CN118147369A - 牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合、crRNA分子、反应体系及应用 - Google Patents

牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合、crRNA分子、反应体系及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物检测技术领域，具体公开了牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合、crRNA分子、反应体系及应用。本发明的牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合包括：牛病毒性腹泻病毒RAA上游引物和牛病毒性腹泻病毒RAA下游引物；所述牛病毒性腹泻病毒RAA上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述牛病毒性腹泻病毒RAA下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。应用含有该RAA检测引物组合的反应体系进行牛病毒性腹泻病毒的检测，成本低、时间短、特异性好，敏感度高。

Description

牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合、crRNA分子、反应体系及 应用
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体地说，涉及牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合、crRNA分子、反应体系及应用。
背景技术
牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrheavirus，BVDV)感染引起的，具有三种不同的基因型，例如BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3。该病毒是一种囊膜病毒，具有耐高温的特点，但持续50℃以上高温可有效杀灭该病毒，潜伏期长，最长可达14d。感染该病毒的牛一般可分为急性和慢性两种。急性感染的牛，血液及体液分泌物中都包含该病毒，而慢性感染时间持续较长，即使康复牛也有一段时间会携带病原，因此会出现反复感染的现象。腹泻病毒具有很强的传染力，主要存在于粪便、尿液、眼鼻分泌物、奶牛的乳汁和血液中，还可污染饲料、饮水及饲养环境。因此。一旦发现感染，应立即进行严格的杀菌消毒处理。腹泻病毒主要通过消化道、呼吸道或母牛子宫胎盘传播。除感染牛外，也可感染羊、猪等多种经济动物。该病毒在进入牛体内，可使牛出现病毒血症，导致体免疫力下降。
现有的对牛病毒性腹泻病毒检测的技术方法有细胞分离、免疫组织化学方法(IHC)、抗原检测技术、微滴数字PCR绝对定量检测技术等。
最可靠的确诊方法是利用相应的细胞分离BVDV，然而这种方法要花费大量的时间和金钱，相对而言针对BVDV核酸及特异性抗体的检测方法更实用。可以从血清、全血、精液、鼻拭子及多种组织中分离到病毒。可从濒死动物血液中的棕色细胞中分离病毒，从死亡动物的淋巴组织中分离病毒进行诊断。免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidasemonolayer assay)可以在动物群体水平筛选分离病毒，这个方法最初是用来检测PI动物的。通过这个方法可以做出确切的诊断，但是由于母源抗体的干扰不能用于3月龄以下小牛检测确诊。
免疫组织化学方法(IHC)和抗原捕获酶联免疫吸附试验(ACE)可用来检测BVDV。这两种检测方法相比分离病毒而言可快速得到检测结果而且花费较小，已经被广泛使用。通过IHC和ACE检测表皮样品，这是目前广泛使用的确诊PI动物快速的方法。经病毒分离试验检测呈阴性的PI动物及因母源抗体干扰ACE试验检测呈阴性的血清样品也可以通过检测皮肤样品确诊。因此IHC和ACE非常适合用来检测PI动物。然而应当引起注意的是，已经出现新的BVDV毒株用常规的IHC及ACE都不能被检测出来。
血清学检测方法也可用于检测BVDV，但是却不能区分检测出来的血清抗体是由自然感染产生的，还是由接种疫苗产生的，还是由母源抗体转移而来的。血清学检测方法可用于疫苗免疫效果的评估以及判断畜群是否暴发BVDV感染。病毒中和试验是最常使用的血清学检测方法，根据所使用对照毒株的不同还可判断抗体是BVDV1特异性抗体还是BVDV2特异性抗体。但是并不能仅仅把血清中和抗体的检测作为鉴别诊断的依据。
微滴数字PCR绝对定量检测技术原理是在PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。但该技术操作复杂，检测时间长，检测范围较窄，仪器设备和试剂昂贵。
因此，仍有必要对牛病毒性腹泻病毒检测技术进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的检测牛病毒性腹泻病毒的高效、理想方法。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合，其包括：牛病毒性腹泻病毒RAA上游引物和牛病毒性腹泻病毒RAA下游引物；所述牛病毒性腹泻病毒RAA上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述牛病毒性腹泻病毒RAA下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供一种crRNA分子，其序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供一种检测牛病毒性腹泻病毒的RAA-CRISPR CAS12a反应体系，其包括上述牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合和crRNA分子。
本发明的RAA-CRISPR CAS12a反应体系，还包括报告基因ssDNA和LbCas12a蛋白；
所述ssDNA的序列如SEQ ID No.10所示并标记有可产生荧光色的荧光基团；
所述荧光基团包括荧光报告基团和荧光猝灭基团；所述荧光报告基团为选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas中的任一种；所述荧光猝灭基团为选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、DABCYL中的任一种。
优选，LbCas12a蛋白和crRNA分子的浓度比为(0.1-0.6)：(0.5-3.0)，更优选为0.3：1.5。
本发明的RAA-CRISPR CAS12a反应体系包括：2.0～6.0mmol/L dNTP、0.2～1.1μmol/L单链结合蛋白、1.0～2.0μmol/L重组酶蛋白、0.2～1.2U/μl DNA聚合酶、10～60mmol/L TrisHCl、40～80mmol/LNaCl、6～12mmol/L二硫苏糖醇、1.0～5.0μmol/L牛病毒性腹泻病毒RAA上游引物、1.0～5.0μmol/L牛病毒性腹泻病毒RAA下游引物、0.2～3.0μmol/L crRNA、0.1～0.6μmol/L LbCas12a、0.1～1.0U/μL Exo核酸外切酶、10～60nmol/L ssDNA和0.4～1.2U/μL RNase Inhibitor。
优选，包括：4mmol/L dNTP、0.9μmol/L单链结合蛋白、1.4μmol/L重组酶蛋白、0.4U/μL DNA聚合酶，31mmol/LTrisHCl、52mmol/LNaCl、10mmol/L二硫苏糖醇、4.0μmol/L牛病毒性腹泻病毒RAA上游引物、4.0μmol/L牛病毒性腹泻病毒RAA下游引物、1.5μmol/LcrRNA、0.30μmol/L LbCas12a、0.6U/μL Exo核酸外切酶、28nmol/L ssDNA、0.7U/μL RNaseInhibitor。
优选将本发明反应体系加入冻干保护剂后，以无核酸酶水补足体积至50μL，之后进行冻干，在进行扩增反应时，再与待测模板(5μL)、20～55％聚乙二醇(43μL)、250～320mmol/L醋酸镁和80～140mmol/L氯化镁(2.0μL)混合，构成50μL反应总体系。
本发明使用RAA-CRISPR-Cas12a系统对牛病毒性腹泻病毒基因进行检测，可通过荧光检测设备和无电源现场视觉检测方法实现结果判读。通过将RAA技术与基于Cas12a的检测相结合，可以在20分钟内使用荧光检测或通过肉眼判定结果。检测设备少、成本低、目视检测、全程封管操作，不会产生气溶胶污染，其应用可能有助于控制牛病毒性腹泻的大流行。
本发明还提供一种上述牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合或crRNA分子或RAA-CRISPR CAS12a反应体系在以下任一方面中的应用：
(1)非疾病诊断或治疗目的的检测牛病毒性腹泻病毒；
(2)制备一管式牛病毒性腹泻病毒检测冻干粉、冻干液、冻干管或试剂盒。
本发明可用于产品中牛病毒性腹泻病毒的检测，用于品控，也可用于抗牛病毒性腹泻病毒的疫苗、药物研发中。
本发明还提供一种非疾病诊断或治疗目的的检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其应用上述RAA-CRISPR CAS12a反应体系对待测样本的核酸进行扩增，若报告基因ssDNA通道出现扩增曲线或扩增产物在紫外灯下表现为白光，则判断所述待测样本中含有牛病毒性腹泻病毒。
本发明扩增程序优选为：38℃，60-100s预热，1循环；38-40℃，30s扩增，40循环。
本发明还提供一种牛病毒性腹泻病毒检测产品，其包括上述牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合、crRNA分子或RAA-CRISPR CAS12a反应体系中的一种或多种；所述产品为冻干粉、冻干液、冻干管或试剂盒。
当所述产品为冻干液时，还包括冻干保护剂：10～13mmol/L的海藻糖、20～24mmol/L的甘露醇和5～21％的牛血清白蛋白。
当所述产品为冻干粉或冻干管时，冻干流程为：先于-80℃冷冻1～2h再进行设备冻干；所述设备冻干包括：预冻阶段、设备抽真空、冷冻干燥和解析干燥阶段；所述解析干燥阶段的条件为：将隔板温度升至-20～-25℃保持12～14h，然后将隔板温度升至4～8℃并保持0.5～1h，最后将隔板降至20～25℃并保持3～6h。
本发明的冻干粉由冻干液冷冻干燥而来，冻干管通过将冻干液冷冻干燥固定在管状容器中获得。
本发明冻干管制备时，优选在容器中装有50μL冻干液(以无核酸酶水补足体积)后进行冻干操作。
本发明的有益效果至少在于：
本发明RAA-CRISPR-Cas12a检测系统在常温下即可进行，其最适温度在37～42℃，不需要昂贵的温度循环设备，降低了检测成本；整个反应过程在10～20min内即可完成，且不需要变性，从而实现了快速核酸检测；
本发明RAA-CRISPR-Cas12a检测系统在较短的反应时间内保持了高灵敏性，从单个模板分子可得到大约1012数量级的扩增产物；且只针对目标序列进行识别和切割，对非目标序列不产生反应，特异性好；
本发明检测试剂可常温保存。除缓冲液及Mg2+外，其余体系组分均可以干粉状态保存于反应管中，稳定且易于保存和运输，操作简便，在封闭的反应体系中减少了污染的可能性；
本发明RAA-CRISPR-Cas12a检测系统结果可通过real-time PCR对扩增过程进行实时监控，还可以在紫外灯下进行可视化显示，结果读取多样化。
附图说明
图1为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR/CAS12a引物筛选结果，图中，1为BVDV-F、BVDV-R、Cas12a-crRNA检测牛病毒性腹泻病毒核酸的结果；2为BVDV-F1、BVDV-R1、Cas12a-crRNA1检测牛病毒性腹泻病毒核酸的结果；3为BVDV-F2、BVDV-R2、Cas12a-crRNA2检测牛病毒性腹泻病毒核酸的结果；4为BVDV-F、BVDV-R、Cas12a-crRNA检测无核酸酶水的结果；5为BVDV-F1、BVDV-R1、Cas12a-crRNA1检测无核酸酶水的结果；6为BVDV-F2、BVDV-R2、Cas12a-crRNA2检测无核酸酶水的结果。
图2为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR/CAS12a引物筛选紫外灯下的检测结果；图中1-6所代表的信息与图1记载一致。
图3为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a对牛病毒性腹泻病毒核酸的检测结果；1为牛病毒性腹泻病毒血清核酸，2为牛病毒性腹泻病毒脾脏组织核酸，3为牛病毒性腹泻病毒鼻拭子核酸，4为牛病毒性腹泻病毒精液核酸，5为牛病毒性腹泻病毒牛奶核酸，6为阴性对照(无核酸酶水)。
图4为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a产物紫外灯检测结果；1为牛病毒性腹泻病毒血清核酸，2为牛病毒性腹泻病毒脾脏组织核酸，3为牛病毒性腹泻病毒鼻拭子核酸，4为牛病毒性腹泻病毒精液核酸，5为牛病毒性腹泻病毒牛奶核酸，6为阴性对照(无核酸酶水)。
图5为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a的不同分型的检测结果；1：阳性对照；2：BVDV-1型；3：BVDV-2型；4：BVDV-3型；5：阴性对照(无核酸酶水)。
图6为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a紫外灯不同分型的检验结果；1：阳性对照；2：BVDV-1型；3：BVDV-2型；4：BVDV-3型；5：阴性对照(无核酸酶水)。
图7为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a的特异性检测结果；1：阳性对照；2：牛病毒性腹泻病毒核酸；3：牛轮状病毒；4：牛冠状病毒；5：牛库布病毒；6：牛星状病毒；7：牛环曲病毒；8：牛源沙门氏菌；9：牛源大肠杆菌；10：阴性对照(无核酸酶水)。
图8为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a紫外灯特异性检验结果；1：牛病毒性腹泻病毒核酸；2：阳性对照；3：牛轮状病毒；4：牛冠状病毒；5：牛库布病毒；6：牛星状病毒；7：牛环曲病毒；8：牛源沙门氏菌；9：牛源大肠杆菌；10：阴性对照(无核酸酶水)。
图9为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a对牛病毒性腹泻病毒阳性质粒的敏感性检测结果；1：1×107copies/mL；2：1×106copies/mL；3：1×105copies/mL；4：1×104copies/mL；5：1×103copies/mL；6：1×102copies/mL；7：50copies/mL；8：25copies/mL；9：12.5copies/mL；10：阴性对照。
图10为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a对牛病毒性腹泻病毒阳性质粒的紫外灯敏感性检测结果；图中1-10所代表的信息与图9记载一致。
图11为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a批内重复性结果；1-3是浓度为1×107copies/mL的牛病毒性腹泻病毒阳性质粒，4是阴性对照(无核酸酶水)。
图12为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a紫外灯下对1×107copies/mL的阳性质粒检测结果；1-3是浓度为1×107copies/mL的阳性质粒，4是阴性对照(无核酸酶水)。
图13为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a批间重复性结果；1-3是三批检验浓度为1×107copies/mL的牛病毒性腹泻病毒阳性质粒，4是无核酸酶水。
图14为牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a紫外灯下对1×107copies/mL的阳性质粒检测结果；1-3是三批检验浓度为1×107copies/mL的阳性质粒，4是阴性对照(无核酸酶水)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。
本发明提供了一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a检测方法，该方法包括1管反应液(成分包括:2.0～6.0mmol/L dNTP、0.2～1.1μmol/L单链结合蛋白、1.0～2.0μmol/L重组酶蛋白、0.2～1.2U/μl DNA聚合酶、10～60mmol/L TrisHCl、40～80mmol/LNaCl、6～12mmol/L二硫苏糖醇、1.0～5.0μmol/L牛病毒性腹泻病毒RAA上游引物、1.0～5.0μmol/L牛病毒性腹泻病毒RAA下游引物、0.2～3.0μmol/L crRNA、0.1～0.6μmol/LLbCas12a、0.1～1.0U/μL Exo核酸外切酶、10～60nmol/L ssDNA、0.4～1.2U/μL RNase Inhibitor；20～55％聚乙二醇；模板；预混液Buffer(成分如下：250～320mmol/L醋酸镁和80～140mmol/L氯化镁)。
实施例1RAA-CRISPR/CAS12a引物筛选
本实施例根据Genbank中登录的牛病毒性腹泻病毒的JQ612705.1，以牛病毒性腹泻病毒核酸为模板，将设计的三对RAA-CRISPR/CAS12a引物(表1)结合ssDNA探针进行RAA-CRISPR/CAS12a荧光检测。具体反应体系见下表2。2.0μL终浓度310mmol/L醋酸镁和130mmol/L氯化镁试剂加在管盖上，将所有的反应试剂混匀为CRISPR/Cas12a初始检测体系，盖上反应管的管盖后进行离心，混匀完立即进行荧光扩增检测，选择FAM通道，扩增程序：38℃，100s预热；40℃，30s扩增，40循环；结束后保存数据进行荧光信号分析，结果如图1所示。
RAA-CRISPR-Cas12a扩增反应物用凝胶成像仪在紫外灯302nM激发，肉眼进行结果判读并拍照，结果见图2。通过比较Ct值、荧光强度筛选出最佳RAA引物为BVDV-F、BVDV-R，Cas12a-crRNA为Cas12a-crRNA。
表1 RAA-Cas12a-crRNA引物表
表中，B代表C或G或T，K代表G或T，H代表A或C或T，R代表A或G，W代表A或T/U，Y代表C或T/U。D代表A或G或T/U，S代表C或G，M代表A或C，V代表A或C或G。
表2RAA-CRISPR CAS12a体系配制表
实施例2crRNA与CAS12a蛋白最适浓度的选择
本实施例以牛病毒性腹泻病毒(其5’UTR基因与HN1507株(Genbank：KU563155.1)同源率为100％)核酸为模板，无核酸酶水为阴性对照，上述最优RAA上下游引物、最优crRNA结合ssDNA探针进行RAA-CRISPR/CAS荧光检测。具体反应体系见表3，其中crRNA终浓度为X和LbCas12a终浓度为Y，X、Y为变量，需以总反应体积为50μL的体系算出不同浓度所需加入LbCas12a蛋白和crRNA的体积，其他组分终浓度不变。
选择的LbCas12a蛋白浓度分别为0.10μM、0.20μM、0.30μM、0.40μM、0.50μM、0.60μM；选择的crRNA浓度分别是0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM进行交叉反应。2.0μL终浓度310mmol/L醋酸镁和130mmol/L氯化镁试剂加在管盖上，将所有的反应试剂混合均匀后离心并立即进行扩增反应，选用的报告分子为荧光报告分子，扩增程序为38℃，60s预热1循环；38℃，30s扩增，40循环。得到核酸扩增产物，将反应完成后的Ct值数据保存分析。结果见表4，对实验结果进行分析并确定最佳反应体系中LbCas12a蛋白终浓度为0.30μM，crRNA的终浓度为1.5μM。
表3RAA-CRISPR CAS12a体系配制表
表4LbCas12a与crRNA的比例筛选结果
实施例3一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a检测方法的建立
1、一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a冻干管制备：
一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a冻干反应液包括4mmol/L dNTP、0.9μmol/L单链结合蛋白、1.4μmol/L重组酶蛋白、0.4U/μL DNA聚合酶，31mmol/LTrisHCl、52mmol/LNaCl、10mmol/L二硫苏糖醇、4.0μmol/L牛病毒性腹泻病毒RAA上游引物、4.0μmol/L牛病毒性腹泻病毒RAA下游引物、1.5μmol/L crRNA、0.30μmol/LLbCas12a、0.6U/μL Exo核酸外切酶、28nmol/L ssDNA、0.7U/μL RNase Inhibitor、12mmol/L海藻糖、22mmol/L甘露醇、10％牛血清白蛋白，以无核酸酶水补充至50μL于0.2mL八连排PCR管中。先于-80℃冷冻1h。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为0.5h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持13h，然后将隔板温度升至5℃并保持40min，最后将隔板降至25℃并保持5h。
2、基因组提取：
将待测样本用商品化核酸提取试剂盒进行核酸提取，得到待检核酸。所用待检测样本来源于感染牛病毒性腹泻病毒的血清、脾脏组织、鼻拭子、精液、牛奶样本。
3、RAA-CRISPR Cas12a扩增
向一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a冻干管中，加入43μL预混液Buffer A(30％聚乙二醇)复融，再加入5μL待检核酸，然后加2.0μL的Buffer B(310mmol/L醋酸镁和130mmol/L氯化镁)溶液在管盖上，盖上反应管的管盖后，简单旋转将BufferB离心至管底，共50μL体系，混合均匀，进行扩增反应，得到核酸扩增产物；扩增程序：38℃，100s预热，1循环；40℃，30s扩增，40循环。
4、结果
一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a核酸检测结果见图3，含有牛病毒性腹泻病毒核酸的样本均有扩增曲线，而阴性对照无扩增曲线，说明本发明提供的方法可以检测牛血清、脾脏组织、鼻拭子、精液、牛奶样本中牛病毒性腹泻病毒是否存在。
将上述获得的反应物用凝胶成像仪在紫外灯302nM激发并进行结果判读，并拍照，结果如图4所示，含有牛病毒性腹泻病毒核酸的样本扩增产物均为白光，而阴性对照无色。
实施例4牛病毒性腹泻病毒不同分型的检测效果
本实施例用BVDV-1型(PUC57插入AB078951.1目的基因)、BVDV-2型(PUC57插入MH231127.1目的基因)和BVDV-3型(PUC57插入JQ612705.1目的基因)核酸合成质粒与阳性对照(PUC57插入JQ612705.1目的基因)及阴性对照一起验证牛病毒性腹泻病毒不同分型的检测效果。
具体地，以各病毒型核酸合成质粒作为模板，进行RAA-CRISPR CAS12a扩增检测，所用一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a冻干管、预混液BufferA和BufferB如实施例3中所述。
向一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a冻干管中加入43μL预混液BufferA及5μL待检核酸，然后加2.0μL的BufferB溶液在管盖上，盖上反应管的管盖后，简单旋转将BufferB离心至管底，共50μL体系，混合均匀，进行扩增反应，得到核酸扩增产物。扩增程序：38℃，60s预热，1循环；38℃，30s扩增，40循环。
扩增结果见图5，将上述扩增反应物用凝胶成像仪在紫外灯302nM激发，进行结果判读并拍照，结果见图6。
由图5可知牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a的检测方法可检测到BVDV-1型和BVDV-2型、BVDV-3型，产生扩增曲线。
由图6可知RAA-CRISPR CAS12a的检测方法对BVDV-1型、BVDV-2型和BVDV-3型合成质粒检测均为白光。
其表明本发明提供的牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR/CAS检测方法可检测3种基因型(BVDV-1型、BVDV-2型和BVDV-3型)。
实施例5一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a检测方法的特异性检验
本实施例用牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛库布病毒、牛星状病毒、牛环曲病毒、牛源沙门氏菌、牛源大肠杆菌与阳性对照及阴性对照一起验证牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a特异性。
1、提取各病毒核酸作为模板，进行RAA-CRISPR CAS12a扩增检测，所用一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a冻干管、预混液BufferA和BufferB如实施例3中所述。
2、反应体系：向一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a冻干管中加入43μL预混液BufferA及5μL待检核酸，然后加2μL的BufferB溶液在管盖上，盖上反应管的管盖后，简单旋转将BufferB离心至管底，共50μL体系，混合均匀，进行扩增反应，得到核酸扩增产物。扩增程序：38℃，60s预热，1循环；38℃，30s扩增，40循环。
扩增结果见图7，将上述扩增反应物用凝胶成像仪在紫外灯302nM激发，进行结果判读并拍照，结果见图8。
由图7可知牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a的检测方法可检测到牛病毒性腹泻病毒核酸，产生扩增曲线。而对其他种类病原均无扩增曲线，说明无非特异性扩增。所述检测方法对牛病毒性腹泻病毒的检测特异性较优。
由图8可知RAA-CRISPR CAS12a的检测方法对牛病毒性腹泻病毒核酸检测为白光，对其他种类病原无扩增，为无色透明，说明不能发生非特异性扩增。所述检测方法具有对牛病毒性腹泻病毒的检测特异性较好。
结果表明：本发明检测方法对牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛库布病毒、牛星状病毒、牛环曲病毒、牛源沙门氏菌、牛源大肠杆菌进行检测，均无扩增曲线，表明该方法具有良好的特异性。
实施例6一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a检测方法的敏感性检验
本实施例进行牛病毒性腹泻病毒敏感性实验：
将浓度为1×107copies/mL的阳性质粒(PUC57插入JQ612705.1目的基因)进行10倍梯度稀释。取102copies/mL的质粒进行2倍稀释。取1×107copies/mL～102copies/mL，50copies/mL，25copies/mL，12.5copies/mL各梯度浓度质粒作为模板，无核酸酶水作为阴性对照，进行RAA-CRISPR-Cas12a试剂的敏感性检测。反应条件和反应体系同实施例3。
扩增结果见图9，将上述扩增反应物用凝胶成像仪在紫外灯302nM激发，进行结果判读并拍照，结果见图10。
由图10可知牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a的检测方法可对牛病毒性腹泻病毒阳性质粒检测最低检测限为25copies/mL。所述检测方法具有敏感性高的特点。
结果表明，采用本发明方法检测，牛病毒性腹泻病毒阳性质粒的最低检测限为25copies/mL，本方法敏感性较高。
实施例7一管式牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a检测方法的重复性检验
选取上述1×107copies/mL的牛病毒性腹泻病毒阳性质粒，分别进行批内重复检测和批间重复检测。批内重复检测：将阳性质粒在同一批实验中进行3个重复。批间重复实验：将阳性质粒分3个批次检测。反应条件和反应体系同实施例3。
扩增结果见图11和图13，将上述扩增反应物用凝胶成像仪在紫外灯302nM激发，进行结果判读并拍照，结果见图12和图14。
由图11可知RAA-CRISPR CAS12a的检测方法对牛病毒性腹泻病毒阳性质粒的1×107copies/mL均有扩增曲线，且批内荧光信号，CT值基本一致。所述检测方法批内重复性较好。
由图12可知同一批次的牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a对阳性质粒1×107copies/mL均可检测到白光，说明检测方法批内重复较好。
由图13可知RAA-CRISPR CAS12a的检测方法对牛病毒性腹泻病毒阳性质粒的1×107copies/mL均有扩增曲线，且批间荧光信号，CT值基本一致。所述检测方法批间重复性较好。
由图14可知3个批次的牛病毒性腹泻病毒RAA-CRISPR CAS12a对阳性质粒1×107copies/mL均可检测到白光，说明检测方法批间重复较好。
结果表明：本发明方法重复性良好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合，其特征在于，包括：牛病毒性腹泻病毒RAA上游引物和牛病毒性腹泻病毒RAA下游引物；所述牛病毒性腹泻病毒RAA上游引物的序列如SEQID No.1所示，所述牛病毒性腹泻病毒RAA下游引物的序列如SEQ IDNo.2所示。
2.crRNA分子，其特征在于，序列如SEQ ID No.3所示。
3.检测牛病毒性腹泻病毒的RAA-CRISPR CAS12a反应体系，其特征在于，包括权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合和权利要求2所述的crRNA分子。
4.根据权利要求3所述的RAA-CRISPR CAS12a反应体系，其特征在于，还包括报告基因ssDNA和LbCas12a蛋白；
所述ssDNA的序列如SEQ ID No.10所示并标记有可产生荧光色的荧光基团；
优选，LbCas12a蛋白和crRNA分子的浓度比为(0.1-0.6)：(0.5-3.0)，更优选为0.3：1.5。
5.根据权利要求4所述的RAA-CRISPR CAS12a反应体系，其特征在于，包括：2.0～6.0mmol/L dNTP、0.2～1.1μmol/L单链结合蛋白、1.0～2.0μmol/L重组酶蛋白、0.2～1.2U/μlDNA聚合酶、10～60mmol/L TrisHCl、40～80mmol/LNaCl、6～12mmol/L二硫苏糖醇、1.0～5.0μmol/L牛病毒性腹泻病毒RAA上游引物、1.0～5.0μmol/L牛病毒性腹泻病毒RAA下游引物、0.2～3.0μmol/L crRNA、0.1～0.6μmol/L LbCas12a、0.1～1.0U/μLExo核酸外切酶、10～60nmol/L ssDNA和0.4～1.2U/μL RNase Inhibitor。
6.权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合或权利要求2所述的crRNA分子或权利要求3-5任一项所述的RAA-CRISPR CAS12a反应体系在以下任一方面中的应用：
(1)非疾病诊断或治疗目的的检测牛病毒性腹泻病毒；
(2)制备一管式牛病毒性腹泻病毒检测冻干粉、冻干液、冻干管或试剂盒。
7.一种非疾病诊断或治疗目的的检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于，应用权利要求3-5任一项所述的RAA-CRISPR CAS12a反应体系对待测样本的核酸进行扩增，若报告基因ssDNA通道出现扩增曲线或扩增产物在紫外灯下表现为白光，则判断所述待测样本中含有牛病毒性腹泻病毒。
8.一种牛病毒性腹泻病毒检测产品，其特征在于，包括权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒RAA检测引物组合、权利要求2所述的crRNA分子或权利要求3-5任一项所述的RAA-CRISPR CAS12a反应体系中的一种或多种；所述产品为冻干粉、冻干液、冻干管或试剂盒。
9.根据权利要求8所述的牛病毒性腹泻病毒检测产品，其特征在于，当所述产品为冻干液时，还包括10～13mmol/L的海藻糖、20～24mmol/L的甘露醇和5～21％的牛血清白蛋白。
10.根据权利要求8所述的牛病毒性腹泻病毒检测产品，其特征在于，当所述产品为冻干粉或冻干管时，冻干流程为：先于-80℃冷冻1～2h再进行设备冻干；所述设备冻干包括：预冻阶段、设备抽真空、冷冻干燥和解析干燥阶段；所述解析干燥阶段的条件为：将隔板温度升至-20～-25℃保持12～14h，然后将隔板温度升至4～8℃并保持0.5～1h，最后将隔板降至20～25℃并保持3～6h。
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