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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Präparation von DNA aus Serum
und Plasma, insbesondere zur Verwendung als ein Target in Amplifizierungsreaktionen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Technologie im Gebiet der Amplifizierung und Detektion von Nukleinsäuren schreitet
schnell fort, insbesondere in Bezug auf kommerzielle Diagnosetests,
welche frühe
Detektion von infektiösen
Krankheiten, Krebs und genetischen Störungen ermöglichen.
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Hochentwickelte
Techniken für
die Amplifizierung von winzigen Mengen von Nukleinsäuren, wie
die PCR (Polymerase-Kettenreaktion), sind heutzutage gut bekannt
(siehe U. S.-Patente Nrn. 4,683,195; 4,683,202 und 4,965,188). Die
inhärente
Sensitivität
der PCR, d. h. ihre Fähigkeit,
sehr geringe Konzentrationen einer Target-DNA zu amplifizieren,
bedeutet, daß geringe
Mengen Übertrag
an PCR-Produkten und Verunreinigung zwischen Proben zu falsch positiven
Ergebnissen führen
können. Übertrag
und Probenkontamination sind unter anderen Dingen eine Funktion
der Anzahl der Manipulationen einer Probe, die während der Aufbereitung benötigt werden.
Daher ist eine einfache Prozedur mit einer minimalen Anzahl von
Schritten, die die Probe der Umgebung aussetzen, sehr erstrebenswert.
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Traditionell
wurde die PCR-Identifizierung von Virämie, die durch infektiösen humanen
Zytomegalovirus (HCMV) verursacht wird, und die Identifizierung
anderer Viren und Bakterien an peripheren Blutleukozyten (WBCs),
die von Vollblut erhalten wurden, durchgeführt. Die Separation von WBCs
von Vollblut ist gewöhnlicherweise
vor der Extraktion der HCMV-DNA aus den WBCs erforderlich. Verfahren
für diese
Separation beinhalten Erythrozyten-Sedimentation in einer Dextranlösung (Rasmussen
et al., J. Infect. Dis. 171:177–82, 1995),
Differentiallyse unter Verwendung von Ammoniumchloridlösungen (U.S.-Patent
Nr. 5,702,884 Ekeze et al.) oder die Anwendung von kommerziell erhältlichen
Verfahren (wie zum Beispiel CPT VacutainerTM-Röhrchen von
Becton-Dickinson). Typischerweise beinhalten diese Verfahren einen
Waschschritt, welcher in der Entfernung von potentiellen Inhibitoren
der Amplifizierung resultieren; alternativ dient die Isolierung
von WBCs zur Entfernung dieser Inhibitoren, welche sich typischerweise
in hohen Konzentrationen in Plasma oder Serum befinden.
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Nachdem
die WBCs isoliert werden, werden sie lysiert und die DNA wird extrahiert.
Dies involviert Verfahren, wie zum Beispiel Kochen, Sonifizieren
oder Einfrieren-Auftauen der WBCs oder die Anwendung von proteolytischen
Enzymen und/oder oberflächenaktiven
Stoffen, um die Zellen zu lysieren und die DNA zu extrahieren. DNA-Extraktion
kann auch alkalische Lyseschritte beinhalten (U.S.-Patent Nr. 5,639,599).
Oftmals wird eine rigorosere Extraktion/Reinigung durchgeführt, um
weiterhin sicherzustellen, daß die
gereinigte DNA, ohne potentielle Inhibitoren erhalten wird, eingeschlossen
zum Beispiel die Anwendung von Glaskügelchen (Gene Clean II Kits,
Bio 101, Inc.), Phenol-Chloroform-Extraktionsverfahren, Polymer-Einfang
(U.S.-Patent Nr. 5,582,988), Spin-Säulenadsorption (Qiagen QIAamp
Kits) und andere kommerziell erhältliche
DNA-Isolierungskits (Puregene, Gentra Systems Inc.).
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In
besonderem Maße
können
Verfahren, die zur Isolierung und Lyse von WBCs verwendet werden, die
zum Waschen oder Entfernen potentieller Inhibitoren aus der WBC-Präparation
dienen, nicht mit Plasma und Serum verwendet werden. Da sich die
große
Mehrheit der endogenen biochemischen Substanzen und konsumierten
Wirkstoffe, Metabolite von Wirkstoffen und ähnliches im Serum und Plasma
befinden und stark konzentriert sind, besteht in der Technik Bedarf
für ein
schnelles und robustes Verfahren, das mit dem Serum und Plasma verwendet
werden könnte,
welches die potentiellen Inhibitoren entfernen oder diese unwirksam machen
würde.
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Extrazelluläre HCMV-Nukleinsäure in infizierten
Individuen ist in Plasma und Serum anwesend. Serum und Plasma gewinnen
an Akzeptanz als Proben der Wahl für die Detektion von HCMV-Nukleinsäure unter
der Verwendung von PCR. Normalerweise existiert die Target-DNA nicht
als freie DNA, sondern eher als eine komplexe Assoziation von DNA,
RNA und Proteinen. Die DNA muß aus
dem Komplex extrahiert und denaturiert werden, um sie für die Amplifizierung
verfügbar
zu machen. Serum- und Plasmaproben werden typischerweise Hitze,
Oberflächen-aktiven
Stoffen ausgesetzt und mit Proteasen behandelt. Oftmals werden zusätzliche
rigorose Protokolle zur Extraktion der Target-DNA verwendet, wie
zum Beispiel diejenigen, die oben für WBCs beschrieben wurden (Spector
et al., J. Clin. Microbiol. 30:2359–65, 1992; Nolte et al., J.
Clin. Microbiol. 33:1263–66,
1995; Wolf et al., Transplantation 56:330–4, 1993; Patel et al., J.
Clin. Microbiol. 32:1432–4, 1994).
Alkalibehandlung wurde auch verwendet. Jedoch erfordert diese Alkalibehandlung
typischerweise eine hohe NaOH-Konzentration
gefolgt von einem Neutralisationsschritt (Hansen et al., J. Infect.
Dis. 170:1271–4, 1994).
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Daher
besteht in der Technik Bedarf für
ein schnelles und effizientes Verfahren zur Extraktion von DNA aus
Serum und Plasma, das mit PCR-Amplifizierungsmethoden kompatibel
ist.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Extraktion von DNA
aus Serum- oder
Plasmaproben zur Verfügung.
Das Verfahren umfaßt:
- (i) in Kontakt bringen von Serum oder Plasma
mit Alkali, um alkalisiertes Serum oder Plasma zu erhalten;
- (ii) Erhitzen des alkalisierten Serums oder Plasmas auf eine
Temperatur zwischen 100 und 110°C
für eine Zeit
zwischen 5 und 20 Minuten, um erhitztes alkalisiertes Serum oder
Plasma zu erhalten;
- (iii) Zentrifugieren des erhitzten alkalisierten Serums oder
Plasmas, um einen DNA-enthaltenden Überstand zu erhalten; und
- (iv) Erhalten des besagten DNA-enthaltenden Überstands.
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In
einem bevorzugten Aspekt wird nach dem besagten Erhitzungsschritt
(ii) und vor dem besagten Zentrifugationsschritt (iii) das erhitzte
alkalisierte Serum oder Plasma gekühlt oder es wird ihm erlaubt,
auf Raumtemperatur zu kühlen.
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In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Detektion
der erwarteten Anwesenheit eines DNA-enthaltenden Mikroorganismus,
zum Beispiel humaner Zytomegalovirus (HCMV), in Serum oder Plasma
zur Verfügung.
Die Methode umfaßt:
- (i) in Kontakt bringen von Serum oder Plasma
mit Alkali, um alkalisiertes Serum oder Plasma zu erhalten;
- (ii) Erhitzen des besagten alkalisierten Serums oder Plasmas
auf eine Temperatur im Bereich zwischen 100 und 110°C für eine Zeit
im Bereich von 5 und 20 Minuten;
- (iii) Zentrifugieren des besagten erhitzten alkalisierten Serums
oder Plasmas, um einen DNA-enthaltenden Überstand zu erhalten;
- (iv) Erhalten des besagten DNA-enthaltenden Überstands;
- (v) Zuführen
der besagten DNA in besagtem Überstand
zu einer Amplifizierung unter der Verwendung von Oligonukleotidprimern,
die Sequenzen innerhalb der DNA des besagten DNA-enthaltenden Mikroorganismus
erkennen, um Amplifizierungsprodukte zu bilden, die spezifisch für besagten
DNA-enthaltenden
Mikroorganismus sind; und
- (vi) Detektieren besagter Amplifizierungsprodukte, wobei die
Detektion der besagten Amplifizierungsprodukte die Anwesenheit von
besagtem Mikroorganismus in besagtem Serum oder Plasma indiziert.
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In
einem bevorzugten Aspekt wird nach dem besagten Erhitzungsschritt
(ii) und vor dem besagten Zentrifugationsschritt (iii) besagtes
erhitztes alkalisiertes Serum oder Plasma gekühlt oder es wird ihm erlaubt, auf
Raumtemperatur abzukühlen.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein einfaches, schnelles und hocheffizientes
Verfahren zur Extraktion von DNA aus Serum- und Plasmaproben zur
Verfügung,
welches in DNA-Präparationen
resultiert, die ohne weitere Manipulation für die nachfolgenden Detektions-Assays geeignet sind.
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Das
Verfahren umfaßt
die Schritte von:
- (i) in Kontakt bringen von
Serum oder Plasma mit Alkali, um alkalisiertes Serum oder Plasma
zu erhalten;
- (ii) Erhitzen des alkalisierten Serums oder Plasmas auf eine
Temperatur zwischen 100 und 110°C
für eine Zeit
zwischen 5 und 20 Minuten;
- (iii) Zentrifugieren des erhitzten alkalisierten Serums oder
Plasmas; und
- (iv) Erhalten des DNA-enthaltenden Überstands.
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Es
wird bevorzugt, daß im
Anschluß an
das Erhitzen und vor dem Zentrifugieren das erhitzte alkalisierte
Serum oder Plasma gekühlt
wird oder ihm erlaubt wird, auf Raumtemperatur, d. h. auf 25°C abzukühlen. Das
Kühlen
kann passiv, d. h. durch einfaches Äquilibrieren mit Raumtemperatur,
oder aktiv sein, d. h. das erhitzte alkalisierte Serum oder Plasma
kann im Kühlschrank
gekühlt
werden, auf Eis plaziert oder in ein Wasserbad gegeben werden, bis
die Temperatur des erhitzten alkalisierten Serums oder Plasmas Raumtemperatur erreicht.
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In
der Ausführung
der vorliegenden Erfindung beinhaltet das geeignete Alkali, aber
ist nicht limitiert auf, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid
oder eine Mischung von jedem der Vorangegangenen. Bevorzugt wird
Natriumhydroxid verwendet. Die Endkonzentration von Alkali in der
Mischung, die in Schritt (i) präpariert
wird, befindet sich im Bereich von 10 bis 90 mM und am meisten bevorzugt
von 15 bis 50 mM. Besonders hervorgehoben wird eine Alkalikonzentration
von 20 mM. Ein bevorzugtes Verfahren beinhaltet die Bildung einer
Mischung aus einem Volumenteil Serum oder Plasma mit vier Volumenteilen
einer wäßrigen Lösung von
25 mM Alkali.
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Die
Temperatur, auf welche das alkalisierte Serum oder Plasma erhitzt
wird, ist bevorzugterweise 105°C
und die Zeit ist bevorzugterweise 5 Minuten. Der Zentrifugationsschritt
wird bevorzugterweise bei Umgebungstemperatur für 2 Minuten bei 16.000 × g durchgeführt.
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Der Überstand,
der von der zentrifugierten Mischung erhalten wird, kann direkt
zu einer PCR-Amplifizierungsbeimischung addiert werden. Jedoch kann
der Überstand
auch durch weitere Behandlung oder Zugabe von Reagenzien, wie gewünscht, vor
der Zugabe der PCR-Beimischung modifiziert werden. Die erfindungsgemäße Behandlung
mit Alkali dient dazu, PCR-Inhibitoren zu inaktivieren und Proteine
zu denaturieren, insbesondere Nukleasen, die die Target-DNA bis
zu einem Punkt degradieren können,
an dem sie nicht mehr amplifiziert werden kann. Es dient auch der
Denaturierung der DNA, es macht sie der Hybridisierung mit den Amplifikationsprimern
mehr zugänglich
und somit der PCR-Amplifizierung. Zusätzlich reduziert die Einfachheit
der Methode die Wahrscheinlichkeit der Proben-zu-Proben-Verunreinigung und
PCR-Produktübertragung
in starken Maße.
Sie eliminiert außerdem
den Bedarf an teuren und oftmals instabilen Materialien, die routinemäßig für die Nukleinsäure-Isolierung und -Reinigung
verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung ist sinnvoll in der Vorbereitung von DNA-Proben
für diagnostische
Assays, insbesondere solche, die DNA-Viren, wie zum Beispiel Zytomegalovirus, Herpes
Simplex-Virus, Epstein-Barr-Virus, Hepatitis B-Virus und jedes im
Blut enthaltene Bakterium, detektieren. Detektionsmethoden, in welchen
die DNA-Präparationen
verwendet werden können,
beinhalten ohne Einschränkung
jede Methode, die Hybridisierung, einschließlich zum Beispiel Polymerase-Kettenreaktion,
Ligase-Kettenreaktion und ähnliches
beinhalten. Daher umfaßt
die vorliegende Erfindung Methoden für die Detektion von DNA-enthaltenden Mikroorganismen,
welche umfassen: die Alkalisierung von Serum oder Plasma einer Testperson,
das Erhitzen des alkalisierten Serums oder Plasmas auf zwischen
100°C und
110°C für eine Zeitspanne
im Bereich von 5 bis 20 Minuten, Zentrifugieren, um einen DNA-enthaltenden Überstand
zu erhalten, Erhalten des Überstandes, Amplifizieren
der DNA im Überstand
unter der Verwendung von Primern, die spezifisch für die DNA
des DNA-enthaltenden
Organismus sind, wobei Amplifikationsprodukte gebildet werden, die
spezifisch für
den Mikroorganismus sind, und danach Detektieren der Amplifikationsprodukte,
wobei deren Anwesenheit indiziert, daß der Mikroorganismus im Blut
oder Serum der Testperson anwesend ist.
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Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsbeispiele
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Die
folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung ohne
Einschränkungen.
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Methoden
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1. Serum- und Plasmaproben
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Vollblutproben
werden in VacutainerTM-Röhrchen, die Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
oder andere anti-Coagulantien, wie Heparin und Oxalat enthalten,
gesammelt um Plasma zu erhalten, oder Vollblutproben werden gesammelt
ohne Anticoagulanz gesammelt, um Serum zu erhalten.
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2. Probenvorbereitung
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20 µl Serum
oder Plasma werden zu 80 µl
einer 25 mM NaOH-Lösung,
die 0,334 µg/ml
Kalbthymus-DNA enthält,
und 1,67 Doppelstrangkopien pro µl einer Internen-Positiv-Kontrolle (IPC)-Plasmid-Target-DNA
in einem Schraubdeckel-Mikrozentrifugenröhrchen addiert. Die Mischung
wird gevortext, dann auf 105°C
für 5 Minuten
erhitz. Den Proben wird erlaubt, sich auf Raumtemperatur einzustellen,
und bei 16.000 × g
für zwei
Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. 25 µl des Überstandes werden zu 75 µl einer
PCR-Reaktionsbeimischung
(Zusammensetzung wie unten beschrieben) addiert und amplifiziert.
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3. Polymereinfang-Kontrolle
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Das
Verfahren zur Extraktion von DNA unter der Verwendung von Polymer-Einfang
wurde ausgeführt wie
in Beispiel 3 des U.S.-Patents Nr. 5,582,988 beschrieben, mit der
Ausnahme, daß 20 µl Serum
oder Plasma in den Experimenten, die hierin beschrieben sind, verwendet
wurden. Der DNA-Polymerkomplex wurde pelletiert und der Überstand
verworfen (von dem erwartet wird, daß er die potentiellen PCR-Inhibitoren
enthält). Die
DNA wurde dann von dem Pellet unter der Verwendung von 100 µl einer
20 mM NaOH-Lösung
eluiert und auf 105°C
für 5 Minuten
erhitzt, gefolgt durch einen 2-Minuten-Zentrifugationsschritt. Der Überstand
(25 µl) wurde
zu 75 µl
einer PCR-Reaktionsbeimischung addiert und amplifiziert. Das Polymer-Einfangverfahren
wurde als eine Kontrolle zum Vergleich mit der vereinfachten DNA-Extraktionsmethode
der vorliegenden Erfindung verwendet.
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4. PCR-Amplifizierung
und Detektion
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Die
PCR-Reaktionsbeimischung bei pH 8,0 beinhaltete 160 U/ml einer rekombinanten
Taq-Polymerase; 5,28 μg/ml
TP4-9,2 (ein 5-facher Überschuß) und 53,37 μg/ml TP1-12,2
anti-Taq-Antikörper;
18 mM Tris-Puffer, 54 mM Kalziumchlorid; 0,2 μM von jedem IPC-Primer (IPC-F1 (vorwärts): Biotin-
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' <SEQ ID NO:1> und IPC-R1 (rückwärts) 5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3' <SEQ ID NO:2>); 0,4 μM
von jedem CMV-Test spezifischen Primer (LB42M (vorwärts) mit der
Sequenz: Biotin- 5'-TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT-3' <SEQ ID NO:3> und Primer LB41 (rückwärts) 5'-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT-3' <SEQ ID NO:4>); 1,2 mM Gesamtmenge Desoxynukleosidtriphosphate
(dNTPs); 4 mM Magnesiumchlorid, 9,5% Glyzerol und ein Konservierungsstoff.
Typischerweise wird der Taq-Polymerase und den anti-Taq-Antikörpern erlaubt,
bei Raumtemperatur für
10 Minuten zu prä-inkubieren,
und das MgCl2 wurde als eine separate Lösung bereitgestellt,
um kurz vor der Probenzugabe addiert zu werden. Die CMV-Assay spezifischen
Primer wurden entworfen, um komplementär zur DNA, die das pp65-Matrix-Protein
des CMV-Late-Gens in Patientenproben kodiert zu sein. Die IPC-Target- und CMV-pp65-Matrix-Protein-Targetsequenzen
wurden in das Bluescript-Plasmid (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert,
um als Assaykontrollen verwendet zu werden. Diese wurden genau durch
spektrophotometrische Analyse quantifiziert und entsprachen der
Poisson's-Verteilung. Die Sequenz
der internen Positiv-Kontroll-Target-DNA, die verwendet wurde, war:
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25 µl der verarbeiteten
Probe wurden zu 75 µl
der PCR-Reaktionsbeimischung addiert. Nach der Zugabe und dem Mischen
wurde die Reaktionsbeimischung in die Amplifikationsblister eines
Plastik-PCR-Beutelbehältersystems
(Johnson & Johnson
Clinical Diagnostics, Inc., U.S.-Patent Nrn. 5,089,233; 5,229,297
und 5,380,489) eingeführt.
Amplifizierung und Detektion wurden unter der Verwendung eines PCR-Amplifikations- und
Detektionsbearbeitungsinstrumentes (Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc.,
U.S.-Patent Nr. 5,567,617) durchgeführt. Nach einem initialen Vorerhitzen
für 3 Minuten
bei 96°C
wurde die Probe 40 Amplifizierungszyklen ausgesetzt, alternierend
zwischen 96°C
(5 Sekunden) Denaturierungen und 70°C (40 Sekunden) Anlagerungsschritten.
Nach einem 5-minütigen
Nacherhitzen bei 103°C
wurden die amplifizierten Produkte in die Detektionskammer des Beutels
eingefügt,
der die Kontroll- und Assay-spezifischen Sonden, die an Einfangkugeln
geknüpft
waren (Tabelle 1), enthielt.
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INC-26.7a
dient als eine interne negative Kontrolle und es wird erwartet,
daß sie
kein Signal in einem richtig funktionierenden PCR-Beutel ergibt.
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Die
Farbbildung an den Einfangkugeln wurde dann visuell abgelesen und
mit einer Farbauswertekarte verglichen, die zehn Abstufungen von
zunehmender blauer Farbe und korrespondierende Zahlen im Bereich von
0 bis 10 (0 = kein Signal, 10 = hohes positives Signal) hat. Eine
visuelle Auswertung über
2 indiziert ein positives Testergebnis an dieser Eingangkugel. Zusätzlich wurden
Reflektionsdichte (Dr)-Messungen des PCR-Bearbeitungsinstruments
aufgezeichnet. Dr-Meßwerte über 0,13 indizierten ein positives
Ergebnis.
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Beispiel 1 Extraktion von
DNA aus Plasma unter der Verwendung des Verfahrens der vorliegenden
Erfindung: Vergleich mit Polymer-Einfang
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Das
folgende Experiment wurde durchgeführt, um das Extraktionsverfahren
der vorliegenden Erfindung mit dem Polymer-Einfangverfahren zu vergleichen.
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Plasmaproben
von 65 Patienten wurden gemäß des Verfahrens
der vorliegenden Erfindung und des Polymer-Einfangverfahrens hergestellt,
wie oben beschrieben. Es wurden 20 µl- und 50 µl-Proben im Polymer-Einfangverfahren
verwendet.
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Alle
diese Proben hatten zuvor ein "kein
Test"-Ergebnis ausgelöst, als
sie unter der Verwendung von 50 µl-Probenvolumen, die durch
das Polymer-Einfangprotokoll vorbereitet waren, in einer initialen
Auswertung ausgewertet wurden. Ein "kein Test"-Ergebnis passiert, wenn die interne
Positiv-Kontroll-Einfangkugel einen falsches negatives Ergebnis
ergibt. Das IPC-Kontrollplasmid, das in die Proben eingeführt wurde,
war bei zehn Kopien pro Endreaktionsbeimischung anwesend. Alle vorbereiteten
Proben wurden mit der PCR-Reaktionsbeimischung
vereinigt und unterlagen Amplifizierung und Detektion, wie oben
beschrieben.
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Die "kein Test"-Frequenz im Polymer-Einfang
im Vergleich zum Verfahren der Erfindung für Plasmaproben ist in Tabelle
2 unten zusammengefaßt.
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Das
50 µl
Polymer-Einfangprotokoll zeigte eine "kein Test"-Frequenz von 21 %, wohingegen das 20 µl Polymer-Einfangprotokoll
und das 20 µl
Protokoll der vorliegenden Erfindung eine 0% Fehlerrate aufwiesen. Bei
beiden Polymer-Einfangprotokollen gab es Anzeichen für ein reduziertes
Signal an einigen Proben und die interne Positiv-Kontrolle grenzte
an negativ.
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Daher übertraf
das Verfahren der Erfindung die 50 µl Polymer-Einfangprozedur
erheblich und zeigte eine Verbesserung gegenüber der 20 µl Polymer-Einfangprozedur
in Bezug auf falsch negative Ergebnisse an der IPC-Einfangkugel.
Die Proben, die unter der Verwendung der 50 µl Polymer-Einfangprozedur
hergestellt wurden, beinhalteten nachweislich Inhibitoren der PCR
oder zeigten einige andere Phänomene,
die mit dem Polymer-Einfang assoziiert sind.
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Zusätzlich gab
es einen Fall bei der Verwendung der 20 µl Polymer-Einfangtechnik,
wo ein falsch positives Ergebnis an der CMV (LBSA-11)-Einfangkugel
von einer CMV Negativ-Patientenprobe erhalten wurde. Da das korrespondierende
50 µl-Ergebnis
negativ war (und 2,5-fach mehr CMV-Target-DNA von der Patientenprobe
zur Verfügung
gestellt hätte,
wenn es wirklich anwesend gewesen wäre), veranschaulicht dieses
Ergebnis die Komplikationen in einem Verfahren mit multiplen Manipulationen,
wie z.B. Produktübertrag.
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Beispiel 2: Extraktion von
DNA aus Serum unter der Verwendung des Verfahrens der vorliegenden
Erfindung: Vergleich mit Polymer-Einfangen
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DNA
wurde von Serumproben extrahiert, die von 100 CMV IgG-Positiv, IgM-Negativ
OB/GYN-Patienten erhalten wurde, die vom Texas Children's Hospital in Houston
TX zur Verfügung
gestellt wurden, unter der Verwendung von 20 µl Probe in der Polymer-Einfangprozedur und
der Methode der Erfindung (siehe Beispiel 1 oben). Vor der Probenvorbereitung
wurde CMV-Kontrollplasmid-DNA zu jeder Probe addiert, um eine endgültige Einzelstrang-Kopiezahl
von 20 CMV-Plasmid-Targets in der PCR-Reaktionsbeimischung zu erhalten. Das
IPC-Kontrollplasmid wurde ebenso in die Proben zu einem Endspiegel
von 10 Kopien pro PCR-Reaktionsbeimischung eingeführt. Alle
vorbereiteten Proben wurden mit der PCR-Reaktionsbeimischung vereinigt wie
oben beschrieben. Amplifizierung und Detektion wurden wie zuvor
in Duplikat in PCR-Beuteln durchgeführt.
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Die
Frequenz der falsch negativen Ergebnisse im Polymer-Einfang im Vergleich
zur Methode der Erfindung unter der Verwendung von Serum sind in
Tabelle 3 unten zusammengefaßt.
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Keine
der Probenvorbereitungsverfahren ergaben negative Ergebnisse an
der IPC-Einfangkugel.
Jedoch resultierte die Zugabe von CMV-Plasmid-Target zu den Proben
in einer 5% falsch negativ Frequenz an der CMV-Kugel, wenn die Polymer-Einfangmethode
verwendet wurde, eine potentielle Inhibition der PCR indizierend.
Im Gegensatz dazu gab es keine falsch negativen CMV-Kugelergebnisse
unter der Verwendung der Methode der vorliegenden Erfindung.
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Beispiel 3: Extraktion von
DNA aus Plasma von einer CMV-Patientenpopulation unter der Verwendung
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung: Vergleich mit GeneClean
II-Probe
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Das
folgende Experiment wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit des
Verfahrens der vorliegenden Erfindung in der Extraktion von DNA
von Patientenproben zu untersuchen.
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Plasmaproben
wurden entweder (i) extrahiert unter der Verwendung der GeneClean
II-Methode (Bio 101,
Inc.) und charakterisiert unter der Verwendung eines sehr sensitiven
P32 Flüssig-Hybridisierungs-CMV-PCR-Assays
und eines direkten Gel-CMV-PCR-Assays oder (ii) extrahiert unter
der Verwendung der Methode der vorliegenden Erfindung und wie oben
in Beispiel 1 beschrieben, untersucht. Das IPC-Kontrollplasmid,
welches in jede Probe eingeführt
wurde, war bei 25 Doppelstrangkopien pro Endreaktionsbeimischung
anwesend. Alle Proben wurden mit der PCR-Reaktionsbeimischung vereinigt,
gefolgt von Amplifizierung und Detektion im Duplikat in PCR-Beuteln,
wie oben.
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Die
Ergebnisse an der CMV-Einfangkugel sind in Tabelle 4 unten gezeigt.
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Tabelle 4
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Die
Methode der vorliegenden Erfindung im Vergleich zur GeneClean II-Probenvorbereitung
von Plasmaproben
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Alle
positiven TCH-Plasmaproben wurden als sehr gering positive Proben
betrachtet, da alle nur im flüssigen
Hybridisierungsassay positiv und negativ auf direktem Gel waren,
was einen niedrigen Kopiespiegel von CMV in der Probe indiziert.
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Es
gab eine 80%-ige Übereinstimmung
zwischen den zwei Probenvorbereitungsmethoden. Unter der Verwendung
der Methode der vorliegenden Erfindung ergaben, 10 der 12 Proben
ein positives Ergebnis der GeneClean-Methode und zwei ergaben negative
Ergebnisse. Nach dem wiederholten Testen der Probenvorbereitungen
wurde eine der original zwei falsch negativen Proben positiv. Für die negativen
GeneClean-Plasmaproben ergab sich eine ähnliche Situation. Bei den
13 negativen Proben ergaben beide Probenvorbereitungsmethoden übereinstimmende
Ergebnisse für
10 der Proben (die gleichen 10).
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Zusätzlich gab
es drei Fälle,
wo die Methode der vorliegenden Erfindung eine CMV positive Probe
anzeigte. Nach wiederholter Testung der Probenvorbereitungen ergaben
zwei dieser drei Proben erneut ein positives CMV-Ergebnis. Aufgrund
der inhärenten
Sensitivität
ist dies eine gewöhnliche
Beobachtung in PCR-Assays, wo sehr geringe Targetproben diskrepierende
Ergebnisse ergeben. Dies wird basierend auf einer erwarteten Poisson-Probenverteilung
vorhergesagt.
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Beispiel 4: Zugabe von potentiell
störenden
Substanzen, die zum Plasma zugegeben werden
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Das
folgende Experiment wurde durchgeführt, um die Fähigkeit
des Verfahrens der Erfindung zu testen, potentiell störende Substanzen
aus dem Plasma zu entfernen.
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Normale
Plasmaprobenpools wurden behandelt, um den pH-Wert zu variieren
und um Zusätze
von Blutspendeproben und andere Substanzen zuzugeben, von denen
bekannt ist oder von denen erwartet wird, daß sie fähig sind, die Probenvorbereitung,
Amplifizierung oder Detektion zu stören. Die Verbindungen wurden zu
einer Probe zu drei Zeiten des geschätzten Spitzenserumspiegels
zugegeben (Tabelle 5).
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DNA
wurde von 20 µl
jeder Probe extrahiert unter der Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung
und der Polymer-Einfangmethode aus dem Stand der Technik, wie in
Beispiel 1 oben beschrieben. Die IPC- und CMV-Plasmide waren bei
jeweils 25 und 10 Doppelstrangkopien in der endgültigen PCR-Reaktionsbeimischung
anwesend. Die Hälfte
der Proben enthielt nur das IPC-Plasmid, um falsch-positive Ergebnisse
evaluieren zu können
(Farbzunahme an der CMV-Sondenkugel), die aufgrund von Proben-Kreuzkontamination
oder Produktübertrag
entstehen könnten.
Alle Proben wurden mit der PCR-Reaktionsbeimischung vereinigt, gefolgt
von Amplifizierung und Detektion in PCR-Beuteln. Für jede Verbindung wurden
vier Beutel für jeweils
die 0 und 10 CMV-Kopiespiegel durchgeführt. Zusätzlich wurden die geeigneten
Kontrollen, die die verschiedenen Lösungsmittel enthielten (Wasser,
Aceton, Ethylalkohol), die in der Vorbereitung der Verbindungen für den Einschluß in den
Assay verwendet wurden, durchgeführt.
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Schlüssel: *+
indiziert positive Ergebnisse an allen CMV- und IPC-Einfang-Kugeln,
wo Targets anwesend waren; FP = falsch-positiv; FN = falsch-negativ
(CMV Negativ-Ergebnisse
an erwarteten CMV Positiv-Einfangkugeln, wo CMV bei einem 10 Kopiespiegel eingegeben
wurde); NT = "kein
Test" IPC-Einfangkugel ist
negativ an einer erwarteten CMV Negativ-Probe (CMV=Neg);
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Während der
Eingangsuntersuchung gab es einige wenige sporadische falsch negative
Ergebnisse an beiden, den CMV- und IPC-Einfangkugeln, und einige "kein Test"-Ergebnisse für jede der
Probenvorbereitungsmethoden, obwohl sie vorwiegend an Polymer-Einfangproben gesehen
wurden. Zusätzlich
ergaben einige der Kontrollen unerwartete negative Ergebnisse und
es gab Anzeichen von Beutelversagen, die zu diesem beitrugen.
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Nach
dem wiederholten Testen der zuvor vorbereiteten Proben lösten alle
Ergebnisse für
alle getesteten Substanzen positive Ergebnisse für das Polymer-Einfangen und
die Methode der vorliegenden Erfindung mit Ausnahme der 25%-Blutproben
(25 Volumenteile Vollblut addiert zu 25 Volumenteilen von Plasma
vor der DNA-Extraktion), die unter der Verwendung der Polymer-Einfangmethode
vorbereitet wurden. Zwei der vier Proben, die nur IPC-Target (kein
CMV-Target) enthielten, zeigten erneut "kein Test"-Ergebnis an den IPC-Einfangkugeln.
Auch zeigten drei der vier Proben, die IPC und CMV-Target-DNA enthielten,
Inhibierung an den IPC-Einfangkugeln mit visuellen Auswertungen
von nur "1 ". Für zwei von
diesen indizierte die CMV-Einfangkugel auch Zeichen von Inhibierung
(visuelle Farbauswertung von "3" und "4"). Auch gab es erneut einen Fall von
einem falsch positiven Ergebnis unter der Verwendung der Polymer-Einfangtechnik
(bei der niedrigen pH-Variation), was erneut den Bedarf für eine einfache
Prozedur mit einem Minimumanzahl von Schritten zeigte, um Übertragskontamination
zu vermeiden.
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Diese
Ergebnisse zeigen, daß 25%-Vollblut
inhibierend im HCMV-Assay ist, wenn Proben unter der Verwendung
der Polymer-Einfangmethode vorbereitet werden. Im Gegensatz dazu
resultierte die Extraktion von DNA unter der Verwendung des Verfahrens
der vorliegenden Erfindung in keiner Inhibierung von PCR-Amplifizierung
und Detektion. Das ist signifikant, weil Serum- und Plasmaproben
in klinischen Laboratorien oftmals mit roten Blutzellen kontaminiert
sind. Außerdem
ist die Polymer-Einfangtechnik aufwendiger und erlaubt, daß die Probe
stärker
der Umwelt ausgesetzt wird im Vergleich zur Methode der vorliegenden
Erfindung, die sich im Vergleich mit dem Polymer-Einfang als vorteilhaft
erweist.
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DNA-Extraktion
unter der Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung resultiert
nicht in der Inhibierung von PCR-Amplifizierung oder Detektion von
amplifizierten Produk ten mit jeder der getesteten Substanzen. Diese
einfache Methode stellt einen signifikanten Vorteil im Vergleich
zu beschwerlicheren, zeitaufwendigeren und aufwendigeren Methoden
aus dem Stand der Technik dar.
