ES2220340T3 - Procedimiento mejorado para preparar adn de suero y plasma. - Google Patents
Procedimiento mejorado para preparar adn de suero y plasma.Info
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Abstract
Un procedimiento para extraer ADN de suero o plasma, comprendiendo dicho procedimiento: (i) poner en contacto el suero o plasma con álcali para producir suero o plasma alcalinizado; (ii) calentar dicho suero o plasma alcalinizado a una temperatura que oscila entre 100 y 110°C durante un tiempo que oscila entre 5 y 20 minutos para producir suero o plasma alcalinizado calentado; (iii) centrifugar dicho suero o plasma alcalinizado calentado para producir un sobrenadante que contiene ADN; y (iv) recuperar dicho sobrenadante que contiene ADN.
Description
Un procedimiento mejorado para preparar ADN de
suero y plasma.
La presente invención se refiere a procedimientos
para preparar ADN de suero y plasma, en particular, para su uso como
diana en reacciones de amplificación.
La tecnología avanza rápidamente en el área de la
amplificación y detección de ácidos nucleicos, en particular, porque
se refiere a pruebas de diagnóstico comerciales, que ofrecen la
detección precoz de enfermedades infecciosas, cáncer y alteraciones
genéticas. En la actualidad se conocen bien técnicas muy
sofisticadas para la amplificación de cantidades mínimas de ácidos
nucleicos, como PCR (reacción en cadena de la polimerasa) (véanse
las Patentes de EE.UU. Nº 4.683.195; 4.683.202; y 4.965.188). La
sensibilidad inherente de PCR, esto es, su capacidad de amplificar
concentraciones muy pequeñas de un ADN diana, significa que el
remanente de bajo nivel de productos PCR, y la contaminación entre
especímenes, pueden producir resultados positivos falsos. La
contaminación del remanente y las muestras es, entre otras cosas,
una función del número de manipulaciones de la muestra necesarias
durante el tratamiento. Por lo tanto, es muy deseable un
procedimiento simple con un mínimo número de etapas que expone la
muestra al medio.
Tradicionalmente, la identificación mediante PCR
de viremia debida a citomegalovirus infeccioso humano
(HCMV), y la identificación de otros virus y bacterias se realizaba en leucocitos de sangre periférica (WBC) obtenidos de sangre completa. La separación de leucocitos de sangre completa normalmente es necesaria antes de la extracción del ADN de HCMV de los leucocitos. Los procedimientos para esta separación incluyen la sedimentación de eritrocitos en una solución de dextrano (Rasmussen y col., J. Infect. Dis. 171:177-82, 1995), la lisis diferencial usando soluciones de cloruro de amonio (Patente de EE.UU. Nº 5.702.884 Ekeze y col.), o el uso de procedimientos disponibles comercialmente (como, por ejemplo, tubos CPT-Vacutainer^{TM} de Becton-Dickinson). Típicamente, estos procedimientos incluyen una etapa de lavado que causa la eliminación de inhibidores potenciales de la amplificación; alternativamente, el aislamiento de leucocitos sirve para eliminar estos inhibidores, que residen típicamente en concentraciones elevadas en plasma o suero.
(HCMV), y la identificación de otros virus y bacterias se realizaba en leucocitos de sangre periférica (WBC) obtenidos de sangre completa. La separación de leucocitos de sangre completa normalmente es necesaria antes de la extracción del ADN de HCMV de los leucocitos. Los procedimientos para esta separación incluyen la sedimentación de eritrocitos en una solución de dextrano (Rasmussen y col., J. Infect. Dis. 171:177-82, 1995), la lisis diferencial usando soluciones de cloruro de amonio (Patente de EE.UU. Nº 5.702.884 Ekeze y col.), o el uso de procedimientos disponibles comercialmente (como, por ejemplo, tubos CPT-Vacutainer^{TM} de Becton-Dickinson). Típicamente, estos procedimientos incluyen una etapa de lavado que causa la eliminación de inhibidores potenciales de la amplificación; alternativamente, el aislamiento de leucocitos sirve para eliminar estos inhibidores, que residen típicamente en concentraciones elevadas en plasma o suero.
Una vez aislados los leucocitos, se lisan y se
extrae el ADN. Esto implica procedimientos como, por ejemplo,
hervido, sonicación, o congelación-descongelación de
los leucocitos, o el uso de enzimas proteolíticas y/o tensioactivos
para lisar las células y extraer el ADN. La extracción de ADN
también puede incluir una etapa de lisis de álcali (Patente de
EE.UU. Nº 5.639.599). A menudo, se realiza una
extracción/purificación más rigurosa para asegurarse más de que el
ADN purificado se obtiene carente de inhibidores potenciales,
incluyendo, por ejemplo, el uso de perlas de cristal (kits Gene
Clean II, Bio 101, Inc.), procedimientos de extracción
fenol-cloroformo, captura de polímero (Patente de
EE.UU. Nº 5.582.988), adsorción de columna giratoria (kits Qiagen
QIAamp), y otros kits de aislamiento de ADN disponibles
comercialmente (Puregene, Gentra Systems Inc.).
Notablemente, los procedimientos usados para
aislar y lisar leucocitos, que sirven para lavar o eliminar
inhibidores potenciales de una preparación de leucocitos, no se
pueden usar con plasma y suero. Ya que la gran mayoría de sustancias
bioquímicas endógenas y medicamentos consumidos, metabolitos de
medicamentos, y otros, residen y se encuentran muy concentrados en
suero y plasma, existe una necesidad en la técnica de un
procedimiento rápido y fiable que se pueda usar con suero y plasma
que eliminaría los inhibidores potenciales o los volvería
ineficaces.
El ácido nucleico de HMCV extracelular en
individuos infectados está presente en plasma y suero. El suero y el
plasma están ganando aceptación como muestras a elegir para detectar
el ácido nucleico de HCMV usando PCR. Generalmente, el ADN diana no
existe como ADN libre sino como una asociación compleja de ADN, ARN
y proteínas. El ADN se debe extraer del complejo y desnaturalizarlo
con objeto de hacerlo disponible para la amplificación. Las muestras
de suero y plasma típicamente se someten a calor, tensioactivos, y
tratamiento con proteasas. A menudo se usan protocolos rigurosos
adicionales para extraer el ADN diana, como los descritos
anteriormente para leucocitos (Spector y col., J. Clin.
Microbiol. 30:2359-65, 1992; Nolte y col., J.
Clin. Microbiol., 33:1263-66, 1995; Wolf y col.,
Transplantation 56:330-4, 1993; Patel y col.,
J. Clin. Microbiol. 32:1431-4, 1994). También
se ha usado el tratamiento con álcali. Sin embargo, este tratamiento
con álcali típicamente requiere una concentración elevada de NaOH
seguida de una etapa de neutralización (Hansen y col., J. Infect.
Dis. 170:1271-4, 1994).
Así, existe una necesidad en la técnica de un
procedimiento rápido y eficiente para extraer ADN de suero y plasma
que es compatible con procedimientos de amplificación con PCR.
La presente invención aporta un procedimiento
para extraer ADN de muestras de suero y plasma. El procedimiento
comprende:
- (i)
- poner en contacto el suero o plasma con álcali para producir suero o plasma alcalinizado;
- (ii)
- calentar el suero o plasma alcalinizado a una temperatura entre 100 y 110ºC durante un tiempo entre 5 y 20 minutos para producir suero o plasma alcalinizado calentado;
- (iii)
- centrifugar el suero o plasma alcalinizado calentado para producir un sobrenadante que contiene ADN; y
- (iv)
- recuperar el sobrenadante que contiene ADN.
En un aspecto preferente, tras dicha etapa de
calentamiento (ii) y antes de dicha etapa de centrifugado (iii),
dicho suero o plasma alcalinizado calentado se enfría o se deja
enfriar a temperatura ambiente.
En otro aspecto, la invención aporta un
procedimiento para detectar la presencia sospechada de un
microorganismo que contiene ADN, por ejemplo, citomegalovirus humano
(HCMV), en suero o plasma. El procedimiento comprende:
- (i)
- poner en contacto el suero o plasma con álcali para producir suero o plasma alcalinizado;
- (ii)
- calentar dicho suero o plasma alcalinizado a una temperatura que oscila entre 100 y 110ºC durante un tiempo que oscila entre 5 y 20 minutos;
- (iii)
- centrifugar dicho suero o plasma alcalinizado calentado para producir un sobrenadante que contiene ADN;
- (iv)
- recuperar el sobrenadante que contiene ADN;
- (v)
- someter dicho ADN en dicho sobrenadante a amplificación usando iniciadores de oligonucleótido que reconocen secuencias dentro del ADN de dicho microorganismo que contiene ADN, para formar productos de amplificación específicos para dicho microorganismo que contiene ADN; y
- (vi)
- detectar dichos productos de amplificación,
en los que la detección de dichos
productos de amplificación indica la presencia de dicho
microorganismo en dicho suero o
plasma.
En un aspecto preferente, tras dicha etapa de
calentamiento (ii) y antes de dicha etapa de centrifugado (iii),
dicho suero o plasma alcalinizado calentado se enfría o se deja
enfriar a temperatura ambiente.
La presente invención aporta un procedimiento
simple, rápido, y muy eficaz para extraer ADN de muestras de suero y
plasma que da como resultado preparaciones de ADN adecuadas para
ensayos de detección posteriores sin más manipulación.
El procedimiento comprende las etapas de:
- (i)
- poner en contacto el suero o plasma con álcali para producir suero o plasma alcalinizado;
- (ii)
- calentar el suero o plasma alcalinizado a una temperatura entre 100 y 110ºC durante un tiempo entre 5 y 20 minutos;
- (iii)
- centrifugar el suero o plasma alcalinizado calentado; y
- (iv)
- recuperar el sobrenadante que contiene ADN.
Se prefiere que después del calentamiento y antes
del centrifugado, el suero o plasma alcalinizado calentado se enfríe
o se deje enfriar a temperatura ambiente, esto es, aproximadamente
25ºC. El enfriamiento puede ser pasivo, esto es, mediante simple
equilibrado con el aire de la habitación, o activo, esto es, el
suero o plasma alcalinizado calentado se puede refrigerar, poner en
hielo, o poner en agua del baño, hasta que la temperatura del suero
o plasma alcalinizado calentado alcance la temperatura ambiente.
Al practicar la presente invención, el álcali
adecuado incluye, sin carácter restrictivo, hidróxido sódico,
hidróxido potásico, hidróxido de amonio, o una mezcla de
cualesquiera de los anteriores. Preferentemente, se usa hidróxido
sódico. La concentración final de álcali en la mezcla preparada en
la etapa (i) oscila entre 10 y 90 mM, y más preferentemente de 15 a
50 mM. Se hace mención especial a una concentración de álcali de 20
mM. Un procedimiento preferente supone formar una mezcla de 1 parte
en volumen de suero o plasma con 4 partes en volumen de una solución
acuosa de álcali 25 mM.
La temperatura a la que se calienta el suero o
plasma alcalinizado es preferentemente 105ºC y el tiempo es
preferentemente de 5 minutos. La etapa de centrifugado se lleva a
cabo preferentemente a temperatura ambiente durante 2 minutos a
16.000 X g.
El sobrenadante recuperado de la mezcla
centrifugada se puede añadir directamente a una mezcla de
amplificación de PCR. Sin embargo, el sobrenadante se puede
modificar mediante más tratamiento o adición de reactivos según se
desee antes de la adición a la mezcla de PCR. El tratamiento con
álcali según la invención sirve para inactivar inhibidores de PCR y
desnaturalizar proteínas, particularmente nucleasas que pueden
degradar el ADN diana hasta un punto en el que no se puede
amplificar. También sirve para desnaturalizar el ADN, haciéndolo más
dispuesto para la hibridación para iniciadores de amplificación y
así para la amplificación por PCR. Además, la simplicidad del
procedimiento reduce enormemente la probabilidad de contaminación
muestra a muestra y de remanente del producto de PCR. También
elimina la necesidad de materiales costosos y a menudo inestables
usados de forma rutinaria para el aislamiento y purificación de
ácidos nucleicos.
La presente invención es útil en la preparación
de muestras de ADN para ensayos de diagnóstico, particularmente
aquellos que detectan virus de ADN como, por ejemplo,
citomegalovirus, virus del herpes simple, virus
Epstein-Barr, virus de la Hepatitis B y bacterias de
la sangre. Los procedimientos de detección en los que se pueden usar
preparaciones de ADN incluyen, sin limitación, cualquier
procedimiento que implica hibridación, incluyendo, por ejemplo,
reacción en cadena de polimerasa, reacción en cadena de ligasa, y
otros. Así, la presente invención engloba procedimientos para la
detección de microorganismos que contienen ADN que comprenden la
alcalinización de suero o plasma de un sujeto, el calentamiento del
suero o plasma alcalinizado entre 100 y 110ºC durante un periodo de
tiempo que oscila de 5 a 20 minutos, centrifugar para obtener un
sobrenadante que contiene ADN, recuperar el sobrenadante, amplificar
el ADN en el sobrenadante usando iniciadores específicos para el ADN
del organismo que contiene ADN, formando de ese modo productos de
amplificación específicos para el microorganismo, y detectando luego
los productos de amplificación, donde su presencia indica que el
microorganismo está presente en la sangre o suero del sujeto.
Los siguientes ejemplos ilustran la presente
invención sin limitación.
Se recogieron muestras de sangre completa en
tubos Vacutainer^{TM} que contenían ácido etilendiamino
tetraacético (EDTA) u otro anticoagulante, como heparina u oxalato,
para obtener plasma, o se recogieron muestras de sangre completa sin
anticoagulante para obtener suero.
Se añadieron 20 \mul de suero o plasma a 80
\mul de una solución de NaOH 25 mM que contenía 0,334
\mug/\mul de ADN de timo de ternera, y 1,67 copias de doble
cadena por \mul del ADN diana del plásmido Control Interno
Positivo (CPI) en un tubo de microcentrifugación con tapón de rosca.
La mezcla se agitó, luego se calentó a 105ºC durante cinco minutos.
Se dejó que las muestras se equilibraran a temperatura ambiente y se
centrifugaron a 16.000 X g durante dos minutos a temperatura
ambiente. Se añadieron 25 \mul del sobrenadante a 75 \mul de la
mezcla de reacción de PCR (composición descrita más adelante) y se
amplificó.
El procedimiento de extracción de ADN usando la
captura de polímero se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 3
de la Patente de EE.UU. Nº 5.582.988, excepto que se usaron 20
\mul de suero o plasma en los experimentos descritos en la
presente memoria descriptiva. Se granuló el complejo
ADN-polímero y se desechó el sobrenadante (que se
espera contenga inhibidores potenciales de PCR). Luego se eluyó el
ADN del granulado usando 100 \mul de una solución de NaOH 20 mM y
se calentó a 105ºC durante 5 minutos, seguido de una etapa de
centrifugado de 2 minutos. Se añadió el sobrenadante (25 \mul) a
75 \mul de una mezcla de reacción de PCR y se amplificó. El
procedimiento de captura del polímero se usó como control para
comparar con el procedimiento de extracción de ADN simplificado de
la presente invención.
La mezcla de reacción de PCR a pH 8,0 contenía
160 U/ml de polimerasa Taq recombinante, 5,28 \mug/ml de
TP4-9,2 (un exceso de 5 veces) y 53,37 \mug/ml de
anticuerpos anti-Taq TP1-12,2,
tampón Tris 18 mM, cloruro de potasio 54 mM, 0,2 \muM de cada
iniciador de CPI (CPI-F1 (delante):
Biotina-5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3'
<ID SEC Nº: 1> e CPI-R1 (reverso)
5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'
<ID SEC Nº: 2>), 0,4 \muM de cada Iniciador Específico de
Ensayo CMV (LB42M (delante) con la secuencia:
Biotina-5'-TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT-3'
<ID SEC Nº: 3> e iniciador LB41 (reverso)
5'-CACCACGCAGCGGCCCTTGATG-
TTT-3' <ID SEC Nº: 4>), desoxinucleósido trifosfatos (dNTPs) totales 1,2 mM, cloruro de magnesio 4 mM, glicerol al 9,5%, y un conservante. Típicamente, se dejó que la polimerasa Taq y los anticuerpos anti-Taq se pre-incubaran a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se incorporó el MgCl_{2} como solución aparte para añadir justo antes de la adición de la muestra. Los Iniciadores Específicos de Ensayo CMV se diseñaron para ser complementarios del ADN que codifica la Proteína de Matriz pp65 del gen Tardío de CMV en especímenes de pacientes. Tanto la diana de CPI como las secuencias diana de la proteína de Matriz pp65 de CMV se clonaron en el plásmido Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) para usar como controles de ensayo. Estos se cuantificaron con mucha exactitud mediante análisis espectrofotométricos y se ajustaron a la distribución de Poisson. La secuencia del ADN diana de control positivo interno usada era:
TTT-3' <ID SEC Nº: 4>), desoxinucleósido trifosfatos (dNTPs) totales 1,2 mM, cloruro de magnesio 4 mM, glicerol al 9,5%, y un conservante. Típicamente, se dejó que la polimerasa Taq y los anticuerpos anti-Taq se pre-incubaran a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se incorporó el MgCl_{2} como solución aparte para añadir justo antes de la adición de la muestra. Los Iniciadores Específicos de Ensayo CMV se diseñaron para ser complementarios del ADN que codifica la Proteína de Matriz pp65 del gen Tardío de CMV en especímenes de pacientes. Tanto la diana de CPI como las secuencias diana de la proteína de Matriz pp65 de CMV se clonaron en el plásmido Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) para usar como controles de ensayo. Estos se cuantificaron con mucha exactitud mediante análisis espectrofotométricos y se ajustaron a la distribución de Poisson. La secuencia del ADN diana de control positivo interno usada era:
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTT-
ATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTC-
TGCTCCAGGATCGTG-3' <ID SEC Nº: 5>.
ATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTC-
TGCTCCAGGATCGTG-3' <ID SEC Nº: 5>.
Se añadieron 25 \mul de muestra procesada a 75
\mul de la mezcla de reacción de PCR. Tras la adición y mezclado,
se introdujo la mezcla de reacción en una burbuja de amplificación
de un sistema de contención de bolsa de PCR plástica (Johnson &
Johnson Clinical Diagnostics, Inc., Patente de EE.UU. Nº 5.089.233;
5.229.297; y 5.380.489). La amplificación y detección se realizaron
usando un instrumento de tratamiento de la amplificación y detección
por PCR (Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc., Patente
de EE.UU. Nº 5.567.617). Tras un precalentamiento inicial de 3
minutos a 96ºC, la muestra se sometió a 40 ciclos de amplificación,
alternando entre desnaturalizaciones a 96ºC (5 segundos), y etapas
de ablandamiento a 70ºC (40 segundos). Tras un postcalentamiento de
5 minutos a 103ºC, los productos amplificados se introdujeron en la
cámara de detección de la bolsa conteniendo las sondas específicas
de control y ensayo unidas a perlas capturadas (Tabla 1).
INC-26,7a sirve como Control
Negativo Interno y se espera que no de señal en una bolsa de PCR que
funcione de manera apropiada.
Luego se leyó visualmente la generación de color
en las perlas capturadas y se comparó con un anotador de color con
diez tonos de color cada vez más azul y con los números
correspondientes oscilando de 0 a 10 (0 = sin señal,
10 = señal muy positiva). Una puntuación visual superior a 2 indica un resultado de la prueba positivo en esa perla de captura. Además, se registraron medidas de densidad de reflectancia (D_{r}) del instrumento de tratamiento de PCR. Las lecturas de D_{r} superiores a 0,13 indican un resultado positivo.
10 = señal muy positiva). Una puntuación visual superior a 2 indica un resultado de la prueba positivo en esa perla de captura. Además, se registraron medidas de densidad de reflectancia (D_{r}) del instrumento de tratamiento de PCR. Las lecturas de D_{r} superiores a 0,13 indican un resultado positivo.
El siguiente experimento se realizó para comparar
el procedimiento de extracción del presente con el procedimiento de
captura de polímero.
Se prepararon muestras de plasma de 65 pacientes
según el procedimiento de la presente invención y el procedimiento
de captura de polímero, como se describe arriba. Ambas muestras de
20 \mul y 50 \mul se usaron en el procedimiento de captura de
polímero. Todas estas muestras previamente provocaron un resultado
"Prueba No" cuando se evaluaron usando volúmenes de muestra de
50 \mul preparados mediante el protocolo de captura de polímero en
una evaluación inicial. Un resultado "Prueba No" ocurre cuando
la perla de captura del Control Positivo Interno da un resultado
negativo falso. El plásmido de control de CPI que se introdujo en
las muestras estaba presente en 10 copias por mezcla de reacción
final. Todas las muestras preparadas se combinaron con la mezcla de
reacción de PCR y se sometieron a amplificación y detección, como se
describe anteriormente.
La frecuencia de "Prueba No" en la captura
de polímero frente al procedimiento de la invención para muestras de
plasma se resume en la Tabla 2 que figura a continuación.
El protocolo de captura de polímero de 50 \mul
exhibió una frecuencia de "Prueba No" del 21% mientras que el
protocolo de captura de polímero de 20 \mul y el protocolo de 20
\mul de la invención instantánea tenía una tasa de error del 0%.
Con ambos protocolos de captura de polímero, había evidencia de
señal reducida en algunas muestras y el Control Positivo Interno
bordeaba el negativo.
Así, el procedimiento de la invención mejoró
significativamente el procedimiento de captura de polímero de 50
\mul y mostró mejora en el procedimiento de captura de polímero de
20 \mul en términos de resultados negativos falsos en la perla de
captura de CPI. Las muestras preparadas usando el procedimiento de
captura de polímero de 50 \mul evidentemente contenían inhibidores
de PCR o exhibían algún otro fenómeno asociado con la captura de
polímero.
Además, había un ejemplo usando la técnica de
captura de polímero de 20 \mul en el que se obtuvo un resultado
positivo falso en la perla de captura de CMV
(LBSA-11) de una muestra de paciente negativa de
CMV. Como el resultado de 50 \mul correspondiente era negativo (y
habría aportado 2,5 veces más ADN diana de CMV de la muestra de
paciente si verdaderamente estuviera presente), este resultado
ejemplifica las complicaciones en el procedimiento con múltiples
manipulaciones, como el remanente del producto.
Se extrajo ADN de muestras de suero obtenidas de
100 pacientes OB/GYN IgG-positivo,
IgM-negativo de CMV aportadas por el Texas
Children's Hospital de Houston, Texas, usando 20 \mul de muestra
en el procedimiento de captura de polímero y el procedimiento de
esta invención (véase el Ejemplo 1 arriba). Antes de la preparación
de las muestras, se añadió ADN de plásmido de control de CMV a cada
muestra para producir números de copia de cadena sencilla finales de
20 dianas de plásmido CMV en la mezcla de reacción de PCR. También
se introdujo el plásmido de control CPI en las muestras a un nivel
final de 10 copias de mezcla de reacción PCR. Todas las muestras
preparadas se combinaron con la mezcla de reacción de PCR, como se
describe arriba. Como antes, se realizó la amplificación y detección
por duplicado en bolsas de PCR.
La frecuencia de resultados negativos falsos en
la captura de polímero frente al procedimiento de la invención
usando suero se resume en la Tabla 3 que figura a continuación.
Ninguno de los procedimientos de preparación de
muestras dio resultados negativos en la perla de captura CPI. Sin
embargo, añadir diana de plásmido CMV a las muestras resultó en una
frecuencia negativa falsa del 5% en la perla de CMV cuando se usó el
procedimiento de captura de polímero, indicando inhibición potencial
de PCR. En contraste, no hubo resultados de perla de CMV negativos
falsos usando el procedimiento de la presente invención.
El siguiente experimento se realizó para probar
la eficacia del procedimiento de la presente invención en la
extracción de ADN de muestras de pacientes.
Las muestras de plasma bien (i) se extrajeron
usando el procedimiento Gene Clean II (Bio 101, Inc.) y se
caracterizaron usando tanto un ensayo de PCR de CMV con hibridación
líquida P^{32} muy sensible como un ensayo de PCR de CMV en gel
directo o bien (ii) se extrajeron usando el procedimiento de la
presente invención y se realizó el ensayo como se describe en el
Ejemplo 1 arriba. El plásmido de control CPI, que se introdujo en
cada muestra, estaba presente en 25 copias de doble cadena por
mezcla de reacción final. Todas las muestras se combinaron con la
mezcla de reacción de PCR seguido de amplificación y detección por
duplicado en bolsas de PCR, como anteriormente.
Los resultados obtenidos en la perla de captura
de CMV se muestran en la Tabla 4 que figura a continuación.
Todas las muestras de plasma TCH positivas se
consideraron muestras muy poco positivas, ya que todas eran
positivas sólo con el ensayo de hibridación líquido y eran negativas
en gel directo, lo que es indicativo de un nivel de copia bajo de
CMV en la muestra.
Había una concordancia del 80% entre los dos
procedimientos de preparación de muestras. Usando el procedimiento
de la presente invención, 10 de las 12 muestras dieron resultados
positivos con el procedimiento GeneClean y dos dieron resultados
negativos. Al volver a probar las preparaciones de muestras, de las
dos muestras negativas falsas originales, una se volvió positiva.
Para las muestras de plasma negativas GeneClean, se encontró una
situación parecida. Con las 13 muestras negativas, ambos
procedimientos de preparación de muestras dieron resultados
concordantes para diez de los especímenes (los mismos 10).
Además, había tres ejemplos en los que el
procedimiento de la presente invención indicaba una muestra positiva
de CMV. Al volver a probar las preparaciones de muestras, dos de
estas muestras volvieron a indicar un resultado positivo de CMV.
Debido a su sensibilidad inherente, esta es una observación común en
ensayos de PCR, donde muestras diana muy bajas dan resultados
discrepantes. Esto se predice basándose en una distribución de
muestreo de Poisson esperada.
El siguiente experimento se realizó para probar
la capacidad del procedimiento de la invención para eliminar
sustancias potencialmente interferentes del plasma.
Se trataron grupos de muestras de plasma normales
para variar el pH y añadir aditivos de recopilación de muestras de
sangre, y otras sustancias conocidas o sospechosas de ser capaces de
interferir en la preparación, amplificación, o detección de
muestras. Los compuestos se añadieron a una muestra a tres veces el
nivel pico de suero estimado (Tabla 5).
Se extrajo el ADN de 20 \mul de cada muestra
usando el procedimiento de la presente invención y el procedimiento
de captura de polímero de la técnica anterior, como se describe en
el Ejemplo 1 arriba. Los plásmidos CPI y CMV estaban presentes en 25
y 10 copias de doble cadena, respectivamente, por mezcla de reacción
de PCR final. La mitad de las muestras sólo contenían el plásmido
CPI para evaluar resultados positivos falsos (subida de color en la
perla de la sonda CMV) que podrían surgir debido a la contaminación
cruzada de la muestra o al remanente del producto. Todas las
muestras se combinaron con la mezcla de reacción de PCR seguido de
amplificación y detección en bolsas de PCR. Para cada compuesto, se
pasaron cuatro bolsas para los dos niveles de 0 y 10 copias de CMV.
Además, se pasaron los controles apropiados que contenían los
diversos disolventes (agua, acetona, alcohol etílico) usados en la
preparación de los compuestos para su inclusión en el ensayo.
Durante el inicio de la prueba había algunos
resultados negativos falsos esporádicos en ambas perlas de captura
CMV e CPI y varios resultados "Prueba No" para cada uno de los
procedimientos de preparación de muestras, aunque se veían
predominantemente en muestras de captura de polímero. Además, varios
de los controles dieron resultados negativos inesperados y había
indicaciones de fallos en las bolsas que contribuían a los
mismos.
Al volver a probar las muestras preparadas
previamente, todos los resultados para todas las sustancias probadas
dieron resultados positivos tanto para la captura del polímero como
para el procedimiento de la presente invención, con la excepción de
las muestras de sangre al 25% (25 partes en volumen de sangre
completa añadidas a 75 partes en volumen del plasma antes de la
extracción de ADN) preparadas usando el procedimiento de captura de
polímero. Dos de las cuatro muestras que sólo contenían diana de CPI
(no diana de CMV) volvieron a mostrar resultados de "Prueba No"
en la perla de captura de CPI. También, tres de las cuatro muestras
que contienen ambas dianas de CPI y CMV mostraron inhibición en la
perla de captura de CPI, con puntuaciones visuales de sólo "1".
Para dos de estos, la perla de captura de CMV también indicó signos
de inhibición (puntuaciones de color visuales de "3" y
"4"). Además, había otra vez un ejemplo de un resultado
positivo falso usando la técnica de captura de polímero (a
variación de pH baja) indicando otra vez la necesidad de un
procedimiento simple con un número de etapas mínimo para prevenir la
contaminación por el remanente.
Estos resultados indican que la sangre completa
al 25% es inhibitoria en el ensayo con HCMV cuando las muestras se
prepararon usando la técnica de captura de polímero. En contraste,
la extracción de ADN usando el procedimiento de la presente
invención resultó en la no inhibición de la amplificación y
detección por PCR. Esto es significativo porque las muestras de
suero y plasma en laboratorios clínicos a menudo están contaminadas
con eritrocitos sanguíneos. Además, la técnica de captura de
polímero es más laboriosa y permite una mayor exposición de la
muestra al medio en comparación con el procedimiento de la presente
invención que compara favorablemente con la captura de polímero.
La extracción de ADN usando el procedimiento de
esta invención no provoca la inhibición de la amplificación o
detección por PCR de productos amplificados con cualquiera de las
sustancias probadas. Este procedimiento simple representa un avance
significativo sobre procedimientos más pesados, de larga duración y
laboriosos de la técnica anterior.
Claims (14)
1. Un procedimiento para extraer ADN de suero o
plasma, comprendiendo dicho procedimiento:
- (i)
- poner en contacto el suero o plasma con álcali para producir suero o plasma alcalinizado;
- (ii)
- calentar dicho suero o plasma alcalinizado a una temperatura que oscila entre 100 y 110ºC durante un tiempo que oscila entre 5 y 20 minutos para producir suero o plasma alcalinizado calentado;
- (iii)
- centrifugar dicho suero o plasma alcalinizado calentado para producir un sobrenadante que contiene ADN; y
- (iv)
- recuperar dicho sobrenadante que contiene ADN.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que tras dicha etapa de calentamiento (ii) y antes de dicha etapa
de centrifugado (iii), dicho suero o plasma alcalinizado calentado
se enfría o se deja enfriar a temperatura ambiente.
3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dicho álcali es hidróxido sódico.
4. Un procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dicha temperatura es 105ºC.
5. Un procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dicho tiempo son 5 minutos.
6. Un procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dicho centrifugado es a 16.000 x g durante 2 minutos.
7. Un procedimiento según la reivindicación 2, en
el que dicho suero o plasma alcalinizado comprende álcali a una
concentración que oscila entre 15 y 50 mM.
8. Un procedimiento para detectar microorganismos
que contienen ADN en suero o plasma, comprendiendo dicho
procedimiento:
- (i)
- poner en contacto el suero o plasma de un sujeto con álcali para producir suero o plasma alcalinizado;
- (ii)
- calentar dicho suero o plasma alcalinizado a una temperatura que oscila entre 100 y 110ºC durante un tiempo que oscila entre 5 y 20 minutos para producir suero o plasma alcalinizado calentado;
- (iii)
- centrifugar dicho suero o plasma alcalinizado calentado para producir un sobrenadante que contiene ADN;
- (iv)
- recuperar dicho sobrenadante que contiene ADN;
- (v)
- someter dicho ADN en dicho sobrenadante a amplificación usando iniciadores de oligonucleótido que reconocen secuencias dentro del ADN de dicho microorganismo que contiene ADN, para formar productos de amplificación específicos para dicho microorganismo que contiene ADN; y
- (vi)
- detectar dichos productos de amplificación,
en los que la detección de dichos productos de
amplificación indica la presencia de dicho microorganismo en dicho
suero o plasma.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en
el que tras dicha etapa de calentamiento (ii) y antes de dicha etapa
de centrifugado (iii), dicho suero o plasma alcalinizado calentado
se enfría o se deja enfriar a temperatura ambiente.
10. Un procedimiento según la reivindicación 8,
en el que dicha temperatura es 105ºC.
11. Un procedimiento según la reivindicación 8,
en el que dicho microorganismo es una bacteria.
12. Un procedimiento según la reivindicación 8,
en el que dicho microorganismo es un virus.
13. Un procedimiento según la reivindicación 12,
en el que dicho virus es un citomegalovirus humano.
14. Un procedimiento según la reivindicación 8,
en el que dicho suero o plasma alcalinizado comprende álcali a una
concentración de 20 mM.
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