CN103827319A - 用于检测jc病毒dna的测定 - Google Patents

Abstract

一方面，本公开提供用于从脑脊髓液(CSF)样品分离核酸的方法。一方面，本公开提供用于测定样品中的JC病毒DNA的量的方法。

Description

用于检测JC病毒DNA的测定

相关申请

本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2011年7月29日提交的美国临时申请号61／513,483的权益，所述临时申请的内容特此以引用的方式整体并入。

发明领域

本发明属于生物样品中的核酸的检测领域。

发明背景

JC病毒(JCV)是已知引起被称为进行性多灶性白质脑病(PML)的中枢神经系统(CNS)的罕见病症的人多瘤病毒。脑脊髓液(CSF)中的JCV的检测是PML的确证，但其在技术上是有挑战性的。因此需要用于CSF中的JCV的检测和定量的改进的测定。

发明概述

本发明的不同方面(尤其)提供用于从脑脊髓液样品分离核酸(例如像JC病毒(JCV)DNA)的方法和试剂盒。根据本发明的方面，被认为不含病毒的生物样品(例如，使用标准技术鉴定为不含JCV的CSF样品)实际上确实含有可使用本文所描述的技术检测到的病毒(例如，JCV)。检测脑脊髓液样品中JCV的存在可能是具有挑战性的，这是因为在一些情况下病毒以小量存在，这可能导致假阴性判定。在一些方面，本文所描述的是新颖的核酸检测方法和试剂盒，所述方法和试剂盒通过增加可以从脑脊髓液样品分离的核酸的产率来部分地减少假阴性结果。这在一些情况下可以通过提供比当前技术中使用的更多的起始材料(例如，较大体积的脑脊髓液)和/或更少载体(例如，较低浓度的RNA)来实现，但本发明不限于此。

因此，在一些方面，本发明提供从脑脊髓液样品分离核酸的方法，所述方法包括将载体核酸和/或蛋白酶添加至CSF样品，孵育包含所述载体核酸和／或所述蛋白酶的样品，将孵育的样品施加至核酸结合柱，洗涤施加有所述样品的柱，以及将洗脱剂施加至所述柱，从而导致核酸的分离。在一些实施方案中，CSF样品的体积为至少1ml。在一些实施方案中，载体核酸为载体RNA。在一些实施方案中，脑脊髓液样品中载体RNA的浓度为约2.8μg／ml或更小(或为2.8μg／ml或更小)。应了解，本发明涵盖包括任何一个或多个上述步骤(例如，任何单个步骤或任何两个、三个、四个或五个上述步骤的组合)(或由其组成，或基本上由其组成)的方法。在一些实施方案中，所述方法还可包括另外步骤。本发明还涵盖进行一个或多个步骤一次以上，例如，可能有利的是进行洗涤步骤两次或更多次。作为另一个实例，还可能有利的是进行洗脱步骤一次以上。在这类情况下，可通过任何标准方法(例如，乙醇沉淀)来进一步浓缩洗脱的核酸。本发明还涵盖省略或取代一个或多个上述步骤。例如，在一些情况下，可使用其它固相提取材料(例如，二氧化硅或其它)代替结合柱来捕获和／或纯化核酸。

一方面，本公开提供用于测定样品中的JC病毒(JCV)的量的方法、试剂盒以及核酸。JCV是已知引起被称为进行性多灶性白质脑病(PML)的中枢神经系统的罕见病症的人多瘤病毒。JCV与BK病毒享有大约75％的核苷酸同源性，所述BK病毒为多瘤病毒家族的另一成员，其通常感染人类，但不会引起PML。

尽管最初被鉴定为HIV感染的主要并发症，但是近年来免疫抑制治疗性抗体已经与增加的PML发病率相关。在一些实施方案中，中枢神经系统中的JCV的检测是确证受试者中PML的存在的重要步骤。CSF中的JCV的早期检测可以用作开始PML早期治疗(例如，在严重疾病症状的进展之前)的依据。因此，JCV的早期检测对于良好的患者预后可能是重要的。在一些实施方案中，本发明的方面涉及测定技术和试剂，所述测定技术和试剂可增加生物样品(例如，CSF样品)中JCV检测的灵敏度。在一些实施方案中，本文所描述的实时PCR测定特异性地检测人CSF中的JCV，灵敏度为10拷贝／mL。

本发明的方面涉及用于确证具有PML的病征或症状(例如，早期病征或症状)的受试者中PML的诊断的方法和组合物。在一些实施方案中，患者的CSF中JCV的存在是PML的诊断(例如，如果患者具有PML的一种或多种其它病征或症状)。在一些实施方案中，受试者的CSF中JCV的存在可适用于确定受试者处于PML的风险。具体地说，本发明提供用于在受试者的免疫系统受损或受抑制的情况下确定受试者是否处于发展PML的风险的方法和组合物。例如，本发明的方面涉及通过测定由于存在JCV感染而造成的受试者的发展PML的风险阈值来确定受试者是否适于用免疫抑制剂(例如，那他珠单抗或其它免疫抑制剂)开始或继续治疗。应认识到，当患者的CSF中JCV的存在用于诊断PML(例如，PML的早期诊断)时，则可针对PML对患者进行治疗和/或患者正在接受的免疫抑制治疗可在适当时中断。

因此，在一些实施方案中，本发明的方面涉及一种方法，所述方法用于通过以下方式来从脑脊髓液(CSF)样品分离核酸：将载体核酸和蛋白酶添加至CSF样品、孵育包含所述载体核酸和所述蛋白酶的样品、将孵育的样品施加至核酸结合柱、洗涤施加有所述样品的柱以及将洗脱剂施加至所述柱，从而导致核酸的分离。

在一些实施方案中，CSF样品的体积为至少1ml。在一些实施方案中，载体核酸为载体RNA。在一些实施方案中，CSF样品中载体RNA的所得浓度为2.8微克／ml或更小。在一些实施方案中，孵育样品包括在室温(RT)下孵育样品的第一步骤和在高于RT的温度下孵育样品的第二步骤。在一些实施方案中，孵育步骤为15分钟长。在一些实施方案中，高于RT的温度为56℃。在一些实施方案中，洗涤柱包括将洗涤缓冲液添加至柱并且以4000g的离心力使柱旋转。在一些实施方案中，施加洗脱剂包括将洗脱剂施加至柱至少两次。在一些实施方案中，将洗脱剂在柱上孵育5分钟。在一些实施方案中，施加30微升洗脱剂。在一些实施方案中，CSF样品中的核酸为DNA，例如病毒DNA(例如，JCV DNA或其它病毒DNA)。

在一些实施方案中，通过进行实时聚合酶链式反应(实时PCR)来测定JC病毒DNA的量来针对核酸(例如，DNA，例如病毒DNA)进行测定。然而，可使用其它检测方法(例如，其它PCR方法、其它扩增方法、其它基于杂交的方法、一种或多种测序方法等)。在一些实施方案中，实时PCR引物和探针针对JC病毒T抗原编码序列。在一些实施方案中，实时PCR引物和探针的序列分别为SEQ ID NO：1-2和SEQ ID NO：3。

在一些实施方案中，本发明的方面涉及一种用于通过在样品上进行实时PCR来测定样品中的JC病毒DNA的量的方法，其中实时PCR引物和探针针对JC病毒T抗原编码序列。在一些实施方案中，实时PCR引物和探针的序列分别为SEQ ID NO：1-2和SEQ ID NO：3。

在一些实施方案中，本发明的方面涉及一种用于从脑脊髓液(CSF)样品分离核酸的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括蛋白酶、载体核酸、核酸结合柱和／或使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括针对JC病毒T抗原编码序列的实时PCR引物和探针。在一些实施方案中，实时PCR引物和探针的序列分别为SEQ ID NO：1-2和SEQ ID NO：3。

在一些实施方案中，本发明的方面涉及一种核酸引物，所述核酸引物特异性地杂交至(例如，在严格杂交条件下)保守病毒序列(例如，保守JCV序列(例如，T抗原编码序列))。在一些实施方案中，核酸为或包括SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的序列。

在本文中更详细地描述本发明的这些和其它方面。

发明详述

在一些实施方案中，本发明的方面涉及检测患者样品中的JCV以便评价患者中PML的风险。虽然初次感染JCV经常无症状地发生在儿童期(Padgett&Walker,1973)，但JCV通常(可能通过病毒血症)散布于全身(Ikegaya等，2004)。虽然JCV感染在大多数受试者中是无症状的，但感染可能导致严重病状(像PML)并且甚至在一些受试者中导致死亡。对PML最敏感的受试者为免疫受损的受试者(例如，AIDS患者)或正在经受免疫抑制剂治疗的受试者，例如器官移植后或待治疗炎症相关病状(如多发性硬化症)(例如，使用那他珠单抗或其它免疫抑制药物)。

据认为在不存在PML的情况下，JCV主要持久存在于肾中，并且PML与脑中JCV的存在相关。因此，在一些实施方案中，本发明的方面涉及检测CSF中的JCV。然而，本发明的方法和组合物还可适用于检测尿、血液、肾脏组织或其它患者样品中的JCV。

一方面，本公开提供用于从脑脊髓液(CSF)样品分离核酸的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：将载体核酸和蛋白酶添加至CSF样品，孵育包含所述载体核酸和所述蛋白酶的样品，将孵育的样品施加至核酸结合柱，洗涤施加有所述样品的柱，以及将洗脱剂施加至所述柱，从而导致核酸的分离。

脑脊髓液为围绕并且保护脑和脊髓的流体。所述流体通常为含有蛋白质和白血细胞的透明液体。一般来说，通过腰椎穿刺(脊椎抽液)从受试者获得CSF。腰椎穿刺是对受试者来说不适的程序，并且腰椎穿刺术的数目应最小化。影响脑和/或中枢神经系统的多种病症(包括脑膜炎、脑肿瘤以及脑出血)可通过分析CSF来进行诊断。脑的病毒感染(如由JC病毒感染)可通过检测CSF中病毒DNA的存在和/或量化CSF中病毒DNA的量来进行诊断。因为CSF中病毒DNA(或病毒RNA)的量可能是低的，因此具有可精确检测甚至少量病毒的诊断技术是重要的。

分离核酸

一方面，本公开提供用于从CSF样品分离核酸的方法。在一些实施方案中，核酸为DNA。在一些实施方案中，从CSF中分离来自DNA病毒(例如，JCV)的DNA。应认识到，本文所描述的方法可以用于分离其它核酸(例如，来自其它病毒或者来自其它微生物或患者来源的DNA或RNA)。在一些实施方案中，核酸为人核酸(即，在人基因组中发现的)。在一些实施方案中，核酸为病毒核酸。在一些实施方案中，核酸为病毒DNA。在一些实施方案中，核酸为JC病毒DNA。在一些实施方案中，在应用本文所提供的分离方法之前，将核酸添加至CSF样品(即，“掺加”)(例如用作参考)。

一方面，本公开提供用于从CSF样品分离核酸的方法，所述方法使用来自可商购的核酸分离试剂盒(例如像QIAamp MinElute Virus Spin Kit(Cat#57704，Qiagen)和来自Qiagen、Promega以及Epicentre的其它试剂盒)的一种或多种组分。应认识到，还可以使用来自其它可商购的核酸试剂盒的组分来实践本文所公开的方法。

在一些实施方案中，从其中分离核酸的CSF样品的体积为0.5ml或更多、1ml或更多、1.5ml或更多、2ml或更多、2.5ml或更多、3ml或更多、5ml或更多或至少10ml或更多。在一些实施方案中，从其中分离核酸的CSF样品的体积为1ml。应认识到，1ml的样品大小高于通常用于从生物样品并且具体地说从CSF中分离核酸的样品大小(例如，200微升或更小)。根据本发明的一些方面，重要的是使用1ml或更多的CSF体积以便实现足够灵敏度(例如，以检测至少10拷贝的JCV核酸)。已经认识到，更小体积(小于1ml)不足以提供足够灵敏度和/或可重复性以确信地确定患者是否具有阳性PML诊断。

在一些实施方案中，将载体核酸添加至从其中分离核酸的CSF样品。添加载体核酸为待分离的核酸提供体积，从而使待分离的核酸在本文所提供方法的步骤之一过程中损失的可能性最小化。在一些实施方案中，载体核酸为RNA。一般来说，载体核酸的性质将取决于待分离(和分析)的核酸的性质。因此，如果待分离的核酸为DNA，那么载体核酸可以是RNA(并且反之亦然)。在完成分离方案后，可容易地去除(例如通过添加RNA酶)不再需要的载体核酸RNA。然而，待分析的核酸和载体核酸可具有相同性质，例如均为DNA。在这类情况下，载体核酸将通常具有与待分离(和分析)的核酸不同的大小，从而允许根据需要容易地分离两种核酸。

在一些实施方案中，CSF样品中载体核酸(例如，RNA)的所得浓度为5微克／ml或更小、4微克／ml或更小、3微克／ml或更小、2微克／ml或更小、1微克／ml或更小，或0.5微克／ml或更小。在一些实施方案中，CSF样品中载体核酸(例如，RNA)的所得浓度为2.8微克／ml或更小。如本文所用，所得浓度是指CSF样品中载体核酸的浓度。因此，可以较高浓度制备载体核酸并且将其稀释至CSF样品中。本文出人意料发现，本公开的方法中所使用的载体核酸的浓度(其低于通常使用的浓度)使得从CSF样品分离的核酸的产率增加。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括将蛋白酶添加至CSF样品。虽然CSF样品可能含有比其它生物样品(例如，血液)少的蛋白质，但是通过蛋白酶的作用去除蛋白质和多肽可增加从CSF样品分离的核酸的产率。用于从生物样品中去除蛋白质和多肽的蛋白酶通常为非特异性蛋白酶，如蛋白酶K和枯草杆菌蛋白酶。应认识到，可能需要添加另外组分或可能需要修改样品的组成，以允许蛋白酶的酶活性。因此，可添加包含特定量的盐(例如，NaCl或Mg盐)的缓冲液或pH缓冲液。另外，可能需要在特定温度下孵育样品以允许优化的酶条件。在蛋白酶反应发生后，可去除蛋白酶或使其失活。可例如通过添加蛋白酶抑制剂和／或添加蛋白酶辅助因子抑制剂和/或增加样品温度和／或改变缓冲条件(例如，通过添加乙醇)来实现失活。

在一些实施方案中，将载体核酸和蛋白酶添加至CSF样品。在一些实施方案中，在添加蛋白酶之前添加载体核酸。在一些实施方案中，在添加载体核酸之前添加蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶与载体核酸一起添加。可与蛋白酶和/或载体核酸一起、在添加蛋白酶和/或载体核酸之前或之后添加蛋白酶缓冲液。在一些实施方案中，可以将另外组分(如溶胞缓冲液)添加至CSF样品。这些另外组分包括溶菌酶和离液剂(例如，盐酸胍和脲)。在一些实施方案中，另外外组分为可商购的核酸分离试剂盒中的“溶胞缓冲液”。通常这些试剂盒中的“溶胞缓冲液”是所使用的第一缓冲液。在一些实施方案中，将来自QIAamp MinElute ViruS Spin Kit的缓冲液“AL”添加至CSF样品。

本文出人意料地发现在室温下孵育包含载体核酸和蛋白酶的CSF样品之后在高于室温的温度(例如，56℃)下的第二孵育步骤使得从CSF中分离核酸的产率增加。因此，在一些实施方案中，本文所公开的方法包括在室温下孵育包含载体核酸和蛋白酶的CSF样品的步骤，接着在高于室温的温度下的第二孵育步骤。在一些实施方案中，取决于所使用的酶制剂，高于室温的温度为30℃或更高、40℃或更高、50℃或更高、60℃或更高、70℃或更高、80℃或更高、90℃或更高、高达100℃。在一些实施方案中，高于室温的温度在50℃与60℃之间。在一些实施方案中，例如，如实施例中所描述，高于室温的温度为56℃。在一些实施方案中，高于室温的温度对应于蛋白酶在其下具有最大活性的温度。

在一些实施方案中，取决于所使用的酶制剂，孵育步骤为至少1分钟、至少2分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟、至少60分钟，或高达120分钟长。在室温下的孵育步骤与在高于室温的温度下的孵育步骤可具有相同的时间长度或可具有不同的时间长度。在一些实施方案中，例如，如实施例中所描述，在室温下的孵育步骤与在高于室温的温度下的孵育步骤均为15分钟长。

孵育包含载体核酸和蛋白酶的CSF样品之后，通过固相提取法(例如，基于柱的核酸纯化)来纯化样品。这些方法通常依赖于以下事实：核酸可取决于pH和所使用的缓冲液的盐含量结合至固相(二氧化硅或其它)，所述缓冲液可以是Tris-EDTA(TE)缓冲液或磷酸盐缓冲液。通常，可以与本发明的不同方面一起使用的核酸纯化方法包括：

将样品(例如，如本文所使用的脑脊髓液样品)添加至结合柱(或“旋转”柱)，并且核酸由于较低的pH(相对于柱上的硅烷醇基团)和结合溶液的盐浓度而结合，所述结合溶液可含有(例如)缓冲液、变性剂(如盐酸胍)、Triton

异丙醇以及pH指示剂；

用(例如)5mM KPO₄pH8.0或类似、80％乙醇(EtOH))洗涤柱；以及

用缓冲液或水洗脱核酸。

根据本发明的方面的方法可以包括将包含载体核酸和蛋白酶的CSF样品施加至核酸结合柱。核酸结合柱是本领域中已知的，并且包括但不限于基于二氧化硅的柱(参见例如，US5,234,809)和阴离子交换柱。在一些实施方案中，可在将CSF样品施加至柱之前将离液试剂和/或盐添加至CSF样品，以产生对CSF样品中的核酸结合至核酸结合柱(例如，基于二氧化硅的柱)来说最佳的条件。本文所使用的核酸结合柱不限于特定构型，并且包括基于珠粒的柱，核酸结合组分借以共价附接至柱的柱、通过重力起作用的柱以及通过真空操作起作用的柱。在一些实施方案中，核酸结合柱为可配合在台式离心机中的Eppendorf管大小的“微型柱”(例如，QIAampMinElute Virus Spin Kit或由(例如)Epicentre和Promega提供的其它试剂盒)。

在将CSF样品施加至核酸结合柱之后，可通过一种或多种洗涤缓冲液(例如，处于pH7.0左右或pH8.0左右的基于Tris的缓冲液)和/或乙醇等分试样洗涤柱。洗涤缓冲液的条件应使得核酸与核酸结合柱之间的键合／相互作用不被破坏，并且核酸保持结合至核酸结合柱。在一些实施方案中，用包含至少70％乙醇的缓冲液(例如，来自商业核酸分离试剂盒的“洗涤缓冲液”，例如像，QIAamp MinElute Virus Spin Kit的缓冲液AW2)洗涤柱。在一些实施方案中，在用“洗涤缓冲液”洗涤柱之后，进行包含乙醇的二次洗涤。

在一些实施方案中，核酸结合柱为“微型柱”。在一些实施方案中，可通过使柱(例如，在台式离心机中)旋转来去除洗涤物。本文出人意料地发现使柱以相对低的离心力旋转使得从CSF样品分离核酸的产率增加。在一些实施方案中，将微型柱以小于7000g、小于6000g、小于5000g、小于4000g、小于3000g、小于2000g或小于1000g的力离心以去除洗涤物。在一些实施方案中，将柱以4000g离心。在一些实施方案中，在以相对低的离心力去除洗涤物之后，随后将柱以高离心力离心以对柱进行干燥。

在将CSF样品施加至柱并且洗涤柱之后，将洗脱剂施加至柱以从柱收获核酸。洗脱剂为将溶解结合至核酸结合柱的核酸的缓冲液。洗脱剂包括水和磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，洗脱剂不含DNA酶和/或RNA酶。在一些实施方案中，洗脱剂还包含DNA酶和/或RNA酶抑制剂，和／或DNA酶和/或RNA酶辅助因子抑制剂。在一些实施方案中，洗脱剂包括微生物毒素(如叠氮化钠)以防止洗脱剂中的微生物生长。在一些实施方案中，洗脱剂为来自商业核酸分离试剂盒的“洗脱缓冲液”(例如，QIAampMinElute Virus Spin Kit的AVE缓冲液)。

施加至核酸结合柱的洗脱剂的体积通常为较大体积与较小体积之间的折衷，所述较大体积有助于从柱摄取较大百分比的核酸，但会导致分离的核酸的浓度较低，所述较小体积导致分离的核酸的浓度较高，但以不能溶解结合到柱的所有核酸为代价。在一些实施方案中，将1微升或更多、5微升或更多、10微升或更多、20微升或更多、30微升或更多、40微升或更多、50微升或更多、60微升或更多、70微升或更多、80微升或更多、90微升或更多、100微升或更多、200微升或更多或500微升或更多的洗脱剂体积施加至柱。在一些实施方案中，将30微升的洗脱剂施加至柱。

在一些实施方案中，允许洗脱剂在柱上孵育1分钟或更长、2分钟或更长、5分钟或更长、10分钟或更长、20分钟或更长、30分钟或更长，或60分钟或更长。在一些实施方案中，允许洗脱剂在柱上孵育5分钟。

在一些实施方案中，将相同洗脱剂施加至柱多次。因此，在一些实施方案中，将洗脱剂施加至柱、允许孵育并且将所述洗脱剂(现在包含核酸)从柱中去除(例如，通过离心)，并且随后将所述洗脱剂重新施加至柱，允许第二次孵育，并且第二次去除。在一些实施方案中，将相同洗脱剂施加至柱两次、三次、四次、高达五次或更多次。在一些实施方案中，将相同洗脱剂施加至柱两次。

在一些实施方案中，将30微升的洗脱剂施加至柱，允许孵育5分钟，从柱中去除(例如，通过离心)，重新施加至柱，允许再孵育5分钟并且从柱中去除。

一旦已经将洗脱剂(现在包含从CSF样品分离的核酸)从柱中去除，就可以在适当温度(例如，4℃-20℃)下储存所述洗脱剂和/或可以分析所述洗脱剂中的核酸(例如，测定序列和／或数量)。

核酸扩增

一方面，本公开提供用于测定样品中的核酸的量的方法。在一些实施方案中，核酸为DNA。在一些实施方案中，核酸为病毒核酸。在一些实施方案中，核酸为病毒DNA。在一些实施方案中，核酸为JC病毒DNA。在一些实施方案中，核酸是从CSF样品分离的。在一些实施方案中，核酸是通过本文所公开的任何方法从CSF样品分离的。在一些实施方案中，核酸为从CSF样品分离的JC病毒DNA。在一些实施方案中，核酸是通过以下方法从CSF样品分离的JC病毒DNA：将载体核酸和蛋白酶添加至CSF样品，孵育包含所述载体核酸和所述蛋白酶的样品，将孵育的样品施加至核酸结合柱，洗涤施加有所述样品的柱，并且将洗脱剂施加至所述柱。

然而，应认识到，本发明的方面(例如，纯化和／或扩增技术)可与任何适合的技术和/或用于结合和/或分离核酸(例如，从CSF中)的基质组合使用。

一方面，本公开提供用于测定样品中的核酸的量的方法，所述方法包括在样品上进行实时聚合酶链式反应(实时PCR)，其还被称为实时定量PCR。实时PCR测定样品中的病毒核酸的量的方法是已良好确立的(参见例如，McKay等，Real-time PCR in virology,Nucl.Acids Res.2002，20：1292)。简单地说，在实时PCR中，将可杂交至目标序列(例如，病毒DNA序列)的两个引物和核酸探针添加至样品。如果存在目标序列，那么所述序列将通过结合PCR引物和PCR反应而扩增。将通过由探针结合来检测／定量PCR核酸产物。通常，核酸探针包括报道元件如荧光标记(例如，6-羧基荧光素，缩写：FAM))和淬灭剂(例如，四甲基罗丹明，缩写：TAMRA)。http：／／en.wikipedia.org／wiki／Fluorescein在结合至PCR反应产物之前，将荧光标记淬灭并且没有观察到荧光。如果存在目标序列，那么探针将结合至PCR产生的序列拷贝(注意，如果存在靶标，那么探针还可结合至靶序列)。探针的结合将导致淬灭剂从荧光标记物理分离，从而产生荧光信号。在一些实施方案中，荧光标签由聚合酶(例如，Taq聚合酶)的5’核酸酶活性释放。信号强度将与存在的目标序列的量成比例，从而允许测定存在的目标序列的量(例如，拷贝数)。通常，量以具有已知量的序列的样品为基准。多个商业实体提供材料，包括“实体实验”组分，如聚合酶、试剂盒以及运行实时PCR实验的硬件。供应商包括Qiagen、Invitrogen、Applied Biosystems以及Bio-Rad。

一方面，本公开提供用于测定样品中的JC病毒DNA的量的方法，所述方法包括进行实时聚合酶链式反应。在一些实施方案中，实时PCR引物和探针针对JV病毒T抗原。在一些实施方案中，引物对应于核酸序列5’CCC TAT TCA GCA CTT TGT CC3’(SEQ ID NO：1)和5’TCA GAAGTA GTA AGG GCG TGG AG3’(SEQ ID NO：2)，并且探针序列对应于5’-AAA CAA GGG AAT TTC CCT GGC CCT CC-3’(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，探针荧光标记为FAM并且淬灭剂为TAMRA。在一些实施方案中，荧光标记位于探针的5’端，并且淬灭剂位于3’端。在一些实施方案中，探针为5’FAM-AAA CAA GGG AAT TTC CCT GGC CCTCC-TAMRA3(SEQ ID NO：3)。然而，应认识到，本公开还涵盖替代性荧光标记、淬灭剂和/或荧光标记和/或淬灭剂在探针序列上的替代性定位。

虽然先前已经使用JV病毒T抗原序列作为实时PCR的靶序列(参见Ryschkewitsch等，J0f Virological methods2004，121：217)，但是本文发现具有SEQ ID NO1和2的引物与具有SEQ ID NO：3的探针的组合提供优异结果。然而，在一些实施方案中，可使用一个或多个其它探针或引物(例如，靶向至JCV T抗原序列的那些)。

还应认识到，可使用其它基于扩增(例如，PCR等)、基于杂交、基于测序的检测技术和/或其它检测技术(例如，使用本文所描述的一个或多个引物或探针)。

核酸

一方面，本公开提供分离的核酸。在一些实施方案中，适用于检测JCV的核酸对于JCV具有特异性(例如，相对于BK病毒或可存在于生物样品中的其它病毒核酸)。在一些实施方案中，核酸与JCV序列互补，但是不与来自其它病毒的序列互补。在一些实施方案中，适用于检测JCV的核酸被设计来检测保守JCV区域(例如，核酸与保守JCV基因组区域互补，例如100％互补)，以便无论其它变体序列是否存在于JCV基因组中都能检测JCV的存在。在一些实施方案中，核酸为针对(例如，互补于，例如100％互补于)JC病毒T抗原编码序列的任一链的引物和探针。在一些实施方案中，核酸允许通过实时PCR测定样品中的JC病毒的量。在一些实施方案中，分离的核酸包含SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，分离的核酸包含SEQID NO：2。在一些实施方案中，分离的核酸包含SEQ IDNO：3。在一些实施方案中，分离的核酸由SEQ ID NO：1组成。在一些实施方案中，分离的核酸由SEQ ID NO：2组成。在一些实施方案中，分离的核酸由SEQ ID NO：3组成。

在一些实施方案中，分离的核酸是包含SEQ ID NO：1的核酸引物。在一些实施方案中，分离的核酸是包含SEQ ID NO：2的核酸引物。在一些实施方案中，分离的核酸是包含SEQ ID NO：3的核酸探针。在一些实施方案中，分离的核酸是由SEQ ID NO：1组成的核酸引物。在一些实施方案中，分离的核酸是由SEQ ID NO：2组成的核酸引物。在一些实施方案中，分离的核酸是由SEQ ID NO：3组成的核酸探针。本文所公开的分离的核酸可进一步具有一个或多个官能团(例如，荧光标记)。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO：3的核酸为包含荧光标记和淬灭剂的核酸探针。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO：3的核酸探针为探针5’FAM-AAACAA GGG AAT TTC CCT GGC CCT CC-TAMRA3(SEQ ID NO：3)。

试剂盒

一方面，本公开提供用于从脑脊髓液(CSF)样品分离核酸的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括蛋白酶、载体核酸、核酸结合柱以及使用说明书。

在一些实施方案中，试剂盒进一步包括针对JC病毒T抗原的实时PCR引物和探针。在一些实施方案中，实时PCR引物和探针的序列分别为SEQID NO：1-2和SEQ ID NO：3。

在一些实施方案中，本发明涉及用于分离和或检测来自患者(例如，来自人CSF样品)的样品中JCV的存在的试剂盒。因此，本发明的方面涉及试剂盒，其含有用于分离和制备核酸的一种或多种组分和／或用于测定具有特定序列的核酸的存在和／或量的一种或多种组分。在一些实施方案中，试剂盒含有一种或多种缓冲液和/或用于从生物样品(例如，CSF样品)中分离JCV颗粒和/或JCV核酸的其它溶液，以及任选地用于进行一个或多个分离步骤的说明书。在一些实施方案中，试剂盒含有用于检测样品中的JCV核酸的一种或多种试剂。例如，试剂盒可包括具有特定序列的核酸。在一些实施方案中，可作为干燥粉末(例如，冻干制剂)提供核酸(例如，核酸引物)。在一些实施方案中，核酸可提供于溶液中。溶液可以是稀释剂、缓冲液、盐溶液、水溶液或其它溶液，包括(例如)水。溶液可含有已知(例如，预定)浓度的核酸。试剂盒可含有用于将核酸溶液稀释至为一种或多种特定成分所限定的一个或多个适当浓度的说明书，将对所述特定成分做标记用于后续验证或质量控制目的。在一些实施方案中，试剂盒可含有一种或多种寡核苷酸(例如，PCR引物)，其可以用于检测生物样品(例如，CSF样品)中具有特定序列的核酸的存在。试剂盒还可含有一种或多种酶和/或用于进行本发明的核酸分离、检测和/或定量测定的其它试剂。在一些实施方案中，试剂盒可含有参考序列和／或具有特定目标序列的参考核酸。还可在试剂盒中提供参考水平(例如，关于参考水平的信息)和／或含有处于参考水平的核酸的参考样品。所述信息和/或酸可以用作对照。在一些实施方案中，试剂盒还可包括用于从患者样品(例如，CSF样品)中分离核酸(例如，JCV核酸)的说明书。

在一些实施方案中，试剂盒包括至少一个容器装置，其具有安置在其中的本文所描述的一种或多种试剂(例如，洗涤缓冲液、溶胞缓冲液、蛋白酶、洗脱缓冲液等)和/或核酸(例如，PCR引物、检测探针等)。在某些实施方案中，试剂盒进一步包括包含一种或多种其它试剂或探针的其它容器。试剂盒还可含有检测试剂。在一些实施方案中，试剂盒中的一种或多种探针可以被标记。在一些实施方案中，试剂盒可包括用于标记探针(例如，在与JCV核酸接触之前或之后)的试剂。检测试剂的实例包括但不限于：放射性标记、荧光标记、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)以及亲和标记(例如，生物素、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)。

详细地说，分隔式试剂盒包括任何试剂盒，其中试剂包含在单独的容器中。所述容器包括小玻璃容器、塑料容器，或塑料或纸的条带。所述容器允许试剂从一个隔室有效转移至另一个隔室，以使得样品和试剂不会交叉污染并且可以将每个容器的药剂或溶液以定量方式从一个隔室添加至另一个。在一些实施方案中，试剂盒可包括将接受测试样品的容器、含有测定中所使用的探针或引物的容器、含有洗涤试剂(如磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲液及类似物)的容器以及含有用于检测杂交探针、扩增产物或类似物的试剂的容器。

通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例决不应当被解释为进一步的限制。整个本申请中所引用的所有文献(包括参考文献、发布的专利、公布的专利申请以及共同未决的专利申请)的全部内容特此以引用的方式明确并入，特别是对于上文参考的教义来说。

实施例

实施例1：从脑脊髓液(CSF)中提取DNA

材料和方法

-对QIAamp MinElute Virus Spin Kit(Cat#57704，QIAGEN)方案进行修改用于处理人CSF样品。以下缓冲液用于DNA提取

-通过将30mL乙醇(96％-100％)添加至含有13mL缓冲液AW2浓缩物的瓶中并且充分混合来制备缓冲液AW2。将缓冲液储存在环境温度下。

-通过将1.4mL缓冲液AVE添加至冻干QIAGEN蛋白酶的瓶中并且轻柔地混合来制备QIAGEN蛋白酶。将蛋白酶储存在2℃-8℃下。

-载体RNA溶液(1μg／μL)：通过将310μL缓冲液AVE添加至冻干载体RNA的管中以制得1μg／μL溶液并且通过脉冲涡旋进行混合来制备。将载体RNA储存在-20+10℃下并且不经受多于三次冻融。缓冲液AL中的载体RNA的最终浓度为5.6μg／mL。例如，对于n样品，将[(1.1)×(5.6)×(n)]μL的载体RNA溶液添加至[(1.1)×(n)]mL缓冲液AL。通过轻柔倒置来混合试剂并且在制备当天使用。

DNA提取

将冷冻的CSF融化至室温并且以5000g离心5分钟。离心之后，用移液管将1000μL的CSF吸移至15mL离心管中。将QIAGEN蛋白酶(125μL)和AL缓冲液-载体RNA溶液(5.6μg／mL，1000μL)添加至CSF。

将样品涡旋15秒并且在室温下孵育15分钟，随后在56℃下在水浴中孵育15分钟。

孵育之后，将1250μL乙醇(96％-100％)添加至样品并且通过脉冲涡旋15秒充分混合。随后将溶胞产物在室温(15℃-25℃)下孵育7分钟。

通过将全部溶胞产物施加至QIAamp Minelute柱中，使用QIAvac24Plus真空歧管(Cat#19413，QIAGEN)来处理溶胞产物。如果需要，那么多次施加用于施加全部溶胞产物。在结合之后，用500μL缓冲液AW2洗涤柱并且以4000g离心1分钟，随后用500μL乙醇(96％-100％)洗涤并且以4000g离心1分钟。

通过以13000g离心3分钟来干燥QIAamp Minelute柱，随后在柱的盖子关闭的情况下，以13000g离心2.5分钟。

当柱干燥时，将其放置在干净的不合DNA酶的微离心管中，并且将30μL缓冲液AVE施加至膜的中心并且孵育5分钟。孵育之后，将管以全速离心1分钟。为了增加所洗脱的DNA的量，将洗脱物从管中去除，并且重新施加至膜的中心，随后孵育5分钟并且以全速离心1分钟。

提取之后，1μL DNA用于DNA定量并且储存20μL用于PCR分析。

实施例2：用于JCVDNA定量的实时PCR测定

材料和方法

针对JC病毒基因组的T抗原基因的保守区域设计引物和探针，并且进行BLAST搜索以确保交叉反应性。引物和探针的序列如下：

使用ABI7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)来进行Taqman实时定量PCR。使用Taqman通用PCR主混合物(Applied Biosystems)来运行实时PCR，并且根据下表来制备各反应：

表1

对于每个反应，在

Optical96孔反应板(Cat#N8010560，Applied Biosystems)上将40μL的以上主混合物添加至10μL DNA洗脱物，并且根据以下步骤使其经受PCR分析：

1.50℃持续2分钟-1个循环

2.95℃持续10分钟-1个循环

3.95℃持续15秒；60℃持续1分钟-50个循环

使用掺加至人CSF中的JC病毒(Cat#VR-1583，ATCC)制备在10-10⁷拷贝／mL范围内变化的标准曲线，所述JC病毒已使用优化的DNA提取程序提取并且一式两份进行测试。每次运行还包括由经受相同提取过程的未被掺加的CSF组成的阴性对照。使用ABI SDS软件通过从标准曲线外推来对样品中绝对拷贝数进行定量。所有样品和标准一式两份进行测试并且来自两个孔的平均结果报道为拷贝／mL。

基于初步测定进展，将检测限(LOD)确定为10拷贝／mL并且动态范围为10-107拷贝／mL。针对紧密相关的BK多瘤病毒来评价测定的特异性并且没有观察到交叉反应性。

实施例1的方法的可重复性在下表中示出。

表2：实施例1的方法的可重复性

Ct：在实时PCR测定中，通过荧光信号的积累来检测阳性反应。Ct(循环阈值)定义为荧光信号超越阈值(即超过背景水平)所需的循环数。Ct水平与样品中的靶核酸的量成反比(即，Ct水平越低，样品中的靶核酸的量越大)。

实施例1的方法的特异性在下表中示出。

表3：实施例1的方法的JC病毒检测的特异性

针对5000拷贝／mL的不同病毒质粒DNA±5000拷贝／mL JCV DNA来评估引物／探针的特异性

实施例3：比较

将实施例1中所描述的方法的结果与QIAamp MinElute Virus SpinKit(Cat#57704，Qiagen)所提供的“标准”方案中所描述的方法进行比较。参见(例如)DNA Mini Kit手册的第59-60页和QIAamp MinElute VirusSpin Kit手册的第19-21页。将不同量的JC病毒DNA拷贝添加至CSF样品，并且使用“标准”方案和实施例1中所描述的方案来分离DNA。使用实施例2中所描述的RT-PCR方案来测定包含分离的DNA的样品中的JC病毒DNA的拷贝数。

“标准”提取方法产生500拷贝／mL的测定灵敏度。实施例1中所描述的方法产生10拷贝／mL的检测。(参见下表)

表4：实施例1的方法与标准方案的比较

等效物

认为前述书面说明书足以使本领域的技术人员能够实践本发明。本发明的范围不受所提供的实施例限制，因为所述实施例意图作为本发明的一个方面的单个说明，并且其它功能等效的实施方案在本发明的范围内。除本文所示出和描述的那些之外，本发明的各种修改由上述描述将变得对本领域的技术人员显而易见并且属于随附权利要求的范围。本发明的优点和目的不必由本发明的每个实施方案涵盖。

整个本申请中所引用的所有参考文献、专利以及公布的专利申请的内容均以引用的方式整体并入本文，尤其对于本文所参考的用途或主题来说。

Claims (25)

1.一种用于从脑脊髓液(CSF)样品分离核酸的方法，所述方法包括：

将载体核酸和蛋白酶添加至CSF样品，

孵育包含所述载体核酸和所述蛋白酶的样品，

将孵育的样品施加至核酸结合柱，

洗涤施加有所述样品的所述柱，以及

将洗脱剂施加至所述柱，从而导致所述核酸的分离。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述CSF样品的体积为至少1ml。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述载体核酸为载体RNA。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述CSF样品中的所述载体RNA的所得浓度为2.8微克／ml或更小。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中孵育所述样品包括在室温(RT)下孵育所述样品的第一步骤和在高于RT的温度下孵育所述样品的第二步骤。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述孵育步骤为15分钟长。

7.如权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述高于RT的温度为56℃。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中洗涤所述柱包括将洗涤缓冲液添加至所述柱并且以4000g的离心力使所述柱旋转。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中施加洗脱剂包括将所述洗脱剂施加至所述柱至少两次。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中将所述洗脱剂在所述柱上孵育5分钟。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中施加30微升的洗脱剂。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述CSF样品中的所述核酸为DNA。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述DNA为病毒DNA。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述病毒DNA为JC病毒DNA。

15.如权利要求14所述的方法，其进一步包括进行实时聚合酶链式反应(实时PCR)来测定JC病毒DNA的量。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述实时PCR引物和探针针对所述JC病毒T抗原。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述实时PCR引物和探针的序列分别为SEQ ID NO：1-2和SEQ ID NO：3。

18.一种用于测定样品中的JC病毒DNA的量的方法，所述方法包括：

在所述样品上进行实时PCR，其中所述实时PCR引物和探针针对所述JC病毒T抗原。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述实时PCR引物和探针的序列分别为SEQ ID NO：1-2和SEQ ID NO：3。

20.一种用于从脑脊髓液(CSF)样品分离核酸的试剂盒，所述试剂盒包括蛋白酶、载体核酸、核酸结合柱以及使用说明书。

21.如权利要求20所述的试剂盒，其进一步包括针对所述JC病毒T抗原的实时PCR引物和探针。

22.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述实时PCR引物和探针的序列分别为SEQ ID NO：1-2和SEQ ID NO：3。

23.一种核酸引物，其包含SEQ ID NO：1。

24.一种核酸引物，其包含SEQ ID NO：2。

25.一种核酸探针，其包含SEQ ID NO：3。