KR20010034467A - 핵산을 분리하는 개선된 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시료로부터 핵산을 분리하는 방법에 관한 것이다. 이들 물질로부터 핵산을 분리하는 기존의 방법은 카오트로픽 물질을 사용하여, 예컨대 출발 물질내 존재하는 세포를 용해시키고 이로부터 핵산을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 핵산 함유 물질을 카오트로프로 처리하고 핵산 결합 고상과 접촉시키는 경우, 핵산은 카오트로프의 존재하에 고상에 결합하고, 고상과 이에 결합된 핵산은 시료의 잔여부분으로부터 분리할 수 있다. 핵산 함유 물질로부터 핵산을 분리하는 본 발명의 방법은 출발 물질을 카오트로픽 물질 및 핵산 결합 고상과 동시에 또는 순차적으로 접촉시키고, 핵산 결합 고상에 세척 단계를 수행한 다음, 필요에 따라 핵산을 핵산 결합 고상으로부터 용출시키는 방법으로서, 세척 절차가 1종 이상의 고염 완충 용액(들), 필요에 따라 알코올 용액 및 저염 완충 용액으로 순차적으로 고상을 세척하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

핵산을 분리하는 개선된 방법{IMPROVED METHOD FOR THE ISOLATION OF NUCLEIC ACID}
핵산 증폭 방법,재조합 DNA 기법 및 서열 결정 방법과 같은 분자 생물학에 있어서의 최근의 발전은 투입 물질로서의 분리형 핵산에 좌우된다. 따라서, 복합 시료로부터 핵산을 정제하는데 현재 사용되는 방법을 개선시킬 필요가 있다. 물론 이들 방법은 가능한 단순하고 신속해야 하며, 출발 물질로부터 고 회수율로 핵산을 얻을 수 있어야 한다. 또한, 용이하게 자동화할 수 있는 방법을 개발하는 것이 바람직하다. 일반적으로 DNA가 분리되는 출발 물질은, 핵산이 단백질 또는 지질 등의 세포 물질에 둘러싸여 존재하는 복합 생물학적 물질이다. 이러한 물질은, 예컨대 전체 혈액, 혈청, 백혈구의 연층, 뇨, 배설물, 뇌척수액, 정액, 타액, 세포 배양물 등일 수 있다.
이들 물질로부터 핵산을 분리하는 기존의 방법은, 예컨대 출발 물질에 존재하는 세포를 용해시키는 카오트로픽제를 사용하여 이로부터 핵산을 분리하는 단계를 포함한다. 카오트로픽 물질이란 단백질 및 핵산의 2차, 3차 및/또는 4차 구조를 변화시킬 수 있지만, 적어도 1차 구조는 온전하게 유지하는 임의의 물질을 의미한다. 카오트로픽 물질의 예는 구아니디늄 (이소)티오시아네이트 및 구아니딘 염산염 등이 있다. 또한, 요오드화나트륨, 요오드화칼륨, (이소)티오시안산나트륨, 우레아 또는 이들의 상호 조합물이 적절하다.
핵산 함유 물질을 카오트로프로 처리하고, 핵산 결합 고상과 접촉시키면, 핵산은 카오트로프의 존재하에 고상에 결합하고 고상과 이에 결합된 핵산을 시료의 잔여 부분으로부터 분리할 수 있다. 이들 방법에 사용되는 고상은 일반적으로 다공성 또는 비다공성의 유리 입자와 같은 규산질 물질, 실리카 겔, 유리 섬유, 규산질 물질로 만든 필터, 규조토 등을 포함한다. 카오트로픽 물질 및 핵산 결합 고상의 사용을 기초로 한 상기 방법은 본원에서 참고로 인용한 EP389063에 개시되어 있다. 이 특허에서는, 카오트로픽 물질 및 실리카 또는 이의 유도체의 사용을 기초로 한 핵산 분리 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 복합 생물학적 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 데 사용할 수 있다. EP389063호에 개시된 방법에서는 핵산을 카오트로프의 존재하에 실리카에 결합시킨다. 그 다음 고상과 이에 결합된 핵산을 액체로부터 분리하고 세척한다.
실제로, 세척은 일련의 세척 단계로 수행하는 것이 일반적이다. 보통 고상은, 그 구성물내 결합 완충액과 유사한 고염 완충액으로 세척한다. 저급 알킬 알코올, 예컨대 에탄올 70%를 사용한 1 이상의 세척 단계는 실리카에 결합될 수 있는 단백질, 지질 등을 제거하기 위한 세척 절차의 일부이다. 또한, 세척 절차는 아세톤을 이용한 추가의 세척 단계를 포함하여 실리카로부터 임의의 잔여 불순물을 제거할 수 있다. 저염 완충액을 사용하여 고상으로부터 핵산을 용출시키기 전에 고상을 건조하여 다시 휘발성 아세톤을 제거한다.
종래의 절차는 이들 복잡한 세척 절차를 수행해야 하기 때문에 시간이 많이 소비되는 단점이 있었다. 특히 아세톤과 같은 유기 용매를 사용하면 공정을 자동화하기가 어렵다. 사용된 용매의 휘발 특성은 자동화된 방식으로 이들 방법을 수행하도록 장치를 고안하는데 있어서 심한 제약을 수반하다.
본 발명은 시료로부터 핵산을 분리하는 방법에 관한 것이다.
도 1: 대안법(alt) 및 붐(Boom) 방법으로 핵산을 분리한 후의 ECL 시그널, NASBA 증폭 및 ECL 검출. 시험관내 전사된 HIV-RNA를 혈장에 매립(spike)시켰다.
도 2: 분리 별법에서 상이한 고염 용액을 분석하였다. 시험관내 전사된 HIV-1 RNA를 혈장내 매립시키고, 세척 단계 중 상이한 완충액을 시험하였다. 정량적 증폭 및 ECL 검출 후에 RNA 회수율에 대하여 요약되어 있다. 시료는 4중으로 시험하였다.
도 3: 상이한 pH에서의 세척 완충액 및 상이한 pH에서의 용출 완충액 분석. 정량 증폭 및 ECL에 의한 검출 후에 RNA 회수율.
도 4: 표준 프로토콜 붐과 비교하여 베타인의 존재 및 부재하에 신규 프로토콜을 이용하여 분리된 RNA(%)
따라서, 관련 세척 절차가 덜 복잡하여 보다 쉽게 자동화된 방식으로 수행할 수 있는 방법이 필요하다. 본 발명은 이러한 방법을 제공한다. 본 발명은 카오트로픽 물질의 존재하에 고상에 핵산을 결합시키는 것을 그 기초로 한다는 점에서 종래 기술과 유사하다. 그러나, 본 발명의 방법에서는 세척 절차가 단순화되고 아세톤을 사용하여 세척하거나 용출 전에 고상을 건조해야 할 필요가 없다.
핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 본 발명의 방법은, 출발 물질을 카오트로픽 물질 및 핵산 결합 고상과 동시에 또는 순차적으로 접촉시키고, 핵산 결합 고상에 대해 세척 절차를 수행한 후에, 필요에 따라 핵산을 핵산 결합 고상으로부터 용출시키는 방법으로서, 상기 세척 절차는 순차적으로
- 1종 이상의 고염 완충 용액(들)
-필요에 따라 알코올 용액
-저염 완충 용액으로 고상을 세척하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
핵산 분리 방법에 있어서, 구아니딘(이소)티오시아네이트는 종종 세포 용해 완충액으로 사용된다.
그러나, 분리하고자 하는 핵산이 증폭 반응에서 투입 물질로서 사용되는 경우, 구아니딘 이온을 적절히 세척해내지 않으면 증폭 반응을 방해할 수 있다. 본 발명의 세척 절차에 사용되는 고염 완충액은 NaSCN이 바람직하다. NaSCN으로 세척하여 용해 완충액에 존재하는 구아니딘 이온을 고염 세척 완충액의 나트륨 이온으로 치환한다.
본 발명의 방법에 있어서, 사용된 고염 완충액(또는 완충액들 중 하나)은 1∼10 M NaSCN/10 mM 트리스를 포함할 수 있다. 이러한 완충액의 pH는 6∼8로 다양할 수 있으며 최적 pH는 약 6.5이다. 2∼5 M 농도의 NaSCN/10 mM 트리스 및 pH 6.5의 완충액을 사용하여 우수한 결과를 얻었다.
본 발명의 방법의 일부인 세척 절차에 사용될 수 있는 또 다른 고염 완충액은 바람직하게는 1∼10 M 농도의 NaCl을 포함할 수 있다. 바람직한 NaCl 완충액은 2∼5 M NaCl/10 mM 트리스를 포함하며, pH는 약 6.5이다.
세척 절차에 사용되는 카오트로픽 고염 완충액으로부터 저염 완충액으로의 전달을 용이하게 하기 위해서, 먼저 NaSCN 함유 완충액으로 고상과 이에 결합된 핵산을 세척하고(구아니딘 이온이 나트륨 이온으로 치환됨), 이어서 NaCl 완충액으로 세척하는(티오시아네이트가 염화 이온으로 치환됨) 것이 유리하다.
따라서, 세척 절차는
- 1∼10 M NaSCN/10 mM 트리스를 포함하고 pH가 대략 6∼8인 제1 고염 완충액으로 세척하는 단계, 및
- 1∼10 M NaCl/10 mM 트리스를 포함하고 pH가 대략 6∼8인 제2 고염 완충액으로 세척하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 양 완충액은 각각 2∼5 M 농도의 NaSCN 및 NaCl을 포함하고 pH가 6.5이다.
고염 완충액을 사용한 세척 단계를 수행한 후에 저급 알킬 알코올, 예컨대 에탄올 또는 이소프로판올로 세척하여 시료내 고상으로부터 염(즉, NaSCN 및 NaCl) 농도를 감소시킨다. 또한, 알코올 세척 단계는 시료내 지질 농도를 감소시킨다. 에탄올이 사용된 경우, 바람직한 농도 범위는 약 60∼70 % 에탄올이다. 가장 바람직한 에탄올 농도는 63%이다. 이소프로판올의 경우 약 50% 농도가 바람직하다. 이 방법은 알코올 용액을 이용한 1 이상의 세척 단계를 포함할 수 있다. 70% 에탄올을 사용한 2 연속 세척 단계를 포함하는 방법으로 우수한 결과를 얻었다.
본 발명에 따른 방법의 세척 절차는 (하나 이상의) 고염 완충액(들)으로 세척한 후에 저염 완충액으로 세척하는 단계와 필요에 따라 저급 알킬 알코올로 세척하는 단계를 포함한다. 저염 완충액을 사용하여 고상으로부터 에탄올을 분리할 수 있다. 저염 완충액을 사용하면 고상으로부터 핵산을 용출시키기 전에 아세톤으로 세척한 뒤 건조할 필요가 없다. 보통 저염 완충액 또는 물로 용출시킨다. 따라서, 본 발명의 방법으로 수행하는 경우 저염 완충 용액을 사용하여 고상을 세척하여도 고상으로부터 핵산의 실질적인 부분이 용출되지 않는다는 것은 놀라운 일이다.
본 발명의 방법에 사용된 바람직한 저염 완충액은 2∼30 mM NaCl/10 mM 트리스를 포함한다. 15 mM NaCl/10 mM 트리스를 포함하고 pH가 6∼8인 저염 완충액을 사용하여 우수한 결과를 얻었다.
저염 완충액으로 세척한 후에, 핵산을 고상으로부터 직접 용출시킬 수 있다. 약한 카오트로프, 예컨대 베타인을 용출 완충액에 첨가하면 용출시 유리한 효과를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 베타인을 용출 완충액에 사용하는 경우, 농도는 약 3M일 수 있다. 더 강한 카오트로프를 더 낮은 농도로 용출 완충액에 사용할 수도 있다. 고상으로부터 핵산의 용출을 증가시키는데 사용되는 임의의 카오트로픽제는 핵산의 임의의 후속 용도, 예컨대 핵산 증폭법 또는 직접적 하이브리드화법에 있어서의 용도를 저해하지 않는 농도로 첨가해야 한다.
서론
하기 실시예는 본 발명의 기작 및 유용성을 입증한다. 이는 본 발명을 제한하려는 것이 아니며, 따라서 제한하려는 것으로 간주해서는 안된다. 표준 분리는 EP389063 및 Boom 등의 문헌[1990, J.Clin.Microbiol. 28:495-503]에 개시된 프로토콜 Y에 따라 수행하였으며, 이하 이를 붐 프로토콜로 칭한다.
분리된 핵산 분석은 실시예에 개시된 몇가지 방법으로 수행하였다. 분석이 NASBA 핵산 증폭법으로 수행되는 경우, 하기 성분 및 조건을 사용하였다. 20 ㎕ 부피내 40 mM 트리스, pH 8.5, 70 mM KCl, 12 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM의 각 dNTP, 2 mM rATP, 2 mM rCTP, 2 mM rUTP, 1.5 mM rGTP, 0.5 mM ITP, 0.2 μM의 각 올리고뉴클레오티드, 375 mM 소르비톨, 0.105 g/ℓ BSA, 6.4 유닛의 AMV-RT, 32 유닛의 T7 RNA 폴리머라제, 0.08 유닛의 E. 콜리 RNase H 및 특정량의 주형(즉, 분리된 핵산). 사용된 프로토콜은 효소를 제외한 전술한 성분을 분리된 핵산과 혼합하는 단계, 5분 동안 65℃로 가열하는 단계, 41℃로 냉각하는 단계, 효소를 첨가하는 단계 및 90분 동안 41℃에서 항온처리하는 단계로 구성된다.
NASBA를 이용한 증폭은, 증폭 전에 첨가되는 대조 RNA(내부 표준물, 각각 Qa, Qb 및 Qc로 칭함)를 기존 농도로 사용하여 수행하였다. 시료(100% 시료로 불리움)는 동일한 내부 표준물로 증폭시키고, 핵산은 분리하지 않았다. 이는 100% 분리시 회수율에 대한 이론적인 시그널을 나타내야 한다. 증폭 생성물의 검출은 전술한 프로토콜에 따라 전자화학발광법으로 수행하였다[B. van Gemen 등, 1994, A one-tube quantitative HIV-1 RNA NASBA nucleic acid amplification assay using electrochemiluminescent(ECL) labeled probes. J.Virol.Methods. 49:157-168)].
방사능 표지된 RNA(32P 표지된 RNA)는 RNA 중32P-ATP를 도입시켜 시험관내 표준 전사 프로토콜로 만들었다. 사용된 분리 방법의 상이한 분획(실시예 참조)을 액체 신틸레이션 계수기에서32P-RNA의 존재에 대하여 분석하였다.
실시예 1
표준 붐 분리법에서, 물 또는 1mM 트리스 중 고상으로부터 핵산을 용출시킨다. 신규 대안 프로토콜을 사용하여 놀라운 결과를 얻었다(도 1). 대안 프로토콜은 다음 단계를 포함한다.
붐 세포 용해 완충액 중 실리카에 핵산을 결합시키는 단계,
고염 용액(5M NaSCN)으로 2회 세척하는 단계,
저염 용액(15 mM NaCl)로 2회 세척하는 단계,
H2O로 용출시키는 단계.
예비 실험에서(도 1), 대안 프로토콜은 표준 붐 분리 프로토콜과 비견할 만한 결과를 산출하는 것 같다. 다음 실시예에서는 더욱 상세하게 프로토콜을 세웠다.
실시예 2
고염 농도의 상이한 용액을 제1 세척 단계에서 전술한 대안 프로토콜을 사용하여 분석한다. 혈장내 매립된 시험관내 전사된 HIV-1 RNA 105분자로 분리를 수행하였다. 상이한 염 용액(도 2 참조)으로 세척하고 H2O로 용출한 후, 내부 표준 RNA(2 ×104Qa 및 5 ×103Qb)로 증폭시켰다. 앰플리콘의 정량적 검출은 ECL로 수행하였으며, 결과는 도 2에 도시되어 있다.
2M 및 5M NaSCN으로 세척할 수 있지만, 5M NaSCN을 이용한 세척 단계가 2M NaSCN 세척 단계에 비하여 수율면에서 좀 더 우수하였다. 또한, NaSCN은 이들 고염 세척 단계에서 NaCl보다 수율이 더 우수한 것 같다.
실시예 3
대안 분리 절차에 있어서 세척 및 용출 완충액의 최적 pH를 결정하기 위해서, 저염 완충액 및 용출 완충액의 상이한 pH를 이용하여 분리하였다. 세척 완충액은 상이한 pH를 갖는 10 mM 트리스 중 15 mM NaCl이었으며, 용출 완충액은 상이한 pH를 갖는 10 mM 트리스였다.
용해 완충액 3.6 ㎖에 0.4 ㎖ 혈장, 시험관내 전사된 HIV-1 RNA 3.2 ×106분자 및 800 ㎕ 실리카를 첨가하였다. 5 M NaSCN/10 mM 트리스(pH7)로 2회 실리카를 세척하였다. 실리카를 4개의 튜브에 나누고, 각 튜브는 상이한 pH의 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 실리카를 4개의 튜브에 나누고 각 튜브를 상이한 pH 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 다시 각 튜브로부터 실리카를 4개의 동일 부분으로 나눈 다음 상이한 pH를 사용하여 용출 완충액으로 항온처리하였다.
도 3에 도시된 결과로부터, pH 6, 7 또는 8에서 15 mM NaCl/10 mM 트리스로 세척하여 비견할 만한 결과를 얻었다. 용출 완충액은 pH 8 또는 9에서 최상일 수 있다.
실시예 4
대안 분리 프로토콜에서 상이한 단계의 효율을 검사하기 위해서, RNA를32P ATP로 표지하고 혈장에 매립시켰다. RNA를 표지하여 완벽하게 절차의 진행 상황에 따라 RNA를 확인할 수 있어 상이한 모든 분리 단계에서 RNA를 측정할 수 있다.
정제되고32P로 표지된 시험관내 전사된 HIV-1 RNA를 혈장에 매립시켰다. 분리는 5M NaSCN(2×), 15 mM NaCl/10 mM 트리스 pH 7(2×)로 전술한 대안 절차에 따라 수행하고 10 mM 트리스(pH 8.5)로 용출시켰다. 각 단계로부터 50 ㎕를 신틸레이션 유체 3 ㎖에 첨가하고 신틸레이터에서 계수하였다.
이 결과(표 1)로부터, 표지된 물질이 모두 실리카에 결합하는 것은 아님이 명백해졌다. 또한, 처음의 15 mM NaCl/10 mM 트리스 세척 단계에서 휠씬 다량의 물질이 손실되었다. 또한, 표지된 모든 물질이 실리카로부터 용출되는 것은 아님이 확인되었다.
붐 분리와의 비교 실험에서, 모든 물질이 실리카로부터 용출되는 것은 아님을 확인하였다.
대안 분리법에서의 세척 단계 분석. 6개의 상이한 시료에 대한 각 세척 단계 중 RNA량(%)
분리의 세척 단계 시료
1 2 3 4 5 6
용해 56% 60% 51% 52% 48% 45%
5M NaSCN 1% 1% 1% 1% 1% 1%
5M NaSCN 0% 0% 0% 0% 0% 0%
15mM NaCl/10mM 트리스 28% 24% 33% 29% 33% 36%
15mM NaCl/10mM 트리스 0% 0% 2% 1% 3% 4%
10 mM 트리스(pH 8.5) 5% 5% 5% 5% 5% 5%
실리카 10% 10% 9% 11% 10% 10%
실시예 5
하기 실시예에서는, 70% 에탄올을 도입한 다음 5M NaSCN에 의한 세척과 5M NaCl에 의한 세척을 비교하였다. 다시, 정제되고32P 표지된 시험관내 전사된 HIV-1 RNA를 혈장에 매립시키고, 분리를 위한 투입용으로 사용하였다. 분리시, 5M NaSCN 또는 5M NaCl로 세척한 다음 70% 에탄올로 2회, 15 mM NaCl/10 mM 트리스(pH 6.5)로 2회 세척하였다. 10 mM 트리스(pH 8.5)로 용출시켰다.
신규 분리 절차에 있어서 세척 단계 분석. 2종의 상이한 방법에 있어서 2가지 다른 시료에 대한 각 세척 단계 중 RNA량(%) A) 5M NaSCN으로 세척 B) 5M NaCl로 세척.
세척 완충액 시료
A1 A2 B3 B4
용해 완충액 48% 60% 39% 38%
5M NaSCN 0% 0%
5M NaCl 2% 2%
에탄올 70% 0% 0% 0% 0%
에탄올 70% 0% 0% 0% 0%
15 mM NaCl/10 mM 트리스 4% 5% 2% 3%
15 mM NaCl/10 mM 트리스 0% 0% 0% 0%
10 mM 트리스 4% 2% 9% 12%
실리카-펠렛 44% 25% 36% 37%
결과(표 2) 분석으로부터 5M NaCl을 사용한 세척 단계에서는 물질이 약간 손실되었으나, 5M NaSCN 및 70% 에탄올을 사용한 세척 단계에서는 물질 손실이 없었음을 확인할 수 있다. 15mM NaCl/10 mM 트리스 pH 6.5를 사용한 제1 세척 단계에서, 모든 경우 약 4%의 물질이 손실되었다. 5M NaCl로 세척하여 완충액 용출물을 얻었으며, 15 mM NaCl/10 mM 트리스(pH 6.5)에서 물질 손실이 적었다.
실시예 6
"붐" 방법에 따른 표준 분리 절차에 있어서, H2O 또는 1 mM 트리스(pH 8.5)로 실리카로부터 핵산을 용출시켰다. 상이한 농도의 NaCl을 사용한 용출은 H2O, 1mM 트리스(pH 8.5) 및 10 mM 트리스(pH 8.5)에서 시험하였다. 각 완충액에 대하여 혈장으로부터 시험관내 전사된 HIV-1 RNA 2 ×105분자를 포함하는 18개 시료와 2개의 주형이 없는 시료를 분리하였다. 상이한 NaCl 농도에서의 용출은 3중으로 시험하였다. 분리 후에, 시료를 내부 표준 RNA(104Qa 및 103Qb)를 사용한 NASBA 증폭으로 정량하였다.
결과는 표 3에 요약되어 있다. 물을 사용한 용출시 NaCl이 존재하면 RNA의 용출을 매우 강력하게 방해하여, 증폭 후에 RNA가 검출되지 않았다. 1mM 트리스로 용출시, 단지 4 mM NaCl이 용인된다. 대조적으로 10 mM 트리스(pH8.5) 중 NaCl(최대 10 mM)의 영향은 최소인 것으로 보인다.
실시예 7
분리의 "질"에 관한 통계학적 평가를 위해서, 20개의 시료를 사용하여 신규 분리 프로토콜 대 붐 프로토콜의 효율을 비교하였다. 각 시료에 대해 시험관내 전사된 HIV-1 RNA 2 ×105카피를 혈장에 매립시켰다. 표준 붐 프로토콜로 100 ㎕ H2O에서 용출시켰다. 실리카에 RNA를 결합시킨 후, 신규 프로토콜에서는 5M NaSCN, 5M NaCl, 70% 에탄올(2×), 15 mM NaCl/10mM 트리스(pH 6.5)(2×)로 세척하고 10 mM 트리스(pH 8.5)로 용출시켰다. 분리 후에, 104Qa 및 105Qb RNA 분자를 내부 표준물질로서 첨가하여 정량적 NASBA 증폭을 수행하였다.
붐 방법 및 프로토콜 Z를 사용한 20개 시료 분리의 통계학적 수치(avg= 평균; std= 표준 편차; cv= 변화율)
정의/방법 붐 신규 프로토콜
평균 42.4 18.1
표준 편차 18.5 8.9
변화율 44% 49%
이들 결과로부터, 붐 방법에 의한 분리 수율(평균 42%)은 프로토콜 Z 수율(평균 18%)과 비교하여 우수한 것으로 나타났다.
실시예 8
신규 프로토콜은 더 효율적인 용출로 더욱 개선시킬 수 있다. 신규 프로토콜에서 용출 개선을 조사하기 위해서, 정제되고32P 표지된 시험관내 전사된 HIV-1 RNA를 혈장에 매립시켰다. 상기 요약된 신규 프로토콜(15 mM NaCl/10 mM 트리스로 단 1회 세척)에 따라 분리하고, 상이한 용액을 용출 단계에서 시험하였다. 10 또는 100 mM NaSCN이나 100 또는 3000 mM N,N,N-트리메틸글리신(베타인)을 첨가하여 10 mM 트리스 용출물(pH 9)을 분석하였다. 또한, 용출 전에 15 mM NaCl/10 mM 트리스(pH 6.5)를 사용한 추가의 세척 단계의 효과를 조사하였다.
용출 완충액에 100 mM NaSCN 또는 3M 베타인을 첨가하여 용출을 개선시켰다(표 5).
대안 분리법에 있어서 상이한 용출 완충액의 분석. 각 분획물에서 측정된 RNA량(%)이 제시되어 있다.
세척 완충액 시료
1 2 3 4 5 6
용해 완충액 4% 6% 7% 4% 5% 4%
5M NaSCN 1% 1% 1% 1% 1% 1%
5M NaCl 0% 0% 0% 0% 0% 0%
에탄올 70% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
에탄올 70% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
15 mM NaCl/10 mM 트리스 4% 4% 8% 6% 12% 9%
15 mM NaCl/10 mM 트리스 0%
10 mM 트리스 4%
10 mM NaSCN/10 mM 트리스 0%
100 mM NaSCN/10 mM 트리스 57%
100 mM 베타인/10 mM 트리스 1%
3M 베타인/10 mM 트리스 62%
용출 완충액 6%
실리카-펠렛 86% 88% 25% 87% 19% 79%
실시예 9
용출 완충액에 베타인을 첨가하면 신규 프로토콜이 상대적으로 개선됨을 분석하기 위해서, 용출 완충액에 베타인을 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 신규 프로토콜에 따라서 실험을 수행하였다. 대조군으로서 3개의 시료를 표준 붐 프로토콜에 따라 분리하였다. 각 시료에 대하여 시험관내 전사된 HIV-1 RNA 2 ×105분자를 혈장내 매립시켰다. 100 ㎕ H2O 중에서 용출시켜 붐 프로토콜을 수행하였다. 실리카에 RNA를 결합시킨 후에, 신규 프로토콜에서는 5M NaSCN, 5M NaCl, 70% 에탄올(2×), 15 mM NaCl/10mM 트리스(pH 6.5)로 세척하고 10 mM 트리스(pH 8.5) 중 3M 베타인으로 용출시켰다. 분리 후에, 104Qa 및 5 ×103Qb RNA 분자를 내부 표준물질로서 첨가하여 정량적 증폭반응을 수행하였다.
이들 결과(표 4)로부터, 신규 프로토콜에 있어서 분리시 베타인을 첨가하면 용출을 개선시킬 수 있음이 명백해졌다. 신규 프로토콜은 표준 붐 프로토콜과 비슷하게 효과적이다.
실시예 10
신규 프로토콜과 표준 붐 프로토콜을 비교하고 통계학적으로 평가하기 위해서, 10개의 시료를 각 프로토콜에 대해 분석하였다. 각 시료에 대하여 시험관내 전사된 HIV-1 RNA 2 ×105분자를 혈장내 매립시켰다. 100 ㎕ H2O 중에서 용출시켜 붐 프로토콜을 수행하였다. 실리카에 RNA를 결합시킨 후에, 신규 프로토콜에서는 5M NaSCN, 5M NaCl, 70% 에탄올(2×), 15 mM NaCl/10mM 트리스(pH 5)로 세척하고 10 mM 트리스(pH 8.5) 중 3M 베타인으로 용출시켰다. 분리 후에, 104Qa 및 5 ×103Qb RNA 분자를 내부 표준물질로서 첨가하여 정량적 증폭반응을 수행하였다. 결과는 표 6 및 표 7에 요약되어 있다. 통계학적 계산으로 2개의 방법은 성능면에서 동일함이 확인되었다.
NASBA 증폭 후에 RNA에 대한 ECL 계수 및 이들 시그널의 평균. 시험관내 전사된 HIV-1 RNA는 이 표에서 wt로 표시된다.
붐 QA QB wt 신규프로토콜 QA QB wt
1 797839 873594 366947 1 669353 971196 349116
2 849519 883281 190842 2 723736 838659 302830
3 865491 842505 264414 3 756767 841488 264288
4 738739 974851 381059 4 737875 906776 276051
5 891318 963281 87410 5 791250 859990 247159
6 841075 863602 279727 6 755119 979499 238056
7 780242 803434 226597 7 683193 890830 297602
8 715077 890399 371066 8 836213 807986 96754
9 739428 730010 236861
평균 809913 886868 271008 평균 743659 869604 256524
내부 표준물질 및 wt(HIV-1) RNA의 ECL 시그널의 평균. RNA 회수의 표준 편차 및 변화율을 결정하였다. 이 방법의 평균 ECL 시그널의 비율은 이 표에 제시되어 있다.
붐 신규 프로토콜 비율
QA:QB:wt 809913886868271008 743659869604256524 1.09:11.02:11.06:1
분리된 RNA(%)표준 편차변화율 33%12.120.37 32%8.370.26
실시예 11
전혈내 매립된 시험관내 전사된 HCV RNA로 전술한 바와 동일한 실시예를 수행하였다. 각 시료에 대하여 HCV RNA 5.9 ×105분자를 전혈에 매립시켰다. 100 ㎕ H2O 중에서 용출시켜 표준 붐 프로토콜을 수행하였다. 실리카에 RNA를 결합시킨 후, 신규 프로토콜에서는 5M NaSCN, 5M NaCl, 70% 에탄올(2×), 15 mM NaCl/10mM 트리스(pH 6.5)로 세척하고 10 mM 트리스(pH 8.5) 중 베타인으로 용출시켰다. 분리 후에, 104Qe 및 5×103Qf RNA 분자를 내부 표준물질로서 첨가하여 정량적 증폭반응을 수행하였다.
결과는 표 8 및 표 9에 요약되어 있다. 통계학적 계산으로 2개의 방법은 성능면에서 동일함이 확인되었다.
NASBA 증폭 후에 RNA에 대한 ECL 계수 및 이들 시그널의 평균. 시험관내 전사된 HCV RNA는 이 표에서 wt로 표시된다.
붐 QE QF wt 신규프로토콜 QE QF wt
1 27486 19826 25112 1 102509 52062 27491
2 31549 19906 29220 2 189642 70934 79123
3 32152 24979 34910 3 114150 50641 39092
4 32416 26361 35251 4 89838 108772 63296
5 39094 31323 38752 5 128956 60813 52171
6 42471 31955 40001 6 114181 43156 92707
7 47300 33755 42681 7 183674 61813 71924
8 48125 46406 52939 8 18322 57185 38332
9 50074 47738 64116 9 176058 82952 18480
10 52082 47813 10 212759 24901
11 54879 51822 11 183631 56489
평균 41603 34717 40331 평균 137611 60883 53624
내부 표준물질 및 wt(HCV) RNA의 ECL 시그널의 평균. RNA 회수의 표준 편차 및 변화율을 결정한다. 이 방법의 평균 ECL 시그널의 비율은 이 표에 제시되어 있다.
붐 신규 프로토콜 비율
QE:QF:wt 416033471740331 1376116088353624 1:3.311:1.751:1.33
분리된 RNA(%)표준 편차변화율 8%2.490.31 5.67%3.300.58

Claims (21)

  1. 출발 물질을 카오트로픽 물질 및 핵산 결합 고상과 동시에 또는 순차적으로 접촉시키고, 핵산 결합 고상에 세척 절차를 수행하고 필요에 따라 핵산을 핵산 결합 고상으로부터 용출시키는 핵산 분리 방법으로서, 상기 세척 절차가 순차적으로
    - 1 이상의 고염 완충 용액(들)
    - 필요에 따라 알코올 용액
    - 저염 완충 용액으로 고상을 세척하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 고염 완충 용액(들)의 pH가 약 6∼8인 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 1∼10 M NaSCN/10 mM 트리스를 포함하는 고염 완충액을 사용하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 고염 완충액이 5M NaSCN/10 mM 트리스를 포함하고 pH가 6.5인 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 1∼10M NaCl/10 mM 트리스를 포함하는 고염 완충액을 사용하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 고염 완충액이 5M NaCl/10 mM 트리스를 포함하고, pH가 6.5인 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1종 이상의 상이한 고염 완충액을 사용하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 1∼10 M NaSCN/10 mM 트리스를 함유하는 제1 고염 완충액을 사용하고, 1∼10 M NaCl/10 mM 트리스를 함유하는 제2 고염 완충액을 사용하며, 양 완충액의 pH가 약 6∼8인 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 세척 절차가
    - 1∼10M NaSCN/10 mM 트리스를 포함하고 pH가 약 6∼8인 제1 고염 완충액으로 세척하는 단계, 및
    - 1∼10M NaCl/10 mM 트리스를 포함하고 pH가 약 6∼8인 제2 고염 완충액으로 세척하는 단계를 포함하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 고염 세척 단계를 수행한 후에 저급 알킬 알코올을 포함하는 알코올 용액으로 세척하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 알코올 용액이 60∼70%의 에탄올을 포함하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 알코올 용액이 63% 에탄올을 포함하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 알코올 용액이 이소프로판올을 포함하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 사용된 저염 완충액이 2∼30 mM NaCl/10 mM 트리스를 포함하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, pH가 대략 6∼8인 저염 완충액을 사용하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 저염 완충액이 15 mM NaCl/10 mM 트리스(pH 6.5)를 포함하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세척 절차가 저염 완충액을 사용한 2회 연속 세척 단계를 포함하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세척 절차가
    - 5M NaSCN/10 mM 트리스(pH 6.5)를 포함하는 제1 고염 완충액으로 세척하는 단계,
    - 5M NaCl/10 mM 트리스(pH 6.5)를 포함하는 제2 고염 완충액으로 세척하는 단계,
    - 70% 에탄올로 세척하는 단계, 및
    - 15 mM NaCl/10 mM 트리스(pH 6.5)를 포함하는 저염 완충액으로 세척하는 단계를 포함하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세척 절차 후에 10 mM 트리스(pH 8.5) 및 카오트로픽제를 함유하는 완충액으로 고상을 처리하여 핵산을 고상으로부터 용출시키는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 카오트로픽제가 베타인인 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 베타인을 3M의 농도로 사용하는 것이 특징인 핵산 함유 출발 물질로부터 핵산을 분리하는 방법.
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