KR20140057296A - Jc 바이러스 dna의 검출 분석 - Google Patents

Jc 바이러스 dna의 검출 분석 Download PDF

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KR20140057296A
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    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC

Abstract

한 국면에서, 본 발명은 뇌척수액 (CSF) 시료로부터 핵산을 단리하는 방법을 제공한다. 한 국면에서, 본 발명은 시료에서 JC 바이러스 DNA의 양을 측정하는 방법을 제공한다.

Description

JC 바이러스 DNA의 검출 분석{ASSAY FOR DETECTION OF JC VIRUS DNA}
관련 출원
본 출원은 2011년 7월 29일자로 출원한 미국 가출원 61/513,483호의 35 U.S.C.§119(e) 하의 수혜를 청구하며, 그의 내용 전체를 참고 문헌으로서 본원에 인용한다.
기술 분야
본 발명은 생물학적 시료들 중의 핵산들의 검출 분야에 속한다.
JC 바이러스 (JCV)는 진행성 다초점 백색질뇌증 (PML)이라는 중추 신경계 (CNS)의 희귀 질환을 일으키는 것으로 알려진 인간 폴리오마바이러스이다. 뇌척수액 (CSF)에서 JCV의 검출은 PML을 확증하지만, 기술적으로 도전 과제이다. 따라서, CSF 중의 JCV의 검출 및 정량화를 위한 향상된 분석 방법이 요구된다.
본 발명의 다양한 국면들은 특히 뇌척수액 시료로부터 예를 들어, JC 바이러스 (JCV) DNA 와 같은 핵산을 단리하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 본 발명의 국면들에 따르면, 바이러스가 없는 것으로 생각되는 생물학적 시료들 (예를 들어, 표준 기술을 사용하여 JCV가 없는 것으로 확인된 CSF 시료들)은 본원 명세서에 기재된 기술들을 사용하여 검출될 수 있는 바이러스 (예를 들어, JCV)를 실제로 함유한다. 일부의 경우, 바이러스는 소량으로 존재하기 때문에 뇌척수액의 시료에서 JCV의 존재를 검출하는 것은 도전 과제가 될 수 있고, 이는 허위-음성 결과로 이어질 수 있다. 뇌척수액의 시료로부터 단리될 수 있는 핵산의 수율을 증가시킴으로써, 부분적으로, 허위 음성 결과를 감소시키는 신규한 핵산 검출 방법들 및 키트들은 본원에서 일부 국면들에 기재되어 있다. 이것은 어떤 경우들에서 현재의 기술에서 사용되는 것보다 더 많은 출발 물질 (예를 들어, 더 큰 부피의 뇌척수액) 및/또는 더 적은 담체 (예를 들어, 더 낮은 농도의 RNA)를 제공함으로써 달성될 수 있지만, 본 발명은 이것으로 한정되지 않는다.
따라서, 몇몇 국면들에서, 본 발명은 뇌척수액 (CSF) 시료에 캐리어 핵산 및/또는 프로테아제를 첨가하는 단계, 캐리어 핵산 및/또는 프로테아제를 포함하는 시료를 인큐베이션(incubation)하는 단계, 인큐베이션된 시료를 핵산 바인딩 컬럼에 도포하는 단계, 시료가 도포된 컬럼을 세척하는 단계, 및 컬럼에 용출액을 도포하여 핵산의 단리를 초래하는 단계를 포함하는, 뇌척수액 (CSF) 시료로부터 핵산을 단리하는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에서, CSF 시료의 부피은 적어도 1 ml이다. 일부 구체예들에서, 캐리어 핵산은 캐리어 RNA이다. 일부 구체예들에서, 뇌척수액 시료 중의 캐리어 RNA의 농도는 약 2.8 ㎍/ml 이하 (또는 2.8 ㎍/ml, 또는 그 이하)이다. 본 발명은 상기 단계들 중의 어느 한 단계 이상, 예를 들면 상기 단계들 중의 어느 하나의 단일 단계, 또는 임의의 둘, 셋, 넷 또는 다섯 단계들의 병용을 포함하는 (또는 이루어지는, 또는 본질적으로 이루어지는)방법을 고려하고 있다는 것이 이해되어야 한다. 이 방법들은 또한 일부 구체예들에서 추가의 단계들을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 단계(들)을 1회 이상 수행하는 것을 고려할 수 있고, 예를 들면, 세척 단계를 2회 이상 수행하는 것이 유리할 수 있다. 또 다른 실시예로서, 용출 단계를 1회 이상 수행하는 것이 유리할 수도 있다. 그러한 경우들에서, 용출된 핵산은 임의의 표준 방법, 예를 들면 에탄올 침전에 의해 추가로 농축될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 단계들 중의 한 단계 이상을 생략하거나 또는 치환하는 것을 고려할 수도 있다. 예를 들면, 몇몇 경우들에서 다른 고체상 추출 물질 (예를 들어, 실리카 또는 다른 물질)이 핵산을 포획 및/또는 정제하기 위해 결합 칼럼 대신에 사용될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 시료에서 JC 바이러스 (JCV)의 양을 측정하기 위한 방법들, 키트들 및 핵산들을 제공한다. JCV는 진행성 다초점 백색질뇌증 (PML)이라는 중추 신경계의 희귀 질환을 일으키는 것으로 알려진 인간 폴리오마바이러스이다. JCV는 인간을 감염시키지만 PML을 유발하지 않는 폴리오마바이러스 부류의 다른 구성원인 BK 바이러스와 대략적으로 75% 뉴클레오티드 상동성을 공유한다.
최근 몇 년 동안 HIV 감염의 주요 합병증으로 초기에 확인되었지만, 면역 억제 치료 항체들은 PML의 증가된 발생률과 연관이 있어 왔다. 일부 구현예들에서, 중추 신경계에서 JCV의 검출은 피험자에서 PML의 존재를 확인하는 중요한 단계이다. CSF 에서JCV의 조기 검출은 (예를 들어, 중증 증상들로 진행되기 전에) PML의 조기 치료를 개시하기 위한 기반으로서 사용될 수 있다. 따라서, JCV의 조기 검출은 환자의 양호한 예후를 위해 중요할 수 있다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 여러 측면들은 생물학적 시료들 (예를 들어, CSF 시료들)에서 JCV 검출의 감도를 증가시킬 수 있는 분석 기법들 및 시약들에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 본원에 기재된 실시간 PCR 분석은 특히 10 카피(copy)/mL 의 감도로 인간 CSF 중의 JCV를 검출한다.
본 발명의 여러 측면들은 PML의 징후들이나 증상들 (예를 들어, 초기 징후들 또는 증상들)을 갖는 피험자에서 PML의 진단을 확인하기 위한 방법들 및 조성물들에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 환자의 CSF에서 JCV의 존재는 PML의 진단이다(예를 들면, 환자가 PML의 하나 이상의 다른 징후들 또는 증상들이 있는 경우). 일부 구현예들에서, 피험자의CSF에서 JCV의 존재는 이 피험자가 PML에 대한 위험이 있는지를 결정하는데 유용할 수 있다. 특히, 본 발명은 피험자의 면역 체계가 손상되거나 억제된 경우에 피험자가 PML을 발병시킬 위험이 있는지 여부를 결정하기 위한 방법들 및 조성물들을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 여러 측면들은 JCV 감염의 존재로 인해 PML을 발병시키는 피험자의 위험 임계치를 결정함으로써 피험자가 면역 억제제 (예를 들어, 나탈리주마브(natalizumab) 또는 기타 면역 억제제)에 의한 초기 또는 지속적인 치료에 적합한지 여부를 결정하는 것에 관한 것이다. 환자의 CSF에서 JCV의 존재가 PML의 진단 (예를 들어, PML의 조기 진단)을 위해 사용되는 경우, 그 환자는 PML에 대한 치료를 받을 수 있고/있거나 또는 필요할 경우 환자가 받고 있는 면역 억제 치료가 중단될 수 있음이 인식되어야 한다.
따라서, 일부 구현예들에서, 본 발명의 여러 측면들은 뇌척수액 (CSF) 시료에 캐리어 핵산 및 프로테아제를 첨가하고, 캐리어 핵산 및 프로테아제를 포함하는 시료를 인큐베이션하고, 인큐베이션된 시료를 핵산 바인딩 컬럼에 도포하고, 시료가 도포된 컬럼을 세척하고, 용출제를 컬럼에 도포하여 핵단의 단리를 초래함으로써 뇌척수액 (CSF) 시료로부터 핵산을 단리하는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예들에서, CSF 시료의 부피는 적어도 1 ml이다. 일부 구현예들에서, 캐리어 핵산은 캐리어 RNA이다. 일부 구현예들에서, CSF 시료 중의 캐리어 RNA 의 생성된 농도는 2.8 ㎍/ml 이하이다. 일부 구현예들에서, 시료를 인큐베이션하는 단계는 실온 (RT) 에서 시료를 인큐베이션하는 제 1 단계 및 RT 이상의 온도에서 시료를 인큐베이션하는 제 2 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 인큐베이션 단계는 15분 길이이다. 일부 구현예들에서, RT 이상의 온도는 56℃이다. 일부 구현예들에서, 컬럼을 세척 하는 단계는 컬럼에 세척 완충액을 첨가하고 4000g의 원심력으로 컬럼을 회전시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 용출액을 도포하는 단계는 컬럼에 용출액을 적어도 두 번 도포하는 것을 포함한다. 일부 구현예들에서, 용출액은 컬럼 상에서 5분 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예들에서, 용출액 30 μL가 도포된다. 일부 구현예들에서, CSF 시료 중의 핵산은 DNA , 예를 들면 바이러스 DNA (예를 들어, JCV DNA 또는 다른 바이러스 DNA)이다.
일부 구현예들에서, 핵산 (예를 들어 DNA, 예를 들어, 바이러스성 DNA)는 JC 바이러스성 DNA의 양을 결정하기 위해 실시간 중합효소 연쇄 반응 (실시간 PCR)을 수행함으로써 분석된다. 그러나, 다른 검출 방법들 (예를 들어, 다른 PCR 방법들, 다른 증폭 방법들, 다른 혼성화 기반 방법들, 하나 이상의 시퀀싱 방법들 등)이 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브는 JC 바이러스 T 항원 암호화 서열에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브의 서열들은 각각 SEQ ID NOs:1-2 및 SEQ ID NO:3이다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 여러 측면은 시료에 대한 실시간 PCR을 수행함으로써 시료 중의 JC 바이러스 DNA의 양을 측정하는 방법에 관한 것이며, 여기서 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브는 JC 바이러스 T 항원 암호화 서열에 관련된다. 일부 구현예들에서, 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브의 서열들은 각각 SEQ ID NOs:1-2 및 SEQ ID NO:3이다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 여러 측면은 뇌척수액 (CSF) 시료로부터 핵산을 단리하는 키트에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 키트는 프로테아제, 캐리어 핵산, 핵산 바인딩 컬럼 및/또는 사용 설명서를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 키트는 JC 바이러스 T 항원 암호화 서열에 관련한 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브의 서열들은 각각 SEQ ID NOs:1-2 및 SEQ ID NO:3이다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 여러 측면들은 보존적 바이러스 서열 (예를 들면, 보존적 JCV 서열, 예를 들어, T 항원 암호화 서열)에 대해 특히 (예를 들어, 엄격한 혼성화 조건 하에서) 혼성화되는 핵산 프라이머에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 핵산은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3의 서열이거나 또는 이를 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 측면들은 본 명세서에서 보다 상세히 설명된다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 여러 측면들은 환자에서 PML의 위험성을 평가하기 위해 환자 시료에서 JCV를 검출하는 것에 관한 것이다. JCV에 의한 일차 감염은 종종 아동기 동안 자각 증상 없이 발생 하지만 (Padgett & Walker, 1973), JCV는 아마도 바이러스혈증을 통해 전형적으로 몸 전체에 전파된다 (Ikegaya et al., 2004). JCV 에 의한 감염은 대부분의 피험자들에서 증상이 없지만, 감염은 일부 피험자들에서 (PML과 같은) 심각한 상태들, 심지어 사망을 초래할 수 있다. PML에 가장 민감한 피험자들은 면역-손상된 환자들 (예를 들어, 에이즈 환자들) 또는 예를 들면 장기 이식 후 또는 (예를 들어, 나탈리주마브 또는 기타 면역 억제 약물을 사용하여) 다발성 경화증 등의 염증 관련된 상태를 치료하기 위해 면역 억제제에 의한 치료를 받고 있는 환자들이다.
JCV는 PML의 부재 하에 신장들에서 대체로 지속되고, PML은 뇌에서 JCV의 존재와 연관되어 있는 것으로 생각된다. 따라서, 일부 구현예들에서, 본 발명의 여러 측면들은 CSF에서 JCV의 검출에 관한 것이다. 그러나, 본 발명의 방법들 및 조성물들은 또한 소변, 혈액, 신장 조직, 또는 다른 환자 시료들에서 JCV를 검출하는데 유용할 수 있다.
일 측면에서, 본 개시는 뇌척수액 (CSF) 시료로부터 핵산을 단리하는 방법들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 CSF 시료에 캐리어 핵산 및 프로테아제를 첨가하고, 캐리어 핵산 및 프로테아제를 포함하는 시료를 인큐베이션하고, 핵산 바인딩 컬럼에 인큐베이션된 시료를 도포하고, 시료가 도포된 칼럼을 세척하고, 용출제를 컬럼에 도포하여 핵산의 단리를 초래하는 것을 포함한다.
뇌척수액은 뇌와 척수를 둘러싸고 보호하는 유체이다. 이 유체는 일반적으로 단백질들과 백혈구들을 함유하는 투명한 액체이다. 일반적으로, CSF는 요추 천자 (척추 탭)를 통해 피험자로부터 얻어진다. 요추 천자는 피험자에게 불쾌하고 요추 구멍들의 수를 최소화해야 하는 절차이다. 뇌수막염, 뇌 종양, 뇌 출혈을 포함하여 뇌 및/또는 중추 신경계에 영향을 미치는 각종 질환들은 CSF를 분석함으로써 진단될 수 있다. JC 바이러스에 의한 감염들과 같은 뇌의 바이러스 감염들은 CSF에서 바이러스 DNA의 존재를 검출하고/하거나 또는 그의 양을 정량화함으로써 진단될 수 있다. CSF 에서 바이러스 DNA (또는 RNA 바이러스)의 양이 적을 수 있기 때문에, 소량의 바이러스라도 정확하게 검출할 수 있는 진단 기술들을 갖추는 것은 중요하다
핵산들의 단리
일 측면에서, 본 개시는 CSF 시료로부터 핵산을 단리하는 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 핵산은 DNA이다. 일부 구현예들에서, DNA 바이러스 (예를 들어, JCV)로부터의 DNA는 CSF로부터 단리된다. 본원에 기재된 방법들은 다른 핵산들 (예를 들어, 다른 바이러스들로부터 또는 다른 미생물 또는 환자 소스로부터 DNA 또는 RNA)를 단리하기 위해 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 일부 구현예들에서, 핵산은 인간 핵산 (즉, 인간 게놈에서 발견됨)이다. 일부 구현예들에서, 핵산은 바이러스 핵산이다. 일부 구현예들에서, 핵산은 바이러스 DNA이다. 일부 구현예들에서, 핵산은 JC 바이러스 DNA이다. 일부 구현예들에서, 핵산은 (예를 들면 기준으로 사용하기 위해) 본원에 제공된 단리 방법을 적용하기에 앞서 CSF 시료에 첨가된다 (즉, "스파이크된다(spiked)").
일 측면에서, 본 개시는 상업적으로 입수할 수 있는 핵산 단리 키트들(예를 들어, QIAamp MinElute Virus Spin Kit (Cat # 57704, Qiagen) 및 Qiagen, Promega 및 Epicentre로부터의 다른 키트들과 같은)로부터 1개 이상의 성분들을 사용하는, CSF 시료로부터 핵산들을 단리시키는 방법들을 제공한다. 본원에 기재된 방법들은 다른 상업적으로 입수할 수 있는 핵산 키드들로부터의 성분들에 의해 실시될 수도 있음을 인식해야 한다.
일부 구현예들에서, 핵산이 단리되는 CSF 시료의 부피는 0.5 ml 이상, 1 ml 이상, 1.5 ml 이상, 2 ml 이상, 2.5 ml 이상, 3 ml 이상, 5 ml 이상, 또는 적어도 10 ml 이상이다. 일부 구현예들에서, 핵산이 단리되는 CSF 시료의 부피는 1 ml이다. 1 ml의 시료 크기는 생물학적 시료로부터, 특히 CSF로부터, 핵산의 단리를 위해 일반적으로 사용되는 시료 크기 (예를 들어, 200 μL 이하)보다 더 크다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 일부 측면들에 따르면, 충분한 감도를 달성하기 위하여 (예를 들어, 적어도 10 카피(copy)의 JCV 핵산을 검출하기 위해) 1 ml 이상의 CSF의 부피량을 사용하는 것이 중요하다. 더 작은 부피 (1 ml 미만)은 환자가 양성의 PML 진단을 받는지 여부를 신뢰할 수 있게 측정하기에 충분한 감도 및/또는 재현성을 제공하기에 충분하지 않은 것으로 인식되어 왔다.
일부 구현예들에서, 캐리어 핵산은 핵산이 단리되는 CSF 시료에 첨가된다. 캐리어 핵산의 첨가는 단리될 핵산에 벌크성을 제공하여 단리될 핵산이 본원에 제공된 방법들의 단계들 중의 하나 동안 손실되는 가능성을 최소화한다. 일부 구현예들에서, 캐리어 핵산은 RNA 이다. 일반적으로 캐리어 핵산의 특성은 단리될 (및 분석될) 핵산의 특성에 좌우될 것이다. 단리될 핵산이 DNA인 경우, 캐리어 핵산은 RNA (및 그 반대)일 수 있다. 단리 프로토콜이 완료되면, 더 이상 필요치 않은 캐리어 핵산 RNA는, 예를 들면 RNAse를 첨가함으로써 쉽게 제거될 수 있다. 그러나, 분석될 핵산 및 캐리어 핵산은 동일한 특성, 예를 들면 둘 다 DNA일 수 있다. 그러한 경우에, 캐리어 핵산은 일반적으로 단리될 (및 분석될) 핵산과 상이한 크기를 가짐으로써 그와 같이 필요한 경우 두 핵산들의 용이한 분리를 허용한다.
일부 구현예들에서, CSF 시료 중의 캐리어 핵산(예를 들어, RNA)의 생성된 농도는 5 ㎍/ml 이하, 4 ㎍/ml 이하, 3 ㎍/ml 이하, 2 ㎍/ml 이하, 1 ㎍/ml 이하 또는 0.5 ㎍/ml 이하이다. 일부 구현예들에서, CSF 시료 중의 캐리어 핵산(예를 들어, RNA)의 생성된 농도는 2.8 ㎍/ml이다. 본원에 사용된 바의 결과의 농도는 CSF 시료 중의 캐리어 핵산의 농도를 의미한다. 따라서, 캐리어 핵산은 더 높은 농도로 제조될 수 있으며, CSF 시료 내로 희석될 수 있다. 놀랍게도, 개시된 방법들에 사용된 캐리어 핵산의 농도가 일반적으로 사용되는 농도보다 더 낮고, 이는 CSF 시료로부터 단리되는 핵산의 증가된 수율을 초래하는 것이 본원에서 밝혀졌다.
일부 구현예들에서, 이 방법들은 CSF 시료에 프로테아제를 첨가하는 것을 추가로 포함한다. CSF 시료는 다른 생물학적 시료들(예를 들어, 혈액)보다 적은 단백질을 함유할 수 있지만, 프로테아제의 작용을 통한 단백질들 및 폴리펩타이드의 제거는 CSF 시료로부터 단리된 핵산의 수율을 증가시킬 수 있다. 생물학적 시료들로부터 단백질들 및 폴리펩타이드들을 제거하기 위한 프로테아제들은 일반적으로 프로테이나제 K 및 서브틸리신(subtilisin)과 같은 비특이적 프로테아제들이다. 프로테아제들의 효소 활성을 허용하기 위해 추가의 성분들이 첨가될 필요가 있거나, 또는 시료의 조성이 수정될 필요가 있다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 특정량의 염 (예를 들어, 염화나트륨 또는 Mg-염들), 또는 pH 완충제들을 포함하는 완충제가 첨가될 수 있다. 또한, 이 시료는 최적화된 효소 상태들을 허용하도록 특정 온도에서 인큐베이션될 필요가 있다. 프로테아제 반응이 발생한 후에 이 프로테아제는 제거되거나 또는 불활성화될 수 있다. 불활성화는 예를 들어 프로테아제 억제제를 추가, 및/또는 프로테아제의 보조 인자 억제제를 추가, 및/또는 시료의 온도를 증가, 및/또는 (예를 들어, 에탄올을 첨가하여) 완충액 상태들을 변경함으로써 달성될 수 있다.
일부 구현예들에서, 캐리어 핵산 및 프로테아제는 CSF 시료에 첨가된다. 일부 구현예들에서, 캐리어 핵산은 프로테아제의 첨가 전에 첨가된다. 일부 구현예들에서, 프로테아제는 캐리어 핵산의 첨가 전에 첨가된다. 일부 구현예들에서, 프로테아제는 캐리어 핵산과 함께 첨가된다. 프로테아제 완충액은 프로테아제 및/또는 캐리어 핵산이 첨가되는 것과 함께, 그 전에, 또는 그 후에 첨가 될 수 있다. 일부 구현예들에서, 용해 완충액과 같은 추가 성분들이 CSF 시료에 첨가될 수 있다. 이들 추가 성분들은 라이소자임 및 카오트로픽제(예를 들어, 구아니듐-염산 및 요소)를 포함한다. 일부 구현예들에서, 추가 성분은 상업적으로 입수할 수 있는 핵산 단리 키트에서 "용해 완충액"이다. 일반적으로 이들 키트들 내의"용해 완충액"은 사용되는 제1 완충액이다. 일부 구현예들에서, QIAamp MinElute Virus Spin Kit로부터 입수한 완충액 "AL"이 CSF 시료에 첨가된다.
놀랍게도, 캐리어 핵산 및 프로테아제를 포함하는 CSF 시료를 실내 온도에서 인큐베이션하고 이어서, 실내 온도 이상 (예를 들어, 56℃)에서 인큐베이션하는 제2 단계는, CSF로부터 단리된 핵산의 증가된 수율을 초래하는 것으로 본원에서 밝혀졌다. 따라서, 일부 구현예들에서, 본원에 기재된 방법들은 캐리어 핵산 및 프로테아제를 포함하는 CSF 시료를 실내 온도에서 인큐베이션하는 단계에 이어서, 실내 온도 이상의 온도에서 이루어지는 제2 인큐베이션 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 사용되는 효소 제법에 따라, 실내 온도 이상의 온도는 30℃ 이상, 40℃ 이상, 50℃ 이상, 60℃ 이상, 70℃ 이상, 80℃ 이상, 90℃ 이상, 또는 100℃ 이하이다. 일부 구현예들에서, 실내 온도 이상의 온도는 50℃ 내지 60℃이다. 일부 구현예들에서, 예를 들면 실시예들에 기재된 바와 같이, 실내 온도 이상의 온도는 56℃이다. 일부 구현예들에서, 실내 온도 이상의 온도는 프로테아제가 가장 큰 활성을 갖는 온도에 상응한다.
일부 구현예들에서, 사용되는 효소 제법에 따라, 인큐베이션 단계는 적어도 1분, 적어도 2분, 적어도 5분, 적어도 10분, 적어도 15분, 적어도 20분, 적어도 25분, 적어도 30분, 적어도 40분, 적어도 50분, 적어도 60분 또는 120분 이하의 길이이다. 실내 온도에서의 인큐베이션 단계 및 실내 온도 이상에서의 인큐베이션 단계는 동일한 시간 길이를 가질 수 있거나 또는 상이한 시간 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예들에서, 예를 들면 실시예들에 기재된 바와 같이, 실내 온도에서의 인큐베이션 단계 및 실내 온도 이상에서의 인큐베이션 단계는 모두 15분 길이이다.
캐리어 핵산 및 프로테아제를 포함하는 CSF 시료의 인큐베이션에 이어, 시료는 고체상 추출 방법들, 예를 들면 컬럼-기반 핵산 정제에 의해 정제된다. 이들 방법들은 전형적으로 사용된 완충액의 pH 및 염 함량에 따라 고체 상(실리카 또는 기타)에 핵산이 결합할 수 있고, 여기서 완충액은 Tris-EDTA (TE) 완충액 또는 인산염 완충액일 수 있다는 사실에 의존한다. 일반적으로, 본 발명의 여러 측면들에 따라 사용될 수 있는 핵산 정제 방법은 다음을 포함한다:
시료 (예를 들어, 본원에 사용된 바의 뇌척수액 시료)를 바인딩 컬럼 (또는 "스핀" 컬럼)에 첨가하고, 여기서 핵산은 예를 들면 완충액, 변성제 (구아니딘 염산염 등), 트리톤 X-100®, 이소프로판올 및 pH 인디케이터(indicator)를 함유할 수 있는 바인딩 용액의 염 농도 및 낮은 pH (컬럼 상의 실란올 기들에 대해 상대적임)로 인해 결합하고;
컬럼을 예를 들면 pH8.0의 5 mM KPO4 또는 유사한, 80% 에탄올 (EtOH)로 세척하고; 핵산을 완충액 또는 물로 용출시킨다.
본 발명의 측면들에 따른 방법들은 캐리어 핵산 및 프로테아제를 포함하는 CSF 시료를 핵산 바인딩 컬럼에 도포하는 것을 포함할 수 있다. 핵산 바인딩 컬럼은 당분야에 공지되어 있고, 제한 없이 실리카 기반 컬럼들 (예를 들어, US 5,234,809 참조) 및 음이온 교환 컬럼들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 핵산 바인딩 컬럼 (예를 들어, 실리카 기반 컬럼)에 CSF 시료 중의 핵산을 결합시키기에 최적인 상태들을 발생시키기 위해 CSF 시료를 컬럼에 도포하기에 앞서 카오트로픽 시약 및/또는 염이 CSF 시료에 첨가될 수 있다. 본원에 사용된 핵산 바인딩 컬럼은 특정 구성으로 제한되지 않고, 비드 기반 컬럼들, 핵산 바인딩 성분들이 컬럼에 공유적으로 부착되어 있는 컬럼들, 중력에 의해 작동하는 컬럼들 및 진공 조작에 의해 작동하는 컬럼들을 포함한다. 일부 구현예들에서, 핵산 바인딩 컬럼은 벤치 톱 원심분리기 (예를 들어, QIAamp MinElute 바이러스 스핀 키트, 및 예를 들면 Epicentre 및 Promega에 의해 제공된 다른 것들)에 들어맞을 수 있는 Eppendorf-튜브 크기의 "미니-컬럼"이다.
CSF 시료를 핵산 바인딩 컬럼에 도포한 후에, 컬럼은 세정 완충액들 (예를 들어, pH 7.0 근처 또는 pH 8.0 근처에서 트리스-기반 완충액들) 및/또는 에탄올 분량들로 1회 이상 세척될 수 있다. 세척 완충액들의 상태들은 핵산과 핵산 바인딩 컬럼 사이의 결합/상호작용이 깨지지 않고 핵산이 핵산 바인딩 컬럼에 결합되어 남아있도록 해야 한다. 일부 구현예들에서, 컬럼은 적어도 70% 에탄올을 포함하는 완충액 (예를 들어, QIAamp MinElute 바이러스 스핀 키트의 완충액 AW2 등의 시판중인 핵산 단리 키트들로부터 입수할 수 있는 "세척 완충액")으로 세척된다. 일부 구현예들에서, 이 컬럼은 "세척 완충액"으로 세척한 후 에탄올을 포함하는 제2 세척액으로 세척된다.
일부 구현예들에서, 핵산 바인딩 컬럼들은 "미니-컬럼들"이다. 일부 구현예들에서, 세척액들은 컬럼들을 (예를 들어, 벤치-톱 원심분리기에서) 회전시킴으로써 제거될 수 있다. 놀랍게도, 컬럼들을 비교적 낮은 원심력으로 회전시킴으로써 CSF 시료로부터 단리되는 핵산의 증가된 수율을 초래하는 것으로 본원에서 밝혀졌다. 일부 구현예들에서, 미니 컬럼들은 세척액들을 제거하기 위해 7000g 미만, 6000g 미만, 5000g 미만, 4000g 미만, 3000g 미만, 2000g 미만, 또는 1000g 미만으로 원심분리된다. 일부 구현예들에서, 컬럼들은 4000g으로 원심분리된다. 일부 구현예들에서, 비교적 낮은 원심력으로 세척액들을 제거한 후, 컬럼들은 상기 컬럼을 건조시키기 위해 비교적 높은 원심력으로 순차로 원심분리된다.
CSF 시료를 컬럼에 도포하고 컬럼을 세척한 후, 컬럼으로부터 핵산을 수확하기 위해 용출액이 컬럼에 도포된다. 용출액은 핵산 바인딩 컬럼에 결합된 핵산을 차지할 완충액이다. 용출제들은 물 및 인산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예들에서, 용출제들은 DNA 분해 효소 및/또는 RNA 분해 효소가 없다. 일부 구현예들에서, 용출제들은 DNA 분해 효소 및/또는 RNA 분해 효소 억제제, 및/또는 DNA 분해 효소 및/또는 RNA 분해 효소 보조 인자 억제제를 포함하기도 한다. 일부 구현예들에서, 상기 용출제는 상기 용출제 중의 미생물의 성장을 방지하기 위해 소듐 아자이드와 같은 미생물 독소를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기용출제는 시판중인 핵산 단리 키트로부터 입수할 수 있는 "용출 완충액" (예를 들어, QIAamp MinElute 바이러스 스핀 키트의 AVE 완충액)이다.
핵산 바인딩 컬럼에 도포되는 용출액의 부피는 일반적으로, 컬럼으로부터 핵산의 더 큰 백분율의 흡수를 조장하지만 단리된 핵산의 더 낮은 농도를 초래하는 더 큰 부피와, 단리된 핵산의 더 큰 농도를 초래하지만 컬럼에 결합된 모든 핵산을 점유하지 않는 대가의 적은 부피 사이의 절충이다. 일부 구현예들에서, 1μL 이상, 5μL 이상, 10μL 이상, 20μL 이상, 30μL 이상, 40μL 이상, 50μL 이상, 60μL 이상, 70μL 이상, 80μL 이상, 90μL 이상, 100μL 이상, 200μL 이상, 500μL 이상의 용출제가 컬럼에 도포된다. 일부 구현예들에서, 30μL 이상의 용출제가 컬럼에 도포된다.
일부 구현예들에서, 용출제는 컬럼 상에서 1분 이상, 2분 이상, 5분 이상, 10분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 또는 60분 이상 동안 인큐베이션되도록 허용된다. 일부 구현예들에서, 용출제는 컬럼 상에서 5분 이상 동안 인큐베이션되도록 허용된다.
일부 구현예들에서, 동일한 용출제가 컬럼에 다수의 횟수로 도포된다. 따라서, 일부 구현예들에서, 용출제는 컬럼에 도포되어 인큐베이션되도록 허용되고 (현재 핵산을 포함하는) 용출제가 (예를 들어, 원심분리에 의해) 컬럼으로부터 제거되고, 순차로 컬럼에 다시 도포되고, 두번째로 인큐베이션되도록 허용되고, 두번째로 제거된다. 일부 구현예들에서, 동일한 용출제가 컬럼에 2회, 3회, 4회, 5회 이상에 이르기까지 도포된다. 일부 구현예들에서, 동일한 용출제가 컬럼에 2회 도포된다.
일부 구현예들에서, 30μL의 용출제가 컬럼에 도포되고, 5분 동안 인큐베이션되도록 허용되고, (예를 들어, 원심분리에 의해) 컬럼으로부터 제거되고, 순차로 컬럼에 다시 도포되고, 또 다른 5분 동안 인큐베이션되도록 허용되고 컬럼으로부터 제거된다.
CSF 시료로부터 단리된 핵산을 현재 포함하는 용출제가 일단 컬럼으로부터 제거되면 적절한 온도 (예를 들어, 4℃, -20℃)에서 저장될 수 있고/있거나 용출제 중의 핵산은 분석될 수 있다 (예를 들어, 서열 및/또는 양이 측정됨).
핵산 증폭
일 측면에서, 본 개시는 시료 중의 핵산의 양을 결정하는 방법들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 핵산은 DNA이다. 일부 구현예들에서, 핵산은 바이러스 핵산이다. 일부 구현예들에서, 핵산은 바이러스 DNA이다. 일부 구현예들에서, 핵산은 JC 바이러스 DNA이다. 일부 구현예들에서, 핵산은 CSF 시료로부터 단리된다. 일부 구현예들에서, 핵산은 본원에 기재된 임의의 방법들에 의해 CSF 시료로부터 단리된다. 일부 구현예들에서, 핵산은 CSF 시료로부터 단리된 JC 바이러스 DNA이다. 일부 구현예들에서, 핵산은 캐리어 핵산 및 프로테아제를 CSF 시료에 첨가하고, 캐리어 핵산 및 프로테아제를 포함하는 시료를 인큐베이션하고, 인큐베이션된 시료를 핵산 바인딩 컬럼에 도포하고, 시료가 도포된 컬럼을 세척하고, 용출제를 컬럼에 도포하는 것으로 이루어진 방법에 의해 CSF 시료로부터 단리된 JC 바이러스 DNA이다.
그러나, 본 발명의 여러 측면들 (예를 들어, 정제 및/또는 증폭 기술들)은 임의의 적절한 기술 및/또는 결합을 위한 매트릭스 및/또는 (예를 들어, CSF로부터) 단리하는 핵산과 병용하여 사용될 수 있음을 인식해야 한다.
일 측면에서, 본 개시는 시료 상에서 실시간 정량적 PCR이라 칭하기도 하는 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (실시간 PCR)을 수행하는 것을 포함하여 시료 중의 핵산의 양을 측정하는 방법들을 제공한다. 시료 중의 바이러스 핵산의 양을 측정하기 위한 실시간 PCR 방법들은 잘 확립되어 있다 (예를 들어, McKay et al., Real-time PCR in virology, Nucl. Acids Res. 2002, 20:1292 참조). 간단히, 실시간 PCR에서 관심 서열 (예를 들어, 바이러스 DNA 서열)에 혼성화될 수 있는 2 프라이머들 및 핵산 프로브는 시료에 첨가된다. 관심 서열이 존재하는 경우 그 서열은 PCR 프라이머의 결합 및 PCR 반응을 통해 증폭될 것이다. 상기 PCR 핵산 생성물은 프로브에 의한 결합을 통해 검출/정량화될 것이다. 일반적으로, 핵산 프로브는 형광 라벨 (예를 들어, 6-카복시플루오레신, 약어: FAM) 등의 리포터 요소 및 ?쳐(quencher) (예를 들어, 테트라메틸로다민, 약어: TAMRA)를 포함한다. PCR 반응 생성물을 결합시키기에 앞서, 형광 라벨은 ?칭되고, 어떠한 형광도 관찰되지 않는다. 관심 서열이 존재하는 경우, 상기 프로브는 서열의 PCR-발생된 카피들에 결합할 것이다 (표적이 존재하는 경우 프로브는 표적 서열에 결합할 수도 있음에 주의). 상기 프로브의 결합은 형광 신호를 초래하는 형광 라벨로부터 ?쳐의 물리적 분리를 초래할 것이다. 일부 구현예들에서, 형광 태그는 폴리머라제 (예를 들어, Taq 폴리머라제)의 5' 폴리머라제 활성에 의해 방출된다. 신호의 강도는 존재하는 관심 서열의 양(카피 수)을 측정하는 것을 허용하는 존재하는 관심 서열의 양에 비례할 것이다. 일반적으로, 그 양은 서열의 공지된 양들에 의해 시료들에 대해 벤치마크된다. 많은 시판중인 개체들은 실시간 PCR 실험을 수행하기 위한 폴리머라제, 키트들 및 하드웨어 등의 "습식-실험실" 성분들을 포함하는 재료들을 제공한다. 공급업체들은 Qiagen, Invitrogen, Applied Biosystems 및 Bio-Rad를 포함한다.
일 측면에서, 본 개시는 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하는 것을 포함하여 JC 바이러스 DNA의 양을 측정하는 방법들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브들은 JV 바이러스 T 항원에 관련된다. 일부 구현예들에서, 상기 프라이머들은 핵산 서열들 5' CCC TAT TCA GCA CTT TGT CC 3' (SEQ ID NO:1) 및 5' TCA GAA GTA GTA AGG GCG TGG AG 3' (SEQ ID NO:2)에 대응하고, 프로브 서열은 5' AAA CAA GGG AAT TTC CCT GGC CCT CC- 3' (SEQ ID NO:3)에 대응한다. 일부 구현예들에서, 프로브 형광 라벨은 FAM이고, ?쳐는 TAMRA이다. 일부 구현예들에서, 형광 라벨은 프로브의 5' 말단에 있고, ?쳐는 3' 말단에 있다. 일부 구현예들에서, 프로브는 5' FAM-AAA CAA GGG AAT TTC CCT GGC CCT CC-TAMRA 3 (SEQ ID NO:3)이다. 그러나, 대체 형광 라벨들, ?쳐 및/또는 프로브 서열 상의 형광 라벨 및/또는 ?쳐의 대체 위치는 본 개시에 포함될 수도 있음을 인식해야 한다.
JV 바이러스 T 항원 서열은 실시간 PCR을 위한 목표 서열로서 이미 사용된 한편 (Ryschkewitsch et al., J of Virological methods 2004, 121: 217 참조), SEQ ID NOs:1 및 2인 프라이머들과 SEQ ID NO:3인 프로브의 조합은 우수한 결과를 제공한 것으로 본원에서 밝혀졌다. 그러나, 일부 구현예들에서, 1개 이상의 다른 프로브 또는 프라이머들 (예를 들어, JCV T 항원 서열로 표적화됨)이 사용될 수 있다.
또한, 다른 증폭-기반 (예를 들어, PCR 등), 혼성화-기반, 시퀀싱-기반, 및/또는 다른 검출 기술들이 사용될 수 있음 (본원에 기재된 1개 이상의 프라이머들 또는 프로브들을 사용함)을 인식해야 한다.
핵산들
일 측면에서, 본 개시는 단리된 핵산들을 제공한다. 일부 구현예들에서, JCV를 검출하는데 유용한 핵산들은 JCV에 대해 특이적이다 (예를 들어, 생물학적 시료 중에 존재할 수 있는 BK 바이러스 또는 다른 바이러스 핵산에 대해 상대적임). 일부 구현예들에서, 핵산들은 JCV 서열들에 대해 상보적이지만, 다른 바이러스들로부터의 서열들에 대해서는 그렇지 않다. 일부 구현예들에서, JCV를 검출하는데 유용한 핵산들은 다른 변종 서열들이 JCV 게놈에 존재하는지 여부와 무관하게 JCV의 존재를 검출하기 위해 보존된 JCV 영역들을 검출하도록 고안된다 (예를 들어, 핵산들은 상보적이고, 보존된 JCV 게놈 영역들에 대해 100% 상보적이다). 일부 구현예들에서, 핵산들은 JC 바이러스 T 항원 암호화 서열들의 어느 스트랜드에 (예를 들어, 상보적으로, 예를 들면 100% 상보적으로) 관련된 프라이머들 및 프로브들이다. 일부 구현예들에서, 핵산들은 실시간 PCR에 의해 시료 중의 JC 바이러스의 양을 측정하는 것을 허용한다. 일부 구현예들에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO:1을 포함한다. 일부 구현예들에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO:2를 포함한다. 일부 구현예들에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO:3을 포함한다. 일부 구현예들에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO:1로 이루어진다. 일부 구현예들에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO:2로 이루어진다. 일부 구현예들에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO:3으로 이루어진다.
일부 구현예들에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO:1을 포함하는 핵산 프라이머이다. 일부 구현예들에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO:2를 포함하는 핵산 프라이머이다. 일부 구현예들에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO:3을 포함하는 핵산 프로브이다. 일부 구현예들에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO:1로 이루어진 핵산 프라이머이다. 일부 구현예들에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO:2로 이루어진 핵산 프라이머이다. 일부 구현예들에서, 단리된 핵산은 SEQ ID NO:3으로 이루어진 핵산 프로브이다. 본원에 개시된 단리된 핵산은 1개 이상의 관능기들 (예를 들어, 형광 라벨)을 추가로 가질 수 있다. 일부 구현예들에서, SEQ ID NO:3에 대응하는 핵산은 형광 라벨 및 ?쳐를 포함하는 핵산 프로브이다. 일부 구현예들에서, SEQ ID NO:3에 대응하는 핵산은 프로브 5' FAM-AAA CAA GGG AAT TTC CCT GGC CCT CC-TAMRA 3 (SEQ ID NO:3)이다.
키트들
일 측면에서, 본 개시는 뇌척수액 (CSF) 시료로부터 핵산을 단리하기 위한 키트들을 제공한다. 일부 구현예들에서, 키트들은 프로테아제, 캐리어 핵산, 핵산 바인딩 컬럼 및 사용 설명서를 포함한다.
일부 구현예들에서, 키트는 JC 바이러스 T 항원에 관련된 실시간-PCR 프라이머들 및 프로브들을 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브들의 서열들은 각각 SEQ ID NOs:1-2 및 SEQ ID NO:3이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 환자로부터 (예를 들어, 인간 CSF 시료로부터) 시료 중의 JCV의 존재를 단리 및/또는 검출시키기 위한 키트에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 여러 국면들은 핵산을 단리 및 제조하기 위한 1개 이상의 성분들 및/또는 특정 서열을 갖는 핵산의 존재 및/또는 양을 분석하기 위한 1개 이상의 성분들을 함유하는 키트들에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 키트는 생물학적 시료 (예를 들어, CSF 시료)로부터 JCV 입자들 및/또는 JCV 핵산을 단리시키기 위해 1개 이상의 완충액 및/또는 다른 용액들을 함유하고, 임의로 1개 이상의 단리 단계를 수행하기 위한 설명서를 함유한다. 일부 구현예들에서, 키트는 시료 중의 JCV 핵산을 검출하기 위한 1개 이상의 시약들을 함유한다. 예를 들면, 키트는 특정 서열을 갖는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 핵산 (예를 들어, 핵산 프라이머)은 건조된 분말 (예를 들어, 동결 건조된 제제)로서 제공될 수 있다. 일부 구현예들에서, 핵산은 용액으로 제공될 수 있다. 용액은 희석액, 완충액, 염 용액, 수용액 또는 예를 들면 물을 포함하는 다른 용액일 수 있다. 용액은 공지된 (예를 들어, 소정의) 농도의 핵산들을 함유할 수 있다. 키트는 후속 인증 또는 품질 관리 목적들을 위해 표시되어야 하는 1개 이상의 특정 성분들에 대해 정의된 1개 이상의 적절한 농도들로 핵산 용액을 희석하기 위한 설명서를 함유할 수 있다. 일부 구현예들에서, 키트는 생물학적 시료 (예를 들어, CSF 시료) 중에서 특정 서열을 갖는 핵산의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 1개 이상의 올리고뉴클레오티드들 (예를 들어, PCR 프라이머들)을 함유할 수 있다. 키트는 또한 본 발명의 핵산 단리, 검출 및/또는 정량적 분석을 수행하기 위하여 1개 이상의 효소들 및/또는 기타 시약들을 함유할 수 있다. 일부 구현예들에서, 키트는 기준 서열 및/또는 특정 관심 서열을 갖는 기준 핵산을 함유할 수 있다. 기준 레벨 (예를 들어, 기준 레벨에 관한 정보) 및/또는 기준 레벨에서 핵산을 함유하는 기준 시료는 또한 키트 내에 제공될 수 있다. 그러한 정보 및/또는 핵산들은 대조군들로서 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 키트는 환자 시료 (예를 들어, CSF 시료)로부터 핵산들 (예를 들어, JCV 핵산들)을 단리시키기 위한 설명서들을 포함할 수도 있다.
일부 구현예들에서, 키트는 1개 이상의 시약들 (예를 들어, 세척 완충액, 용해 완충액, 프로테아제들, 용출 완충액 등) 및/또는 본원에 기재된 핵산들 (예를 들어, PCR 프라이머들, 검출 프로브들 등)이 내부에 배치된 적어도 하나의 용기 수단을 포함한다. 특정 구현예들에서, 키트는 1개 이상의 다른 시약들 또는 프로브들을 포함하는 다른 용기들을 추가로 포함한다. 키트는 검출 시약을 함유할 수도 있다. 일부 구현예들에서, 키트 내의 1개 이상의 프로브들은 라벨링될 수 있다. 일부 구현예들에서, 키트는 프로브를 (예를 들어, JCV 핵산과의 접촉 전 또는 후에) 라벨링하기 위한 시약들을 포함할 수 있다. 검출 시약들의 예들은 방사선 라벨들, 형광 라벨들, 효소 라벨들 (예를 들어, 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 인산염), 및 친화성 라벨들 (예를 들어, 비오틴, 아비딘, 또는 스텝타비딘)을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.
상세하게는, 구획화된 키트는 시약들이 별개의 용기들에 함유된 임의의 키트를 포함한다. 그러한 용기는 작은 유리 용기들, 플라스틱 용기들 또는 플라스틱이나 종이의 스트립들을 포함한다. 그러한 용기들은 하나의 구획으로부터 또 다른 구획으로 시약들의 효율적인 전이를 허용함으로써 시료들 및 시약들은 교차 오염되지 않고, 각각의 용기의 시약들 및 용액들은 하나의 구획으로부터 또 다른 구획으로 정량적인 형식으로 첨가될 수 있다. 일부 구현예들에서, 키트는 시험 시료를 수용하는 용기, 분석에 사용된 프로브 또는 프라이머들을 함유하는 용기, 세척 시약들 (인산염 완충 염수, 트리스-완충액들 등)을 함유하는 용기들, 및 혼성화된 프로브, 증폭된 생성물 등을 검출하기 위해 사용된 시약들을 함유하는 용기들을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예들에 의해 추가로 예시되며, 어떠한 방식으로든지 추가로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전반에 인용된 전체 참고 문헌들 (참고 문헌들, 발행된 특허들, 공고된 특허 출원들 및 공-계류중인 특허 출원들을 포함함)의 전체 내용은 명백히 참고로 본원에 인용되고, 특히 상기 참조된 가르침을 위해 인용된다.
실시예
실시예 1: 뇌척수액( CSF )으로부터 DNA 추출
재료 및 방법
- QIAamp MinElute 바이러스 스핀 키트 (Cat # 57704, QIAGEN) 프로토콜은 인간 CSF 시료들을 처리하기 위해 변경되었다. 다음 완충액들은 DNA 추출을 위해 사용되었다.
- 완충액 AW2는 13mL의 완충액 AW2 농축물을 함유하는 병에 30mL의 에탄올 (96-100%)을 첨가하고 철저히 혼합함으로써 제조되었다. 완축액은 상온에서 저장되었다.
- QIAGEN 프로테아제는 동결 건조된 QIAGEN 프로테아제의 병에 1.4mL의 완충액 AVE를 첨가함으로써 제조되었고 부드럽게 혼합되었다. 프로테아제 효소는 2-8℃에서 저장되었다.
- 캐리어 RNA 용액 (1㎍/μL): 동결 건조된 캐리어 RNA의 튜브에 310μL의 완충액 AVE를 첨가함으로써 1㎍/μL의 용액을 제조하고 펄스 와동(pulse vortexing)에 의해 혼합됨. 캐리어 RNA는 -20±10℃에서 저장되었고, 3회 이상 동결-해동을 겪지 않았다. 완충액 AL 중의 캐리어 RNA의 최종 농도는 5.6㎍/mL였다. 예를 들면, 캐리어 RNA 용액의 n 시료들 [(1.1) x (5.6) x (n)]μL가 [(1.1) x (n)]mL 완충액 AL에 첨가되었다. 시약은 부드러운 반전들에 의해 혼합되었고 제조일에 사용되었다.
DNA 추출
동결된 CSF는 실온으로 해동되었고, 5000g에서 5분 동안 원심분리되었다. 원심분리에 이어, 1000μL의 CSF가 15mL의 원심분리 튜브 내로 피펫팅되었다. QIAGEN 프로테아제 (125μL) 및 AL 완충액-캐리어 RNA 용액 (1000μL 중의 5.6㎍/mL)이 CSF에 첨가되었다.
시료는 15초 동안 와동되었고 실온에서 15분 동안 인큐베이션되고 이어서 수조 내에서 15분 동안 56℃에서 인큐베이션되었다.
인큐베이션 후, 1250μL의 에탄올 (96-100%)이 시료에 첨가되었고 15초 동안 펄스-와동에 의해 철저히 혼합되었다. 용해물은 실온 (15-25℃)에서 7분 동안 순차로 인큐베이션되었다.
용해물은 전체 용해물을 QIAamp Minelute 내로 도포함으로써 QIAvac 24 Plus 진공 매니폴드 (Cat # 19413, QIAGEN) 를 사용하du 처리되었다. 필요할 경우, 다중 도포가 전체 용해물을 도포하기 위해 사용되었다. 결합 후, 컬럼은 500μL의 완충액 AW2로 세척하고 4000g에서 1분 동안 원심분리하였고, 이어서 500μL의 에탄올 (96-100%)로 세척하고, 4000g에서 1분 동안 원심분리하였다.
QIAamp Minelute 컬럼은 캡이 개방되지 않은 채로 13000g에서 3분 동안 원심분리하고 이어서 13000g에서 2.5분 동안 원심분리하여 건조되었다.
컬럼이 건조되었을 때, 그것은 깨끗한 DNA 분해 효소 없는 마이크로 원심분리 튜브 내에 배치되고 30μL의 완충액 AVE가 멤브레인의 중심에 도포되었고, 5분 동안 인큐베이션되었다. 인큐베이션 후, 튜브는 1분 동안 최대 속도로 원심분리되었다. 용출된 DNA의 양을 증가시키기 위해, 용출액은 튜브로부터 제거되었고 멤브레인의 중심에 다시 도포되었고 5분 동안 인큐베이션된 후 1분 동안 최대 속도로 원심분리되었다.
추출 후, 1μL의 DNA가 DNA 정량화를 위해 사용되었고, 20μL가 PCR 분석을 위해 저장된다.
실시예 2: JCV DNA의 정량화를 위한 실시간 PCR 분석
재료들 및 방법들
프라이머들 및 프로브들은 JC 바이러스 게놈의 T-항원 유전자의 보존된 영역에 반하여 고안되었으며 BLAST 서치는 교차-반응성을 보장하기 위해 수행되었다. 프라이머들 및 프로브의 서열은 다음과 같다:
Figure pct00001
Taqman 실시간 정량적 PCR는 ABI 7900HT 서열 검출 시스템 (Applied Biosystems)을 사용하여 수행되었다. 실시간 PCR은 Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)을 사용하여 운행되었으며, 각각의 반응은 다음 표에 따라 제조되었다.
마스터 믹스 최종물 카탈로그 번호/제조업체 반응당 부피(μL)
300nM 순방향 프라이머 (저장품(Stock) = 100uM) 사용자 지정
Applied Biosystems		 0.15
300nM 역방향 프라이머 (저장품 = 100uM) 사용자 지정
Applied Biosystems		 0.15
200nM 프로브 (저장품 = 100uM) 사용자 지정
Applied Biosystems		 0.1
AmpliTaq Gold DNA 폴리머라제 Cat # N8080242
Applied Biosystems		 0.5
10X IPC Exo Mix Cat # 4308323
Applied Biosystems		 5
50X IPC DNA Mix 1
1X Taqman Universal PCR 마스터 믹스 (저장품 = 2X) Cat # 4304437
Applied Biosystems		 25
DNA 분해 효소/RNA 분해 효소 없는 물 Cat # 10977-023
Gibco (또는 유사함)		 8.1
전체 부피 40
각각의 반응을 위해, 40μL의 상기 마스터 믹스를 MicroAmp® Optical 96-웰 반응 플레이트 (Cat # N8010560, Applied Biosystems) 상에서 10μL의 DNA 용출액에 첨가되었고 다음 단계들에 따라 PCR 분석에 적용되었다:
1. 2분 동안 50℃ - 1 싸이클 (cycle)
2. 10분 동안 95℃ - 1 싸이클
3. 15초 동안 95℃; 1분 동안 60℃ - 50 싸이클
표준 곡선은 인간 CSF에 스파이크된, 최적화된 DNA 추출 절차를 사용하여 추출되었고 중복 시험된, JC 바이러스 (Cat # VR-1583, ATCC)를 사용하여 10 - 107 카피/mL 범위로 제조되었다. 각각의 운행은 동일한 추출 공정을 겪는 스파이크되지 않은 CSF로 구성된 음성 대조군을 포함하기도 하였다. 시료 중의 절대 카피 수는 ABI SDS 소프트웨어를 사용하여 표준 곡선으로부터 외삽법에 의해 정량화되었다. 모든 시료들 및 표준들은 중복 시험되었으며 두 웰들로부터 평균 결과는 카피/mL로 보고된다.
예비 분석 진전에 기초하여, 검출 한계 (LOD)는 10 카피/mL로 측정되었고, 동적인 범위는 10 - 107 카피/mL이다. 분석의 특이성은 치밀하게 관련된 BK 폴리오마바이스에 반하여 평가되었고 어떠한 교차-반응성도 관찰되지 않았다.
실시예 1의 방법의 재현성은 하기 표에 나타낸다.
실시예 1의 방법의 재현성
인간 CSF Ct 평균 Ct 평균 Ct 평균 Ct 평균 Ct 평균 평균 표준
편차 		%CV
Exp 1 Exp 2 Exp 3 Exp 4 Exp 5 Ct
10000 27.87 28.01 27.72 27.08 27.30 27.6 0.39 1.42
5000 28.74 29.74 29.11 28.14 28.94 28.94 0.58 2.01
1000 31.83 32.99 31.63 30.94 30.36 31.55 0.99 3.15
500 33.09 33.80 32.19 32.91 31.68 32.73 0.82 2.51
100 35.61 37.76 34.78 36.54 34.97 35.93 1.23 3.42
50 36.90 37.52 35.36 36.85 35.40 36.41 0.97 2.67
20 38.72 N/A 38.74 40.89 39.99 39.59 1.05 2.66
10 39.27 39.90 40.64 40.18 40.25 40.05 0.51 1.27
0 ND ND ND ND ND ND N/A N/A
Ct: 실시간 PCR 분석에서, 양성 반응은 형광 신호의 축적에 의해 검출된다. Ct(싸이클 임계값)은 임계값을 교차하는 (즉, 백그라운드 레벨을 초과하는) 형광 신호에 요구되는 싸이클들의 수로서 정의된다. Ct 레벨들은 시료에서 표적 핵산의 양에 반비례한다 (즉, Ct 레벨이 낮을 수록 시료 중의 표적 핵산의 양이 더 많다).
실시예 1의 방법의 특이성은 다음 표에 나타낸다.
실시예 1의 방법의 JC 바이러스 검출의 특이성
　바이러스 DNA 카피/mL
( JCV DNA 없음) 		카피/mL
(+ 5000 카피/mL
JCV DNA)
HSV1 0 2555
HSV2 0 2929
CMV 0 4785
EBV 0 4451
VZV 0 5333
HHV7 0 6107
HHV8 0 5273
HHV6A 0 3276
HHV6B 0 5109
HTLV-1 0 1726
HTLV-2 0 3856
HIV1 0 10206
HIV2 0 6265
BKV 0 7441
JCV 1210 6030
프라이머들/프로브의 특이성은 5000카피/mL의 상이한 바이러스 플라스미드 DNA ± 5000카피/mL의 JCV DNA
실시예 3: 비교
실시예 1 하에 기재된 방법의 결과들은 QIAamp MinElute 바이러스 스핀 키트 (Cat # 57704, Qiagen)를 구비한 "표준" 프로토콜에 기재된 방법들에 비교하였다. 예로서, DNA 미니 키트 핸드북 페이지 59-60 및 QIAamp MinElute 바이러스 스핀 키트 핸드북 페이지 19-21 참조하라. 다양한 양의 JC 바이러스 DNA 카피들이 CSF 시료에 첨가되었고, DNA는 "표준" 프로토콜 및 실시예 1에 기재된 프로토콜 모두를 사용하여 단리되었다. 단리된 DNA를 포함하는 시료들에서 JC 바이러스 DNA의 카피수는 실시예 2에서 기재된 RT-PCR 프로토콜을 사용하여 측정되었다.
"표준" 추출법은 500 카피/mL의 분석 감도를 초래하였다. 실시예 1에서 기재된 방법은 10 카피/mL의 검출을 초래하였다. (아래 표 참조)
실시예 1 대 표준 프로토콜의 비교 방법
카피/mL 평균 C t (실시예 1) 평균 C t
(표준)
10000000 20.66 23.80
1000000 23.66 27.05
500000 25.07 28.20
100000 27.64 30.06
10000 31.11 33.73
5000 32.60 35.15
1000 35.78 37.61
500 36.53 37.94
200 36.93 측정되지 않음
100 37.43 40.90
50 42.56 측정되지 않음
20 측정되지 않음 측정되지 않음
10 44.30 측정되지 않음
0 측정되지 않음 측정되지 않음
등가물
상기 서면 명세서는 당업계의 숙련자가 본 발명을 실시하기에 충분한 것으로 간주된다. 실시예들은 본 발명의 하나의 국면의 하나의 예시로 의도되고, 다른 기능적으로 동등한 실시 태양들은 본 발명의 범위 내에 있기 때문에, 본 발명은 제공된 실시들예에 의해 범위가 제한되는 것은 아니다. 본원에 도시되고 설명된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형들이 상기 설명으로부터 당업계의 숙련자들에게 명백하고, 첨부된 청구항의 범위 내에 속할 것이다. 본 발명의 이점들 및 목적들이 본 발명의 각각의 실시 태양에 의해 반드시 포함되지는 않는다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌들, 특허들 및 공개된 특허 출원들의 내용은 특히 본원에 참조된 용도 또는 주제에 대해, 그들의 전체로서 본원에 참고로 인용된다.
<110> Biogen Idec MA Inc. <120> ASSAY FOR DETECTION OF JC VIRUS DNA <130> B1152.70019WO00 <150> 61/513,483 <151> 2011-07-29 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 ccctattcag cactttgtcc 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 tcagaagtag taagggcgtg gag 23 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 aaacaaggga atttccctgg ccctcc 26

Claims (25)

  1. 뇌척수액 (CSF) 시료에 캐리어 핵산 및 프로테아제를 첨가하는 단계,
    캐리어 핵산 및 프로테아제를 포함하는 시료를 인큐베이션하는 단계,
    인큐베이션된 시료를 핵산 바인딩 컬럼에 도포하는 단계,
    시료가 도포된 컬럼을 세척하는 단계, 및
    컬럼에 용출액을 도포하여 핵산의 단리를 초래하는 단계를 포함하는, 뇌척수액 (CSF) 시료로부터 핵산을 단리하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 CSF 시료의 부피가 적어도 1 ml인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 캐리어 핵산이 캐리어 RNA인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 CSF 시료 중의 상기 캐리어 RNA의 생성된 농도가 2.8 ㎍/ml 이하인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시료를 인큐베이션하는 단계는 상기 시료를 실온 (RT)에서 인큐베이션하는 제1 단계 및 상기 시료를 실온 (RT) 이상의 온도에서 인큐베이션하는 제2 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 인큐베이션 단계는 15분 길이인 방법.
  7. 청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 실온 (RT) 이상의 온도는 56℃인 방법.
  8. 청구항 1 내지 7중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 컬럼을 세척하는 단계는 상기 컬럼에 세척 완충액을 첨가하는 단계 및 4000g의 원심력으로 상기 컬럼을 회전시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 1 내지 8중 어느 하나의 항에 있어서, 용출액을 도포하는 단계는 상기 컬럼에 상기 용출액을 적어도 2회 도포하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 1 내지 9중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 용출액은 상기 컬럼 상에서 5분 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
  11. 청구항 1 내지 10중 어느 하나의 항에 있어서, 30μL의 용출액이 도포되는 것인 방법.
  12. 청구항 1 내지 11중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 CSF 시료 중의 상기 핵산이 DNA인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 DNA가 바이러스성 DNA인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 바이러스성 DNA가 JC 바이러스 DNA인 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, JC 바이러스 DNA의 양을 측정하기 위하여 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (실시간 PCR)을 수행하는 단계를 더 포함하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브가 JC 바이러스 T 항원에 관한 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브의 서열이 각각 SEQ ID NOs:1-2 및 SEQ ID NO:3인 방법.
  18. 시료에 대하여 실시간 PCR을 수행하는 단계를 포함하고, 여기서 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브는 JC 바이러스 T 항원에 관한 것인, 시료 중의 JC 바이러스 DNA의양을 측정하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브의 서열이 각각 SEQ ID NOs:1-2 및 SEQ ID NO:3인 방법.
  20. 프로테아제, 캐리어 핵산, 핵산 바인딩 컬럼 및 사용 설명서를 포함하는, 뇌척수액( CSF ) 시료로부터 핵산을 단리하기 위한 키트.
  21. 청구항 20에 있어서, JC 바이러스 T 항원에 관하여 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브를 추가로 포함하는 키트.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 실시간 PCR 프라이머들 및 프로브의 서열이 각각 SEQ ID NOs:1-2 및 SEQ ID NO:3인 키트.
  23. SEQ ID NO:1을 포함하는 핵산 프라이머.
  24. SEQ ID NO:2를 포함하는 핵산 프라이머.
  25. SEQ ID NO:3을 포함하는 핵산 프로브.

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