WO1999025867A1 - Verfahren zum nachweis von nukleinsäuren aus mehreren proben - Google Patents

Abstract

Ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, welches eine besonders günstige Assayzeit erlaubt, benutzt die Schritte Verfügbarmachen der Nukleinsäuren in den Proben, Abreicherung von Inhibitoren der Amplifikation, simultane Erzeugung von Amplifikationsprodukten von Teilabschnitten der nachzuweisenden Nukleinsäuren in jeder der Proben, Abstoppen der Amplifikationsreaktionen und sequentielle automatische Detektion der simultan erzeugten Amplifikationsprodukte durch Trennung der Abstoppung der Amplifikation von der anschließenden Denaturierung der Nukleinsäuren. Hierdurch wird eine weitergehende Taktung des Detektionsprozesses ermöglicht. Dies führt zu einer weitergehenden Standardisierung des Verfahrens für unterschiedliche nachzuweisende Nukleinsäuren und damit zu einem hohen Maß an Reproduzierbarkeit und Präzision.

Description

Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren aus mehreren Proben

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in mehreren Proben enthaltend die Schritte Verfügbarmachen der Nukleinsäuren, Abreicherung von Inhibitoren der Amplifikation, Erzeugung von Amplifikationsprodukten, Abstoppen der Ampli- fikationsreaktion und Detektion der Amplifikationsprodukte.

Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren stellen immer mehr eine echte Alternative zu den bislang üblichen auf der Anwesenheit von Enzymen oder immunologisch nachweisbaren Analyten basierenden Verfahren dar. Besondere Anwendung hat die Nukleinsäureanalvtik bei den Infektionskrankheiten sowie in der Onkologie gefunden, da auf der Basis von Nukleinsäuren selbst geringste Unterschiede, z. B. Subtypen oder Polymorphismen, nachgewiesen werden können, selbst wenn diese immunologisch nicht ausreichend differenziert werden können. Hierbei spielt die Etablierung von Amplifikationsverfahren für Nukleinsäuren eine große Rolle. In der Regel sind nämlich die Nukleinsäuren in den zur Verfügung stehenden Proben nur in sehr geringen Mengen und nur in einer Mischung mit anderen, nicht nachzuweisenden Nukleinsäuren vorhanden. Amplifikationsverfahren, wie die Polymerase-Ketten- reaktion (PCR, US-A-4,683,202), sorgen für eine überproportionale Vermehrung von Teilen der nachzuweisenden Nukleinsäuren verglichen mit nicht nachzuweisenden Nukleinsäuren. Der Nachweis der Amplifikate wird in der Regel durch Einbau einer Markierung in die Amplifikationsprodukte (Amplifikate) möglich. Aus der Menge an eingebauten Markierungen kann auf die Anwesenheit oder die Menge der nachzuweisenden Nukleinsäuren geschlossen werden.

In jüngerer Zeit sind Geräte mit einer Kombination von Amplifikation und Nachweis von Nukleinsäuren auf dem Markt erhältlich. In einem ersten Gerät, welches die PCR zur Amplifikation verwendet, werden die Proben in PCR-Gefäßen amplifiziert, die Proben manuell nacheinander mit Natronlauge versetzt, um die Nukleinsäuren zu denaturieren und anschließend die Lösungen nacheinander manuell in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte übertragen und mit einem Hybridisierungsreagenz versetzt, wobei die Amplifikate an die Wand gebunden werden. Hier ist zu berücksichtigen, daß die Immobilisierung über festphasengebundene (immobilisierte) analytspezifische Fangsonden erfolgt und somit eine starke Einschränkung der Variabilität der Teste vorliegt. Die gebundenen Hybride werden nacheinander gewaschen und mit einer Lösung eines Nachweisreagenzes (Enzymsubstrat) versetzt. Die Detektion erfolgt einzeln oder für 8 Proben gleichzeitig. Dieses Verfahren ist nicht standardisiert und die Präzision ist abhängig von der Geschicklichkeit und Erfahrung des Anwenders. Der dynamische Meßbereich des auf einer Enzymreaktion beruhenden Nachweisverfahrens ist gering, was die Verwendung mehrerer Verdünnungen für jede Probe erforderlich macht, damit für jede Probe mindestens ein Signal im Meßbereich liegt.

In einem ähnlichen, aber weiter automatisierten, Verfahren werden die Proben nach der batchweisen Amplifikation bei 4°C gelagert, um die Polymerase-Aktivität zu reduzieren, bis die Detektion gestartet wird. Hierzu werden die Proben nacheinander mit einer Lösung von Natronlauge zur Denaturierung der Nukleinsäuren in eine Nadel aufgenommen und in ein Inkubationsgefäß überführt, wo die Hybridisierung mit wandgebundenen analytspezifischen Fangsonden stattfindet. Die Detektion erfolgt sequentiell wie oben beschrieben. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß es nicht ohne erheblichen Verlust an Sensitivität möglich ist, eine größere Anzahl von Proben durchzusetzen. Die Gesamt-Assay-Zeit ist in diesem Verfahren ebenfalls verhältnismäßig hoch.

Ein weiteres kommerziell erhältliches System beruht auf einer Amplifikation durch eine Kombination von Ligase und Polymerase. Eine enzymatische Dekontamination ist nicht gegeben. Dieses komplexe System hat darüber hinaus auch noch den Nachteil eines recht geringen Probendurchsatzes.

In einem anderen Gerät, welches auf einem isothermen Amplifikationsverfahren (NASBA, EP-A-0 329 822) beruht, wird ein sehr komplexes und damit störanfälliges 3 -Enzym-System verwendet. Es ist darüber hinaus nicht automatisiert und standardisiert. Die Varianzen in der Assay-Präzision sind hoch.

Es war Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren, bei dem die Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise vermieden werden, und insbesondere ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem die auf die Amplifikation folgenden Schritte automatisch in sehr kurzer Zeit bearbeitet werden bzw. bei dem die Präzision hoch ist. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in mehreren Proben enthaltend die Schritte Verfügbarmachen der Nukleinsäuren in den Proben. Anreicherung von Inhibitoren der Amplifikation, (gleichzeitige) Erzeugung von Amplifikationspro- dukten von Teilabschnitten der nachzuweisenden Nukleinsäuren, Abstoppen der Amplifika- tionsreaktionen und sequentielle automatische Detektion der simultan erzeugten Amplifikationsprodukte.

In Fig. 1 ist ein Gesamtablauf eines beispielhaften erfindungsgemäßen Nukleinsäurenachweis- verfahrens gezeigt.

In Fig. 2 ist die Taktung der Probenbearbeitung schematisch dargestellt.

In Fig 3 ist der Variationskoeffizient über einen weiten Konzentrationsbereich grafisch dargestellt.

Nukleinsäuren, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden können, können beliebigen Ursprungs sein, beispielsweise virale, bakterielle oder zelluläre Nukleinsäuren. Die sie enthaltende Probe kann eine Lösung (z. B. eine Körperflüssigkeit, wie Urin, oder eine davon abgeleitete Flüssigkeit, wie Serum oder Plasma) oder eine Suspension sein, aber auch ein Festkörper oder ein zellhaltiges Medium wie Vollblut, ein Zellabstrich, fixierte Zellen, ein Gewebsschmtt oder ein fixierter Organismus.

Die Reaktionssequenz wird gestartet durch Verfügbarmachung der nachzuweisenden Nuklein- säure mit entsprechenden Reagenzien. Hierbei können sowohl Veränderungen des pHs (alkalisch), Hitze, Wiederholung extremer Temperaturveränderungen (Einfrieren/ Auftauen), Veränderung der physiologischen Wachstumsbedingungen (Osmotischer Druck), Druck (French press), Glasperlen, Einwirkung von Detergenzien, chaotropen Salzen oder Enzymen (z. B. Proteasen, Lipasen), alleine oder in Kombination zur Freisetzung der Nukleinsäuren beitragen.

Beispielsweise kann ein Verfahren zum Nachweis eines speziellen Virus in einer Körperflüssigkeit (z. B. Serum) als ersten Schritt die Lyse der Virushülle enthalten. Verfahren zur Lyse von Virushüllen sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise kann die Lyse durch Behandlung mit Alkalihydroxydlösungen vorgenommen werden. Auch der Zusatz von Hilfsstoffen, z. B. Detergenzien, ist möglich. Bei einem Nachweis von Bakterien, beispielsweise in Lebensmitteln, können dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls mehrere Schritte vorgeschaltet werden. Im allgemeinen werden Bakterienproben, ggf. nach in vivo Vermehrung der Bakterien, unter Bedingungen, welche die Lyse der Bakterienzellwand bewirken (z. B. Proteinasen, Alkali), aufgeschlossen.

Resultat der diversen Vorbehandlungen ist in der Regel eine Probenflüssigkeit, welche die nachzuweisenden Nukleinsäuren gelöst enthält, und in der ggf. die in den vorbereitenden Schritten eingesetzten Reagenzien sowie gegebenenfalls zerstörte Zellbestandteile enthalten sind.

Diese Probenflüssigkeit enthält einerseits die Nukleinsäuren, insbesondere die nachzuweisenden Nukleinsäuren, in sehr geringen Mengen, andererseits enthält sie darüber hinaus noch Stoffe, welche eine enzymatische Amplifikation stark beeinträchtigen können. Aus diesem Grund wird im Laufe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung eine Abtrennung von Inhibitoren vorgesehen. Hierzu werden die nachzuweisenden Nukleinsäuren oder auch die Gesamtnukleinsäuren oder ein Teil davon, welcher die nachzuweisenden Nukleinsäuren umfaßt, an eine feste Phase gebunden, und die flüssige Phase entfernt. Hierfür stehen dem Fachmann eine Reihe von Verfahren zur Verfügung. In einer ersten Ausführungsform werden die nachzuweisenden Nukleinsäuren zusammen mit anderen in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren an einer Glasoberfläche unspezifisch gebunden. In einer ersten Ausfuhrungform, welche in WO 96/41811 beschrieben ist, werden der Probenflüssigkeit, welche die freigesetzten Nukleinsäuren enthält, Glasmagnetpartikel zugesetzt. Die Nukleinsäuren binden an die Glasoberfläche, während Inhibitoren der Polymerase-Aktivität, z. B. Eisen, Hämin oder Bilirubin, in der Flüssigkeit verbleiben. Sofern sich die Probenflüssigkeit mit den Magnetpartikeln in einem Gefäß befindet, kann ein Magnet in die Nähe der Gefäßwand gebracht werden, so daß die Magnetpartikel an die Gefäßwand wandern und dort festgehalten werden, während die sie umgebende Flüssigkeit entfernt, z. B. abpipettiert wird. Gewünschtenfalls können noch anhaftende Flüssigkeitsreste durch Waschen und erneutes Absaugen entfernt werden. Danach werden die Magnetpartikel in einer Lösung mit geringem Salzgehalt aufgeschlemmt, wodurch sich die Nukleinsäuren wieder von den Glasmagnetpartikeln ablösen. Durch erneutes Anlegen eines Magneten an der Gefaßwand werden die Magnetpartikel wieder an die Wand gezogen und der nukleinsäurehaltige Überstand kann dem Gefäß entaommen werden. Sofern die Magnetpartikel der WO 96/41811 verwendet werden, können die Nukleinsäuren in im wesentlichen nativer Form erhalten werden.

In einer alternativen Ausfuhrungsform werden die Nukleinsäuren in einer Vorrichtung gemäß EP-A-0 738 733 gereinigt. Hierbei handelt es sich um ein Zentrifugationsröhrchen, welches in seinem Inneren ein Glasvlies enthält, durch welches die Probenflüssigkeit durch Zentrifugation hindurchtransportiert wird. In Anwesenheit eines chaotropen Salzes binden die Nukleinsäuren beim Durchtritt durch das Vlies, während die Inhibitoren mit der übrigbleibenden Flüssigkeit in ein Auffanggefäß durchtreten. Die Nukleinsäuren können durch Aufgabe eines Niedrigsalzpuffers während der Zentrifugation in ein neues Auffanggefäß wieder aus dem Vlies eluiert werden.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft, die Freisetzung der Nukleinsäuren und deren Immobilisierung in getrennten Verfahrensschritten vorzunehmen. Beispielsweise wird hierzu die feste Phase erst nach praktisch vollständigem Aufschluß von Zellkompartimenten zugegeben bzw. wird die Flüssigkeit erst nach möglichst vollständigem Aufschluß in das Zentrifugationsröhrchen eingefüllt. Die genannten Schritte zur Freisetzung von Nukleinsäuren können einerseits manuell, andererseits jedoch auch weitgehend automatisiert durchgeführt werden. Für den Fall einer automatisierten Durchführung kann beispielsweise ein Gerät gemäß DE-A-195 123 68 eingesetzt werden. Auf die diesbezügliche Offenbarung wird vollinhaltlich Bezug genommen. Eine besonders bevorzugte Probenvorbereitung ist in DE 19743518 beschrieben. Auf den Inhalt dieser Anmeldung wird vollinhaltlich Bezug genommen.

Nach diesen Schritten steht eine von Amplifϊkations-Inhibitoren im wesentlichen befreite und an Nukleinsäuren aufkonzentrierte Probenflüssigkeit zur Verfügung. Sie kann zur Dekontamination von verschleppten Amplifikaten anderer Proben, mit Uracil-N-Glykosylase versetzt werden. Dieses Verfahren ist in EP-B-0 401 037 ausführlich beschrieben.

Ein wesentlicher Schritt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die gleichzeitige Erzeugung von Amplifikationsprodukten von Teilabschnitten der nachzuweisenden Nukleinsäuren in jeder der erzeugten Probenflüssigkeiten. Hierzu ist es bevorzugt, die Probenflüssigkeit aus dem Abreicherungsschritt in eine WegwerfVorrichtung zu überführen, die mehrere Vertiefungen zur Aufnahme einer Vielzahl von Proben enthält. Hierbei handelt es sich bevorzugt um eine Vorrichtung, bei der jede Vertiefung nur für die Aufnahme einer einzigen Probe eingesetzt und nach einmaligem Gebrauch nicht mehr wiederverwendet wird. Beispielsweise handelt es sich daher um ein Kunststoffdevice, in dem eine Vielzahl von sogenannten Tubes oder Reagenzgefäßen miteinander verbunden sind. Diese Vorrichtung ist bevorzugt in ihrer geometrischen Form auf die Aufnahmen des Gerätes angepaßt, in welchem die Amplifikation dvjrchgeführt wird. Für den Fall einer in Thermocyclen vorgenommenen Amplifikation, wie bei der PCR, ist es bevorzugt, daß die Vorrichtung geometrisch auf die kommerziell erhältlichen Thermocycler angepaßt ist. Ein entsprechendes Gerät ist in EP-B-0 236 069 beschrieben. Auf die darin enthaltene Offenbarung wird vollinhaltlich Bezug genommen. Bevorzugt enthält die Vorrichtung 8 oder mehr, bevorzugt weniger als 100, besonders bevorzugt 16 bis 32 solcher Vertiefungen. Dies ermöglicht die gleichzeitige Durchführung einer Amplifikation gleicher oder unterschiedlicher Nukleinsäuren in einer entsprechenden Anzahl von Proben. Besonders bevorzugt sind diese WegwerfVorrichtungen gegen passive und aktive Kontamination der Proben bzw. der Umwelt geschützt. Dies kann beispielsweise geschehen durch Vorsehen eines Deckels, der zumindest während der Amplifikation mehrere Vertiefungen der Vorrichtung gasdicht verschließt. Besonders bevorzugt sind Einzeldeckel, die sich automatisch öffnen und schließen lassen. Möglich ist auch eine in den Deckel integrierte Dichtmatte aus elastischem Material, z. B. Silikon, die durch den Deckel bzw. die Deckelheizung des Thermocyclers auf die obere Öffnung der Vertiefung gedrückt wird und somit auch gegen während der Erhitzung der Probenflüssigkeit entstehenden Druck dicht hält. Eine besonders bevorzugte WegwerfVorrichtung im Sinne dieser Beschreibung ist in DE- 196 433 20 beschrieben. Auf den Inhalt dieser Patentanmeldung wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen.

Zur Amplifikation werden die erforderlichen Reagentien, bevorzugt in Form von Reagenzlösungen, den in der WegwerfVorrichtung enthaltenen Proben entweder nacheinander oder gleichzeitig zugegeben, z. B. zupipettiert, oder umgekehrt. Sofern die WegwerfVorrichtung in ihren Vertiefungen Proben für den Nachweis unterschiedlicher Nukleinsäuren enthält, ist die sequentielle Zugabe jeder Reagenzlösung zu den einzelnen Vertiefungen bevorzugt. Dies kann einerseits manuell geschehen, z. B. mit Hilfe einer Kolbenhubpipette, andererseits jedoch auch automatisiert, z. B. mit Hilfe eines Pipettierautomaten. Im Falle einer Amplifikation mittels PCR wird die Vorrichtung in ein. Gerät zur Erzeugung von Thermocyclen eingeführt und so viele Thermocyclen durchgeführt, wie für die ausreichende Amplifikation der Nukleinsäuren erforderlich sind. Hier wird insbesondere auf EP-B-0 201

184 bzw. US-A-4,683,202 Bezug genommen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden den der Amplifikation zu unterziehenden Proben mit unterschiedlichen nachzuweisenden Nukleinsäuren (z. B. Proben, die auf virale Parameter zu untersuchen sind, neben Proben, die auf bakterielle Parameter zu untersuchen sind) Reagenzlösungen mit standardisierten Konzentrationen einer DNA- oder/und RNA-Polymerase, Nukleosidtriphosphaten, Puffersubstanzen und bevorzugt auch Primern zugegeben. Nukleosidtriphosphate (NTP) sind Ribo (rNTP)- oder Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP). Die für die Amplifikation erforderlichen Reagenzien und deren Konzentrationen sind für die einzelnen Amplifikationsverfahren, z. B. die PCR oder NASBA, einem Fachmann ausreichend bekannt. Im Sinne der Erfindung wird jedoch ein verhältnismäßig geringes Verhältnis der Volumina an Probenflüssigkeit (z. B. 10 - 50 μl) zum Gesamtvolumen von 50 bis 100 μl der Reaktionsmischung eingesetzt. In Zusammenhang mit einer effizienten Inhibitorenabtrennung läßt sich so eine erhöhte Sensitivität erzielen. Für PCR hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Polymerase der Probe so zuzusetzen, daß ihre Endkonzentration in einem Bereich zwischen 1 und 30 Units, bevorzugt zwischen 2.5 und 15 U liegt. Die Nukleosidtriphosphate werden in einer Konzentration von 0.1 bis 1 mM, bevorzugt zwischen 0.2 und 0.6 mM eingesetzt. Als DNA-Polymerase kommen beispielsweise solche aus T.aq. oder T.th. in Frage. Die Puffersubstanzen richten sich auch nach der eingesetzten Polymerase. Die Pufferkonzentration in der fertigen PCR-Mischung beträgt bevorzugt 1 mM bis 100 mM, besonders bevorzugt 10 bis 50 mM. Geeignete Puffersubstanzen sind z. B. Tris oder Bicine. Primer sind dem Fachmann prinzipiell bekannt. Sie müssen im wesentlichen die Bedingung erfüllen, daß sie mit einem Strang der nachzuweisenden Nukleinsäure und dem Gegenstrang hybridisieren, durch die Enzymaktivität der Polymerase mit Hilfe von Nukleosidtriphosphaten unter Verwendung der nachzuweisenden Nukleinsäure als Templatnukleinsäure verlängerbar sind und daß, im Falle der PCR, die Verlängerungsprodukte des einen Primers als Templatnukleinsäure für die Verlängerung eines anderen Primers dienen können. Eine Templatnukleinsäure ist eine Nukleinsäure, zu der insbesondere zu einem Teil davon ein im wesentlichen komplementärer Nukleinsäurestrang neu gebildet wird. In Bezug auf die Sequenzinformation dient die Templatnukleinsäure als Matrize für die Umschreibung. Die Basensequenz der Primer wird sich nach der gewünschten Spezifität der Amplifikationsreaktion richten. Ist eine spezifische Amplifikation gewünscht, werden die Sequenzen der Primer so ausgewählt, daß sie möglichst nur mit einem Strang der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisiert, nicht jedoch mit anderen in der Probenflüssigkeit vorhandenen Nukleinsäuren. Es ist selbstverständlich, daß es auch erwünscht sein kann, eine Gruppe von Nukleinsäuren zu amplifizieren, z. B. Nukleinsäuren einer bestimmten Gattung von Bakterien. Aus diesem Grund ist es selbstverständlich, daß sich die Reagenzlösungen für den Nachweis unterschiedlicher Nukleinsäuren in der Beschaffenheit der enthaltenen Primer, insbesondere deren Sequenz, unterscheiden, bevorzugt jedoch nicht in deren Konzentration.

In einem besonders bevorzugten Format wird im Sinne der vorliegenden Erfindung während der Amplifikation mindestens einer der Primer so gewählt, daß er ein oder mehrere zur Immobilisierung befähigende Gruppen I aufweist. Zur Immobilisierung befähigende Gruppen I sind beispielsweise chemische Gruppen, die normalerweise in natürlichen Nukleinsäuren nicht vorhanden sind und die kovalent, beispielsweise über eine chemische Reaktion oder eine Photoreaktion an eine feste Phase gebunden werden können, oder Gruppen bzw. Molekülteile, die über gruppenspezifische Wechselwirkungen von einem anderen Molekül oder Molekülteil erkannt und gebunden werden können. Solche Gruppen sind daher z. B. Haptene, Antigene und Antikörper, Nukleotidsequenzen, Rezeptoren, Regulationssequenzen, Glykoproteine, beispielsweise Lectine, oder auch die Bindungspartner von Bindeproteinen, wie Biotin oder Iminobiotin. Bevorzugt sind Vitamine und Haptene, besonders bevorzugt sind Biotin, Fluorescein oder Steroide, wie Digoxigenin oder Digoxin.

Im Anschluß an die Amplifikation wird die Amplifikationsreaktion, bevorzugt durch Zugabe eines die Polymerase-Aktivität inhibierenden und die UNG inaktivierenden Reagenz, gestoppt. Während im Stand der Technik hierfür insbesondere Natronlauge (NaOH) eingesetzt wurde, wobei gleichzeitig eine Denaturierung der Nukleinsäuren stattfand, oder zum anderen Teil die Reaktionsmischung stark gekühlt wurde, ist es im Sinne der vorliegenden Erfindung bevorzugt, die Inaktivierung der Polymerase und der UNG von der Denaturierung der Nukleinsäuren zeitlich zu trennen. Als Reagenzien zur Inaktivierung der Polymerase und UNG haben sich insbesondere Detergenzien, bevorzugt anionische Detergenzien, als zweckmäßig erwiesen. Besonders bevorzugt ist die Klasse der N-acylaminosäuren, wobei der Acylrest zwischen 5 und 30 Kohlenstoffatome enthält und die Aminosäure bevorzugt Sarcosin ist. Als besonders bevorzugtes Reagenz hat sich N-Lauroylsarcosin erwiesen. Durch dieses Reagenz werden unspezifische Reaktionen der Polymerase, z. B. Auffüllreaktionen, unterdrückt, welche den Nachweis der nachzuweisenden Nukleinsäuren beeinträchtigen könnten. Das Stoppreagenz kann simultan in alle Vertiefungen der WegwerfVorrichtung gegeben werden, bevorzugt ist jedoch ein sequentielles Einpipettieren der Lösung in die einzelnen Vertiefungen, sobald die Reaktionsmischung aus der Amplifikation etwas abgekühlt ist. Diese Zugabe kann einerseits schon vor Amplifikation oder kurz nach Amplifikation auf dem Thermocycler, andererseits aber auch nach Überführung der WegwerfVorrichtung oder der Reaktionsmischung in eine andere Aufnahme vorgenommen werden. Die Behandlung der Amplifikate mit Detergentien verschafft dem System ein vergrößertes Zeitfenster vor der anschließenden Detektion, innerhalb dem keine weiteren unspezifischen Reaktionen stattfinden können, z. B. Abbau der Amplifikate durch UNG-Reaktivierung bei Raumtemperatur und unerwünschte Weiterreaktion der Polymerase. Auch das lange Verbleiben der Amplifikate in Natronlauge hat sich als unvorteilhaft erwiesen. Dadurch kann der Probendurchsatz (Batchgröße bzw. maximale Bestückung des Gerätes oder Rotors) deutlich erhöht werden.

Desweiteren ermöglicht das vergrößerte Zeitfenster, die nach der getakteten Probenvorbereitung aufgegebene konsequente Taktung der Proben erneut aufzunehmen und eine getaktete Detektion anzuschließen.

Die vorzugsweise abgekühlte Reaktionsmischung aus der Amplifikationsreaktion wird nun bevorzugt in Gefäße in einer weiteren Aufnahme transportiert. Dies kann einerseits direkt durch Transport der WegwerfVorrichtung in die Aufnahme geschehen, bevorzugt wird die WegwerfVorrichtung jedoch in eine erste Aufnahme transportiert, von der Aliquots der einzelnen Proben getrennt und automatisch in Einzelgefäße in einer weiteren Aufnahme transportiert werden. Bevorzugt befindet sich die WegwerfVorrichtung auf einem Rotor, und wird ähnlich behandelt wie eine Primärprobe in einer konventionellen automatisierten immunologischen Bestimmung.

An das Abstoppen schließt sich die sequentielle automatische Detektion der simultan erzeugten Amplifikationsprodukte an. Ein wesentliches Merkmal des Detektionsverfahrens ist die zeitlich getaktete automatische Denaturierung der Amplifikate. Denaturierung von Nukleinsäuren bedeutet Auftrennung von Nukleinsäuredoppelsträngen in Einzelstränge. Dem Fachmann stehen prinzipiell eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Verfügung, z. B. Behandlung durch Alkalihydroxide, durch Hitze, oder durch Chemikalien. Bevorzugt wird die Denaturierung durch Zugabe einer 0.01 bis 1.0 N Natronlaugelösung bewirkt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens finden nun sämtliche Reaktionsschritte und Zugaben von Reagenzien ab der Zugabe der Denaturierungsreagenzien bis zur Messung zeitlich getaktet statt. Unter einer zeitlichen Taktung wird eine Vorgehensweise verstanden, bei der jede einzelne Probe in einem genau festgelegten zeitlichen Abstand (Takt) zur vorangehenden bzw. nächsten Probe prozessiert wird. In der vorliegenden Erfindung sind die Abstände besonders kurz wählbar, insbesondere zwischen 30 und 200 sec. Dies führt zu einer höheren Intra- (gleiche Probe nocheinmal bestimmt) und Interassay (andere Probe, aber gleicher Analyt) Präzision. Darüber hinaus können die Inkubationszeiten für alle Proben und alle Teste (unabhängig vom Analyt) gleich sein. Eine beispielhafte Taktung ist in Fig. 2 gezeigt. Die getakteten Arbeitsschritte sind Denaturierung (z. B. 1), Sondenhybridisierung (Inkubation) (2), Anlagerung an die Festphase (Inkubation mit Magnetbeads (3) und Messung (Inkubation in Meßzelle und Signalmessung) (4).

Ferner finden bevorzugt alle Reaktionsschritte startend mit dem Abstoppen bis zur Überführung der Probenflüssigkeit in die Meßzelle (d. h. insbesondere die Schritte Denaturierung, Hybridisierung und Beadanlagerung) bei einer konstanten Temperatur statt, bevorzugt bei zwischen 18 und 80, besonders bevorzugt bei 30 bis 45°C, insbesondere 37°C. Hierfür werden die Proben in einer entsprechenden Aufnahme konstant temperiert, insbesondere reicht hierfür ein Heizsystem aus, ein Kühlgerät ist nicht erforderlich. Dies erlaubt technische Vereinfachungen.

Für den Fall, daß die Probenflüssigkeiten getrennt in Einzelgefäße einer weiteren Aufnahme transportiert werden, muß die Aufnahme für die WegwerfVorrichtung nicht konstant temperiert werden. Es genügt beispielsweise, die Probenflüssigkeiten in der WegwerfVorrichtung bei Raumtemperatur aufzubewahren. Dies ist ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Abstoppens der Amplifikationsreaktion mit einem Abstoppreagenz, welches nicht Natronlauge enthält. Es hat sich nämlich herausgestellt, daß ein Abstoppen mit Natronlauge mit der Zeit zu einem Signalverlust führt, so daß Probenflüssigkeiten, die in der sequentiellen Detektion später bearbeitet werden, eher zu falschnegativen Ergebnissen führen. Das erfindungsgemäße Vorgehen hingegen bewirkt, daß auch die Denaturierung der Nukleinsäuren in die Taktung einbezogen werden kann, so daß, sofern ein Signalverlust stattfindet, dieser bei allen Proben gleichmäßig geschieht. Darüber hinaus erlaubt die Inkubation bei Raumtemperatur weitere technische Vereinfachungen.

Bevorzugt werden also die Probenflüssigkeiten nach Überführung in die Gefäße der zweiten Aufnahme nacheinander folgenden Reaktionsschritten unterzogen. Zunächst werden die Nukleinsäuren durch Zugabe von Natronlauge denaturiert. Die Denaturierung findet bevorzugt während eines Zeitraumes von zwischen 1 und 10 Minuten statt.

Darauf wird den Probenflüssigkeiten eine Lösung zugegeben, welche eine auf die in der jeweiligen Probe nachzuweisende Nukleinsäure abgestimmte Nachweissonde enthält. Bevorzugt enthält die Lösung der Sonde einen Puffer, mit dem die ursprünglich alkalische Lösung so neutralisiert wird, daß Hybridisierungsbedingungen eingestellt sind.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahrensschritt handelt es sich um eine spezielle Ausführungsform der sogenannten Hybridisierungstests, die in ihren Grundzügen dem Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik bekannt sind. Soweit experimentelle Details im Folgenden nicht ausgeführt sind, wird dazu vollinhaltlich auf "Nucleic acid hybridisation", Herausgeber B.D. Harnes und S.J. Higgins, IRL Press, 1986, z. B. in den Kapiteln 1 (Hybridisation Stra- tegy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridisation) und 4 (Quantitative Filter Hybridisation), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, und Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al., CSH, 1989, Bezug genommen.

Bevorzugt ist die Hybridisierungssonde spezifisch für die jeweils nachzuweisende Nukleinsäure und enthält eine Markierung.

Eine Markierung im Sinne der vorliegenden Erfindung besteht aus einer direkt oder indirekt nachweisbaren Gruppe L. Direkt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise radioaktive (³²P), farbige, oder fluoreszierende Gruppen oder Metallatome. Indirekt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise immunologisch oder enzymatisch wirksame Verbindungen, wie Antikörper, Antigene, Haptene oder Enzyme oder enzymatisch aktive Teilenzyme. Diese werden in einer nachfolgenden Reaktion oder Reaktionssequenz detektiert. Besonders bevorzugt sind Haptene, da an mit ihnen markierte Nukleosidtriphosphate im allgemeinen besonders gut als Substrate von Polymerasen einsetzbar sind und eine anschließende Reaktion mit einem markierten Antikörper gegen das Hapten oder das haptenisierte Nukleosid leicht vorgenommen werden kann. Solche Nukleosidtriphosphate sind beispielsweise Brom- Nukleosidtriphosphate oder Digoxigenin-, Digoxin- oder Fluorescein-gekoppelte Nukleosidtriphosphate. Als besonders geeignet haben sich die in EP-A-0 324 474 genannten Steroide und deren Detektion erwiesen. Ganz besonders bevorzugt sind jedoch Direktmarkierungen, insbesondere solche, die mit Hilfe der Elektrochemolumineszenz nachgewiesen werden können, z. B. Ruthenium-bispyridyl-Komplexe, wie sie in EP- 94 108 442 beschrieben sind.

Unter einem spezifischen Nachweis wird ein Verfahren verstanden, durch welches gewünsch- tenfalls selektiv bestimmte Nukleinsäuren auch in Gegenwart anderer Nukleinsäuren nachgewiesen werden können. Es ist jedoch auch möglich, eine Gruppe von Nukleinsäuren mit teilweise übereinstimmender oder ähnlicher Nukleotidsequenz nachzuweisen. Zum Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäuren kann jeder der beiden komplementären Stränge einbezogen werden. Unter einer zu einer Nukleinsäure im wesentlichen komplementären Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenz werden Nukleinsäuren oder Sequenzen verstanden, die mit der entsprechenden Nukleinsäure hybridisieren können, deren Nukleotidsequenz im hybridisierenden Bereich entweder genau komplementär zu der anderen Nukleinsäure ist oder sich in wenigen Basen von der genau komplementären Nukleinsäure unterscheidet. Die Spezifität richtet sich dabei sowohl nach dem Grad der Komplementarität als auch nach den Hybridisierungsbedin- gungen. Da aus einer Amplifikationsreaktion mehrere Hybridisierungen möglich sind, erlaubt das Verfahren auch eine automatische Genotypisierung.

Während der Inkubation der Sonden mit den nachzuweisenden einzelsträngigen Nukleinsäuren hybridisieren diese miteinander unter Bildung von Hybriden D. Sofern die Hybridisierung weiterer Nukleinsäuren, z. B. Nachweissonden, mit einzelsträngigen Teilen der Hybride D beabsichtigt ist, können diese schon in diese Mischung eingebracht werden und wie gewünscht zur Hybridisierung gebracht werden. Die Inkubation wird so lange durchgeführt, bis zu erwarten ist, daß eine für den Nachweis ausreichende Anzahl von Hybriden aus nachzuweisender Nukleinsäure und Hybridisierungssonde gebildet wurden. Bevorzugte Inkubationszeiten liegen gemäß dem vorliegenden Verfahren zwischen 1 und 120 Minuten, besonders bevorzugt zwischen 15 und 45 Minuten. Bevorzugt sind die Inkubationszeiten für unterschiedliche Proben, unabhängig von der nachzuweisenden WO 99/25867 , -. PCT/EP98/07159

Nukleinsäure gleich. Dies erleichtert die sequentielle und automatische Abarbeitung der Proben.

Bevorzugt werden die gebildeten Hybride anschließend an einer festen Phase immobilisiert. Dies kann über immobilisierte Fangsonden geschehen. Bevorzugt geschieht dies aber über die zur Immobilisierung befähigenden Gruppen I der Primer, welche in die Amplifikationsprodukte eingebaut wurden. Die Flüssigkeit, welche die Nukleinsäurehybride D gelöst enthält, wenn die nachzuweisenden Nukleinsäuren in den Proben vorhanden war, wird hierzu mit festen Phasen in Kontakt gebracht, welche das Hybrid D über die immobilisierbaren Gruppen der Nukleinsäuresonde spezifisch binden können.

Die Art der Festphase richtet sich nach der zur Immobilisierung befähigenden Gruppe I. Bevorzugt weist sie eine immobilisierende Gruppe R auf, die eine bindende Wechselwirkung mit I eingehen kann. Ist die immobilisierbare Gruppe I beispielsweise ein Hapten, dann kann eine Festphase verwendet werden, die an ihrer Oberfläche Antikörper gegen dieses Hapten aufweist. Ist die immobilisierbare Gruppe ein Vitamin, wie z. B. Biotin, dann kann die Festphase diese bindende Proteine, wie Avidin oder Streptavidin immobilisiert enthalten. Besonders bevorzugte Reste I und R sind Biotin und Streptavidin (SA). Die Immobilisierung über eine nicht-nukleoidische Gruppe I an der modifizierten Nukleinsäure ist besonders vorteilhaft, da sie unter milderen Bedingungen stattfinden kann als beispielsweise Hybridisierungsreaktionen. Bevorzugt werden zur Immobilisierung der gebildeten Nukleinsäuren den Reaktionsmischungen nach Bildung der Nukleinsäurehybride D Magnetpartikel zugegeben, welche an ihrer Oberfläche mit der immobilisierbaren Gruppe reagieren können, und zwar universell, unabhängig von der Sequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure. Das Gefäß für die Reaktion ist bevorzugt eine Küvette, ein Röhrchen oder eine Mikrotiterplatte. Die feste Phase sollte mindestens so viele Bindungsstellen für die immobilisierbare Gruppe der Sonde haben, wie Nukleinsäurehybride D und damit nachzuweisende Nukleinsäuren vorhanden sind. Die Herstellung einer bevorzugten festen Phase ist in der EP-A-0 344 578 beschrieben, aufweiche vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Nach einer Inkubationszeit von bevorzugt zwischen 1 und 60, besonders bevorzugt 5 und 15 Minuten, während der die Immobilisierungsreaktion stattfindet, werden die Flüssigkeiten aus den Gefäßen entfernt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform, in der es sich bei der Festphase um suspendierte Magnetpartikel handelt, werden die Magnetpartikel mit den gebundenen Amplifika- tionsprodukten von der sie ungebunden Flüssigkeit, insbesondere einen Überschuß nicht gebundener Nachweissonde abgetrennt und gewünschtenfalls gewaschen. Anschließend wird ein Aliquot, bevorzugt von zwischen 100 und 200 μl, einer Suspension jeder der Flüssigkeiten aus den Gefäßen mit Hilfe einer automatischen Pipettiereinrichtung entfernt und nacheinander zu einer Meßzelle transportiert.

Bei direkt nachweisbaren Gruppen, beispielsweise Fluoreszenslabeln, wird die Menge an Markierung fluorometrisch bestimmt. Ist die nachweisbare Gruppe indirekt nachweisbar z. B. ein Hapten, so wird die modifizierte Nukleinsäure bevorzugt mit einem markierten Antikörper gegen das Hapten umgesetzt, wie analog in der EP-A-0 324 474 beschrieben. Die Markierung am Antikörper kann beispielsweise eine Färb- oder Fluoreszenzmarkierung oder bevorzugt eine Enzymmarkierung, wie ß-Galactosidase, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, sein. Im Falle der Enzymmarkierung wird die Menge an Nukleinsäure über die meist photometrische, chemoluminometrische oder fluorometrische Verfolgung einer Reaktion des Enzyms mit einem chromogenen, chemoluminogenen oder fluorogenen Substrat gemessen. Das Meßsignal ist ein Maß für die Menge ursprünglich vorhandener nachzuweisender Nukleinsäure und somit ggf. an nachzuweisenden Organismen.

Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Markierung um eine Elektrochemilumineszenz- markierung, wie sie beispielsweise in WO 93/10267 beschrieben ist. Als besonders zweckmäßig haben sich hier Bispyridylkomplexe von Ruthenium erwiesen. Diese können mit Hilfe einer Lösung von Kaliumphosphat, Tripropylamin und Thesit^® unter Anlegen einer Spannung über das dann erzeugte Blitzsignal bestimmt werden. Hierzu wird die Suspension von Magnetpartikeln, an welche die Hybride aus nachzuweisender Nukleinsäure und Rutheniumkomplex markierte Hybridisierungssonde gebunden sind, in eine Meßzelle überführt. Eine solche Meßzelle ist beispielsweise in EP-A-0 658 760 beschrieben. Die Magnetpartikel werden über einen Magneten in der Meßzelle zurückgehalten. Anschließend wird die bisherige Flüssigkeit durch die oben genannte Detektionslösung ersetzt. Anschließend wird die Chemilumineszenz durch Anlegen einer Spannung an der Meßzelle erzeugt. Als Signal wird die Stärke des erzeugten Lichtblitzes gemessen. Die Höhe des Signals ist ein Anzeichen für die Anwesenheit oder die Menge der nachzuweisenden Nukleinsäure in der ursprünglichen Probe.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren kann zum Nachweis von Organismen (z. B. Viren oder Bakterien) in der Probe, zum Feststellen eines genetischen ZuStands (z. B. genetische Erkrankungen oder Dispositionen), zur Diagnose von Tumoren oder zur Identifizierung von Individuen (z. B. in der Pathologie oder Forensik) eingesetzt werden. Es hat den Vorteil einer sehr kurzen TAT (total assay time). Darüber hinaus hat es im Vergleich zu Verfahren, die nicht mit Direktmarkierungen arbeiten, eine hohe Sensitivität und einen für unterschiedliche nachzuweisende Nukleinsäuren ähnlichen dynamischen Meßbereich. Die Intraassay- und die Interassay-Präzision ist hoch. Aufgrund der standardisierten Bedingungen mit standardisiertem Probenfluß ist eine separate Anpassung der Software für die einzelnen Analyten nicht erforderlich. Alle individuellen Proben, die auf dieselbe Nukleinsäure untersucht werden sollen, können bezüglich Reaktionszeiten, Reaktionstemperaturen, Pufferzusammensetzung, Taktung und TAT in Amplifikation und Detektion gleich behandelt werden. Darüber hinaus können alle Proben, auch bei unterschiedlichen nachzuweisenden Nukleinsäuren bezüglich Reaktionszeiten, Reaktionstemperaturen, Taktung und TAT in der Detektion gleich behandelt werden. Auch für den Betreiber des Gerätes ergeben sich durch die automatisierte Testführung Vorteile.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Reagenzkits und Geräte, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind, insbesondere ein Reagenzkit zum Nachweis von Nukleinsäuren, enthaltend in unterschiedlichen Behältern:

a Reagentien zur Amplifikation von Teilsequenzen dieser Nukleinsäuren mit oder ohne Primer,

b Ein Reagenz zur Inaktivierung von UNG und

c Reagentien zum Nachweis von Amplifikaten ohne oder mit einer markierten

Sonde bzw ein Gerät zum Nachweis von Nukleinsäuren, enthaltend:

a einen Probenrotor enthaltend Aufnahmen für Gefäße enthaltend Proben mit amplifizierten Nukleinsäuren, Gefäße mit Denaturierungsreagentien und Gefäße mit Hybridisierungsreagentien und b eine Einheit zum Transfer von Proben und Reagentien aus dem Probenrotor in einen Reaktionsrotor,

c einen Reaktionsrotor mit einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen für die

Hybridisierung,

d eine Detektionseinheit und

e eine Steuerungseinheit zur getakteten Bearbeitung von Proben von der Denaturierung bis zur Detektion.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher:

Beispiel 1

Automatisierte Bestimmung von Chlamydia trachomatis

• Probenvorbereitung (PV)

Die Nukleinsäuren wurden analog zu dem in WO 96/41811 und DE 19743518 beschriebenen Verfahren isoliert und von Inhibitoren befreit. Die Probenvorbehandlung geschah für die Proben nacheinander, getaktet.

• Amplifikation

Als Standardmaterial wurde Chlamydia Plasmid in 10^"' bis 10⁷ Kopien in die PCR eingesetzt. 10 μl des gereinigten Probenmaterials jeder der Eluate aus der PV oder Standardmaterial wurde nacheinander mit 90 μl der Reagenzien für die PCR-Reaktion versetzt, so daß folgende Konzentrationen im endgültigen Amplifikationsansatz vorlagen:

Die PCR wurde für einen Batch (Reaktionsansätze) von 96 Proben in einem Thermocycler PE 9600 nach folgendem Cyclerprogramm durchgeführt:

10 min 37°C Dekontamination durch UNG

5 min 95°C Denaturierung

1 min 60°C Primer Annealing und Elongation

30 sec 95°C 29 Zyklen Amplifikation

1 min 60°C Detektion

Nach der Amplifikation wurde der gesamte Reaktionsansatz auf Raumtemperatur abgekühlt, jede der Gemische mit dem Stopreagenz (5 μl einer l%igen wäßrigen Lösung von N-Lauroyl-Sarkosin) versetzt und gemischt. Dieses abgestoppte Reaktionsgemisch wird dann auf den Eingangsbereich eines Analyseautomaten (Boehringer Mannheim GmbH (BM), Elecsys 1010) gestellt, auf dem die Detektionsreaktion vollautomatisch und getaktet abläuft. Dabei wurden jeweils lOμl der Mischung aus jeder Amplifikationsmischung entnommen und mit 35μl Denaturierungslösung (BM Enzymun Denaturation solution Id. No. 146 9053) in jeweils einem neuen Reaktionsgefäß für 5 min bei 37°C inkubiert (maximal 128 Gemische). Nach Zugabe von 120 μl Hybrisierungslösung (BM Enzymun Hybridization solution Id. No 146 9045), versetzt mit 25 ng/ml Ruthenium-markierter Sonde (5'-Ru CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG - 3^', SEQ.ID.NO. 3), wurde 30 min bei 37°C inkubiert. Die Bindung an die Festphase erfolgte durch aufeinanderfolgende Zugabe von 35 μl Elecsys SA Magnetbeadlösung (BM Id. No. 171 9556) zu jedem Gemisch und jeweils Inkubation für 10 min bei 37°C. 130 μl der Reaktionslösung wurden daraufhin nacheinander in die Meßzelle des Geräts gesaugt und der Gehalt an gebundenen Ruthenium-markierten Targets bestimmt.

Zur getakteten Bestimmung von 80 Proben wurde der Detektionsablauf alle 75 Sekunden für jeweils ein neues abgestopptes Reaktionsgemisch gestartet, bis alle Proben abgearbeitet waren ( Siehe FIG 2). Bis zu 48 weitere Bestimmungen wurden (ebenfalls getaktet) aus ausgewählten Gemischen desselben Reaktionsansatzes gemacht, jedoch wurden dabei Amplifikate nachgewiesen, die aus der Originalprobe in bekannter Menge zugegebenen internen Standardnukleinsäuren gebildet worden waren. Hierzu wurden Hybridisierungs- lösungen eingesetzt, die eine Sonde mit für die internen Standard spezifischer Nukleotidsequenz anstelle der Chlamydia-spezifischen Sonde beinhalteten. Alternativ kann auch die Asgangsnukleinsäure, z.B. mit zusätzlichen Sonden zur Genotypisierung, hybridisiert werden. Beispiel 2

Präzision des Nachweises

In Tabelle 1 werden Meßwerte (jeweils 1000 ECL-Einheiten) für eine Verdünnungsreihe von Proben mit bekanntem Gehalt an Chlamydia-Plasmiden (Analyt) gegeben, die in einem Batch nach Beispiel 1 erhalten werden (63 Bestimmungen aus 9 Proben unterschiedlicher Konzentration).

Tabelle 1:

Intraassay-Präzision ECL-Messung

Verdünnungsreihe Chlamydia trachomatis

7 Messungen

Integriertes Signal in tausend counts

Es wird klar, daß der Variationskoeffizient (d. h. die Intraassay-Präzision) über den enormen Konzentrationsbereich exzellent ist. Die Ergebnisse sind in Fig 3 visualisiert.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in mehreren Proben enthaltend die Schritte a) Verfügbarmachen der Nukleinsäuren in den Proben,

b) Abreicherung von Inhibitoren der Amplifikation,

c) simultane Erzeugung von Amplifikationsprodukten von Teilabschnitten der nachzuweisenden Nukleinsäuren in jeder der Proben,

d) Abstoppen der Amplifikationsreaktionen und

e) sequentielle automatische Detektion der simultan erzeugten Amplifikationsprodukte.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c) Proben mit unterschiedlichen nachzuweisenden Nukleinsäuren Reagenzlösungen mit standardisierten Konzentrationen einer DNA-Polymerase, Nukleosidtriphosphaten, Puffersubstanzen und Primern zugegeben werden.

3. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt c) in einer WegwerfVorrichtung enthaltend mehrere Vertiefungen zur Aufnahme einer Vielzahl von Proben durchgeführt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenflüssigkeit nach Schritt c) in Gefäße einer weiteren Aufnahme transportiert wird, von wo die einzelnen Proben getrennt zu einer Meßzelle transportiert werden können.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Proben nach Überführung in die Aufnahme automatisch und zeitlich getaktet eine individuell für die jeweilige nachzuweisende Nukleinsäure spezifische Hybridisierungssonde zugegeben wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5. dadurch gekennzeichnet, daß es die anschließende für alle Proben gleichlange Inkubation zur Bildung eines Hybrids aus nachzuweisender Nukleinsäure und Hybridisierungssonde beinhaltet.

. Verfahren gemäß Anspruch 4 - 6. dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Proben nach Überführung in die Aufnahme automatisch und zeitlich getaktet eine standardisierte Menge einer festen Phase zur Immobilisierung der Amplifikationsprodukte zugegeben wird.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben in der Aufnahme konstant temperiert werden.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 - 8, dadurch gekennzeichnet, daß jede Probe nach der Inkubation automatisch getrennt in eine Meßzelle überführt wird, in der ein mit der Hybridbildung verbundenes Signal gemessen wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9. dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion für mehrere Proben im Hinblick auf den Zeitablauf und die Empfindlichkeitseinstellungen des für die Detektion verwendeten Gerätes standardisiert ist.

11. Reagenzkit zum Nachweis von Nukleinsäuren, enthaltend in unterschiedlichen Behältern:

a Reagentien zur Amplifikation von Teilsequenzen dieser Nukleinsäuren mit oder ohne Primer,

b Ein Reagenz zur Inaktivierung von UNG und

c Reagentien zum Nachweis von Amplifikaten ohne oder mit einer markierten Sonde.

12. Gerät zum Nachweis von Nukleinsäuren, enthaltend:

a einen Probenrotor enthaltend Aufnahmen für Gefäße enthaltend Proben mit amplifi- zierten Nukleinsäuren, Gefäße mit Denaturierungsreagentien und Gefäße mit Hybri- disierungsreagentien und

b eine Einheit zum Transfer von Proben und Reagentien aus dem Probenrotor in einen Reaktionsrotor,

c einen Reaktionsrotor mit einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen ^•für die Hybridisierung, d eine Detektionseinheit und

e eine Steuerungseinheit zur getakteten Bearbeitung von Proben von der Denaturierung bis zur Detektion.