1	E2	E3	E4
					Ct值	29.75	33.11	35.95	40
浓度(IU/mL)	2.55E+04	2.66E+03	393.43	22.57

根据表2可以看出，通过配方B测定样本E4计算得到的浓度为22.57IU/mL，低于配方B的灵敏度下限25IU/mL。

将E4样本2倍稀释，得到理论浓度为11IU/mL的1/2E4样本。使用实施例1中所述配方A(本发明试剂盒)测定样本E4和1/2E4的核酸浓度，得到表 3数据。

表3：配方A测定值

由表3针对每种样品所示出的二十次重复实验结果可以看出，本发明的试剂A能够稳定提取样本E4和1/2E4，证实试剂的测出下限低于试剂B。也就是说，本发明试剂盒A在灵敏度上优于试剂B。

Claims

1.用于提取丙型肝炎病毒RNA的试剂盒，包含以下组分：

核酸提取试剂2：盐酸胍50-60g/100mL，曲拉通TX-100 2％-20％(v/v)，柠檬酸0-2g/L，柠檬酸钠0-15g/L，pH 4.0-7.0；

核酸提取试剂4：盐酸胍10-50g/100mL，柠檬酸0-2g/L，柠檬酸钠0-20g/L，异丙醇20％-60％(v/v)，pH 4.0-7.0；

核酸提取试剂5：氯化钠5-20g/L，曲拉通TX-100 0-5％(v/v)。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，在核酸提取试剂5中，所述氯化钠5-15g/L，曲拉通TX-100 0-3％(v/v)。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述核酸提取试剂2为盐酸胍50-60g/100mL，曲拉通TX-100 10-20％(v/v)，柠檬酸1-2g/L，柠檬酸钠10-15g/L，pH 4.0-6.0。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述核酸提取试剂4为盐酸胍20-40g/100mL，柠檬酸1-2g/L，柠檬酸钠10-20g/L，异丙醇30％-50％(v/v)，pH4.0-6.0。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其还包含：

核酸提取试剂3：磁珠，10-50mg/mL。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述：

核酸提取试剂3：磁珠，25mg/mL。

7.根据权利要求1或5所述的试剂盒，其还包含：

核酸提取试剂1：蛋白酶K 10-40mg/mL；

核酸提取试剂6：矿物油50-100％(v/v)；

核酸提取试剂7：pH 8.0的Tris 1-50mM，pH 8.0的EDTA 1-20mM。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述：

核酸提取试剂1：蛋白酶K，20mg/mL。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，所述：

核酸提取试剂6：矿物油，70-100％(v/v)。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，所述：

核酸提取试剂7：pH 8.0的Tris 5-20mM，pH 8.0的EDTA 1-10mM。

11.根据前述权利要求1至6、8至10中任一项所述的试剂盒，其用于提取血样中的丙型肝炎病毒RNA。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述血样为血浆或血清。