JP4468534B2 - 血清又は血漿からdnaを調製するための改良法 - Google Patents
血清又は血漿からdnaを調製するための改良法 Download PDFInfo
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は血清又は血漿から、特に増幅反応における標的として使用するためのDNAを調製する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
核酸の増幅及び検出の領域における技術の進歩は急速であり、特に感染性疾患、癌及び遺伝的疾患を早期に検出する市販の診断テストに関するものがそうである。現在、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法のような微量の核酸を増幅するための高度で巧妙な技法が周知である(米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号及び同第4,965,188号明細書参照)。PCRの感度が固有であること、すなわち、極低濃度の標的DNAを増幅できることは、PCR産物の低濃度キャリオーバーや試料間の汚染が偽陽性の結果をもたらしうることを意味する。とりわけ、キャリオーバー及び試料汚染は、処理に際して必要とされる試料の操作回数の関するとなる。したがって、試料が環境に晒される工程数を最小限にした簡素な手順が切望されている。
【0003】
従来、感染性ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)によるウイルス血症のPCR同定並びに他のウイルス及び細菌の同定が、全血から得られた周辺血液白血球(WBC)について行われている。通常、全血からWBCを分離することは、WBCからHCMV DNAを抽出する前に必要とされる。この分離のための手順には、デキストラン溶液中での赤血球沈降(Rasmussen ら、J. Infect. Dis. 171:177-82, 1995)、塩化アンモニウム溶液による差別的溶解(米国特許第5,702,884号、Ekeze ら)又は市販の手順の利用(例、Becton-Dickinson製の CPT-Vautainer(商標)管)が含まれる。典型的に、これらの手順には、増幅の潜在的阻害剤を除去することとなる洗浄工程が含まれ、別法として、WBCの単離は、典型的には血漿又は血清中に高濃度で存在するこれらの阻害剤を除去するのに役立つ。
【0004】
WBCを単離したら、それらを溶解し、そのDNAを抽出する。これには、例えば、WBCの煮沸、超音波処理もしくは凍結融解のような手順又はタンパク質分解酵素及び/もしくは界面活性剤を使用して細胞を溶解しDNAを抽出する手順が含まれる。DNA抽出法にはアルカリ溶解工程が含まれる場合もある(米国特許第5,639,599号)。さらに、潜在的な阻害剤を含まない精製DNAを確実に得るべく、一層精密な抽出/精製法が、例えば、ガラスビーズの使用(Gene Clean II kits, Bio 101 Inc.)、フェノール−クロロホルム抽出法、ポリマー捕捉法(米国特許第5,582,988号)、スピンカラム吸着法(Qiagen QIAamp kits)、その他市販のDNA単離キット(Puregene, Gentra Systems Inc.)により行われている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
WBC調製物から潜在的な阻害剤を洗浄又は除去するのに役立つWBCの単離、溶解に用いられる手順は、血漿や血清には使用できないことに着目すべきである。多量の内因性生化学物質及び消費薬剤、薬剤代謝物、等が存在し、しかも血清や血漿中では非常に濃縮されているので、当該技術分野では、血清や血漿に使用でき、潜在的な阻害剤を除去する、或いはこれを無効なものにする、迅速な確固たる手順が必要とされている。
【0006】
感染個体における細胞外HCMV核酸は血漿及び血清に存在する。血清及び血漿は、PCRを利用してHCMV核酸を検出するための試料の選択肢として受け入れられつつある。一般に、標的DNAは遊離DNAとしては存在せず、むしろDNA、RNA及びタンパク質の会合した複合体として存在する。DNAは、当該複合体から抽出され且つ変性されなければ、増幅に利用することはできない。血清及び血漿の試料は、典型的には熱、界面活性剤に晒され、そしてプロテアーゼで処理される。標的DNAの抽出には、先にWBCについて説明したような追加的な精密なプロトコルを採用する場合も多い(Spector et al., J. Clin. Microbiol. 30:2359-65, 1992; Nolte et al., J. Clin. Microbiol. 33:1263-66, 1995; Wolf et al., Transplantation 56:330-4, 1993; Patel et al., J. Clin. Microbiol.32:1431-4, 1994)。アルカリ処理も使用されている。しかしながら、このアルカリ処理は典型的には高濃度NaOH及びその後の中和工程を必要とする(Hansen et al., J. Infect. Dis. 170:1271-4, 1994)。
このように、当該技術分野では、PCR増幅法に適合する血清及び血漿からDNAを抽出するための迅速且つ効率的な方法が必要とされている。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明は、血清又は血漿の試料からDNAを抽出するための方法を提供するものである。本法は、
(1)血清又は血漿にアルカリを接触させてアルカリ化された血清又は血漿を得、
(2)当該アルカリ化された血清又は血漿を約100〜約110℃の範囲の温度に約5〜約20分の時間加熱し、
(3)当該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を遠心分離し、そして
(4)当該DNAを含有する上清を回収する、ことを特徴とする。
好ましい態様では、当該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を遠心分離する前に、工程(2)で得られた加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を、工程(3)の遠心分離の前に、室温、すなわち約25℃まで冷却する。
【0008】
別の態様では、本発明は、血清又は血漿に含まれるDNA含有微生物、例えば、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、の存在を検出するための方法を提供するものである。本法は、
(1)血清又は血漿にアルカリを接触させてアルカリ化された血清又は血漿を得、
(2)当該アルカリ化された血清又は血漿を約100〜約110℃の範囲の温度に約5〜約20分の時間加熱し、
(3)当該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を遠心分離し、
(4)当該DNAを含有する上清を回収し、
(5)当該上清中の当該DNAを、当該微生物のDNAに含まれる配列を認識するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより、当該微生物に特異的な増幅産物を得、そして
(6)当該増幅産物を検出する、ことを特徴とする。
本法では、当該微生物に特異的な増幅産物の検出が、当該血清又は血漿中に当該微生物が存在していることを示すものである。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明は、血清や血漿の試料からDNAを抽出するための簡便、迅速且つ効果的な方法であって、さらなる操作をしなくても後続の検出アッセイに適したDNA調製物が得られる方法を提供するものである。本法は、
(1)血清又は血漿にアルカリを接触させてアルカリ化された血清又は血漿を得、
(2)当該アルカリ化された血清又は血漿を約100〜約110℃の範囲の温度に約5〜約20分の時間加熱し、
(3)当該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を遠心分離し、そして
(4)当該DNAを含有する上清を回収する、という各工程を含む。
【0010】
加熱工程の後であるが遠心分離工程の前に、当該加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を、室温、すなわち約25℃まで冷却する。冷却は、受動的であること、すなわち、単に室内空気との平衡によることであってもよいし、能動的であること、すなわち、加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を、その温度が室温に達するまで冷蔵し、氷上に配置し、又は水浴中に配置してもよい。
【0011】
本発明を実施する際に適したアルカリには、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム又はこれらいずれかの混合物が含まれるが、これらに限定はされない。水酸化ナトリウムの使用が好ましい。工程(1)で調製された混合物中のアルカリの最終濃度は約10〜約90mMの範囲、最も好ましくは約15〜約50mMの範囲である。特にアルカリ濃度を約20mMとすることに着目される。好ましい方法は、1体積部の血清又は血漿に対して約4体積部の約25mMのアルカリ水溶液を混合した混合物を形成するというものである。
アルカリ化された血清又は血漿を加熱する温度は約105℃とすることが好ましく、またその時間は約5分とすることが好ましい。遠心分離工程は周囲温度において約16,000×gで約2分間行うことが好ましい。
【0012】
遠心分離後の混合物から回収された上清は、PCR増幅混合物に直接添加することができる。しかしながら、その上清を、所望により、PCR混合物に添加する前に、さらに処理又は試薬添加することにより変性させてもよい。本発明によるアルカリ処理は、PCR阻害剤を不活性化し、そしてタンパク質、特に標的DNAを増幅不可能になるまで分解しうるヌクレアーゼを変性させるのに役立つ。また、DNAを変性し、増幅プライマーとハイブリダイズしやすくなるように、すなわちPCR増幅を促進するのにも役立つ。さらに、本法の簡便さにより、試料間汚染やPCRキャリオーバーの可能性が大幅に減少する。また、核酸を単離、精製するために日常的に用いられる高価で往々にして不安定な材料を使う必要もなくなる。
【0013】
本発明は、診断アッセイ、特にDNAウイルス、例えば、サイトメガロウイルス、単純性疱疹性ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、B型肝炎ウイルスその他の任意の血液中のウイルス、を検出するアッセイのためのDNA試料を調製するのに有用である。このDNA調製物を使用できる検出方法には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、等をはじめとするハイブリダイゼーションが関与する任意の方法が含まれるが、これに限定はされない。このように、本発明は、被験体の血清又は血漿をアルカリ化し、アルカリ化された血清又は血漿を約100〜約110℃の範囲の温度に約5〜約20分の時間加熱し、遠心分離してDNAを含有する上清を得、その上清を回収し、上清中のDNAをそのDNA含有微生物のDNAに特異的なプライマーを用いて増幅することによりその微生物に特異的な増幅産物を得、その後増幅産物を検出する各工程を含み、その増幅産物の存在が当該被験体の血液又は血清に当該微生物が存在していることを示すこととなる、DNA含有微生物を検出するための方法を包含する。
【0014】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例示するものであって、これを限定するものではない。
方法:
1.血清及び血漿試料
血漿を得るためには、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)又は他の抗凝固剤、例えば、ヘパリン及びオキサレートを含有するVacutainer(商標)管に全血試料を集め、また血清を得るためには抗凝固剤を使用せずに全血試料を集めた。
2.試料調製
スクリューキャップ式微小遠心分離管において1μL当たり内部陽性対照(IPC)プラスミド標的DNA二本鎖1.67コピーと0.334μg/μLのウシ胸腺DNAとを含有する80μLの25mMのNaOHに20μLの血清又は血漿を添加した。混合物をボルテックス攪拌した後、105℃で5分間加熱した。試料を室温と平衡化させ、そして室温において16,000×gで2分間遠心分離した。その上清25μLを75μLのPCR反応混合物(組成については後述)に添加して増幅した。
【0015】
3.ポリマー捕捉法−対照
ポリマー捕捉法によるDNAの抽出法を米国特許第5,582,988号の実施例3に記載されているように実施したが、本実験では20μLの血清又は血漿を使用した。DNA−ポリマー複合体をペレットにし、その上清を廃棄した(PCRの潜在的阻害剤を含有すると思われるもの)。次いで、そのペレットから、100μLの20mMのNaOH溶液を用いてDNAを溶離させ、これを105℃で5分間加熱し、その後2分間の遠心分離にかけた。その上清(25μL)を75μLのPCR反応混合物に添加して増幅した。ポリマー捕捉法は、本発明の簡素化されたDNA抽出法との比較用対照法として使用したものである。
【0016】
4.PCR増幅及び検出
PCR反応混合物は、pH8.0において、160U/mLの組換えTaqポリメラーゼ、5.28μg/mLのTP4−9.2(5倍過剰量)及び53.37μg/mLのTP1−12.2抗Taq抗体、18mMのトリス緩衝剤、54mMの塩化カリウム、0.2μMの各IPCプライマー(IPC−F1(前向):ビオチン-5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3' <配列番号1>及びIPC−R1(逆向)5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'<配列番号2>)、0.4μMの各CMVアッセイ特異的プライマー(LB42M(前向)配列:ビオチン-5'-TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT-3'<配列番号3>及びプライマーLB41(逆向)5'-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT-3' <配列番号4>)、1.2mMの全デオキシヌクレオシドトリホスフェート(dNTP)、4mMの塩化マグネシウム、9.5%のグリセロール並びに防腐剤を含有するものとした。典型的には、Taqポリメラーゼと抗Taq抗体を室温にて10分間プレインキュベートさせ、またMgCl2 を独立した溶液として試料の添加直前に添加した。CMVアッセイ特異的プライマーは、患者試料に含まれるCMV Late 遺伝子のpp65マトリックスタンパク質をコードするDNAに相補的となるように設計した。IPC標的及びCMVpp65マトリックスタンパク質標的の各配列をBluescriptプラスミド(Stratagene, La Jolla, CA)でクローニングし、アッセイ対照として使用した。これらは分光光度分析により正確に定量化され、ポワソン分布に適合した。使用した内部陽性対照標的DNAの配列は以下の通り。
【0017】
【化1】
【0018】
75μLのPCR反応混合物に25μLの処理後試料を添加した。添加し混合した後、反応混合物をプラスチック製のPCRパウチ容器システムの増幅ブリスターに導入した(Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc., 米国特許第5,089,233号、同第5,229,297号及び同第5,380,489号明細書)。PCR増幅及び検出処理装置を用いて増幅及び検出を実施した(Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc., 米国特許第5,567,617号明細書)。96℃、3分間の初期予備加熱の後、96℃(5秒)の変性工程と70℃(40秒)のアニール工程とを交互させることにより試料を40サイクルの増幅にかけた。103℃で5分間の後加熱を行った後、増幅産物を、捕捉ビーズに結合した対照及びアッセイ特異的プローブを含有するパウチの検出室に導入した(表1)。
【0019】
【表1】
INC-26.7a は内部陰性対照として働き、適切に機能するPCRパウチにおいて何らシグナルを与えないことが予想される。
【0020】
次いで、捕捉ビーズ上の発色を目視で読み取り、青色の10段階の濃淡を有し、それに対応して0〜10(0=信号なし、10=高い陽性信号)の範囲で数値を付したカラースコアカードと比較した。目視のスコアが2よりも大きい場合には、その捕捉ビーズのテスト結果が陽性であることを示す。さらに、PCR処理装置の反射濃度(Dr )の測定値を記録した。Dr が0.13よりも高い場合には結果が陽性であることを示す。
【0021】
例1:本発明の方法による血漿からのDNAの抽出:ポリマー捕捉法との比較
本発明の抽出法とポリマー捕捉法とを比較するため、以下の実験を行った。
65人の患者から、上述のように本発明の方法及びポリマー捕捉法に従い血漿試料を調製した。ポリマー捕捉法では20μLと50μLの両方の試料を使用した。これらの試料はすべて、従前に初期評価においてポリマー捕捉プロトコルにより調製された50μL試料体積で評価した時に「ノー・テスト」の結果を引き出していた。「ノー・テスト」の結果は、内部陽性対照捕捉ビーズが偽陰性の結果を与えた時に起こる。試料に導入されたIPC対照プラスミドは最終反応混合物当たり10コピーで存在した。調製したすべての試料をPCR混合物と一緒にし、上述のように増幅及び検出を行った。
【0022】
【表2】
*IPC陰性結果の数/全試料実験数
【0023】
50μLのポリマー捕捉法は21%の「ノー・テスト」頻度を示したが、20μLのポリマー捕捉法及び本発明の20μLのプロトコルの失敗率は0%であった。どちらのポリマー捕捉法も、一部の試料及び陰性との境界にある内部陽性対照について信号が減少したことを示した。
このように、本発明の方法は、50μLのポリマー捕捉法よりも顕著に優れており、また20μLのポリマー捕捉法に対してもIPC捕捉ビーズでの偽陰性結果に関して改良されていることを示した。50μLのポリマー捕捉法により調製された試料は、明らかにPCRの阻害剤を含有し、しかもポリマー捕捉法に関連する他の何らかの現象を示した。
【0024】
さらに、20μLのポリマー捕捉法を使用した場合に、CMV(LBSA−11)捕捉ビーズ上でCMV陰性患者試料から偽陽性結果が得られた場合が1回あった。対応する50μLの結果は陰性であり(もし本当に存在したのであれば、患者試料から2.5倍多いCMV標的DNAを提供したはずである)、この結果は、操作の多い手順の複雑さ、例えば、生成物のキャリオーバーを例示するものである。
【0025】
例2:本発明の方法による血清からのDNAの抽出:ポリマー捕捉法との比較
ポリマー捕捉法及び本発明の方法において20μLの試料を使用して、テキサス州ヒューストンにあるテキサス子供病院より提供された100人のCMV IgG陽性、IgM陰性OB/GYN患者から得た血清思料からDNAを抽出した(例1参照)。試料の調製前に、CMV対照プラスミドDNAを各試料に添加してPCR反応混合物中に20のCMVプラスミド標的の最終一本鎖コピー数を得た。試料にはIPC対照プラスミドもPCR反応混合物当たり10コピーの最終レベルになるように導入した。上述のように、調製した試料のすべてをPCR反応混合物と一緒にした。前回と同様に、PCRパウチにおいて増幅及び検出を2回づつ実施した。
血清を用いた場合のポリマー捕捉法と本発明の方法との偽陰性結果の頻度を下記表3にまとめた。
【0026】
【表3】
*IPC陰性結果の数/全試料実験数
【0027】
いずれの試料も、IPC捕捉ビーズについては陰性結果を与えなかった。しかしながら、CMVプラスミド標的を試料に添加すると、ポリマー捕捉法を使用した場合にCMVビーズについて5%の偽陰性頻度が発生し、PCRの潜在的阻害を示唆した。対照的に、本発明の方法による場合にはCMVビーズの結果が偽陰性を示すことはまったくなかった。
【0028】
例3:本発明の方法によるCMV患者集団のプラスミドからのDNAの抽出: GeneClean II 試料との比較
患者試料からDNAを抽出する際の本発明の方法の効能を調べるため、以下の実験を行った。
血漿試料を、(1)GeneClean II法(Bio 101, Inc.) を用いて抽出し、高感度P32液体ハイブリダイゼーション式CMV PCRアッセイ及び直接ゲル式CMV PCRアッセイの両方により特性決定するか、又は(2)本発明の方法を用いて抽出し、例1に記載したようにアッセイした。IPC対照プラスミドは、各試料に導入したが、最終反応混合物当たり二本鎖コピー数25で存在した。すべての試料をPCR反応混合物と一緒にし、次いで上述のようにPCRパウチにおいて増幅及び検出を2回づつ行った。
CMV捕捉ビーズについての結果を以下の表4に示す。
【0029】
本発明の方法対GeneClean II法:血漿試料の試料調製
【表4】
【0030】
いずれの陽性TCH血漿試料も陽性の極めて低い試料であると考えられた。いずれも液体ハイブリダイゼーションアッセイにおいてのみ陽性であり、直接ゲル上では陰性であったことから、試料中のCMVのコピーレベルは低いことを示しているからである。
二つの試料調製法の間の一致率は80%であった。本発明の方法を用いると、12の試料のうち10がGeneClean 法による陽性結果を与え、そして二つが陰性結果を与えた。最初に偽陰性であった二つの試料の試料調製物を再テストしたところ、一つは陽性となった。GeneClean の陰性血漿試料についても同様の状況であった。13の陰性試料を用いた場合、双方の試料調製法は試料のうち10について一致した(同じ10個)。
さらに、本発明の方法がCMV陽性試料を示した場合が三つあった。当該試料調製物を再テストしたところ、これら三つの試料のうちの二つが再度CMV陽性の結果を示した。PCRアッセイでは、その固有感度故、非常に少ない標的試料が矛盾する結果を与えることはよく見られることである。この予測は、予測ポワソンサンプリング分布に基づくものである。
【0031】
例4:潜在的妨害性物質の血漿への添加
本発明の方法が血漿から潜在的妨害性物質を除去できることをテストするため、以下の実験を行った。
正常な血漿試料プールを処理してpHを変化させ、血液試料コレクション添加物及びその他の試料調製、増幅又は検出を妨害し得ることが知られている又は疑われている物質を添加する。化合物の試料への添加は、血清レベルの推定ピークの3倍で行った(表5)。
DNAの抽出は、例1に記載したように、本発明の方法及び従来技術のポリマー捕捉法により20μLの各試料から行った。IPC及びCMVプラスミドは、最終PCR反応混合物当たり25及び10の二本鎖コピー数で存在した。試料の交差汚染又は生成物キャリオーバーが原因で起こり得る偽陽性結果(CMVプローブビーズ上での発色増強)を評価するため、試料の半分にIPCプラスミドのみを含めた。すべての試料をPCR反応混合物と一緒にし、PCRパウチにおいて増幅及び検出した。各化合物について、CMVコピーレベル0及び10の両方について四つのパウチを実験した。さらに、アッセイに含めるための化合物を調製する際に用いられる各種溶剤(水、アセトン、エチルアルコール)を含有する適当な対照物についても実験した。
【0032】
【表5】
【表6】
【表7】
【表8】
【0033】
略語解:*+は標的が存在するすべてのCMV及びIPC捕捉ビーズにおける陽性結果を示し;FPは偽陽性を示し;FNは偽陰性(CMVが10コピーレベルでインプットされたCMV陽性が予定された捕捉ビーズ上でのCMV陰性結果)を示し;NTは「ノー・テスト」、CMV陰性が予定された試料上でIPC捕捉ビーズが陰性であること(CMV=Neg)を示す。
初期の試験の際に、CMV及びIPCの捕捉ビーズのいずれにも突発的な偽陰性結果が若干見られ、また試料調製法の各々についていくつかの「ノー・テスト」結果が存在したが、それらは主としてポリマー捕捉試料において見られた。さらに、対照のいくつかは予想外の陰性結果を与え、パウチの失敗がこれらに起因していることを示唆していた。
【0034】
先に調製した試料を再テストしたところ、ポリマー捕捉法により調製した25%血液試料(DNA抽出前に75体積部の血漿に25体積部の全血を添加したもの)を除き、テストしたすべての物質のすべての結果がポリマー捕捉法及び本発明の方法の両方について陽性結果を引き出した。IPC標的のみを含有する(CMV標的は含まない)四つの試料のうち二つが、IPC捕捉ビーズに対して「ノー・テスト」の結果を示した。また、IPCとCMVの両方の標的DNAを含む四つの試料のうち三つが、IPC捕捉ビーズに対して阻害を示し、目視スコアは「1」にすぎなかった。このうち二つについては、CMV捕捉ビーズも阻害の兆候を示した(目視発色スコアが「3」及び「4」であった)。さらに、ここでもまたポリマー捕捉法を用いた場合に偽陽性の結果を示すものが1回あり(pH変動が少ない場合に)、キャリオーバー汚染を防止するためには工程数を最少限にした簡素な方法が必要であることを示唆している。
【0035】
これらの結果は、25%全血が、試料をポリマー捕捉法で調製した場合にはHCMVアッセイにおいて阻害作用を有することを示している。対照的に、本発明の方法によるDNA抽出は、PCRの増幅及び検出を何ら阻害しない結果となった。このことは、臨床実験室の血清及び血漿試料は赤血球細胞で汚染されている場合が多いため、重要なことである。さらに、本発明の方法に比べポリマー捕捉法は労力が多大であり、試料が環境に晒される機会も多いので、本発明の方法はポリマー捕捉法よりも優れている。
本発明の方法によるDNA抽出は、被験物質のいずれによってもPCR増幅又は増幅産物の検出を阻害することにならない。この簡素な方法は、従来の煩わしく、時間がかかり、しかも労力の多い方法を顕著に凌ぐものである。
Claims (14)
- (1)血清又は血漿にアルカリを接触させてアルカリ化された血清又は血漿を得、
(2)前記アルカリ化された血清又は血漿を100〜110℃の範囲の温度に5〜20分の時間加熱することにより、加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を得、
(3)前記加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を遠心分離することにより、DNAを含有する上清を得、そして
(4)前記DNAを含有する上清を回収することを特徴とする、血清又は血漿からDNAを抽出するための方法。 - 前記加熱工程(2)の後、前記遠心分離工程(3)の前に、前記加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を25℃まで冷却することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記アルカリが水酸化ナトリウムであることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記温度が105℃であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記時間が5分であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記遠心分離を16000×gで2分間行うことを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記アルカリ化された血清又は血漿がアルカリを15〜50mMの濃度範囲で含むことを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 血清又は血漿に含まれるDNA含有微生物を検出するための方法であって、
(1)被験体の血清又は血漿にアルカリを接触させてアルカリ化された血清又は血漿を得、
(2)前記アルカリ化された血清又は血漿を100〜110℃の範囲の温度に5〜20分の時間加熱することにより、加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を得、
(3)前記加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を遠心分離することにより、DNAを含有する上清を得、
(4)前記DNAを含有する上清を回収し、
(5)前記上清中の前記DNAを、前記DNA含有微生物のDNAに含まれる配列を認識するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより、前記DNA含有微生物に特異的な増幅産物を得、そして
(6)前記増幅産物を検出することを特徴とし、前記増幅産物の検出が前記血清又は血漿に含まれる前記微生物の存在を示すこととなる方法。 - 前記接触工程(2)の後、前記遠心分離工程(3)の前に、前記加熱後のアルカリ化された血清又は血漿を25℃まで冷却することを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記温度が105℃であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記微生物が細菌であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記微生物がウイルスであることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記ウイルスがサイトメガロウイルスであることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記アルカリ化された血清又は血漿がアルカリを20mMの濃度で含むことを特徴とする、請求項8に記載の方法。
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