CN101235412A - 从临床血液标本中提取总dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从临床血液标本中提取适用于致病菌检测的总DNA的方法。该方法的基本步骤包括：用碱溶液处理样品，离心收集并洗涤后重新悬浮细胞，以煮沸方法裂解细菌细胞并得到所需的DNA。本发明的方法可从很少量的临床血液标本中提取得到高质量的、适于临床血液致病菌检测的DNA样品。

Description

从临床血液标本中提取总DNA的方法

技术领域

本发明涉及DNA提取方法，尤其涉及从临床血液标本中提取适用于致病菌检测的总DNA的方法。

背景技术

健康人的血液是无菌的，但在特定的条件下，如实施外科手术的过程中或者是当人的免疫力处于低下的状态时，血液中感染病原菌的机率会大大增加。当人体局部感染向全身播散和出现全身感染时，血液中可出现细菌，按程度不同可分为菌血症、败血症和毒血症，其中以败血症的临床症状最为严重。败血症通常由一种病原菌引起，但也有由两种或更多种类的病原菌所引起，称为复数菌败血症。在全部的败血症中，其发病率超过10％。败血症的死亡率一般为30～50％；复数菌败血症的死亡率更高，可达70％～80％。

对血液中感染致病菌的传统检测方法依赖于细菌的表型和生化特征检查，这类方法的最大弊端在于耗费的时间比较长，所以很容易延误疾病的治疗。另外，在临床环境中，也很容易造成环境和/或标本的污染。再者，传统方法还存在培养条件苛刻或某些致病菌难以培养的问题。

以PCR为基础的现代分子生物学技术为临床病原微生物的检测开辟了一条快速灵敏的途径。分子生物学技术应用于临床微生物检测首先需要用PCR方法扩增临床样品中病原体的靶核酸序列，然后用其它多种分子生物学手段对扩增产物进行分析，从而鉴定病原体的种类。对扩增产物进行分析的常用方法包括电泳、杂交等。以DNA杂交为基础的基因芯片技术，更具有敏感性高、特异性强、可实现大规模集成化等优点。

分子生物学技术应用于临床血液感染致病菌检测的核心之一是临床标本中DNA的有效提取。人血浆样品中残存的大量红细胞以及血液培养期间加入的某些其他外来成分(例如聚茴香磺酸钠)可强烈抑制PCR反应。如果在标本DNA提取过程中不能有效去除这些抑制成分，将会对以后的PCR反应造成很大困难。

为了克服上述缺陷，目前人们已采取了多种方法，例如对标本进行预处理并使用柱层析方法分离DNA，以及Beverley C.Millar等人的方法(J.Microbiol.Methods，42(2000)：139-147)。但这些方法皆因成本较高或易于造成DNA的损伤等问题，而难以在基层医疗单位的实验室广泛使用。

因此，本领域有必要提供一种新的提取血液标本中总DNA的方法，以便能够以较低的成本，简单、快速地从血液培养样品中提取高质量的总DNA，使其适应临床血液感染致病菌检测的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够以较低成本，简单、快速的从临床血液标本中提取高质量总DNA的方法，以适应临床血液感染致病菌检测的需要。

为了达到上述目的，经过大量实验得到了本发明的从临床血液标本中提取总DNA的方法，该方法包括以下步骤：

(1)使用由0.4M-0.6M氢氧化钠和0.04M-0.06M柠檬酸钠组成的碱溶液处理样品；

(2)离心收集、充分洗涤并重新悬浮沉淀物；

(3)将步骤(2)的沉淀物煮沸5-30分钟裂解细菌细胞；

(4)常规分离并收集所需的DNA。

根据本发明的一个优选实施方案，上述步骤(1)中所用的碱溶液由0.5M氢氧化钠和0.05M柠檬酸钠组成。

根据本发明的一个优选实施方案，上述步骤(2)中用缓冲液洗涤的次数为2次。

根据本发明的一个优选实施方案，上述步骤(2)中重悬沉淀物的溶液由10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mM EDTA组成。

根据本发明的一个优选实施方案，上述步骤(3)中煮沸的时间为8-15分钟。

根据本发明的一个优选实施方案，提取血液培养样品中总DNA的方法还包括在上述步骤(3)后进行冻融。

我们的实验结果表明，本发明的方法有很强的去除抑制剂的效果，其所使用的碱溶液可有效破坏并去除抑剂成分；灵敏度高，使用本发明的方法，可对少至5微升的样品进行处理，而获得稳定的PCR扩增效果；操作简便，适用于临床检测；所需试剂均为常规试剂，费用低；而且对DNA的损伤很小，提高了PCR的稳定性和分析结果的准确性。

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原则前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求范围内。

附图说明

图1为几种不同浓度碱溶液处理样品后最终所得DNA的琼脂糖电泳结果。

图2为沉淀物经历几种不同煮沸时间所获得的DNA及其PCR产物的琼脂糖电泳结果

具体实施方式

下面通过最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。以下实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。

提取血液培养样品中的总DNA

提取血液培养样品中总DNA的完整步骤包括：

1)取450μl临床样品加入到1.5ml灭菌离心管中。

2)加入900μl样品提取液I(0.5M氢氧化钠，0.05M柠檬酸钠)，反复颠倒混匀10分钟。

3)13,000×g离心5分钟，立刻倾倒上清。

4)沉淀用500μl样品提取液II(0.5MTris-HCl pH8.0)重悬。

5)13,000×g离心5分钟，立刻倾倒上清。

6)沉淀用500μl样品提取液II重悬。

7)13,000×g离心5分钟，弃上清。

8)沉淀用100μl样品提取液III(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA)重悬，100℃煮沸10分钟。

9)13,000×g离心15分钟，取上清60μl转移到一个新的1.5ml灭菌离心管中，进行后续PCR反应或-20℃储存。

碱溶液处理样品浓度梯度实验

取氢氧化钠浓度分别为0.1、0.2、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M，柠檬酸钠浓度均为0.05M的碱溶液裂解含菌株1(大肠杆菌)和菌株2(金黄色葡萄球菌)的两个样品，其它步骤按照上述实施例的提取培养的血液样品中总DNA的方法操作，最终所得DNA的琼脂糖电泳结果如图1所示，从中可以看出0.5M的碱溶液的实验效果较佳。

沉淀物煮沸时间梯度实验

将含菌株1(大肠杆菌)、菌株2(肺炎克雷伯氏菌)及菌株3(金黄色葡萄球菌)的三个样品分别参照上述实施例的提取血液培养样品中总DNA的方法操作，其中用提取液III(10mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA)重悬沉淀后的煮沸时间分别设定为0、5分钟、10分钟、30分钟和60分钟，所提取的DNA和PCR产物的琼脂糖电泳结果如图2所示，从中可以看出较佳的煮沸时间为10分钟。

细菌感染患者血液培养物提取的DNA的效果

目前根据此实施方案共完成了168例细菌感染患者血培养临床标本DNA的提取，并通过PCR扩增进行验证，具体情况见下表：

完成例数	PCR检测正确率	DNA浓度	DNA纯度(OD260/280)
				168	98.6％	10-50ng/ul	1.6-2.0

上述细菌感染患者血液培养物是指将可疑菌血症患者的血液经培养后获得的用于DNA提取的样品。

提取的DNA用于其后的分子生物学检测，PCR检测的正确率直接反映了DNA提取方法的优劣。利用本发明的方法从168例细菌感染患者血液培养物提取所得DNA的PCR检测正确率为98.8％，即表示针对每100份含有细菌血液培养样品，用本发明的提取方法进行DNA提取后，有98.8份样品的DNA可进行PCR扩增。而使用公知的适用于临床的方法(Beverley C.Millar等人的方法(J.Microbiol.Methods，42(2000)：139-147))从含细菌的血液培养样品中提取的DNA的PCR检测正确率为68％。本发明的方法十分显著地优于此公知技术。

Claims (5)

1. 从临床血液标本中提取总DNA的方法，该方法包括以下步骤：

(1)使用由0.4M-0.6M氢氧化钠和0.04M-0.06M柠檬酸钠组成的碱溶液处理样品；

(2)离心收集、充分洗涤并重新悬浮沉淀物；

(3)将步骤(2)的沉淀物煮沸5-30分钟裂解细菌细胞；

(4)常规分离并收集所需的DNA。

2. 根据权利要求1所述的从临床血液标本中提取总DNA的方法，其特征是上述步骤(1)中所用的碱溶液由0.5M氢氧化钠和0.05M柠檬酸钠组成。

3. 根据权利要求1所述的从临床血液标本中提取总DNA的方法，其特征是上述步骤(2)中用缓冲液洗涤的次数为至少2次。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征是上述步骤(2)中重悬沉淀物的溶液由10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mM EDTA组成。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征是上述步骤(3)中煮沸的时间为8-15分钟。

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