JP2000279199A - 血清又は血漿からｄｎａを調製するための改良法 - Google Patents
血清又は血漿からｄｎａを調製するための改良法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】血清又は血漿からＤＮＡを調製する方法。
【解決手段】血清又は血漿にアルカリを接触させてアル
カリ化された血清又は血漿を得、当該アルカリ化された
血清又は血漿を約１００〜約１１０℃で約５〜約２０分
間加熱し、当該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿
を遠心分離することにより、ＤＮＡを含有する上清を
得、当該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を室
温、すなわち約２５℃まで冷却し、そして当該ＤＮＡを
含有する上清を回収することを特徴とする、血清又は血
漿からＤＮＡを抽出する方法、また、血清又は血漿にお
いてＤＮＡを含有する微生物を検出する方法。
カリ化された血清又は血漿を得、当該アルカリ化された
血清又は血漿を約１００〜約１１０℃で約５〜約２０分
間加熱し、当該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿
を遠心分離することにより、ＤＮＡを含有する上清を
得、当該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を室
温、すなわち約２５℃まで冷却し、そして当該ＤＮＡを
含有する上清を回収することを特徴とする、血清又は血
漿からＤＮＡを抽出する方法、また、血清又は血漿にお
いてＤＮＡを含有する微生物を検出する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は血清又は血漿から、
特に増幅反応における標的として使用するためのＤＮＡ
を調製する方法に関する。
特に増幅反応における標的として使用するためのＤＮＡ
を調製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸の増幅及び検出の領域における技術
の進歩は急速であり、特に感染性疾患、癌及び遺伝的疾
患を早期に検出する市販の診断テストに関するものがそ
うである。現在、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法の
ような微量の核酸を増幅するための高度で巧妙な技法が
周知である（米国特許第４，６８３，１９５号、同第
４，６８３，２０２号及び同第４，９６５，１８８号明
細書参照）。ＰＣＲの感度が固有であること、すなわ
ち、極低濃度の標的ＤＮＡを増幅できることは、ＰＣＲ
産物の低濃度キャリオーバーや試料間の汚染が偽陽性の
結果をもたらしうることを意味する。とりわけ、キャリ
オーバー及び試料汚染は、処理に際して必要とされる試
料の操作回数の関するとなる。したがって、試料が環境
に晒される工程数を最小限にした簡素な手順が切望され
ている。
の進歩は急速であり、特に感染性疾患、癌及び遺伝的疾
患を早期に検出する市販の診断テストに関するものがそ
うである。現在、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法の
ような微量の核酸を増幅するための高度で巧妙な技法が
周知である（米国特許第４，６８３，１９５号、同第
４，６８３，２０２号及び同第４，９６５，１８８号明
細書参照）。ＰＣＲの感度が固有であること、すなわ
ち、極低濃度の標的ＤＮＡを増幅できることは、ＰＣＲ
産物の低濃度キャリオーバーや試料間の汚染が偽陽性の
結果をもたらしうることを意味する。とりわけ、キャリ
オーバー及び試料汚染は、処理に際して必要とされる試
料の操作回数の関するとなる。したがって、試料が環境
に晒される工程数を最小限にした簡素な手順が切望され
ている。
【０００３】従来、感染性ヒトサイトメガロウイルス
（ＨＣＭＶ）によるウイルス血症のＰＣＲ同定並びに他
のウイルス及び細菌の同定が、全血から得られた周辺血
液白血球（ＷＢＣ）について行われている。通常、全血
からＷＢＣを分離することは、ＷＢＣからＨＣＭＶ Ｄ
ＮＡを抽出する前に必要とされる。この分離のための手
順には、デキストラン溶液中での赤血球沈降（Rasmusse
n ら、J. Infect. Dis.171:177-82, 1995）、塩化アン
モニウム溶液による差別的溶解（米国特許第５，７０
２，８８４号、Ekeze ら）又は市販の手順の利用（例、
Becton-Dickinson製の CPT-Vautainer（商標）管）が含
まれる。典型的に、これらの手順には、増幅の潜在的阻
害剤を除去することとなる洗浄工程が含まれ、別法とし
て、ＷＢＣの単離は、典型的には血漿又は血清中に高濃
度で存在するこれらの阻害剤を除去するのに役立つ。
（ＨＣＭＶ）によるウイルス血症のＰＣＲ同定並びに他
のウイルス及び細菌の同定が、全血から得られた周辺血
液白血球（ＷＢＣ）について行われている。通常、全血
からＷＢＣを分離することは、ＷＢＣからＨＣＭＶ Ｄ
ＮＡを抽出する前に必要とされる。この分離のための手
順には、デキストラン溶液中での赤血球沈降（Rasmusse
n ら、J. Infect. Dis.171:177-82, 1995）、塩化アン
モニウム溶液による差別的溶解（米国特許第５，７０
２，８８４号、Ekeze ら）又は市販の手順の利用（例、
Becton-Dickinson製の CPT-Vautainer（商標）管）が含
まれる。典型的に、これらの手順には、増幅の潜在的阻
害剤を除去することとなる洗浄工程が含まれ、別法とし
て、ＷＢＣの単離は、典型的には血漿又は血清中に高濃
度で存在するこれらの阻害剤を除去するのに役立つ。
【０００４】ＷＢＣを単離したら、それらを溶解し、そ
のＤＮＡを抽出する。これには、例えば、ＷＢＣの煮
沸、超音波処理もしくは凍結融解のような手順又はタン
パク質分解酵素及び／もしくは界面活性剤を使用して細
胞を溶解しＤＮＡを抽出する手順が含まれる。ＤＮＡ抽
出法にはアルカリ溶解工程が含まれる場合もある（米国
特許第５，６３９，５９９号）。さらに、潜在的な阻害
剤を含まない精製ＤＮＡを確実に得るべく、一層精密な
抽出／精製法が、例えば、ガラスビーズの使用（Gene C
lean II kits, Bio 101 Inc.）、フェノール−クロロホ
ルム抽出法、ポリマー捕捉法（米国特許第５，５８２，
９８８号）、スピンカラム吸着法（QiagenQIAamp kit
s）、その他市販のＤＮＡ単離キット（Puregene, Gentr
a Systems Inc.)により行われている。
のＤＮＡを抽出する。これには、例えば、ＷＢＣの煮
沸、超音波処理もしくは凍結融解のような手順又はタン
パク質分解酵素及び／もしくは界面活性剤を使用して細
胞を溶解しＤＮＡを抽出する手順が含まれる。ＤＮＡ抽
出法にはアルカリ溶解工程が含まれる場合もある（米国
特許第５，６３９，５９９号）。さらに、潜在的な阻害
剤を含まない精製ＤＮＡを確実に得るべく、一層精密な
抽出／精製法が、例えば、ガラスビーズの使用（Gene C
lean II kits, Bio 101 Inc.）、フェノール−クロロホ
ルム抽出法、ポリマー捕捉法（米国特許第５，５８２，
９８８号）、スピンカラム吸着法（QiagenQIAamp kit
s）、その他市販のＤＮＡ単離キット（Puregene, Gentr
a Systems Inc.)により行われている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ＷＢＣ調製物から潜在
的な阻害剤を洗浄又は除去するのに役立つＷＢＣの単
離、溶解に用いられる手順は、血漿や血清には使用でき
ないことに着目すべきである。多量の内因性生化学物質
及び消費薬剤、薬剤代謝物、等が存在し、しかも血清や
血漿中では非常に濃縮されているので、当該技術分野で
は、血清や血漿に使用でき、潜在的な阻害剤を除去す
る、或いはこれを無効なものにする、迅速な確固たる手
順が必要とされている。
的な阻害剤を洗浄又は除去するのに役立つＷＢＣの単
離、溶解に用いられる手順は、血漿や血清には使用でき
ないことに着目すべきである。多量の内因性生化学物質
及び消費薬剤、薬剤代謝物、等が存在し、しかも血清や
血漿中では非常に濃縮されているので、当該技術分野で
は、血清や血漿に使用でき、潜在的な阻害剤を除去す
る、或いはこれを無効なものにする、迅速な確固たる手
順が必要とされている。
【０００６】感染個体における細胞外ＨＣＭＶ核酸は血
漿及び血清に存在する。血清及び血漿は、ＰＣＲを利用
してＨＣＭＶ核酸を検出するための試料の選択肢として
受け入れられつつある。一般に、標的ＤＮＡは遊離ＤＮ
Ａとしては存在せず、むしろＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパ
ク質の会合した複合体として存在する。ＤＮＡは、当該
複合体から抽出され且つ変性されなければ、増幅に利用
することはできない。血清及び血漿の試料は、典型的に
は熱、界面活性剤に晒され、そしてプロテアーゼで処理
される。標的ＤＮＡの抽出には、先にＷＢＣについて説
明したような追加的な精密なプロトコルを採用する場合
も多い（Spector et al., J. Clin. Microbiol. 30:235
9-65, 1992; Nolte et al., J. Clin. Microbiol. 33:1
263-66,1995; Wolf et al., Transplantation 56:330-
4, 1993; Patel et al., J. Clin. Microbiol.32:1431-
4, 1994)。アルカリ処理も使用されている。しかしなが
ら、このアルカリ処理は典型的には高濃度ＮａＯＨ及び
その後の中和工程を必要とする（Hansen et al., J. In
fect. Dis. 170:1271-4, 1994)。このように、当該技術
分野では、ＰＣＲ増幅法に適合する血清及び血漿からＤ
ＮＡを抽出するための迅速且つ効率的な方法が必要とさ
れている。
漿及び血清に存在する。血清及び血漿は、ＰＣＲを利用
してＨＣＭＶ核酸を検出するための試料の選択肢として
受け入れられつつある。一般に、標的ＤＮＡは遊離ＤＮ
Ａとしては存在せず、むしろＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパ
ク質の会合した複合体として存在する。ＤＮＡは、当該
複合体から抽出され且つ変性されなければ、増幅に利用
することはできない。血清及び血漿の試料は、典型的に
は熱、界面活性剤に晒され、そしてプロテアーゼで処理
される。標的ＤＮＡの抽出には、先にＷＢＣについて説
明したような追加的な精密なプロトコルを採用する場合
も多い（Spector et al., J. Clin. Microbiol. 30:235
9-65, 1992; Nolte et al., J. Clin. Microbiol. 33:1
263-66,1995; Wolf et al., Transplantation 56:330-
4, 1993; Patel et al., J. Clin. Microbiol.32:1431-
4, 1994)。アルカリ処理も使用されている。しかしなが
ら、このアルカリ処理は典型的には高濃度ＮａＯＨ及び
その後の中和工程を必要とする（Hansen et al., J. In
fect. Dis. 170:1271-4, 1994)。このように、当該技術
分野では、ＰＣＲ増幅法に適合する血清及び血漿からＤ
ＮＡを抽出するための迅速且つ効率的な方法が必要とさ
れている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、血清又は血漿
の試料からＤＮＡを抽出するための方法を提供するもの
である。本法は、（１）血清又は血漿にアルカリを接触
させてアルカリ化された血清又は血漿を得、（２）当該
アルカリ化された血清又は血漿を約１００〜約１１０℃
の範囲の温度に約５〜約２０分の時間加熱し、（３）当
該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を遠心分離
し、そして（４）当該ＤＮＡを含有する上清を回収す
る、ことを特徴とする。好ましい態様では、当該加熱後
のアルカリ化された血清又は血漿を遠心分離する前に、
工程（２）で得られた加熱後のアルカリ化された血清又
は血漿を、工程（３）の遠心分離の前に、室温、すなわ
ち約２５℃まで冷却する。
の試料からＤＮＡを抽出するための方法を提供するもの
である。本法は、（１）血清又は血漿にアルカリを接触
させてアルカリ化された血清又は血漿を得、（２）当該
アルカリ化された血清又は血漿を約１００〜約１１０℃
の範囲の温度に約５〜約２０分の時間加熱し、（３）当
該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を遠心分離
し、そして（４）当該ＤＮＡを含有する上清を回収す
る、ことを特徴とする。好ましい態様では、当該加熱後
のアルカリ化された血清又は血漿を遠心分離する前に、
工程（２）で得られた加熱後のアルカリ化された血清又
は血漿を、工程（３）の遠心分離の前に、室温、すなわ
ち約２５℃まで冷却する。
【０００８】別の態様では、本発明は、血清又は血漿に
含まれるＤＮＡ含有微生物、例えば、ヒトサイトメガロ
ウイルス（ＨＣＭＶ）、の存在を検出するための方法を
提供するものである。本法は、（１）血清又は血漿にア
ルカリを接触させてアルカリ化された血清又は血漿を
得、（２）当該アルカリ化された血清又は血漿を約１０
０〜約１１０℃の範囲の温度に約５〜約２０分の時間加
熱し、（３）当該加熱後のアルカリ化された血清又は血
漿を遠心分離し、（４）当該ＤＮＡを含有する上清を回
収し、（５）当該上清中の当該ＤＮＡを、当該微生物の
ＤＮＡに含まれる配列を認識するオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて増幅することにより、当該微生物に特
異的な増幅産物を得、そして（６）当該増幅産物を検出
する、ことを特徴とする。本法では、当該微生物に特異
的な増幅産物の検出が、当該血清又は血漿中に当該微生
物が存在していることを示すものである。
含まれるＤＮＡ含有微生物、例えば、ヒトサイトメガロ
ウイルス（ＨＣＭＶ）、の存在を検出するための方法を
提供するものである。本法は、（１）血清又は血漿にア
ルカリを接触させてアルカリ化された血清又は血漿を
得、（２）当該アルカリ化された血清又は血漿を約１０
０〜約１１０℃の範囲の温度に約５〜約２０分の時間加
熱し、（３）当該加熱後のアルカリ化された血清又は血
漿を遠心分離し、（４）当該ＤＮＡを含有する上清を回
収し、（５）当該上清中の当該ＤＮＡを、当該微生物の
ＤＮＡに含まれる配列を認識するオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて増幅することにより、当該微生物に特
異的な増幅産物を得、そして（６）当該増幅産物を検出
する、ことを特徴とする。本法では、当該微生物に特異
的な増幅産物の検出が、当該血清又は血漿中に当該微生
物が存在していることを示すものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明は、血清や血漿の試料から
ＤＮＡを抽出するための簡便、迅速且つ効果的な方法で
あって、さらなる操作をしなくても後続の検出アッセイ
に適したＤＮＡ調製物が得られる方法を提供するもので
ある。本法は、（１）血清又は血漿にアルカリを接触さ
せてアルカリ化された血清又は血漿を得、（２）当該ア
ルカリ化された血清又は血漿を約１００〜約１１０℃の
範囲の温度に約５〜約２０分の時間加熱し、（３）当該
加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を遠心分離し、
そして（４）当該ＤＮＡを含有する上清を回収する、と
いう各工程を含む。
ＤＮＡを抽出するための簡便、迅速且つ効果的な方法で
あって、さらなる操作をしなくても後続の検出アッセイ
に適したＤＮＡ調製物が得られる方法を提供するもので
ある。本法は、（１）血清又は血漿にアルカリを接触さ
せてアルカリ化された血清又は血漿を得、（２）当該ア
ルカリ化された血清又は血漿を約１００〜約１１０℃の
範囲の温度に約５〜約２０分の時間加熱し、（３）当該
加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を遠心分離し、
そして（４）当該ＤＮＡを含有する上清を回収する、と
いう各工程を含む。
【００１０】加熱工程の後であるが遠心分離工程の前
に、当該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を、室
温、すなわち約２５℃まで冷却する。冷却は、受動的で
あること、すなわち、単に室内空気との平衡によること
であってもよいし、能動的であること、すなわち、加熱
後のアルカリ化された血清又は血漿を、その温度が室温
に達するまで冷蔵し、氷上に配置し、又は水浴中に配置
してもよい。
に、当該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を、室
温、すなわち約２５℃まで冷却する。冷却は、受動的で
あること、すなわち、単に室内空気との平衡によること
であってもよいし、能動的であること、すなわち、加熱
後のアルカリ化された血清又は血漿を、その温度が室温
に達するまで冷蔵し、氷上に配置し、又は水浴中に配置
してもよい。
【００１１】本発明を実施する際に適したアルカリに
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモ
ニウム又はこれらいずれかの混合物が含まれるが、これ
らに限定はされない。水酸化ナトリウムの使用が好まし
い。工程（１）で調製された混合物中のアルカリの最終
濃度は約１０〜約９０ｍＭの範囲、最も好ましくは約１
５〜約５０ｍＭの範囲である。特にアルカリ濃度を約２
０ｍＭとすることに着目される。好ましい方法は、１体
積部の血清又は血漿に対して約４体積部の約２５ｍＭの
アルカリ水溶液を混合した混合物を形成するというもの
である。アルカリ化された血清又は血漿を加熱する温度
は約１０５℃とすることが好ましく、またその時間は約
５分とすることが好ましい。遠心分離工程は周囲温度に
おいて約１６，０００×ｇで約２分間行うことが好まし
い。
は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモ
ニウム又はこれらいずれかの混合物が含まれるが、これ
らに限定はされない。水酸化ナトリウムの使用が好まし
い。工程（１）で調製された混合物中のアルカリの最終
濃度は約１０〜約９０ｍＭの範囲、最も好ましくは約１
５〜約５０ｍＭの範囲である。特にアルカリ濃度を約２
０ｍＭとすることに着目される。好ましい方法は、１体
積部の血清又は血漿に対して約４体積部の約２５ｍＭの
アルカリ水溶液を混合した混合物を形成するというもの
である。アルカリ化された血清又は血漿を加熱する温度
は約１０５℃とすることが好ましく、またその時間は約
５分とすることが好ましい。遠心分離工程は周囲温度に
おいて約１６，０００×ｇで約２分間行うことが好まし
い。
【００１２】遠心分離後の混合物から回収された上清
は、ＰＣＲ増幅混合物に直接添加することができる。し
かしながら、その上清を、所望により、ＰＣＲ混合物に
添加する前に、さらに処理又は試薬添加することにより
変性させてもよい。本発明によるアルカリ処理は、ＰＣ
Ｒ阻害剤を不活性化し、そしてタンパク質、特に標的Ｄ
ＮＡを増幅不可能になるまで分解しうるヌクレアーゼを
変性させるのに役立つ。また、ＤＮＡを変性し、増幅プ
ライマーとハイブリダイズしやすくなるように、すなわ
ちＰＣＲ増幅を促進するのにも役立つ。さらに、本法の
簡便さにより、試料間汚染やＰＣＲキャリオーバーの可
能性が大幅に減少する。また、核酸を単離、精製するた
めに日常的に用いられる高価で往々にして不安定な材料
を使う必要もなくなる。
は、ＰＣＲ増幅混合物に直接添加することができる。し
かしながら、その上清を、所望により、ＰＣＲ混合物に
添加する前に、さらに処理又は試薬添加することにより
変性させてもよい。本発明によるアルカリ処理は、ＰＣ
Ｒ阻害剤を不活性化し、そしてタンパク質、特に標的Ｄ
ＮＡを増幅不可能になるまで分解しうるヌクレアーゼを
変性させるのに役立つ。また、ＤＮＡを変性し、増幅プ
ライマーとハイブリダイズしやすくなるように、すなわ
ちＰＣＲ増幅を促進するのにも役立つ。さらに、本法の
簡便さにより、試料間汚染やＰＣＲキャリオーバーの可
能性が大幅に減少する。また、核酸を単離、精製するた
めに日常的に用いられる高価で往々にして不安定な材料
を使う必要もなくなる。
【００１３】本発明は、診断アッセイ、特にＤＮＡウイ
ルス、例えば、サイトメガロウイルス、単純性疱疹性ウ
イルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイル
スその他の任意の血液中のウイルス、を検出するアッセ
イのためのＤＮＡ試料を調製するのに有用である。この
ＤＮＡ調製物を使用できる検出方法には、例えば、ポリ
メラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、等をはじめとす
るハイブリダイゼーションが関与する任意の方法が含ま
れるが、これに限定はされない。このように、本発明
は、被験体の血清又は血漿をアルカリ化し、アルカリ化
された血清又は血漿を約１００〜約１１０℃の範囲の温
度に約５〜約２０分の時間加熱し、遠心分離してＤＮＡ
を含有する上清を得、その上清を回収し、上清中のＤＮ
ＡをそのＤＮＡ含有微生物のＤＮＡに特異的なプライマ
ーを用いて増幅することによりその微生物に特異的な増
幅産物を得、その後増幅産物を検出する各工程を含み、
その増幅産物の存在が当該被験体の血液又は血清に当該
微生物が存在していることを示すこととなる、ＤＮＡ含
有微生物を検出するための方法を包含する。
ルス、例えば、サイトメガロウイルス、単純性疱疹性ウ
イルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイル
スその他の任意の血液中のウイルス、を検出するアッセ
イのためのＤＮＡ試料を調製するのに有用である。この
ＤＮＡ調製物を使用できる検出方法には、例えば、ポリ
メラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、等をはじめとす
るハイブリダイゼーションが関与する任意の方法が含ま
れるが、これに限定はされない。このように、本発明
は、被験体の血清又は血漿をアルカリ化し、アルカリ化
された血清又は血漿を約１００〜約１１０℃の範囲の温
度に約５〜約２０分の時間加熱し、遠心分離してＤＮＡ
を含有する上清を得、その上清を回収し、上清中のＤＮ
ＡをそのＤＮＡ含有微生物のＤＮＡに特異的なプライマ
ーを用いて増幅することによりその微生物に特異的な増
幅産物を得、その後増幅産物を検出する各工程を含み、
その増幅産物の存在が当該被験体の血液又は血清に当該
微生物が存在していることを示すこととなる、ＤＮＡ含
有微生物を検出するための方法を包含する。
【００１４】
【実施例】以下の実施例は本発明を例示するものであっ
て、これを限定するものではない。 方法： １．血清及び血漿試料 血漿を得るためには、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）又は他の抗凝固剤、例えば、ヘパリン及びオキサレ
ートを含有するVacutainer（商標）管に全血試料を集
め、また血清を得るためには抗凝固剤を使用せずに全血
試料を集めた。 ２．試料調製 スクリューキャップ式微小遠心分離管において１μＬ当
たり内部陽性対照（ＩＰＣ）プラスミド標的ＤＮＡ二本
鎖１．６７コピーと０．３３４μｇ／μＬのウシ胸腺Ｄ
ＮＡとを含有する８０μＬの２５ｍＭのＮａＯＨに２０
μＬの血清又は血漿を添加した。混合物をボルテックス
攪拌した後、１０５℃で５分間加熱した。試料を室温と
平衡化させ、そして室温において１６，０００×ｇで２
分間遠心分離した。その上清２５μＬを７５μＬのＰＣ
Ｒ反応混合物（組成については後述）に添加して増幅し
た。
て、これを限定するものではない。 方法： １．血清及び血漿試料 血漿を得るためには、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）又は他の抗凝固剤、例えば、ヘパリン及びオキサレ
ートを含有するVacutainer（商標）管に全血試料を集
め、また血清を得るためには抗凝固剤を使用せずに全血
試料を集めた。 ２．試料調製 スクリューキャップ式微小遠心分離管において１μＬ当
たり内部陽性対照（ＩＰＣ）プラスミド標的ＤＮＡ二本
鎖１．６７コピーと０．３３４μｇ／μＬのウシ胸腺Ｄ
ＮＡとを含有する８０μＬの２５ｍＭのＮａＯＨに２０
μＬの血清又は血漿を添加した。混合物をボルテックス
攪拌した後、１０５℃で５分間加熱した。試料を室温と
平衡化させ、そして室温において１６，０００×ｇで２
分間遠心分離した。その上清２５μＬを７５μＬのＰＣ
Ｒ反応混合物（組成については後述）に添加して増幅し
た。
【００１５】３．ポリマー捕捉法−対照 ポリマー捕捉法によるＤＮＡの抽出法を米国特許第５，
５８２，９８８号の実施例３に記載されているように実
施したが、本実験では２０μＬの血清又は血漿を使用し
た。ＤＮＡ−ポリマー複合体をペレットにし、その上清
を廃棄した（ＰＣＲの潜在的阻害剤を含有すると思われ
るもの）。次いで、そのペレットから、１００μＬの２
０ｍＭのＮａＯＨ溶液を用いてＤＮＡを溶離させ、これ
を１０５℃で５分間加熱し、その後２分間の遠心分離に
かけた。その上清（２５μＬ）を７５μＬのＰＣＲ反応
混合物に添加して増幅した。ポリマー捕捉法は、本発明
の簡素化されたＤＮＡ抽出法との比較用対照法として使
用したものである。
５８２，９８８号の実施例３に記載されているように実
施したが、本実験では２０μＬの血清又は血漿を使用し
た。ＤＮＡ−ポリマー複合体をペレットにし、その上清
を廃棄した（ＰＣＲの潜在的阻害剤を含有すると思われ
るもの）。次いで、そのペレットから、１００μＬの２
０ｍＭのＮａＯＨ溶液を用いてＤＮＡを溶離させ、これ
を１０５℃で５分間加熱し、その後２分間の遠心分離に
かけた。その上清（２５μＬ）を７５μＬのＰＣＲ反応
混合物に添加して増幅した。ポリマー捕捉法は、本発明
の簡素化されたＤＮＡ抽出法との比較用対照法として使
用したものである。
【００１６】４．ＰＣＲ増幅及び検出 ＰＣＲ反応混合物は、ｐＨ８．０において、１６０Ｕ／
ｍＬの組換えＴａｑポリメラーゼ、５．２８μｇ／ｍＬ
のＴＰ４−９．２（５倍過剰量）及び５３．３７μｇ／
ｍＬのＴＰ１−１２．２抗Ｔａｑ抗体、１８ｍＭのトリ
ス緩衝剤、５４ｍＭの塩化カリウム、０．２μＭの各Ｉ
ＰＣプライマー（ＩＰＣ−Ｆ１（前向）：ビオチン-5'-
CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' ＜配列番号１＞及びＩ
ＰＣ−Ｒ１（逆向）5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'
＜配列番号２＞）、０．４μＭの各ＣＭＶアッセイ特異
的プライマー（ＬＢ４２Ｍ（前向）配列：ビオチン-5'-
TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT-3'＜配列番号３＞及びプラ
イマーＬＢ４１（逆向）5'-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT
-3' ＜配列番号４＞）、１．２ｍＭの全デオキシヌクレ
オシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、４ｍＭの塩化マ
グネシウム、９．５％のグリセロール並びに防腐剤を含
有するものとした。典型的には、Ｔａｑポリメラーゼと
抗Ｔａｑ抗体を室温にて１０分間プレインキュベートさ
せ、またＭｇＣｌ2 を独立した溶液として試料の添加直
前に添加した。ＣＭＶアッセイ特異的プライマーは、患
者試料に含まれるＣＭＶ Late 遺伝子のpp65マトリック
スタンパク質をコードするＤＮＡに相補的となるように
設計した。ＩＰＣ標的及びＣＭＶpp65マトリックスタン
パク質標的の各配列をBluescriptプラスミド(Stratagen
e, La Jolla, CA)でクローニングし、アッセイ対照とし
て使用した。これらは分光光度分析により正確に定量化
され、ポワソン分布に適合した。使用した内部陽性対照
標的ＤＮＡの配列は以下の通り。
ｍＬの組換えＴａｑポリメラーゼ、５．２８μｇ／ｍＬ
のＴＰ４−９．２（５倍過剰量）及び５３．３７μｇ／
ｍＬのＴＰ１−１２．２抗Ｔａｑ抗体、１８ｍＭのトリ
ス緩衝剤、５４ｍＭの塩化カリウム、０．２μＭの各Ｉ
ＰＣプライマー（ＩＰＣ−Ｆ１（前向）：ビオチン-5'-
CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' ＜配列番号１＞及びＩ
ＰＣ−Ｒ１（逆向）5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'
＜配列番号２＞）、０．４μＭの各ＣＭＶアッセイ特異
的プライマー（ＬＢ４２Ｍ（前向）配列：ビオチン-5'-
TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT-3'＜配列番号３＞及びプラ
イマーＬＢ４１（逆向）5'-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT
-3' ＜配列番号４＞）、１．２ｍＭの全デオキシヌクレ
オシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、４ｍＭの塩化マ
グネシウム、９．５％のグリセロール並びに防腐剤を含
有するものとした。典型的には、Ｔａｑポリメラーゼと
抗Ｔａｑ抗体を室温にて１０分間プレインキュベートさ
せ、またＭｇＣｌ2 を独立した溶液として試料の添加直
前に添加した。ＣＭＶアッセイ特異的プライマーは、患
者試料に含まれるＣＭＶ Late 遺伝子のpp65マトリック
スタンパク質をコードするＤＮＡに相補的となるように
設計した。ＩＰＣ標的及びＣＭＶpp65マトリックスタン
パク質標的の各配列をBluescriptプラスミド(Stratagen
e, La Jolla, CA)でクローニングし、アッセイ対照とし
て使用した。これらは分光光度分析により正確に定量化
され、ポワソン分布に適合した。使用した内部陽性対照
標的ＤＮＡの配列は以下の通り。
【００１７】
【化１】
【００１８】７５μＬのＰＣＲ反応混合物に２５μＬの
処理後試料を添加した。添加し混合した後、反応混合物
をプラスチック製のＰＣＲパウチ容器システムの増幅ブ
リスターに導入した（Johnson & Johnson Clinical Dia
gnostics, Inc., 米国特許第５，０８９，２３３号、同
第５，２２９，２９７号及び同第５，３８０，４８９号
明細書）。ＰＣＲ増幅及び検出処理装置を用いて増幅及
び検出を実施した（Johnson & Johnson Clinical Diagn
ostics, Inc., 米国特許第５，５６７，６１７号明細
書）。９６℃、３分間の初期予備加熱の後、９６℃（５
秒）の変性工程と７０℃（４０秒）のアニール工程とを
交互させることにより試料を４０サイクルの増幅にかけ
た。１０３℃で５分間の後加熱を行った後、増幅産物
を、捕捉ビーズに結合した対照及びアッセイ特異的プロ
ーブを含有するパウチの検出室に導入した（表１）。
処理後試料を添加した。添加し混合した後、反応混合物
をプラスチック製のＰＣＲパウチ容器システムの増幅ブ
リスターに導入した（Johnson & Johnson Clinical Dia
gnostics, Inc., 米国特許第５，０８９，２３３号、同
第５，２２９，２９７号及び同第５，３８０，４８９号
明細書）。ＰＣＲ増幅及び検出処理装置を用いて増幅及
び検出を実施した（Johnson & Johnson Clinical Diagn
ostics, Inc., 米国特許第５，５６７，６１７号明細
書）。９６℃、３分間の初期予備加熱の後、９６℃（５
秒）の変性工程と７０℃（４０秒）のアニール工程とを
交互させることにより試料を４０サイクルの増幅にかけ
た。１０３℃で５分間の後加熱を行った後、増幅産物
を、捕捉ビーズに結合した対照及びアッセイ特異的プロ
ーブを含有するパウチの検出室に導入した（表１）。
【００１９】
【表１】 INC-26.7a は内部陰性対照として働き、適切に機能する
ＰＣＲパウチにおいて何らシグナルを与えないことが予
想される。
ＰＣＲパウチにおいて何らシグナルを与えないことが予
想される。
【００２０】次いで、捕捉ビーズ上の発色を目視で読み
取り、青色の１０段階の濃淡を有し、それに対応して０
〜１０（０＝信号なし、１０＝高い陽性信号）の範囲で
数値を付したカラースコアカードと比較した。目視のス
コアが２よりも大きい場合には、その捕捉ビーズのテス
ト結果が陽性であることを示す。さらに、ＰＣＲ処理装
置の反射濃度（Ｄr ）の測定値を記録した。Ｄr が０．
１３よりも高い場合には結果が陽性であることを示す。
取り、青色の１０段階の濃淡を有し、それに対応して０
〜１０（０＝信号なし、１０＝高い陽性信号）の範囲で
数値を付したカラースコアカードと比較した。目視のス
コアが２よりも大きい場合には、その捕捉ビーズのテス
ト結果が陽性であることを示す。さらに、ＰＣＲ処理装
置の反射濃度（Ｄr ）の測定値を記録した。Ｄr が０．
１３よりも高い場合には結果が陽性であることを示す。
【００２１】例１：本発明の方法による血漿からのＤＮ
Ａの抽出：ポリマー捕捉法との比較 本発明の抽出法とポリマー捕捉法とを比較するため、以
下の実験を行った。６５人の患者から、上述のように本
発明の方法及びポリマー捕捉法に従い血漿試料を調製し
た。ポリマー捕捉法では２０μＬと５０μＬの両方の試
料を使用した。これらの試料はすべて、従前に初期評価
においてポリマー捕捉プロトコルにより調製された５０
μＬ試料体積で評価した時に「ノー・テスト」の結果を
引き出していた。「ノー・テスト」の結果は、内部陽性
対照捕捉ビーズが偽陰性の結果を与えた時に起こる。試
料に導入されたＩＰＣ対照プラスミドは最終反応混合物
当たり１０コピーで存在した。調製したすべての試料を
ＰＣＲ混合物と一緒にし、上述のように増幅及び検出を
行った。
Ａの抽出：ポリマー捕捉法との比較 本発明の抽出法とポリマー捕捉法とを比較するため、以
下の実験を行った。６５人の患者から、上述のように本
発明の方法及びポリマー捕捉法に従い血漿試料を調製し
た。ポリマー捕捉法では２０μＬと５０μＬの両方の試
料を使用した。これらの試料はすべて、従前に初期評価
においてポリマー捕捉プロトコルにより調製された５０
μＬ試料体積で評価した時に「ノー・テスト」の結果を
引き出していた。「ノー・テスト」の結果は、内部陽性
対照捕捉ビーズが偽陰性の結果を与えた時に起こる。試
料に導入されたＩＰＣ対照プラスミドは最終反応混合物
当たり１０コピーで存在した。調製したすべての試料を
ＰＣＲ混合物と一緒にし、上述のように増幅及び検出を
行った。
【００２２】
【表２】 ＊ＩＰＣ陰性結果の数／全試料実験数
【００２３】５０μＬのポリマー捕捉法は２１％の「ノ
ー・テスト」頻度を示したが、２０μＬのポリマー捕捉
法及び本発明の２０μＬのプロトコルの失敗率は０％で
あった。どちらのポリマー捕捉法も、一部の試料及び陰
性との境界にある内部陽性対照について信号が減少した
ことを示した。このように、本発明の方法は、５０μＬ
のポリマー捕捉法よりも顕著に優れており、また２０μ
Ｌのポリマー捕捉法に対してもＩＰＣ捕捉ビーズでの偽
陰性結果に関して改良されていることを示した。５０μ
Ｌのポリマー捕捉法により調製された試料は、明らかに
ＰＣＲの阻害剤を含有し、しかもポリマー捕捉法に関連
する他の何らかの現象を示した。
ー・テスト」頻度を示したが、２０μＬのポリマー捕捉
法及び本発明の２０μＬのプロトコルの失敗率は０％で
あった。どちらのポリマー捕捉法も、一部の試料及び陰
性との境界にある内部陽性対照について信号が減少した
ことを示した。このように、本発明の方法は、５０μＬ
のポリマー捕捉法よりも顕著に優れており、また２０μ
Ｌのポリマー捕捉法に対してもＩＰＣ捕捉ビーズでの偽
陰性結果に関して改良されていることを示した。５０μ
Ｌのポリマー捕捉法により調製された試料は、明らかに
ＰＣＲの阻害剤を含有し、しかもポリマー捕捉法に関連
する他の何らかの現象を示した。
【００２４】さらに、２０μＬのポリマー捕捉法を使用
した場合に、ＣＭＶ（ＬＢＳＡ−１１）捕捉ビーズ上で
ＣＭＶ陰性患者試料から偽陽性結果が得られた場合が１
回あった。対応する５０μＬの結果は陰性であり（もし
本当に存在したのであれば、患者試料から２．５倍多い
ＣＭＶ標的ＤＮＡを提供したはずである）、この結果
は、操作の多い手順の複雑さ、例えば、生成物のキャリ
オーバーを例示するものである。
した場合に、ＣＭＶ（ＬＢＳＡ−１１）捕捉ビーズ上で
ＣＭＶ陰性患者試料から偽陽性結果が得られた場合が１
回あった。対応する５０μＬの結果は陰性であり（もし
本当に存在したのであれば、患者試料から２．５倍多い
ＣＭＶ標的ＤＮＡを提供したはずである）、この結果
は、操作の多い手順の複雑さ、例えば、生成物のキャリ
オーバーを例示するものである。
【００２５】例２：本発明の方法による血清からのＤＮ
Ａの抽出：ポリマー捕捉法との比較 ポリマー捕捉法及び本発明の方法において２０μＬの試
料を使用して、テキサス州ヒューストンにあるテキサス
子供病院より提供された１００人のＣＭＶ ＩｇＧ陽
性、ＩｇＭ陰性ＯＢ／ＧＹＮ患者から得た血清思料から
ＤＮＡを抽出した（例１参照）。試料の調製前に、ＣＭ
Ｖ対照プラスミドＤＮＡを各試料に添加してＰＣＲ反応
混合物中に２０のＣＭＶプラスミド標的の最終一本鎖コ
ピー数を得た。試料にはＩＰＣ対照プラスミドもＰＣＲ
反応混合物当たり１０コピーの最終レベルになるように
導入した。上述のように、調製した試料のすべてをＰＣ
Ｒ反応混合物と一緒にした。前回と同様に、ＰＣＲパウ
チにおいて増幅及び検出を２回づつ実施した。血清を用
いた場合のポリマー捕捉法と本発明の方法との偽陰性結
果の頻度を下記表３にまとめた。
Ａの抽出：ポリマー捕捉法との比較 ポリマー捕捉法及び本発明の方法において２０μＬの試
料を使用して、テキサス州ヒューストンにあるテキサス
子供病院より提供された１００人のＣＭＶ ＩｇＧ陽
性、ＩｇＭ陰性ＯＢ／ＧＹＮ患者から得た血清思料から
ＤＮＡを抽出した（例１参照）。試料の調製前に、ＣＭ
Ｖ対照プラスミドＤＮＡを各試料に添加してＰＣＲ反応
混合物中に２０のＣＭＶプラスミド標的の最終一本鎖コ
ピー数を得た。試料にはＩＰＣ対照プラスミドもＰＣＲ
反応混合物当たり１０コピーの最終レベルになるように
導入した。上述のように、調製した試料のすべてをＰＣ
Ｒ反応混合物と一緒にした。前回と同様に、ＰＣＲパウ
チにおいて増幅及び検出を２回づつ実施した。血清を用
いた場合のポリマー捕捉法と本発明の方法との偽陰性結
果の頻度を下記表３にまとめた。
【００２６】
【表３】 ＊ＩＰＣ陰性結果の数／全試料実験数
【００２７】いずれの試料も、ＩＰＣ捕捉ビーズについ
ては陰性結果を与えなかった。しかしながら、ＣＭＶプ
ラスミド標的を試料に添加すると、ポリマー捕捉法を使
用した場合にＣＭＶビーズについて５％の偽陰性頻度が
発生し、ＰＣＲの潜在的阻害を示唆した。対照的に、本
発明の方法による場合にはＣＭＶビーズの結果が偽陰性
を示すことはまったくなかった。
ては陰性結果を与えなかった。しかしながら、ＣＭＶプ
ラスミド標的を試料に添加すると、ポリマー捕捉法を使
用した場合にＣＭＶビーズについて５％の偽陰性頻度が
発生し、ＰＣＲの潜在的阻害を示唆した。対照的に、本
発明の方法による場合にはＣＭＶビーズの結果が偽陰性
を示すことはまったくなかった。
【００２８】例３：本発明の方法によるＣＭＶ患者集団
のプラスミドからのＤＮＡの抽出：GeneClean II試料と
の比較 患者試料からＤＮＡを抽出する際の本発明の方法の効能
を調べるため、以下の実験を行った。血漿試料を、
（１）GeneClean II法(Bio 101, Inc.) を用いて抽出
し、高感度Ｐ32液体ハイブリダイゼーション式ＣＭＶ
ＰＣＲアッセイ及び直接ゲル式ＣＭＶ ＰＣＲアッセイ
の両方により特性決定するか、又は（２）本発明の方法
を用いて抽出し、例１に記載したようにアッセイした。
ＩＰＣ対照プラスミドは、各試料に導入したが、最終反
応混合物当たり二本鎖コピー数２５で存在した。すべて
の試料をＰＣＲ反応混合物と一緒にし、次いで上述のよ
うにＰＣＲパウチにおいて増幅及び検出を２回づつ行っ
た。ＣＭＶ捕捉ビーズについての結果を以下の表４に示
す。
のプラスミドからのＤＮＡの抽出：GeneClean II試料と
の比較 患者試料からＤＮＡを抽出する際の本発明の方法の効能
を調べるため、以下の実験を行った。血漿試料を、
（１）GeneClean II法(Bio 101, Inc.) を用いて抽出
し、高感度Ｐ32液体ハイブリダイゼーション式ＣＭＶ
ＰＣＲアッセイ及び直接ゲル式ＣＭＶ ＰＣＲアッセイ
の両方により特性決定するか、又は（２）本発明の方法
を用いて抽出し、例１に記載したようにアッセイした。
ＩＰＣ対照プラスミドは、各試料に導入したが、最終反
応混合物当たり二本鎖コピー数２５で存在した。すべて
の試料をＰＣＲ反応混合物と一緒にし、次いで上述のよ
うにＰＣＲパウチにおいて増幅及び検出を２回づつ行っ
た。ＣＭＶ捕捉ビーズについての結果を以下の表４に示
す。
【００２９】本発明の方法対GeneClean II法：血漿試料
の試料調製
の試料調製
【表４】
【００３０】いずれの陽性ＴＣＨ血漿試料も陽性の極め
て低い試料であると考えられた。いずれも液体ハイブリ
ダイゼーションアッセイにおいてのみ陽性であり、直接
ゲル上では陰性であったことから、試料中のＣＭＶのコ
ピーレベルは低いことを示しているからである。二つの
試料調製法の間の一致率は８０％であった。本発明の方
法を用いると、１２の試料のうち１０がGeneClean 法に
よる陽性結果を与え、そして二つが陰性結果を与えた。
最初に偽陰性であった二つの試料の試料調製物を再テス
トしたところ、一つは陽性となった。GeneClean の陰性
血漿試料についても同様の状況であった。１３の陰性試
料を用いた場合、双方の試料調製法は試料のうち１０に
ついて一致した（同じ１０個）。さらに、本発明の方法
がＣＭＶ陽性試料を示した場合が三つあった。当該試料
調製物を再テストしたところ、これら三つの試料のうち
の二つが再度ＣＭＶ陽性の結果を示した。ＰＣＲアッセ
イでは、その固有感度故、非常に少ない標的試料が矛盾
する結果を与えることはよく見られることである。この
予測は、予測ポワソンサンプリング分布に基づくもので
ある。
て低い試料であると考えられた。いずれも液体ハイブリ
ダイゼーションアッセイにおいてのみ陽性であり、直接
ゲル上では陰性であったことから、試料中のＣＭＶのコ
ピーレベルは低いことを示しているからである。二つの
試料調製法の間の一致率は８０％であった。本発明の方
法を用いると、１２の試料のうち１０がGeneClean 法に
よる陽性結果を与え、そして二つが陰性結果を与えた。
最初に偽陰性であった二つの試料の試料調製物を再テス
トしたところ、一つは陽性となった。GeneClean の陰性
血漿試料についても同様の状況であった。１３の陰性試
料を用いた場合、双方の試料調製法は試料のうち１０に
ついて一致した（同じ１０個）。さらに、本発明の方法
がＣＭＶ陽性試料を示した場合が三つあった。当該試料
調製物を再テストしたところ、これら三つの試料のうち
の二つが再度ＣＭＶ陽性の結果を示した。ＰＣＲアッセ
イでは、その固有感度故、非常に少ない標的試料が矛盾
する結果を与えることはよく見られることである。この
予測は、予測ポワソンサンプリング分布に基づくもので
ある。
【００３１】例４：潜在的妨害性物質の血漿への添加 本発明の方法が血漿から潜在的妨害性物質を除去できる
ことをテストするため、以下の実験を行った。正常な血
漿試料プールを処理してｐＨを変化させ、血液試料コレ
クション添加物及びその他の試料調製、増幅又は検出を
妨害し得ることが知られている又は疑われている物質を
添加する。化合物の試料への添加は、血清レベルの推定
ピークの３倍で行った（表５）。ＤＮＡの抽出は、例１
に記載したように、本発明の方法及び従来技術のポリマ
ー捕捉法により２０μＬの各試料から行った。ＩＰＣ及
びＣＭＶプラスミドは、最終ＰＣＲ反応混合物当たり２
５及び１０の二本鎖コピー数で存在した。試料の交差汚
染又は生成物キャリオーバーが原因で起こり得る偽陽性
結果（ＣＭＶプローブビーズ上での発色増強）を評価す
るため、試料の半分にＩＰＣプラスミドのみを含めた。
すべての試料をＰＣＲ反応混合物と一緒にし、ＰＣＲパ
ウチにおいて増幅及び検出した。各化合物について、Ｃ
ＭＶコピーレベル０及び１０の両方について四つのパウ
チを実験した。さらに、アッセイに含めるための化合物
を調製する際に用いられる各種溶剤（水、アセトン、エ
チルアルコール）を含有する適当な対照物についても実
験した。
ことをテストするため、以下の実験を行った。正常な血
漿試料プールを処理してｐＨを変化させ、血液試料コレ
クション添加物及びその他の試料調製、増幅又は検出を
妨害し得ることが知られている又は疑われている物質を
添加する。化合物の試料への添加は、血清レベルの推定
ピークの３倍で行った（表５）。ＤＮＡの抽出は、例１
に記載したように、本発明の方法及び従来技術のポリマ
ー捕捉法により２０μＬの各試料から行った。ＩＰＣ及
びＣＭＶプラスミドは、最終ＰＣＲ反応混合物当たり２
５及び１０の二本鎖コピー数で存在した。試料の交差汚
染又は生成物キャリオーバーが原因で起こり得る偽陽性
結果（ＣＭＶプローブビーズ上での発色増強）を評価す
るため、試料の半分にＩＰＣプラスミドのみを含めた。
すべての試料をＰＣＲ反応混合物と一緒にし、ＰＣＲパ
ウチにおいて増幅及び検出した。各化合物について、Ｃ
ＭＶコピーレベル０及び１０の両方について四つのパウ
チを実験した。さらに、アッセイに含めるための化合物
を調製する際に用いられる各種溶剤（水、アセトン、エ
チルアルコール）を含有する適当な対照物についても実
験した。
【００３２】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【００３３】略語解：＊＋は標的が存在するすべてのＣ
ＭＶ及びＩＰＣ捕捉ビーズにおける陽性結果を示し；Ｆ
Ｐは偽陽性を示し；ＦＮは偽陰性（ＣＭＶが１０コピー
レベルでインプットされたＣＭＶ陽性が予定された捕捉
ビーズ上でのＣＭＶ陰性結果）を示し；ＮＴは「ノー・
テスト」、ＣＭＶ陰性が予定された試料上でＩＰＣ捕捉
ビーズが陰性であること（ＣＭＶ＝Ｎｅｇ）を示す。初
期の試験の際に、ＣＭＶ及びＩＰＣの捕捉ビーズのいず
れにも突発的な偽陰性結果が若干見られ、また試料調製
法の各々についていくつかの「ノー・テスト」結果が存
在したが、それらは主としてポリマー捕捉試料において
見られた。さらに、対照のいくつかは予想外の陰性結果
を与え、パウチの失敗がこれらに起因していることを示
唆していた。
ＭＶ及びＩＰＣ捕捉ビーズにおける陽性結果を示し；Ｆ
Ｐは偽陽性を示し；ＦＮは偽陰性（ＣＭＶが１０コピー
レベルでインプットされたＣＭＶ陽性が予定された捕捉
ビーズ上でのＣＭＶ陰性結果）を示し；ＮＴは「ノー・
テスト」、ＣＭＶ陰性が予定された試料上でＩＰＣ捕捉
ビーズが陰性であること（ＣＭＶ＝Ｎｅｇ）を示す。初
期の試験の際に、ＣＭＶ及びＩＰＣの捕捉ビーズのいず
れにも突発的な偽陰性結果が若干見られ、また試料調製
法の各々についていくつかの「ノー・テスト」結果が存
在したが、それらは主としてポリマー捕捉試料において
見られた。さらに、対照のいくつかは予想外の陰性結果
を与え、パウチの失敗がこれらに起因していることを示
唆していた。
【００３４】先に調製した試料を再テストしたところ、
ポリマー捕捉法により調製した２５％血液試料（ＤＮＡ
抽出前に７５体積部の血漿に２５体積部の全血を添加し
たもの）を除き、テストしたすべての物質のすべての結
果がポリマー捕捉法及び本発明の方法の両方について陽
性結果を引き出した。ＩＰＣ標的のみを含有する（ＣＭ
Ｖ標的は含まない）四つの試料のうち二つが、ＩＰＣ捕
捉ビーズに対して「ノー・テスト」の結果を示した。ま
た、ＩＰＣとＣＭＶの両方の標的ＤＮＡを含む四つの試
料のうち三つが、ＩＰＣ捕捉ビーズに対して阻害を示
し、目視スコアは「１」にすぎなかった。このうち二つ
については、ＣＭＶ捕捉ビーズも阻害の兆候を示した
（目視発色スコアが「３」及び「４」であった）。さら
に、ここでもまたポリマー捕捉法を用いた場合に偽陽性
の結果を示すものが１回あり（ｐＨ変動が少ない場合
に）、キャリオーバー汚染を防止するためには工程数を
最少限にした簡素な方法が必要であることを示唆してい
る。
ポリマー捕捉法により調製した２５％血液試料（ＤＮＡ
抽出前に７５体積部の血漿に２５体積部の全血を添加し
たもの）を除き、テストしたすべての物質のすべての結
果がポリマー捕捉法及び本発明の方法の両方について陽
性結果を引き出した。ＩＰＣ標的のみを含有する（ＣＭ
Ｖ標的は含まない）四つの試料のうち二つが、ＩＰＣ捕
捉ビーズに対して「ノー・テスト」の結果を示した。ま
た、ＩＰＣとＣＭＶの両方の標的ＤＮＡを含む四つの試
料のうち三つが、ＩＰＣ捕捉ビーズに対して阻害を示
し、目視スコアは「１」にすぎなかった。このうち二つ
については、ＣＭＶ捕捉ビーズも阻害の兆候を示した
（目視発色スコアが「３」及び「４」であった）。さら
に、ここでもまたポリマー捕捉法を用いた場合に偽陽性
の結果を示すものが１回あり（ｐＨ変動が少ない場合
に）、キャリオーバー汚染を防止するためには工程数を
最少限にした簡素な方法が必要であることを示唆してい
る。
【００３５】これらの結果は、２５％全血が、試料をポ
リマー捕捉法で調製した場合にはＨＣＭＶアッセイにお
いて阻害作用を有することを示している。対照的に、本
発明の方法によるＤＮＡ抽出は、ＰＣＲの増幅及び検出
を何ら阻害しない結果となった。このことは、臨床実験
室の血清及び血漿試料は赤血球細胞で汚染されている場
合が多いため、重要なことである。さらに、本発明の方
法に比べポリマー捕捉法は労力が多大であり、試料が環
境に晒される機会も多いので、本発明の方法はポリマー
捕捉法よりも優れている。本発明の方法によるＤＮＡ抽
出は、被験物質のいずれによってもＰＣＲ増幅又は増幅
産物の検出を阻害することにならない。この簡素な方法
は、従来の煩わしく、時間がかかり、しかも労力の多い
方法を顕著に凌ぐものである。
リマー捕捉法で調製した場合にはＨＣＭＶアッセイにお
いて阻害作用を有することを示している。対照的に、本
発明の方法によるＤＮＡ抽出は、ＰＣＲの増幅及び検出
を何ら阻害しない結果となった。このことは、臨床実験
室の血清及び血漿試料は赤血球細胞で汚染されている場
合が多いため、重要なことである。さらに、本発明の方
法に比べポリマー捕捉法は労力が多大であり、試料が環
境に晒される機会も多いので、本発明の方法はポリマー
捕捉法よりも優れている。本発明の方法によるＤＮＡ抽
出は、被験物質のいずれによってもＰＣＲ増幅又は増幅
産物の検出を阻害することにならない。この簡素な方法
は、従来の煩わしく、時間がかかり、しかも労力の多い
方法を顕著に凌ぐものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 ケリー リー アンジー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14505, マリオン，ミル ストリート 3693
Claims (14)
- 【請求項１】 （１）血清又は血漿にアルカリを接触さ
せてアルカリ化された血清又は血漿を得、 （２）前記アルカリ化された血清又は血漿を１００〜１
１０℃の範囲の温度に５〜２０分の時間加熱することに
より、加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を得、 （３）前記加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を遠
心分離することにより、ＤＮＡを含有する上清を得、そ
して （４）前記ＤＮＡを含有する上清を回収することを特徴
とする、血清又は血漿からＤＮＡを抽出するための方
法。 - 【請求項２】 前記加熱工程（２）の後、前記遠心分離
工程（３）の前に、前記加熱後のアルカリ化された血清
又は血漿を２５℃まで冷却することを特徴とする、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記アルカリが水酸化ナトリウムである
ことを特徴とする、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記温度が１０５℃であることを特徴と
する、請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 前記時間が５分であることを特徴とす
る、請求項２に記載の方法。 - 【請求項６】 前記遠心分離を１６０００×ｇで２分間
行うことを特徴とする、請求項２に記載の方法。 - 【請求項７】 前記アルカリ化された血清又は血漿がア
ルカリを１５〜５０ｍＭの濃度範囲で含むことを特徴と
する、請求項２に記載の方法。 - 【請求項８】 血清又は血漿に含まれるＤＮＡ含有微生
物を検出するための方法であって、 （１）被験体の血清又は血漿にアルカリを接触させてア
ルカリ化された血清又は血漿を得、 （２）前記アルカリ化された血清又は血漿を１００〜１
１０℃の範囲の温度に５〜２０分の時間加熱することに
より、加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を得、 （３）前記加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を遠
心分離することにより、ＤＮＡを含有する上清を得、 （４）前記ＤＮＡを含有する上清を回収し、 （５）前記上清中の前記ＤＮＡを、前記ＤＮＡ含有微生
物のＤＮＡに含まれる配列を認識するオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて増幅することにより、前記ＤＮＡ
含有微生物に特異的な増幅産物を得、そして （６）前記増幅産物を検出することを特徴とし、前記増
幅産物の検出が前記血清又は血漿に含まれる前記微生物
の存在を示すこととなる方法。 - 【請求項９】 前記接触工程（２）の後、前記遠心分離
工程（３）の前に、前記加熱後のアルカリ化された血清
又は血漿を２５℃まで冷却することを特徴とする、請求
項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記温度が１０５℃であることを特徴
とする、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記微生物が細菌であることを特徴と
する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記微生物がウイルスであることを特
徴とする、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記ウイルスがサイトメガロウイルス
であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記アルカリ化された血清又は血漿が
アルカリを２０ｍＭの濃度で含むことを特徴とする、請
求項８に記載の方法。
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|---|---|---|---|---|
| WO2020075695A1 (ja) * | 2018-10-09 | 2020-04-16 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 微生物の検出方法 |
| JP2020058271A (ja) * | 2018-10-09 | 2020-04-16 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 微生物の検出方法 |
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| KR20020028386A (ko) * | 2000-10-09 | 2002-04-17 | 박제철 | 소량의 동물조직으로부터 미토콘드리아 디.엔.에이의순수분리 방법 |
| AU2003287082A1 (en) * | 2002-10-11 | 2004-05-04 | Imutex Pharmaceuticals, Inc. | Heterologous plasma cocktail for hiv treatment |
| CN107683330A (zh) * | 2015-05-25 | 2018-02-09 | 卡尤迪生物科技（北京）有限公司 | 用于样品收集的装置和方法 |
| CN107920789A (zh) * | 2015-05-25 | 2018-04-17 | 卡尤迪生物科技宜兴有限公司 | 用于样品收集的装置和方法 |
| CN108795926A (zh) * | 2018-06-27 | 2018-11-13 | 中国农业科学院麻类研究所 | 一种dna模板快速制备方法 |
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| US5380489A (en) | 1992-02-18 | 1995-01-10 | Eastman Kodak Company | Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes |
| CA2137563C (en) | 1992-06-08 | 2005-06-28 | Thomas B. Ryder | Preparation of nucleic acid from mononuclear cells |
| US5582988A (en) | 1994-09-15 | 1996-12-10 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same |
| EP0929694A4 (en) * | 1996-03-15 | 2002-05-02 | Penn State Res Found | DETECTION OF TUMOR-RELATED EXTRACELLULAR NUCLEIC ACID USING PLASMA OR BLOOD SERUM USING NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TESTS |
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2000
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- 2000-02-02 NO NO20000539A patent/NO324041B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-02-03 JP JP2000032644A patent/JP4468534B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-03 CN CNB001046985A patent/CN100334102C/zh not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| WO2020075695A1 (ja) * | 2018-10-09 | 2020-04-16 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 微生物の検出方法 |
| JP2020058271A (ja) * | 2018-10-09 | 2020-04-16 | 公益財団法人筑波メディカルセンター | 微生物の検出方法 |
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