KR20000076596A - 혈청 및 혈장으로부터 ｄｎａ를 조제하는 개선된 방법 - Google Patents

혈청 및 혈장으로부터 ｄｎａ를 조제하는 개선된 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에는 혈청 또는 혈장을 알칼리와 접촉시켜 알칼리화 혈청 또는 혈장을 수득하는 단계, 알칼리화 혈청 또는 혈장을 약 5 내지 약 20분 동안 약 100 내지 약 110EC의 온도로 가열하는 단계, 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 원심분리하여 DNA 함유 상등액을 수득하는 단계, 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 실온 또는 약 25EC로 냉각시키는 단계 및 DNA 함유 상등액을 회수하는 단계를 포함하여, 혈청 또는 혈장으로부터 DNA를 추출하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 혈청 또는 혈장 중의 DNA 함유 미생물을 검출하는 방법이 기재되어 있다.

Description

혈청 및 혈장으로부터 ＤＮＡ를 조제하는 개선된 방법{An improved method for preparing DNA from serum and plasma}
본 발명은 특히 증폭 반응에서 타겟으로 사용하기 위해 DNA를 혈청 및 혈장으로부터 조제하는 방법에 관한 것이다.
핵산의 증폭 및 검출 분야의 기술은 감염성 질환, 암 및 유전적 장애의 조기 진단을 제공하는 상업적 진단 시험과 연관되어 있어 급속히 진전되었다. 미량 핵산을 증폭시키는 매우 복잡한 기술, 예를 들면, PCR(폴리머라제 쇄 반응; polymerase chain reaction)은 현재 익히 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,965,188호]. PCR의 고유 민감도, 즉 매우 적은 농도의 타겟 DNA를 증폭시키는 능력은 PCR 생성물의 낮은 수준의 캐리오버(carryover) 및 샘플간의 오염에 의해 허용되지 않는 포지티브 결과가 얻어질 수 있다는 것을 의미한다. 다른 것들 중에서 캐리오버와 샘플 오염은 프로세싱 동안 수득된 샘플의 조작 횟수의 함수이다. 따라서, 샘플을 환경에 노출시키는 단계의 수가 최소인 간단한 방법이 매우 바람직하다.
전통적으로, 감염성 사람 사이토메갈로바이러스(HCMV: human cytomegalovirus)로 인한 바이러스 혈증의 PCR 동정 및 기타 바이러스와 박테리아의 동정은 전혈로부터 수득된 말초 혈액 백혈구(WBC)에 대해 수행한다. 일반적으로 WBC로부터 HCMV DNA를 추출하기 전에 전혈로부터의 WBC의 분리가 필요하다. 이러한 분리방법은 덱스트란 용액 속의 적혈구의 침전[참조: Rasmussen et al., J. Infect. Dis., 171:177-82, 1995], 염화암모늄 용액을 사용하는 시차 분해(differential lysis)[참조: 미국 특허 제5,702,884호, 에케제(Ekeze) 등] 또는 상업적 방법[예: CPT-Vacutainer(배큐테이너)TM튜브, 벡톤-딕킨슨(Becton-Dickinson)사]을 포함한다. 전형적으로, 이들 방법은 증폭의 잠재성 억제제를 제거하는 세척 단계를 포함한다. 또한, WBC의 분리는 전형적으로 혈청 또는 혈장에 고농도로 존재하는 이들 억제제를 제거하는 데 도움이 된다.
일단 WBC를 분리하면, 이들을 분해하고 DNA를 추출한다. 이것은 예를 들면 WBC의 비등, 초음파 처리 또는 냉동-해동 방법을 포함하거나, 단백질 분해 효소 및/또는 계면활성제를 사용하여 세포를 분해하고 DNA를 추출하는 방법을 포함한다. 또한, DNA 추출은 알칼리 분해 단계[참조: 미국 특허 제5,639,599호]를 포함할 수 있다. 잠재성 억제제를 포함하지 않는 정제 DNA를 더욱 확실하게 수득하기 위해, 종종, 예를 들면, 유리 비이드[참조: 진 클린 II 키트(Gene Clean II Kits), 바이오 101 인코포레이티드(Bio 101, Inc.)], 페놀-클로로포름 추출방법, 중합체 포획[참조: 미국 특허 제5,582,988호], 스핀-컬럼 흡착(spin-column adsorption)[퀴아겐 퀴아앰프 키트(Qiagen QIAamp kits)] 및 기타 시판중인 DNA 분리 키트[퓨어겐(Puregene), 젠트라 시스템스 인코포레이티드(Gentra Systems Inc.)]의 사용을 포함한 더욱 격렬한 추출/정제를 수행한다.
명백하게도, WBC 조제물로부터 잠재성 억제제를 세척 또는 제거하는데 도움이 되는 WBC의 분리 및 분해에 사용되는 방법은 혈청 및 혈장에 대해 사용할 수 없다. 대부분의 내인성 생화학적 물질과 소비된 약물, 약물 대사물 등이 혈청 및 혈장에 고농도로 존재하기 때문에, 당해 분야에서는 잠재성 억제제를 제거하거나 이들을 불활성화하는, 혈청 및 혈장의 경우에 사용할 수 있는 신속하고 강력한 방법이 요구되고 있다.
감염된 개체의 세포외 HCMV 핵산은 혈청 및 혈장에 존재한다. 혈청 및 혈장은 PCR을 사용하여 HCMV 핵산을 검출하기 위한 선택적인 샘플로서 허용되고 있다. 일반적으로, 타겟 DNA는 유리 DNA로서 존재한다기 보다는 DNA, RNA 및 단백질이 복합 결합체로서 존재한다. DNA는 증폭에 사용할 수 있도록 복합체로부터 추출하고 변성시킨다. 혈청 및 혈장 샘플은 전형적으로 열, 계면활성제로 처리하고 프로테아제로 처리한다. 종종, WBC에 대해 위에서 기재한 바와 같은 추가의 강력한 프로토콜(protocol)을 사용하여 타겟 DNA를 추출한다[참조: Spector et al., J. Clin. Microbiol. 30:2359-65,; Nolte et al., J. Clin. Microbiol. 33:1263-66, 1995; Wolf et al., Transplantation 56:330-4, 1993; Patel et al., J. Clin. Microbiol. 32:1431-4, 1994]. 또한, 알칼리 처리법이 사용되고 있다. 그러나, 전형적으로 이러한 알칼리 처리는 고농도의 NaOH와 이후의 중화 단계를 필요로 한다[참고: Hansen et al., J. Infect. Dis. 170:1271-4, 1994].
따라서, 당해 분야에서는 PCR 증폭 방법과 양립할 수 있는 신속하고 효과적인 혈청 및 혈장으로부터의 DNA 추출방법이 요구된다.
본 발명은 혈청 또는 혈장으로부터 DNA를 추출하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 혈청 또는 혈장을 알칼리와 접촉시켜 알칼리화 혈청 또는 혈장을 수득하는 단계(i),
알칼리화 혈청 또는 혈장을 약 5 내지 약 20분 동안 약 100 내지 약 110EC의 온도로 가열하는 단계(ii),
가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 원심분리하는 단계(iii) 및
DNA 함유 상등액을 회수하는 단계(iv)를 포함한다.
바람직한 양태에서, 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 원심분리하는 단계(iii)전에, 단계(ii)에 의해 제조된 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 냉각시키거나 실온, 즉 약 25EC로 냉각시킨다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 혈청 또는 혈장 중의 DNA 함유 미생물, 예를 들면, 사람 사이코메칼로바이러스(HCMV)의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 혈청 또는 혈장을 알칼리와 접촉시켜 알칼리화 혈청 또는 혈장을 수득하는 단계(i),
알칼리화 혈청 또는 혈장을 약 5 내지 약 20분 동안 약 100 내지 약 110EC의 온도로 가열하는 단계(ii),
가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 원심분리하는 단계(iii),
DNA 함유 상등액을 회수하는 단계(iv),
미생물 DNA 내의 서열을 인식하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 상등액 속의 DNA를 증폭시켜 미생물 특이성 증폭 생성물을 형성시키는 단계(v) 및
미생물 특이성 증폭 생성물을 검출하는 단계(여기서, 미생물 특이성 증폭 생성물의 검출은 혈청 또는 혈장에 미생물이 존재함을 나타낸다)(vi)를 포함한다.
바람직한 양태에서, 단계(ii)에 이어서, 단계(ii)에 의해 제조된 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 냉각시키거나 실온, 즉 약 25EC로 냉각시킨 후, 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 원심분리하는 단계(iii)를 수행한다.
본 발명은 혈청 및 혈장 샘플로부터 DNA를 추출하는 간단하고 신속하며 매우 효과적인 방법으로서, 추가의 조작없이 이후의 검출 검정에 사용하기 적합한 DNA 조제물을 수득할 수 있는 방법을 제공한다.
당해 방법은 혈청 또는 혈장을 알칼리와 접촉시켜 알칼리화 혈청 또는 혈장을 수득하는 단계(i),
알칼리화 혈청 또는 혈장을 약 5 내지 약 20분 동안 약 100 내지 약 110EC의 온도로 가열하는 단계(ii),
가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 원심분리하는 단계(iii) 및
DNA 함유 상등액을 회수하는 단계(iv)를 포함한다.
바람직하게는, 가열 단계와 원심분리 단계 사이에, 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 냉각시키거나 실온, 즉 약 25EC로 냉각시킨다. 냉각은 수동적으로 수행, 즉 실내 공기와의 평형에 의해 간단히 수행하거나, 강제 냉각, 즉 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장의 온도가 실온에 도달할 때까지 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 냉장시키거나 얼음 위에 놓거나 수욕에 넣을 수 있다.
본 발명을 수행하는 경우, 적합한 알칼리는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 수산화나트륨을 사용한다. 단계(i)에서 제조된 혼합물 속의 알칼리 농도는 약 10 내지 약 90mM이고, 가장 바람직하게는 약 15 내지 약 50mM이다. 알칼리 농도가 약 20mM인 경우가 특히 바람직하다. 바람직한 방법은 혈청 또는 혈장 1용적부와 약 25mM 알칼리 수용액 약 4용적부와의 혼합물을 형성시킴을 포함한다.
알칼리화 혈청 또는 혈장의 바람직한 가열 온도는 약 105EC이고, 바람직한 가열 시간은 약 5분이다. 원심분리 단계는 바람직하게는 약 16,000×g에서 약 2분동안 주위 온도에서 수행한다.
원심분리한 혼합물로부터 회수한 상등액은 PCR 증폭 혼합물에 직접 가할 수 있다. 그러나, 상등액을 PCR 혼합물에 가하기 전에 바람직하게는 추가의 처리 또는 시약 처리로 변성시킬 수 있다. 본 발명에 따르는 알칼리 처리는 PCR 억제제를 불활성화시키고 단백질, 특히 타겟 DNA를 증폭시킬 수 없는 상태까지 분해할 수 있는 뉴클레아제를 불활성화시키는 데 도움이 된다. 또한, 본 발명에 따르는 알칼리 처리는 DNA를 변성시켜 DNA가 더욱 증폭 프라이머로 하이브리드화(hybridization)되어 PCR 증폭시키는 데 도움이 된다. 또한, 당해 방법은 간단하여 샘플-대-샘플(sample-to-sample) 오염 가능성 및 PCR 생성물 캐리오버를 매우 감소시킬 수 있다. 또한, 당해 방법은 핵산 분리와 정제에 통상적으로 사용되는 값비싸고 종종 불안정하기도 한 물질을 사용할 필요가 없다.
본 발명은 진단 검정, 특히 DNA 바이러스, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 엡슈타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스, 헵파티티스 B 바이러스 및 임의의 혈액-발생(blood-borne) 박테리아를 검출하는 진단 검정을 위한 DNA 샘플을 조제하는 데 유용하다. DNA 조제물이 사용될 수 있는 검출방법은 예를 들면, 폴리머라제 쇄 반응, 리가제 쇄 반응 등을 포함하는 하이브리드화을 포함하는 임의의 방법을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명은 검체로부터의 혈청 또는 혈장을 알칼리화하는 단계, 알칼리화 혈청 또는 혈장을 약 5 내지 약 20분 동안 약 100 내지 약 110EC의 온도로 가열하는 단계, 원심분리하여 DNA 함유 상등액을 수득하는 단계, DNA 함유 상등액을 회수하는 단계, DNA 함유 미생물의 DNA 특이성 프라이머를 사용하여 상등액 속에서 DNA를 증폭시켜 미생물 특이성 증폭 생성물을 형성시키는 단계 및 이어서, 미생물 특이성 증폭 생성물을 검출하는 단계(여기서, 미생물 특이성 증폭 생성물의 존재는 검체의 혈청 또는 혈장에 미생물이 존재함을 나타낸다)를 포함하여 DNA 함유 미생물을 검출하는 방법을 포함한다.
아래의 실시예로 본 발명을 설명하며, 이들이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
방법:
1. 혈청 및 혈장 샘플
전혈 샘플을 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 또는 다른 항응집제, 예를 들면, 헤파린과 옥살레이트가 담긴 배큐테이너TM튜브에 수집하여 혈장을 수득하거나, 전혈 샘플을 항응집제의 부재하에 수집하여 혈청을 수득한다.
2. 샘플 조제
스크류 캡이 달린 마이크로 원심분리 튜브 속의 송아지 흉선 DNA 0.334㎍/㎕와 내부 포지티브 대조군(IPC) 1㎕당 1.67개의 이중 나선 복사체(copy)를 함유하는 25mM NaOH 용액 80㎕에 혈청 또는 혈장 20㎕를 가한다. 혼합물을 볼텍싱한 후 105EC에서 5분 동안 가열한다. 샘플을 실온과 평형 상태로 하고 실온에서 2분 동안 16,000×g에서 원심분리한다. 상등액 25㎕를 PCR 반응 혼합물(아래에 기재된 조성물) 75㎕에 가하여 증폭시킨다.
3. 중합체 포획-대조군
중합체 포획을 사용하는 DNA 추출방법은 미국 특허 제5,582,988호의 실시예 3에 기재되어 있는 바와 같이 수행하되, 단 본원의 실험에서는 혈청 또는 혈장 20㎕를 사용한다. DNA-중합체 복합체를 펠렛화하고 (PCR의 잠재성 억제제를 함유하는 것으로 생각되는) 상등액을 버린다. 이어서, 20mM NaOH 용액 100㎕를 사용하여 펠렛으로부터 DNA를 용출시키고 105EC에서 5분 동안 가열한 다음, 2분 동안 원심분리한다. 상등액(25㎕)을 PCR 반응 혼합물 75㎕에 가하고 증폭시킨다. 중합체 포획방법은 본 발명의 간단한 DNA 추출방법과 비교하기 위한 대조군으로서 사용한다.
4. PCR 증폭 및 검출
pH 8.0의 PCR 반응 혼합물은 재조합 Taq 폴리머라제 160U/㎖, TP4-9.2 5.28㎍/㎖(5배 과량) 및 TP1-12.2 안티-Taq 항체 53.37㎍/㎖, 트리스 버퍼 18mM, 염화칼륨 54mM, 각각의 IPC 프라이머(IPC-F1(정방향): 바이오틴-5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAA-3'〈서열 번호: 1〉 및 IPC-R1(역방향): 5'-CACGATCCTGGAGCAGACACTGAAGA-3'〈서열 번호: 2〉) 0.2μM, 각각의 CMV 검정 특이적 프라이머(LB42M(정방향): 바이오틴-5'-TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT-3'〈서열 번호: 3〉 및 프라이머 LB41(역방향): 5'-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTT-3'〈서열 번호: 4〉) 0.4μM, 총 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTP) 1.2mM, 염화마그네슘 4mM, 95% 글리세롤 및 보존제를 함유한다. 전형적으로, Taq 폴리머라제와 안티-Taq 항체를 실온에서 10분 동안 예비배양하고 MgCl2를 샘플 첨가 직전에 첨가할 별도의 용액으로서 공급한다. CMV 검정 특이적 프라이머는 환자 샘플의 CMV 후기 유전자의 pp65 매트릭스 단백질을 암호화하는 DNA에 상보적이도록 디자인한다. 검정 대조군으로서 사용하기 위해 IPC 타겟과 CMV pp65 매트릭스 단백질 타겟 서열을 블루스크립트 플라스미드(Bluescript plasmid)(Stratagene, La Joolla, CA)로 클로닝한다. 이들은 분광 분석으로 정확하게 정량하고 포이쓴 분포(Poisson's distribution)에 맞춘다. 사용한 IPC 타겟 DNA의 서열은 다음과 같다: 5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3'〈서열 번호 : 5〉.
가공된 샘플 25㎕를 PCR 반응 혼합물 75㎕에 가한다. 첨가 및 혼합 후, 반응 혼합물을 플라스틱 PCR 파우치 오염 시스템[참조: 존슨 앤드 존슨 클리니칼 디아그노스틱스, 인코포레이티드(Johnson ＆ Johnson Clinical Diagnostics, Inc.), 미국 특허 제5,089,233호, 제5,229,297호 및 제5,380,489호]의 증폭 블리스터에 도입한다. 증폭 및 검출은 PCR 증폭 및 검출 가공 기기[참조: 존슨 앤드 존슨 클리니칼 디아그노스틱스, 인코포레이티드, 미국 특허 제5,567,617호]를 사용하여 수행한다. 96EC에서 3분 동안의 최초의 예비가열 후, 96EC(5초) 변성 및 70EC(40초) 어닐링 단계를 번갈아 수행하면서 샘플을 40사이클 증폭시킨다. 103EC에서 5분 동안 후가열한 다음, 증폭된 생성물을 포획 비드에 결합된 대조군 및 검정 특이적 프로브(probe)를 함유하는 파우치의 검출 챔버에 도입시킨다(표 1).
비드 번호 명칭 서열 서열 번호
비드 2 IPC-1P 5'-CTGCGTTAGACCGAGAACTGTGGATAAAGG-3' 6
비드 4 LBSA-11(CMV) 5'-GAACCGAGGGCCGGCTCACCTCTATGTTGG-3'(pp65 매트릭스 단백질) 7
비드 6 INC-26.7a 5'-TTAGTAGTAGAAGGACGACGATGGCG-3' 8
INC-26.7a는 내부 네가티브 대조군(Internal Negative Control)으로서 작용하며 적합하게 기능화된 PCR 파우치 속에서 시그널을 제공하지 않는 것으로 예상된다.
이어서, 포획 비드 상의 발색을 시각으로 평가하고 증가하는 청색 색상의 10가지 농도와 0 내지 10의 범위(0=시그널 없음, 10=높은 포지티브 시그널)에 상응하는 수를 갖는 색상 스코어 카드와 비교한다. 2 이상의 시각 스코어는 당해 포획 비드에 대한 포지티브 시험 결과를 나타낸다. 또한, PCR 가공 기기로부터의 반사율 밀도(Dr) 측정값을 기록한다. 0.13 이상의 Dr값은 포지티브 결과를 나타낸다.
실시예 1: 본 발명의 방법을 사용한, 혈장으로부터의 DNA 추출: 중합체 포획과의 비교
아래의 실험을 수행하여 본 발명의 추출방법과 중합체 포획방법을 비교한다.
65명의 환자로부터의 혈장 샘플을 위에 기재된 바와 같이 본 발명의 방법과 중합체 포획방법에 따라 조제한다. 중합체 포획방법에서 샘플 20㎕와 50㎕ 둘 다를 사용한다. 이들 샘플 모두 이전에는 초기 평가에서 중합체 포획 프로토콜에 의해 제조된 50㎕ 용적의 샘플을 사용하여 평가하였을 때, "시험 불능(No Test)"의 결과를 나타내었다. "시험 불능"의 결과는 내부 포지티브 대조군 포획 비드가 허용되지 않는 네가티브 결과를 제공하는 경우에 나타난다. 샘플에 도입된 IPC 대조군 플라스미드는 최종 반응 혼합물당 10개의 복사체로 존재한다. 위에 기재된 바와 같이, 모든 조제 샘플을 PCR 반응 혼합물과 혼합하고 증폭 및 검출을 수행한다.
혈장 샘플에 대한 중합체 포획방법 대 본 발명의 추출방법에서의 "시험 불능" 빈도는 아래의 표 2에 요약하였다.
중합체 포획방법50㎕ 샘플 중합체 포획방법20㎕ 샘플 본 발명의 추출방법20㎕ 샘플
IPC 포획 비드 결과* 14/65 0/65 0/65
"시험 불능" 빈도 21% 0% 0%
범위(시각 스코어) 3 내지 8 3 내지 8 5 내지 7.5
시각 스코어가 4 미만인 샘플 갯수* 3/65(4.6%) 1/65(1.5%) 0/65(0%)
*: IPC 네가티브 결과의 갯수/시험 샘플의 총 갯수
50㎕ 중합체 포획 프로토콜은 21%의 "시험 불능" 빈도를 나타내는 반면, 20㎕ 중합체 포획 프로토콜과 본 발명의 20㎕ 프로토콜은 실패율이 0%이다. 두 가지 중합체 포획 프로토콜 모두의 경우, 일부 샘플에서 시그널이 감소된 것으로 입증되었으며 내부 포지티브 대조군은 네가티브에 근접한다.
따라서, 본 발명의 방법은 50㎕ 중합체 포획방법보다 상당히 더 우수하며 IPC 포획 비드에 대한 허용되지 않는 네가티브 결과의 견지에서 20㎕ 중합체 포획방법보다 향상된 방법이다. 명백하게도, 50㎕ 중합체 포획방법을 사용하여 제조한 샘플은 PCR 억제제를 함유하거나 중합체 포획과 관련된 다른 특정 현상을 나타낸다.
또한, CMV(LBSA-11) 포획 비드에 대한 허용되지 않는 포지티브 결과가 CMV 네가티브 환자 샘플로부터 수득되는 20㎕ 중합체 포획기술을 사용한 한 가지 예가 있다. 상응하는 50㎕ 결과는 네가티브이므로(만일 실제로 존재한다면, 환자 샘플로부터 2.5배 이상의 CMV 타겟 DNA를 제공할 것이다), 이 결과는 예를 들면, 생성물 캐리오버와 같은 다수 조작을 포함하는 방법의 복잡성을 예시한다.
실시예 2: 본 발명의 방법을 사용한, 혈청으로부터의 DNA 추출: 중합체 포획과의 비교
중합체 포획방법과 본 발명의 추출방법에서 20㎕ 샘플을 사용하여(실시예 1 참조) 텍사스 아동 병원(텍사스주 휴스톤 소재)이 제공한 100명의 CMV IgG-포지티브, IgM-네가티브 OB/GYN 환자로부터 수득한 혈청 샘플로부터 DNA를 추출한다. 샘플 제조 전에, CMV 대조군 플라스미드 DNA를 각각의 샘플에 가하여, PCR 반응 혼합물에서 최종 단일 나선형 복사체 갯수의 20CMV 플라스미드 타겟을 얻는다. 또한, IPC 대조군 플라스미드를 PCR 반응 혼합물당 최종 복사체 10개 수준에서 샘플에 도입한다. 제조한 모든 샘플을 위에 기재한 바와 같이 PCR 반응 혼합물과 혼합한다. 위에 기재된 바와 같이, 증폭 및 검출을 PCR 파우치 속에서 2회 실시한다.
혈청 샘플을 사용한 중합체 포획방법 대 본 발명의 추출방법에서의 허용되지 않는 네가티브 결과의 빈도는 아래의 표 3에 요약하였다.
중합체 포획방법20㎕ 샘플 본 발명의 방법20㎕ 샘플
CMV 포획 비드 결과*(빈도, %) 5/100(5%) 0/100(0%)
IPC 포획 비드 결과*(빈도, %) 0/100(0%) 0/100(0%)
*: IPC 네가티브 결과의 갯수/시험 샘플의 총 갯수
모든 샘플 제조방법이 IPC 포획 비드에 대해 네가티브 결과를 나타내지 않았다. 그러나, 샘플에 CMV 플라스미드 타겟을 가한 결과, 중합체 포획방법을 사용한 경우에는 CMV 비드에 대해 5%의 허용되지 않는 네가티브 빈도가 나타났으며, 이는 PCR의 잠재적인 억제를 나타낸다. 대조적으로, 본 발명의 방법을 사용한 결과, 허용되지 않는 네가티브 CMV 비드는 나타나지 않는다.
실시예 3: 본 발명의 방법을 사용한, CMV 환자 집단의 혈장으로부터의 DNA 추출: 진클린(GeneClean) II 샘플과의 비교
아래의 실험을 수행하여 환자 샘플로부터 DNA를 추출하는데 있어서의 본 발명의 방법의 효과를 시험한다.
혈장 샘플을 진 클린 II 방법(바이오 101 인코포레이티드)을 사용하여 추출하고 매우 민감한 P32액체 하이브리드화 CMV PCR 검정과 직접 겔 CMV PCR 검정 둘 다를 이용하여 특정화(i)하거나, 본 발명의 방법을 사용하여 추출하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 검정(ii)한다. 각각의 샘플에 도입된 IPC 대조군 플라스미드는 최종 반응 혼합물당 25개의 이중 나선 복사체로 존재한다. 모든 샘플을 PCR 반응 혼합물과 혼합한 후, 위에 기재된 바와 같이 PCR 파우치에서 반복하여 증폭 및 검출한다.
CMV에 대한 결과가 표 4에 나타나 있다.
본 발명의 혈장 샘플 제조방법 대 진클린 II 혈장 샘플 제조방법
모든 포지티브 TCH 혈장 샘플은 액체 하이브리드화 검정에 의해서만 포지티브이고 직접 겔에서는 네가티브이므로 모든 샘플은 매우 낮은 포지티브 샘플인 것으로 생각되며, 이는 샘플 내의 CMV의 복사체 수준이 낮다는 것을 나타낸다.
2가지 샘플 제조방법은 80% 일치된다. 본 발명의 방법을 사용하여, 진클린방법에 의해 12개 샘플 중 10개는 포지티브 결과를 나타내며, 2개 샘플은 네가티브 결과를 나타낸다. 허용되지 않는 최초의 2개의 네가티브 샘플의 조제물을 재시험하는 경우, 1개가 포지티브 결과를 나타낸다. 진클린 네가티브 혈장 샘플의 경우, 유사한 상황이 나타난다. 13개의 네가티브 샘플의 경우, 두 가지 샘플 제조방법 모두 샘플 10개에 대해 동일한 결과를 나타낸다(동일하게 10개).
또한, 본 발명의 방법이 CMV 포지티브 샘플을 나타내는 세가지 예가 있다. 샘플 조제물을 재시험하는 경우, 이들 3개 샘플 중 2개는 다시 CMV 포지티브 결과를 나타낸다. 이의 고유 민감도 때문에, 이는 매우 적은 타겟 샘플이 모순된 결과를 제공하는 PCR 검정에서 일반적으로 관찰된다. 이것은 예상되는 포이쓴 샘플링 분포를 기준으로 예측한다.
실시예 4: 혈장에 대한 잠재성 억제 물질의 첨가
아래의 실험을 수행하여 본 발명의 방법이 혈장으로부터의 잠재성 억제 물질을 제거하는 능력을 시험한다.
정상 혈장 샘플 푸울(pool)을 처리하여 pH를 변화시키고 혈액 샘플 수집 첨가제와 샘플 제조, 증폭 또는 검출을 방해할 수 있는 것으로 공지되어 있거나 의심되는 기타 물질을 가한다. 화합물을 평가된 피크 혈청 수준의 3배로 샘플에 가한다(표 5).
위의 실시예 1에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법과 선행 기술의 중합체 포획방법을 사용하여 각각의 샘플 20㎕로부터 DNA를 추출한다. IPC 및 CMV 플라스미드는 최종 PCR 반응 혼합물당 각각 25개 및 10개의 이중 나선 복사체로 존재한다. 샘플 교차-오염 또는 생성물 캐리오버로 인해 일어날 수 있는 허용되지 않는 포지티브 결과(CMV 프로브 비드 상의 색상 수치 상승)를 평가하기 위해 샘플의 절반은 IPC 플라스미드만을 함유한다. 모든 샘플을 PCR 반응 혼합물과 혼합한 후, PCR 파우치 속에서 증폭 및 검출한다. 각각의 화합물의 경우, 0 및 10개의 CMV 복사체 수준 둘 다에 대해 4개의 파우치를 가동시킨다. 또한, 당해 검정에 사용하기 위한 화합물을 제조하는 데 사용한 각종 용매(물,아세톤, 에틸 알콜)를 함유하는 적합한 대조군을 실행시킨다.
평가된 억제 물질 근거 피크 혈청 수준(단위: ㎍/㎖) 중합체 포획방법 결과* 본 발명의 방법*
아세트아미노펜 통상적인 약물 20 + +
아목시실린 통상적인 약물 10 + +
아스피린 통상적인 약물 35 + +
코데인 통상적인 약물 0.4 + +
덱스트로메토르판 통상적인 약물 0.38 + +
푸로세미드[라식스(Lasix)] 통상적인 약물 10 + +
이부프로펜 통상적인 약물 70 + +
페니토인[딜란틴(Dilantin)] 통상적인 약물 20 + +
프레드니손 통상적인 약물 0.1 + +
아세틸 시스테인 검출 억제제 300 + +
아스코르브산 검출 억제제 20 + +
디피론 검출 억제제 200 + +
도파민 검출 억제제 100 + +
EDTA-0.25×draw 샘플 수집 첨가제 1500 + +
겐티스산 검출 억제제 55 + +
헤파린(Na)-0.25×draw 샘플 수집 첨가제 33.3 + +
하이파크 검출 억제제 500 + +
레보도파 검출 억제제 4 + +
옥살레이트-0.25×draw 샘플 수집 첨가제 2000 + +
평가된 억제 물질 근거 피크 혈청 수준(단위: ㎍/㎖) 중합체 포획방법 결과* 본 발명의 방법*
코카인(벤조일렉고닌으로서) 중독성 약물 1 + +
에틸 알콜 중독성 약물 1320 + +
헤로인(모르핀 설페이트로서) 중독성 약물 0.135 + +
메타돈 중독성 약물 0.5 + +
메탐페타민 중독성 약물 0.5 + +
THC 중독성 약물 0.1 + +
알부민 고농도 분석물 50000 + +
전혈 혈청/혈장 속의 잔류 혈액 샘플 용적의 25% 2NT ＆ 3IPC FN +
빌리루빈(전체) 태어난지 1주 미만인 신생아 120 + +
크레아티닌 신장 부전증 환자 15 + +
Ca(NO3)2 고농도 분석물 104 + +
사이클로스포린 A 이식 환자 1 + +
글루코스 고농도 분석물 1000 + +
리페믹(콜레스테롤으로서) 고농도 분석물 1000 + +
MgCl2 PCR 억제 시험 190 + +
저 pH(6.8) PCR 억제 시험 샘플 pH 1FP +
고 pH(8.8) PCR 억제 시험 샘플 pH + +
Zn(OAc)2 PCR 억제 시험 1.5 + +
포스카르넷 CMV 약물 180 + +
평가된 억제 물질 근거 피크 혈청 수준(단위: ㎍/㎖) 중합체 포획방법 결과* 본 발명의방법*
간시클로비 CMV 약물 1.18 + +
크릭시반 HIV 약물 8.98 + +
ddC[히비드(Hivid)] HIV 약물 0.0252 + +
ddI[비덱스(Videx)] HIV 약물 1.6 + +
주:*, +는 타겟이 존재하는 모든 CMV와 IPC 포획 비드에 대한 포지티브 결과를나타낸다; FP=허용되지 않는 포지티브; FN=허용되지 않는 네가티브(CMV가 10개의복사체 수준으로 투입되는 예상 CMV 포지티브 포획 비드에 대한 CMV 네가티브 결과); NT="시험 불능" IPC 포획 비드는 예상 CMV 네가티브 샘플에 대해 네가티브이다(CMV=Neg).
초기 시험 동안 CMV 및 IPC 포획 비드 둘 다에 대해 수 개의 산발적인 허용되지 않는 네가티브 결과와 샘플 제조방법 각각에 대해 수 개의 "시험 불능" 결과가 나타나지만 이러한 네가티브 결과와 "시험 불능" 결과는 중합체 포획 샘플에 대해서는 우세하게 나타난다. 또한, 수 개의 대조군은 예상하지 못한 네가티브 결과를 제공하고 이러한 결과를 낳는 파우치 실패(failure)가 지적된다.
미리 제조한 샘플을 재시험하는 경우, 25% 혈액 샘플(DNA 추출 전에 혈장 75용적부에 전혈 25중량부를 첨가한 것)을 제외한 모든 시험 물질에 대한 모든 결과는 중합체 포획방법과 본 발명의 방법 둘 다의 경우에 포지티브 결과를 나타낸다. IPC 타겟만을 함유하는 샘플(CMV 타겟은 함유하지 않음) 4개 중 2개는 다시 IPC 포획 비드에 대해 "시험 불능"의 결과를 나타낸다. 또한, IPC 및 CMV 타겟 DNA 둘 다를 함유하는 4개의 샘플 중 3개는 시각 스코어가 겨우 "1"로서 IPC 포획 비드에 대해 억제효과를 나타낸다. 이들 중 2개의 경우, 또한 CMV 포획 비드가 억제 신호(sign)를 나타낸다(시각 색상 스코어가 "3" 및 "4"이다). 또한, (낮은 pH 변화에서) 중합체 포획기술을 사용하여 허용되지 않는 포지티브 결과가 나타나는 또 하나의 예가 있으며, 이는 캐리오버 오염을 방지하기 위해 단계의 갯수가 최소인 간단한 방법이 필요하다는 것을 나타낸다.
이들 결과에 의하면, 25% 전혈은 샘플을 중합체 포획기술을 사용하여 제조하는 경우에 HCMV 검정에서 억제성이다. 대조적으로, 본 발명의 방법을 사용하는 DNA 추출에서는 PCR 증폭과 검출이 억제되지 않는다. 이것은 임상 실험실에서 혈청 및 혈장 샘플이 종종 적혈구로 오염되기 때문에 중요하다. 게다가, 중합체 포획기술은 유리하게는 중합체 포획에 필적하는 본 발명의 방법보다 더욱 어렵고 샘플을 환경에 더 많이 노출시킨다.
본 발명의 방법을 사용한 DNA 추출은 임의의 시험 물질을 포함하지 않고 PCR 증폭 또는 증폭 생성물의 검출을 억제하지 않는다. 이 간단한 방법은 더 복잡하고 시간이 많이 소비되는 어려운 선행 기술의 방법보다 상당히 향상된 것이다.
본 발명에서는 위에서 언급한 모든 특허 문헌, 특허 출원, 논문, 간행물 및 시험방법을 참고로 전체 인용한다.
본 발명의 상세한 설명의 견지에서 당해 분야의 숙련가에게 본 발명을 다양하게 변화시킬 수 있음을 제안한다. 이러한 명백한 변화는 본 발명의 특허청구범위에서 목적하는 전체 범위에 포함된다.
본 발명은 혈청 및 혈장 샘플로부터 DNA를 추출하는 간단하고 신속하며 매우 효과적인 방법으로서, 추가의 조작을 하지 않고 이후의 검출 검정에 사용하기 적합한 DNA 조제물을 수득할 수 있는 방법을 제공한다.

Claims (14)

  1. 혈청 또는 혈장을 알칼리와 접촉시켜 알칼리화 혈청 또는 혈장을 수득하는 단계(i),
    알칼리화 혈청 또는 혈장을 약 5 내지 약 20분 동안 약 100 내지 약 110EC의 온도로 가열하여 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 수득하는 단계(ii),
    가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 원심분리하여 DNA 함유 상등액을 수득하는 단계(iii) 및
    DNA 함유 상등액을 회수하는 단계(iv)를 포함하여, 혈청 또는 혈장으로부터 DNA를 추출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 가열 단계(ii)와 원심분리 단계(iii) 사이에, 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 냉각시키거나 약 25EC로 냉각시키는 단계를 수행하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 알칼리가 수산화나트륨인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 가열 온도가 약 105EC인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 가열 시간이 약 5분인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 원심분리가 약 16,000×g에서 약 2분 동안 수행되는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 알칼리화 혈청 또는 혈장이 알칼리를 약 15 내지 약 50mM의 농도 범위로 포함하는 방법.
  8. 혈청 또는 혈장을 알칼리와 접촉시켜 알칼리화 혈청 또는 혈장을 수득하는 단계(i),
    알칼리화 혈청 또는 혈장을 약 5 내지 약 20분 동안 약 100 내지 약 110EC의 온도로 가열하여 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 수득하는 단계(ii),
    가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 원심분리하여 DNA 함유 상등액을 수득하는 단계(iii),
    DNA 함유 상등액을 회수하는 단계(iv),
    DNA 함유 미생물의 DNA 내의 서열을 인식하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 상등액 속의 DNA를 증폭시켜 DNA 함유 미생물 특이성 증폭 생성물을 형성시키는 단계(v) 및
    미생물 특이성 증폭 생성물을 검출하는 단계(여기서, 미생물 특이성 증폭 생성물의 검출은 혈청 또는 혈장에 미생물이 존재함을 나타낸다)(vi)를 포함하여, 혈청 또는 혈장 중의 DNA 함유 미생물을 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 가열 단계(ii)와 원심분리 단계(iii) 사이에, 가열된 알칼리화 혈청 또는 혈장을 냉각시키거나 약 25EC로 냉각시키는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 가열 온도가 약 105EC인 방법.방법.
  11. 제8항에 있어서, 미생물이 세균인 방법.
  12. 제8항에 있어서, 미생물이 바이러스인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 바이러스가 사람 사이토메갈로바이러스인 방법.
  14. 제8항에 있어서, 알칼리화 혈청 또는 혈장이 알칼리를 약 20mM의 농도로 포함하는 방법.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020028386A (ko) * 2000-10-09 2002-04-17 박제철 소량의 동물조직으로부터 미토콘드리아 디.엔.에이의순수분리 방법
AU2003287082A1 (en) * 2002-10-11 2004-05-04 Imutex Pharmaceuticals, Inc. Heterologous plasma cocktail for hiv treatment
CN107683330A (zh) * 2015-05-25 2018-02-09 卡尤迪生物科技（北京）有限公司 用于样品收集的装置和方法
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CN108795926A (zh) * 2018-06-27 2018-11-13 中国农业科学院麻类研究所 一种dna模板快速制备方法
WO2020075695A1 (ja) * 2018-10-09 2020-04-16 公益財団法人筑波メディカルセンター 微生物の検出方法
JP7329912B2 (ja) * 2018-10-09 2023-08-21 公益財団法人筑波メディカルセンター 微生物の検出方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229297A (en) 1989-02-03 1993-07-20 Eastman Kodak Company Containment cuvette for PCR and method of use
US5089233A (en) 1989-06-12 1992-02-18 Eastman Kodak Company Processing apparatus for a chemical reaction pack
US5380489A (en) 1992-02-18 1995-01-10 Eastman Kodak Company Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes
CA2137563C (en) 1992-06-08 2005-06-28 Thomas B. Ryder Preparation of nucleic acid from mononuclear cells
US5582988A (en) 1994-09-15 1996-12-10 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Methods for capture and selective release of nucleic acids using weakly basic polymer and amplification of same
EP0929694A4 (en) * 1996-03-15 2002-05-02 Penn State Res Found DETECTION OF TUMOR-RELATED EXTRACELLULAR NUCLEIC ACID USING PLASMA OR BLOOD SERUM USING NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TESTS

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