CN100334102C - 从血清和血浆中制备dna的改进方法 - Google Patents

从血清和血浆中制备dna的改进方法 Download PDF

Info

Publication number
CN100334102C
CN100334102C CNB001046985A CN00104698A CN100334102C CN 100334102 C CN100334102 C CN 100334102C CN B001046985 A CNB001046985 A CN B001046985A CN 00104698 A CN00104698 A CN 00104698A CN 100334102 C CN100334102 C CN 100334102C
Authority
CN
China
Prior art keywords
serum
blood plasma
dna
alkalization
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB001046985A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1270962A (zh
Inventor
L·博格梅耶
K·L·安吉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ortho Clinical Diagnostics Inc
Original Assignee
Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ortho Clinical Diagnostics Inc filed Critical Ortho Clinical Diagnostics Inc
Publication of CN1270962A publication Critical patent/CN1270962A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100334102C publication Critical patent/CN100334102C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明描述了从血清或血浆中提取DNA的方法，方法包括将血清或血浆与碱接触，制备碱化的血清或血浆，将碱化的血清或血浆加热至约100到110EC之间，保持约5到20分钟，离心加热后的碱化血清或血浆，制备含DNA的上清液，将加热的碱化血清或血浆冷却至室温，或冷却至约25EC，最后提取含DNA的上清液。本发明还公开了检测血清或血浆中的含DNA的微生物的方法。

Description

从血清和血浆中制备DNA的改进方法
本发明涉及从血清和血浆中制备DNA的方法，特别是在扩增反应中用作目的DNA的DNA制备方法。
扩增和检测核酸领域的技术进展十分迅速，特别当其涉及对感染性疾病、癌症和遗传疾病提供早期检测的商业诊断试验时。目前已经知道少量核酸的扩增，例如PCR(聚合酶链式反应)已相当成熟的技术(参见美国专利号4683195；4683202；和4965188)。PCR的内在灵敏性，即其扩增非常低浓度的目的DNA的能力，意味着PCR产物低水平的遗留以及样品间的污染可以产生假阳性结果。在所有因素中，遗留和样品污染是处理过程中所需的样品操作次数的指标。因此，具有使样品暴露于周围环境的最少次数的简单程序是非常理想的。
传统上，已经就由全血得到的外周血白细胞(WBC)中经PCR鉴定了人巨细胞病毒(HCMV)感染引起的病毒血症，并鉴定了其它病毒和细菌。在从WBC中提取HCMV DNA之前，通常需要从全血中分离WBC。这种分离程序包括红细胞在葡聚糖溶液中的沉降(Rasmussen等，传染病杂志171：177-82，1995)，用氯化铵溶液差别溶解(美国专利号5702884，Ekeze等)，或者应用商业提供的方法(例如，来自Becton-Dickinson的CPT-VacutainerTM试管)。这些方法通常包括除去扩增的潜在抑制物的清洗步骤；或者，分离WBC以便除去这些抑制物，所述抑制物通常以高浓度存在于血浆或血清中。
分离出WBC后，溶解并提取DNA。这包括以下程序，例如煮沸、超声、或WBC的冷冻干燥，或者应用蛋白溶解酶和/或表面活性剂溶解细胞，然后提取DNA。提取DNA还可以应用碱溶步骤(美国专利号5639599)。通常进行更严格的提取/纯化步骤以便进一步确保纯化到的DNA不含潜在抑制物，这些步骤包括，例如，应用玻璃珠(Gene Clean II试剂盒，Bio 101，Inc.)、酚-氯仿提取程序、聚合物捕获(美国专利号5582988)，旋转柱吸附(Qiagen QIAamp试剂盒)，以及其它商业提供的DNA分离试剂盒(Puregene，Gentra Systems Inc.)。
值得注意的是，用于从WBC制备物中清洗掉或除去潜在抑制物的分离和溶解WBC的程序不能被用于血浆和血清。由于大量内源性生化物质和服用药物、药物的代谢产物等在血清和血浆中保留并严重累积，因此现有技术需要一种适用于血浆和血清的快速和强效的方法，该方法将除去潜在抑制物或使该抑制物失效。
感染个体中的胞外HCMV核酸存在于血浆和血清中。选择血浆和血清作为PCR检测HCMV核酸的样品正逐步被接受。通常，目的DNA不以游离DNA的形式存在，而作为与DNA、RNA和蛋白质的复合联合体的形式存在。必须从复合物中提取DNA，然后变性，以便使其适用于扩增反应。通常对血清和血浆样品进行加热、表面活性剂处理、和蛋白酶处理。常使用另外一些精确的方案提取目的DNA，例如前面描述WBC时提到的那些(Spector等，临床微生物学杂志，30：2359-65，1992；Nolte等，临床微生物学杂志，33：1263-66，1995；Wolf等，移植，56：330-4，1993；Patel等，临床微生物学杂志，32：1431-4，1994)。碱处理也曾被使用。然而，碱处理通常需要高NaOH浓度，随后需要中和步骤(Hansen等，传染病杂志170：1271-4，1994)。
因此，现有技术需要一种快速有效地从血清和血浆中提取DNA的并与PCR扩增方法相容的方法。
本发明提供了一种从血清或血浆样品中提取DNA的方法。该方法包括：
(i)将血清或血浆与碱接触，以制备碱化的血清或血浆；
(ii)将碱化的血清或血浆加热至约100到110℃之间，保持约5到20分钟；
(iii)离心加热的碱化血清或血浆；和
(iv)提取含DNA的上清液。
在一个优选的方面，在离心加热的碱化血清或血浆之前，在步骤(iii)离心之前，将由步骤(ii)制备的加热的碱化血清或血浆放冷，或冷却至室温，即25℃。
另一方面，本发明提供了一种检测在血清或血浆中可能存在含DNA的微生物，例如人巨细胞病毒(HCMV)的方法。该方法包括：
(i)将血清或血浆与碱接触，以制备碱化的血清或血浆；
(ii)将碱化的血清或血浆加热至约100到110℃之间，保持约5到20分钟；
(iii)离心加热的碱化血清或血浆；
(iv)提取含DNA的上清液；
(v)用识别微生物DNA中的序列的寡核苷酸引物扩增上清液中的DNA以形成微生物特异性的扩增引物；和
(vi)检测扩增产物，其中特异于微生物的扩增产物的检测表明血清或血浆中存在微生物。
在一个优选的方面中，在步骤(ii)之后，步骤(iii)的离心之前，使加热的碱化血清或血浆放冷或冷至室温，即约25℃。
本发明提供了一种从血清和血浆样品中简便、快速、高效地提取DNA的方法，该方法使得到DNA制备物不需进一步操作即可适用于随后的检测分析。
该方法包括以下步骤：
(i)将血清或血浆与碱接触，以制备碱化的血清或血浆；
(ii)将碱化的血清或血浆加热至约100到110℃之间，保持约5到20分钟；
(iii)离心加热的碱化血清或血浆；和
(iv)提取含DNA的上清液。
优选在加热之后，离心之前，使加热的碱化血清或血浆冷却或冷至室温，即约25℃。冷却可以是消极的，即仅用室内空气平衡，也可以是积极的，即可以离心加热的碱化血清或血浆、或将加热的碱化血清或血浆置于冰上、或置于水浴中，直到加热的碱化血清或血浆的温度达到室温。
在本发明的实践中，合适的碱包括但不限于：氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、或上述种类的混合物。优选使用氢氧化钠。步骤(i)中制备的混合物中碱的终浓度约为10-90mM范围内，最优选约为15-50mM范围内。特别优选的碱浓度约为20mM。一个优选方案包括1体积的血清或血浆与约4体积的约25mM的碱水溶液制成混合物。
将加热碱化的血清或血浆加热到的温度优选约105℃，时间优选约5分钟。离心步骤优选在环境温度下约16,000Xg下离心约2分钟。
可以直接将从离心混合物中提取到的上清液加入PCR扩增混合物中。然而，可以在将上清液加到PCR混合物之前，进一步处理或加入需要的试剂以调整上清液。本发明的碱处理用于灭活PCR制物并使蛋白质变性，特别是导致目的DNA降解至不能被扩增的核酸酶。碱处理还用于使DNA变性，使它更易于与扩增引物杂交，从而进行PCR扩增。另外，本发明的简便性极大地降低了样品间污染以及PCR产物遗留的可能性。本发明还避免了对大量花费以及核酸常规分离纯化中应用的通常不稳定的材料的需要。
本发明可用于制备诊断分析的DNA样品，具体地说诊断分析是检测DNA病毒例如巨细胞病毒、单纯性疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、乙肝病毒和一些血液细菌的分析。可以使用DNA制品的检测方法包括但不限于：任何涉及杂交的方法，包括例如聚合酶链式反应、连接酶链式反应等。因此，本发明包括检测含DNA微生物的检测方法，该方法包括碱化来自受试者的血清或血浆、将碱化的血清或血浆加热到约100-110℃之间保持约5-20分钟、离心以便制备含DNA的上清液，收集上清液、用特异于含DNA微生物的DNA的引物扩增上清液中的DNA，从而得到特异于该微生物的扩增产物，然后检测扩增产物，其中它们的存在表明受试者血液或血清中存在该微生物。
下列实施例说明但不限制本发明。
方法：
1.血清和血浆样品
将全血样品收集到含乙烯基二氨基四乙酸(EDTA)或其他抗凝剂(例如肝素和草酸盐)的VacutainerTM试管中，用于收集血浆，或者收集不加抗凝剂的全血样品用于收集血清。
2.样品的制备
将20μl血清或血浆加入装有80μl包含0.334μg/μl小牛胸腺DNA和每μl内部阳性对照(IPC)质粒目的DNA的1.67双链拷贝的25mM NaOH溶液的螺旋盖微量离心管中。混合液经旋涡振荡，于105℃加热5分钟。使样品平衡到室温，室温下16,000Xg离心2分钟。将25μl上清液加入75μlPCR反应混合物(组成下述)中进行扩增。
3.聚合物捕获-对照
按照美国专利号5582988实施例3中描述的方法应用聚合物捕获法提取DNA，差别在于本试验应用20μl的血清或血浆。使DNA-聚合物复合物沉淀，弃去上清液(预期含有PCR的潜在抑制物)。然后用100μl 20mM NaOH溶液从沉淀中洗脱DNA，然后在105℃加热5分钟，随后离心2分钟。将上清液(25μl)加入75μl的PCR反应混合物，进行扩增。聚合物捕获法作为与本发明简便的DNA提取法进行比较的对照。
4.PCR扩增和检测
PCR反应混合物pH为8.0，含有160U/ml重组Taq聚合酶，5.28μg/ml TP4-9.2(过量5倍)和53.37μg/ml TP1-12.2抗Taq抗体，18mM Tris缓冲液，54mM氯化钾，IPC引物(IPC-F1(正向)：生物素-5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3’<SEQ ID NO：1>和IPC-R1(反向)5’-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3’<SEQ ID NO：2>)各0.2μM，CMV特异性分析引物(LB42M(正向)序列为：Biotin-5’-TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT-3’<SEQ ID NO.：3>和引物LB41(反向)5’-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT-3’<SEQ ID NO.：4>)各0.4μM，1.2mM所有脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，4mM氯化镁，9.5％甘油，和防腐剂。典型地，需将Taq聚合酶和抗Taq抗体在室温下预保温10分钟，将MgCl2作为单独溶液在加样品之前加入。CMV特异性分析引物设计为与编码患者样品中CMV晚期基因的pp65基质蛋白的DNA互补。将IPC目的序列和CMV pp65基质蛋白目的序列都克隆到Bluescript质粒(Stratagene，La Jolla，CA)上作为测试对照。这样可以用光谱分析进行准确的定量分析，并符合Poisson’s分布。使用作为内部阳性对照的目的DNA序列为：
5’-CGCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACA
TCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCA
GTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGAT
CGTG-3’<SEQ ID NO.：5>
将25μl处理后的样品加入75μl PCR反应混合物。加完并混合后，将反应混合物倒进塑料袋状PCR容器系统的扩增腔(Johnson & Johnson Clinical Diagnostics，Inc.，美国专利号5089233；5229297；和5380489)。用PCR扩增和检测处理装置(Johnson & Johnson Clinical Diagnostics，Inc.，美国专利号5567617)进行扩增和检测。96℃初始预热3分钟后，使样品在96℃(5秒)变性步骤和70℃(40秒)退火步骤之间交替，进行40次循环扩增。在103℃最后加热5分钟后，将扩增产物导入袋内含对照和测试特异性探针(与捕捉玻珠相连)的检测室(表1)。
表1
玻珠号 设计 序列 SEQIDNO.
玻珠2 IPC-1P 5’-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3’ 6
玻珠4 LBSA-11(CMV) 5’-GAACCGAGGGCCGGCTCACCTCTATGTTGG-3’ 7
玻珠6 INC-26.7a 5’-TTAGTAGTAGAAGGACGACGATGGCG-3’ 8
INC-26.7a作为内部阴性对照，在操作适当的PCR袋内期望不给出信号。
然后目测玻珠上产生的颜色，并与颜色记录卡比较，该颜色记录卡具有10种蓝色逐步增加的渐变颜色，相应的编号为0到10(0＝无信号，10＝最高阳性信号)。2以上的目测记录表明捕捉玻珠上的阳性试验。另外，记录PCR处理装置测量得到的反射比密度(Dr)。Dr读数大于0.13表明结果为阳性。
实施例1：应用本发明的方法从血浆中提取DNA：与聚合物捕获法比较
进行下述试验以将本发明的提取法和聚合物捕获法进行比较。
按照前面所述的本发明方法和聚合物捕获法，从来自65位患者的血浆中制备样品。在聚合物捕获法中使用了20μl和50μl样品。这些样品在最初评价中，对通过聚合物捕获方案制备的50μl样品评价时均得到“未检测到”的结果。当内部阳性对照捕捉玻珠给出假阴性结果时出现“未检测到”的结果。导入样品的IPC对照质粒为每个终反应混合物中10个拷贝。制备的所有样品与PCR反应混合物混合，进行如上述的扩增和检测。
聚合物捕获法得到“未检测到”的几率与本发明处理血浆样品的方法得到“未检测到”的几率相对照，结果在下表2中列出。
表2
聚合物捕获50φL样品 聚合物捕获20φL样品 本发明20φL样品
IPC捕捉玻珠的结果* 14/65 0/65 0/65
“未检测到”的几率 21％ 0％ 0％
范围(目视记录) 3-8 3-8 5-7.5
样品数＜4的目视记录* 3/65(4.6％) 1/65(1.5％) 0/65(0％)
*IPC阴性结果的数目/操作的样品总数
50μl聚合物捕获方法表明“未检测到”的几率为21％，而20μl聚合物捕获方案和20μl本发明方法的失败率为0％。对于上述两种聚合物捕获方法，显然某些样品的信号偏低，内部阳性对照接近阴性。
因此，本发明的方法显著优于50μl聚合物捕获方法，在IPC捕捉玻珠上出现假阴性结果方面，本发明的方法表现出比20μl聚合物捕获方法进步。用50μl聚合物捕获方法制备的样品显然含有PCR抑制物或者表现其它一些与聚合物捕获有关的现象。
另外，有这样一个使用20μl聚合物捕获方法的实例，其中从CMV阴性患者获得的样品得到CMV(LBSA-11)捕捉玻珠上的假阳性结果。而相应的50μl聚合物捕获方法的结果为阴性(如果为真正的阳性，患者样品中将出现多于2.5倍的CMV目标DNA)，该结果例证了多步骤操作程序的复杂性，例如产物遗留。
实施例2：用本发明的方法从血清中提取DNA：与聚合物捕获法比较
从来自100位CMV IgG-阳性，IgM-阴性的OB/GYN患者的血清样品提取DNA，这些患者由Houston TX的Texas儿童医院提供，在聚合物捕获程序和本发明的方法中应用20μl样品(参见上述实施例1)。在制备样品之前，将CMV对照质粒DNA加到各样品中，以制备在PCR反应混合物中终单链拷贝数为20的CMV质粒目的DNA。同时也将IPC对照质粒加入样品，使每PCR反应混合物终水平为10拷贝。制备的所有样品如上述与PCR反应混合物混合。如上述在PCR袋中进行双次扩增和检测。
聚合物捕获法与本发明应用血清的方法相比，假阴性结果的几率在下表3中列出。
表3
聚合物捕获法20φL样品 本发明的方法20φL样品
CMV捕捉玻珠的结果*(％几率) 5/100(5％) 0/100(0％)
IPC捕捉玻珠的结果*(％几率) 0/100(0％) 0/100(0％)
*IPC阴性结果数/操作的样品总数
样品制备程序均没有在IPC捕捉玻珠上给出阴性结果。然而，使用聚合物捕获法时，将CMV质粒目的物加入样品在CMV玻珠上得到5％的假阴性几率，表明对PCR的潜在抑制作用。相反，应用本发明的方法无假阴性CMV玻珠结果。
实施例3：应用本发明的方法从CMV患者人群得到的血浆提取DNA：与GeneClean II样品比较
进行下列试验以检测本发明方法在从患者样品提取DNA中的效能。
用下面两种方法提取血浆样品：(i)用Gene Clean II法(Bio 101，Inc.)，特征在于利用非常灵敏的P32液体杂交CMV PCR分析和直接凝胶CMV PCR分析；(ii)用本发明的方法，分析过程如上面实施例1的描述。导入各样品的IPC对照质粒为每终反应混合物25双链拷贝。所有样品与PCR反应混合物混合，随后在PCR袋中如上述进行双次扩增和检测。
CMV捕捉玻珠上的结果列于下表4中。
表4：本发明方法与GeneClean II法制备血浆样品的比较GeneClean
Figure C0010469800111
所有TCG血浆阳性样品均认为是非常低的阳性样品，因为它们仅在液体杂交分析中表现阳性，而在直接凝胶分析中表现阴性，这表明样品中CMV拷贝水平非常低。
两种样品制备方法具有80％的一致性。应用本发明的方法，通过GeneClean法，12个阳性样品中10个得到阳性结果，两个给出阴性结果。对样品制备进行重复测试后，起初的两个假阴性样品中一个变成阳性。对于GeneClean阴性血浆样品，也遇到类似的结果。对于13个阴性样品，这两种样品制备方法对于10个样品给出一致的结果。
另外，还有三个本发明方法显示为CMV阳性样品的实例。重复测试样品制备后，这三个样品中的两个再次表现CMV阳性结果。由于PCR分析的固有灵敏性，分析中常观察到非常低的目的样品给出矛盾的结果。这预示可能符合Poisson取样分布。
实施例4：在血浆中加入潜在干扰物质
下列试验用于检测本发明方法排除血浆中潜在干扰物质的能力。
处理常规血浆样品组以调节pH，加入血样收集添加剂和其它公知的或可能干扰样品制备扩增或检测的物质。将化合物以估计血清峰水平三倍量加入样品(表5)。
如前面实施例1的描述用本发明方法和现有技术聚合物捕获法从20μl各样品中提取DNA。IPC和CMV质粒分别为每终PCR反应混合物25和10个双链拷贝。半数样品仅含IPC质粒，以便评价由于样品交叉污染或产物遗留可能引起的假阳性结果(基于CMV探针玻珠上的颜色)。所有样品与PCR反应混合物混合，然后在PCR袋内扩增并检测。对于每种化合物，在四个PCR袋中分析，其中包括0和10 CMV拷贝水平。另外，同时操作含用于制备包括在分析中的化合物的各种溶剂(水、丙酮、酒精)的适当对照。
表5
用于评价的干扰物质 原理 血清峰水平(φg/mL) 聚合物捕获结果* 本发明*
对乙酰氨基酚 普通药 20 + +
阿莫西林 普通药 10 + +
阿司匹林 普通药 35 + +
可待因 普通药 0.4 + +
右美沙芬 普通药 0.38 + +
速尿(呋喃苯胺酸) 普通药 10 + +
布洛芬 普通药 70 + +
苯妥因(大仑丁) 普通药 20 + +
泼尼松 普通药 0.1 + +
乙酰半胱氨酸 检测干扰剂 300 + +
抗坏血酸 检测干扰剂 20 + +
安乃近 检测干扰剂 200 + +
多巴胺 检测干扰剂 100 + +
EDTA-0.25x draw 样品收集添加剂 1500 + +
龙胆酸 检测干扰剂 55 + +
肝素(钠)-0.25xdraw 样品收集添加剂 33.3 + +
海帕克 检测干扰剂 500 + +
左旋多巴胺 检测干扰剂 4 + +
草酸盐-0.25xdraw 样品收集添加剂 2000 + +
可卡因(苯甲酰爱康宁) 滥用药 1 + +
酒精 滥用药 1320 + +
海洛因(硫酸吗啡) 滥用药 0.135 + +
美沙酮 滥用药 0.5 + +
脱氧麻黄碱 滥用药 0.5 + +
THC 滥用药 0.1 + +
白蛋白 高浓度分析剂 50000 + +
全血 血清/血浆中的残余血 25％取样体积 2NT&3IPCFN +
胆红素(总) 婴儿＜1周龄 120 + +
肌酸酐 肾衰患者 15 + +
Ca(NO3)2 高浓度分析剂 104 + +
环孢菌素A 移植患者 1 + +
葡萄糖 高浓度分析剂 1000 + +
血脂类(如胆固醇) 高浓度分析剂 1000 + +
MgCl2 PCR抑制实验 190 + +
低pH(6.8) PCR抑制实验 样品pH′d 1FP +
高pH(8.8) PCR抑制实验 样品pH′d + +
Zn(OAc)2 PCR抑制实验 1.5 + +
膦甲酸 CMV药 180 + +
更昔洛韦 CMV药 1.18 + +
Crixivan HIV药 8.98 + +
ddC(Hivid) HIV药 0.0252 + +
ddI(Videx) HIV药 1.6 + +
注解：*+表示存在目的物时所有CMV和IPC捕捉玻珠上均出现阳性结果；FP＝假阳性；FN＝假阴性(当CMV水平为10拷贝时，在期望CMV阳性捕捉玻珠上出现CMV阴性结果)；NT＝在期望CMV阴性样品中“未检测到”，IPC捕捉玻珠为阴性(CMV＝Neg)；
在最初测试中，各样品制备方法在CMV捕捉玻珠和IPC捕捉玻珠上均偶尔出现假阴性结果和几次“未检测到”结果，但聚合物捕获法制备的样品更多地观察到上述结果。另外，几个对照给出不期望的阴性结果，表明PCR袋失效所致。
再次测试前面的样品制备方法，聚合物捕获法和本发明方法对所有测试物质均给出阳性结果，除了用聚合物捕获法制备的25％的血样(提取DNA之前将25体积份全血加入75体积份的血浆)。四个仅含IPC目的物(无CMV目的物)的样品中，两个再次在IPC捕捉玻珠上表现“未检测到”结果。另外，四个含IPC和CMV目的DNA的样品中的三个表现IPC捕捉玻珠的抑制，目视记录仅为“1”。对于这四个样品，CMV捕捉玻珠也表现抑制信号(目视颜色记录为“3”和“4”)。还有一个利用聚合物捕获技术得到假阳性结果的实例(在pH改变较小的条件下)，再次表明少数次操作步骤的简单程序有利于防止遗留污染。
这些结果显示，当利用聚合物捕获技术制备样品时，在HCMV分析中25％全血表现抑制。相反，用本发明方法提取DNA不表现PCR扩增和检测的抑制。这一点十分有意义，因为临床试验室中血清和血浆样品常被红细胞污染。另外，与相比较优于聚合物捕获法的本发明方法比较，聚合物捕获技术比本发明方法更繁复，并使样品更大程度地与环境接触。
利用本发明方法提取DNA部不会导致任何试验物质对PCR扩增的抑制或扩增产物检测的抑制。这种简便的方法代表着对较笨拙耗时繁杂的现有技术方法的有意义的改进。
前面提到的所有专利、申请、文章、出版物和试验方法均参考全文插入本文。
根据上述详细描述，本发明的某些改变将对本领域技术人员是显而易见的。这种明显的改变完全落入附加的权利要求界定的范围内。

Claims (13)

1.从血清或血浆中提取DNA的方法，所述方法包括：
(i)将血清或血浆与一种选自氢氧化钠、氢氧化钾和氨水的碱接触，制备碱化的血清或血浆；
(ii)将所述碱化的血清或血浆加热至温度100℃至110℃，保持5至20分钟，制备加热的碱化血清或血浆；
(iii)离心所述加热的碱化血清或血浆，制备含DNA的上清液；和
(iv)提取所述含DNA的上清液。
2.如权利要求1的方法，其中在所述加热步骤(ii)之后，所述离心步骤(iii)之前，将所述加热的碱化血清或血浆放冷或冷却至室温。
3.如权利要求1的方法，其中所述碱为氢氧化钠。
4.如权利要求1的方法，其中所述温度为105℃。
5.如权利要求1的方法，其中所述时间为5分钟。
6.如权利要求1的方法，其中所述离心条件为16000xg离心2分钟。
7.如权利要求1的方法，其中所述碱化的血清或血浆含有浓度为15-50mM范围内的碱。
8.检测血清或血浆中含DNA的微生物的方法，所述方法包括：
(i)将受试者的血清或血浆与一种选自氢氧化钠、氢氧化钾和氨水的碱接触，制备碱化的血清或血浆；
(ii)将所述碱化的血清或血浆加热至温度100℃至110℃，保持5至20分钟，以制备加热的碱化血清或血浆；
(iii)离心所述加热的碱化血清或血浆，以制备含DNA的上清液；
(iv)提取所述含DNA的上清液；
(v)用识别包含在微生物DNA中的序列的寡核苷酸引物扩增所述上清液中的所述DNA，形成对所述含DNA微生物的特异性的扩增产物；和
(vi)检测所述扩增产物，
其中所述扩增产物的检测表明在所述血清或血浆中存在所述微生物。
9.如权利要求8的方法，其中在所述接触步骤(ii)之后，所述离心步骤(iii)之前，将所述加热的碱化血清或血浆放冷或冷却至室温。
10.如权利要求8的方法，其中所述微生物是细菌。
11.如权利要求8的方法，其中所述微生物是病毒。
12.如权利要求11的方法，其中所述病毒是人巨细胞病毒。
13.如权利要求8的方法，其中所述碱化的血清或血浆含有浓度为20mM的碱。
CNB001046985A 1999-02-03 2000-02-03 从血清和血浆中制备dna的改进方法 Expired - Fee Related CN100334102C (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11849699P 1999-02-03 1999-02-03
US60/118,496 1999-02-03
US60/118496 1999-02-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1270962A CN1270962A (zh) 2000-10-25
CN100334102C true CN100334102C (zh) 2007-08-29

Family

ID=22378966

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB001046985A Expired - Fee Related CN100334102C (zh) 1999-02-03 2000-02-03 从血清和血浆中制备dna的改进方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6268127B1 (zh)
EP (1) EP1026241B1 (zh)
JP (1) JP4468534B2 (zh)
KR (1) KR100845949B1 (zh)
CN (1) CN100334102C (zh)
AT (1) ATE267251T1 (zh)
AU (1) AU769709C (zh)
CA (1) CA2297547C (zh)
DE (1) DE60010776T2 (zh)
DK (1) DK1026241T3 (zh)
ES (1) ES2220340T3 (zh)
NO (1) NO324041B1 (zh)
PT (1) PT1026241E (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020028386A (ko) * 2000-10-09 2002-04-17 박제철 소량의 동물조직으로부터 미토콘드리아 디.엔.에이의순수분리 방법
AU2003287082A1 (en) * 2002-10-11 2004-05-04 Imutex Pharmaceuticals, Inc. Heterologous plasma cocktail for hiv treatment
WO2016187780A1 (en) * 2015-05-25 2016-12-01 Coyote Bioscience Yixing Co., Ltd. Device and method for sample collection
CN107683330A (zh) * 2015-05-25 2018-02-09 卡尤迪生物科技（北京）有限公司 用于样品收集的装置和方法
CN108795926A (zh) * 2018-06-27 2018-11-13 中国农业科学院麻类研究所 一种dna模板快速制备方法
WO2020075696A1 (ja) * 2018-10-09 2020-04-16 公益財団法人筑波メディカルセンター 試料の前処理方法
JP7329912B2 (ja) * 2018-10-09 2023-08-21 公益財団法人筑波メディカルセンター 微生物の検出方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5582988A (en) * 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
US5639599A (en) * 1992-06-08 1997-06-17 Gen-Probe Incorporated Amplification of nucleic acids from mononuclear cells using iron complexing and other agents
WO1997034015A1 (en) * 1996-03-15 1997-09-18 The Penn State Research Foundation Detection of extracellular tumor-associated nucleic acid in blood plasma or serum using nucleic acid amplification assays

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229297A (en) 1989-02-03 1993-07-20 Eastman Kodak Company Containment cuvette for PCR and method of use
US5089233A (en) 1989-06-12 1992-02-18 Eastman Kodak Company Processing apparatus for a chemical reaction pack
US5380489A (en) 1992-02-18 1995-01-10 Eastman Kodak Company Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5639599A (en) * 1992-06-08 1997-06-17 Gen-Probe Incorporated Amplification of nucleic acids from mononuclear cells using iron complexing and other agents
US5582988A (en) * 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
WO1997034015A1 (en) * 1996-03-15 1997-09-18 The Penn State Research Foundation Detection of extracellular tumor-associated nucleic acid in blood plasma or serum using nucleic acid amplification assays

Also Published As

Publication number Publication date
JP2000279199A (ja) 2000-10-10
NO20000539D0 (no) 2000-02-02
DE60010776T2 (de) 2005-05-12
NO324041B1 (no) 2007-07-30
PT1026241E (pt) 2004-09-30
ATE267251T1 (de) 2004-06-15
EP1026241B1 (en) 2004-05-19
US6268127B1 (en) 2001-07-31
ES2220340T3 (es) 2004-12-16
AU1488000A (en) 2000-08-10
NO20000539L (no) 2000-08-04
CN1270962A (zh) 2000-10-25
KR100845949B1 (ko) 2008-07-11
EP1026241A1 (en) 2000-08-09
KR20000076596A (ko) 2000-12-26
JP4468534B2 (ja) 2010-05-26
DK1026241T3 (da) 2004-08-30
CA2297547A1 (en) 2000-08-03
DE60010776D1 (de) 2004-06-24
AU769709C (en) 2004-10-14
CA2297547C (en) 2006-12-19
AU769709B2 (en) 2004-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Houfflin-Debarge et al. High sensitivity of fetal DNA in plasma compared to serum and nucleated cells using unnested PCR in maternal blood
CN106893777A (zh) 用于检测结直肠癌相关基因多位点甲基化试剂盒及应用
CN103725799B (zh) 一种检测风疹病毒rna的方法及试剂盒
EP1358355A2 (en) New method for genotype determination
CN100334102C (zh) 从血清和血浆中制备dna的改进方法
Ulloa et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit
JPH11266899A (ja) 核酸ハイブリダイゼ―ションの阻害剤を減少する方法
JP3451667B2 (ja) 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法
US20030044771A1 (en) Method for discovering new infectious particles
KR101981398B1 (ko) 세포외소포체 용해 버퍼 및 이를 이용한 핵산 추출 방법
CN114410836A (zh) 一种集样本处理、核酸提取及多重恒温扩增一体化的检测人细小病毒b19的试剂盒和方法
CN116891849B (zh) 一种快速从鼻咽拭子中提取核酸的试剂盒及提取方法
EP2804957B1 (en) Method of detecting residual genomic dna and a kit thereof
US11891599B2 (en) Recovery of nucleic acids from solid supports
CN104023752B (zh) 用于从蛋白质溶液中除去病毒的方法
JP3494509B2 (ja) 核酸合成法
CN103757131A (zh) 鉴别马疱疹病毒1/4型的Lamp检测引物及方法
Falcinelli et al. First-trimester fetal sex prediction by deoxyribonucleic acid analysis of maternal peripheral blood
JP2003506708A (ja) 直接吸引反応も注入も可能なデバイスならびにその使用方法
CN102816866B (zh) 一种检测肠道病毒rna的方法及试剂盒
CN103725797B (zh) 一种丙型肝炎病毒基因型检测试剂盒
CN101220390A (zh) 一种快速提取植物样本dna的方法
US20100173283A1 (en) Method of predicting potential severity of hepatitis e, probe sets, and primer sets
CN101235412A (zh) 从临床血液标本中提取总dna的方法
WO2022177851A1 (en) Sars cov-2 infectivity determination assay

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20070829

Termination date: 20120203