JP2004531251A - メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｒｓａ）の直接検出の方法 - Google Patents
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｒｓａ）の直接検出の方法 Download PDFInfo
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Abstract
標本からのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の検出定量方法であってa)標本を抗タンパクA抗体と接触させ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌を吸着させる工程、b)標本から、前記メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌を吸着した前記抗体を分離する工程、c)前記抗体に吸着されたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌を溶菌して、それらのDNAをリリースする工程、d)リリースされたDNAを(i)メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミス(Staphylococcus epidermis)のmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー、(ii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー及び(iii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外のメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーと合わせる工程であって、ここでメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の及びメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスの標的DNA配列が相同的でない工程、e)リリースDNA及び特異的プローブ及び/又はプライマーを合わせたものを、前記標的DNA配列の増幅を可能とする条件に供する工程、f)増幅された標的DNAの存在及び量を、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の存在及び量を示すものとして検出する工程を含む方法、新たなプライマー及びプローブ並びに診断キットであってMRSAの検出及び定量のためのものが記載される。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本からのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)の検出及び定量の新規な方法に関する。さらに、本発明は、MRSAの検出及び定量のための新しいプライマー及びプローブ及び診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
MRSAは病原性の細菌であり、多剤耐性細菌のクラスに属する。MRSAの罹患率の増加は、主要な臨床上の問題となっている。したがって、臨床標本中のMRSAの迅速で正確な検出及び同定は、感染性疾患の予防及び治療に重要であると考えられている。
【０００３】
MRSAの検出及び同定の方法は、既に開示されている。例えば、スタフィロコッカス属の、及びメチシリン耐性をコードする抗生剤耐性遺伝子(mecA遺伝子)の、種特異的検出、同定及び定量のための、PCR及び増幅プライマーを採用したDNAに基く方法が、WO98/20157に記載されている。
【０００４】
WO99/16780は、マルチプレックスPCRを用いた増幅のための、mecA遺伝子に特異的なプライマー、及び細胞壁代謝に関与する調節遺伝子であるfemA遺伝子についてのスタフィロコッカス種特異的プライマーの使用を開示する。気管吸引物を標本として採り、感受性の黄色ブドウ球菌及びメチシリン耐性コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス属が、電気泳動により検出された。
【０００５】
US5702895は、黄色ブドウ球菌を他のスタフィロコッカス属から区別するマーカーであるmecA及びspa遺伝子についての、ビオチンラベル化及びジニトロフェニルラベル化プライマーを用いたMRSAの検出のためのマルチプレックスPCR方法を開示する。標本は、単離された細菌の培養物から採られ、増幅されたDNAは吸光により検出された。
【０００６】
この開示された方法は、単離された細菌及び滅菌したサイトの培養物から採られた標本の分析のためのみに用いられている。しかしながら滅菌していない標本を用いた場合、含まれるMRSAの数が少なく、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, MSSA)及びメチシリン感受性スタフィロコッカス・エピデルミス(methicillin-sensitive Staphylococcus epidermis, MSSE)並びにメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミス(methicillin-resistant Staphylococcus epidermis, MRSE)等のさらなるスタフィロコッカス属が存在しうる。このような状況下では、この開示される方法は、mecA遺伝子の存在が、MRSAの存在と、明示的かつ一義的にはリンクしないという点において不利である。さらに、このような条件下では、非特異的増幅のリスクを完全には排除できず、この方法の感受性は低下する。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の目的は、標本が非滅菌サイトからのものであっても、MRSAの高感受性の定量を可能とする、標本からのMRSAの検出及び定量のための改善された方法を提供することにある。
【０００８】
この目的は、請求項1による新規な方法により達成される。
【０００９】
本発明によれば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌は、下記工程を含む方法で標本から検出及び定量される：
a)標本を抗タンパクA抗体と接触させ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌を吸着させる工程
b)標本から、前記メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌が吸着した前記抗体を分離する工程
c)前記抗体に吸着されたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌を溶菌して、それらのDNAをリリースする工程、
d)リリースされたDNAを(i)メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミス(Staphylococcus epidermis)のmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー、(ii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー及び(iii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外のメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーと合わせる工程であって、ここでメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の及びメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスの標的DNA配列が相同的でない工程、
e)リリースDNA及び特異的プローブ及び/又はプライマーを合わせたものを、前記標的DNA配列の増幅を可能とする条件に供する工程、
f)増幅された標的DNAの存在及び量を、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の存在及び量を示すものとして検出する工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
標本
本発明によりMRSAを検出及び定量しうる標本は、滅菌及び/又は非滅菌サイトからのものである。標本がとられうる滅菌サイトは、血液、尿、脳脊髄液、滑液、胸膜液、心膜液、眼内液、組織生検物又は気管内吸引物等の体液である。単離された細菌の培養物もまたここでは滅菌サイトとして規定される。標本が採られうる非滅菌サイトは、例えば、喀痰、便、例えば皮膚、鼠径部、鼻腔及び/又は喉からの拭取物である。好ましくは、非滅菌サイトからの、より好ましくは鼠径及び/又は鼻腔拭取物からの標本が、本発明で用いられる。
【００１１】
標本の、抗タンパク A 抗体との接触
通常標本は、抗タンパクA抗体との接触前に、例えば生理食塩水、ブロス(broth)溶液又はCS培地(コリスチン及び2.5%NaClを含む脳-心臓浸出液)等の細菌培養培地に再懸濁される。通常、例えば血清アルブミン等の保護剤を、再懸濁標本に添加する。
【００１２】
本発明において用いられる抗タンパクA抗体は、MRSA及びMSSAのタンパクAに対する抗体であり、通常モノクローナル抗体である。MRSA及び/又はMSSAの吸着を可能とするために、標本は、抗体と、通常5〜120分間、好ましくは10〜60分間接触させる。
【００１３】
MRSA及び/又はMSSAの吸着を行なった後、抗体は標本から分離される。採用される分離方法に応じて、抗タンパクA抗体又はビオチニル化等の改変をされた抗タンパクA抗体(どちらも商業的に入手可能)を本発明において用いることができる。標本及び抗体は、遠心、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー若しくは抗体の固定化又はこれらの方法の組み合わせにより分離することができる。固定化又はアフィニティークロマトグラフィーが用いられる場合、代わりに、まず抗体がアフィニティーカラムに固定化されたり又は相互作用することができ、それから標本と接触させることができる。
【００１４】
好ましくは、本発明において、抗タンパクA抗体の固定化は、吸着したMRSA及び/又はMSSAを有する抗体を、標本から分離するのに用いられる。特に、遠心の工程が、抗体の固定化の前に追加される。抗体は、常磁性のビーズ上に固定化することができる。ストレプトアビジン及びビオチンを結合パートナーとして、例えばビオチニル化した抗タンパクA抗体を、ストレプトアビジンで被覆した常磁性ビーズにリンクすることにより用いることができる。好ましくは、ビオチニル化した抗タンパクA抗体及びストレプトアビジン被覆常磁性ビーズは、抗体を固定化するのに用いられる。ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズは、商業的に入手可能である。通常、抗体及び常磁性ビーズは、抗体が常磁性ビーズに結合できるようインキュベートされ、続いて磁的に保持され、常磁性ビーズを洗浄することにより標本から分離される。インキュベーション時間は通常5〜120分間、好ましくは10〜60分間である。常磁性ビーズを磁気的に保持する時間は通常1〜60分間、好ましくは2〜20分間である。
【００１５】
抗体は、必要に応じて、分離の間に再懸濁することができる。再懸濁及び洗浄のために、例えばヒト血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水を用いることができる。
【００１６】
吸着された微生物を溶解しそれらの DNA をリリース
抗体に吸着されたMRSA及び/又はMSSAは、それらのDNAをリリースするために、例えばTween、Triton X-100等の界面活性剤、NaOH等のアルカリ、プロテイナーゼK等のプロテアーゼ若しくはカオトロープ及び/又はせん断力を適用することにより溶解することができる。溶解は、通常TE(Tris-HCl 10mM、pH=8及びEDTA 1mM)のような緩衝液中、又は水(分子級純度)中、又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)のような緩衝液中、又は生理食塩水中で行なわれる。
【００１７】
カオトロープとしては、例えばグアニジニウムイソチオシアネート、尿素、又は塩酸グアニジン、好ましくはグアニジニウムイソチオシアネートが用いられる。カオトロープが用いられる場合、Qiagenにより商品化されている、グアニジニウムイソチオシアネートを含むATL緩衝液が好ましく用いられる。カオトロープが用いられる場合、カオトロープは、例えばリリースされたDNAをQlamp(Qiagen)等のDNA結合カラムに接触させることにより、溶菌の後リリースされたDNAから除かれる。カラムから溶出されたDNAは、それからプローブ及び/又はプライマーと合わせることができ、又は事前に濃縮することができる。
【００１８】
例えばビーズを添加し溶液を混合することにより、せん断力を適用することができる。ビーズとしては、好ましくはガラスビーズを添加ことができ、より好ましくはSchieritz and Hauenstein AG (スイス)により市販される直径100〜200μmのガラスビーズを添加することができる。ガラスビーズの使用は特に有用である。なぜならば、溶菌がPBS中又は生理食塩水中で行なわれる場合、ガラスビーズ、特にSchieritz and Hauenstein AG (スイス)により市販される直径100〜200μmのガラスビーズは、リリースされたDNAに定量的に結合し、DNAを他のコンポネントから効率的に抽出することが見出されているからである。ガラスビーズに結合したDNAを水又はTEで溶出した後、溶出したDNAは、プローブ及び/又はプライマーと直接合わせることができ、又は事前に濃縮することができる。または、結合したDNAを伴なったガラスビーズをPBS中に又は生理食塩水中に懸濁することができ、プローブ及び/又はプライマーと直接合わせることができる。
【００１９】
さらに、TE(Tris-HCl 10mM、pH=8及びEDTA 1mM)中又は水(分子級純度)中においても、ビーズを、好ましくはガラスビーズを、さらに好ましくはSchieritz and Hauenstein AG (スイス)により市販される直径100〜200μmのガラスビーズを用いて、せん断力を適用した溶菌を実行することができる。この手順は、DNAの液相中での直接的な回収を可能とする。液相中のDNAは、プローブ及び/又はプライマーと直接合わせることができ、又は事前に濃縮することができる。
【００２０】
溶菌の好ましい実行方法は、せん断力を使用するものである。より好ましくは、溶菌は、PBSのような緩衝液又は生理食塩水中において、ガラスビーズ、特にSchieritz and Hauenstein AG (スイス)により市販される直径100〜200μmのガラスビーズを用い実行される。
【００２１】
プローブ及び / 又はプライマー
MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列、及びmecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列に特異的なものである本発明のプローブ及び/又はプライマーは、特定のプローブ及び/又はプライマーの特定の配列、それと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、さらに好ましくは20ヌクレオチド長を有するそれらの一部、及びそれらの変異物を包含する。変異物は、それぞれのプライマー又はプローブが特定の標的DNA配列に対しなお特異的である限りにおいて、1以上のヌクレオチド位置において変性された配列、欠失、挿入、及び置換を包含する。通常、プローブ及びプライマーは、それぞれの標的DNA配列に対し適用される。好ましくは、順行(forward)プライマー及び逆行(reverse)プライマーなどのプライマーの対、及びプローブが適用される。
【００２２】
本願において、「特異的プローブ及び/又はプライマー」又は「標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー」の用語は、増幅される特定の標的DNA配列に対し、60%より高い、好ましくは70%より高い、より好ましくは80%より高い、特には90%より高い相同性を有するプローブ、及び増幅される特定の標的DNA配列に隣接するDNAに対し、60%より高い、好ましくは70%より高い、より好ましくは80%より高い、特には90%より高い相同性を有するプライマーを表す。プローブ及びプライマーはそれぞれ、例えば55から65℃の間、好ましくは58から62℃の間の温度及び3から10mMの間、好ましくは4から6mMの間の所定の塩濃度といったストリンジェントな条件下で、それぞれ増幅される特定の標的DNA配列の相補物と、又は増幅される特定の標的DNA配列の相補物に隣接するDNAとハイブリダイズする。
【００２３】
(i)MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー、(ii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、MRSAの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー、及び(iii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、MRSEの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーを選択する基礎として、GenBank又はEMBL等のデータベース配列、文献に記載されるフラグメント又は対応する微生物の単離されたフラグメントを用いることができる。好ましくは、GenBank又はEMBL等のデータベース配列、より好ましくはGenBankが用いられる。特に、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーは配列番号Y14051(Genbank)に含まれるmecA遺伝子配列から選択され、(ii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、MRSAの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーは配列番号X17688(Genbank)に含まれるMRSAのfemA遺伝子配列から選択され、(iii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、MRSEの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーは配列番号U23713(Genbank)に含まれるMRSEのfemA遺伝子配列から選択される。
【００２４】
mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、MRSAの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーはまた、GenBank又はEMBL等のデータベース配列、文献中に記載されたフラグメント又は対応する微生物の単離されたフラグメントであって、MSSAの標的DNA配列を含むものからも選択することができる。ただしこれらの標的DNA配列はMRSAによっても保持されるものである。
【００２５】
mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、MRSEの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーはまた、GenBank又はEMBL等のデータベース配列、文献中に記載されたフラグメント又は対応する微生物の単離されたフラグメントであって、MSSEの標的DNA配列を含むものからも選択することができる。ただしこれらの標的DNA配列はMRSEによっても保持されるものである。
【００２６】
通常、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及びプライマーを設計するのには、MRSA又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列を1つ選択すれば十分である。なぜならば、mecA遺伝子は、MRSA及びMRSE間で、95%から100%の間で、通常97%より高く相同的だからである。好ましくは、選択されるmecA遺伝子の標的DNA配列は、MRSAからのものである。
【００２７】
相同的でないMRSA及びMRSEの標的DNA配列として、両方の標的DNA配列の相同性が90%未満、好ましくは85%未満、もっとも好ましくは80%未満であり、両方の配列が上記のストリンジェントな条件下で交差ハイブリダイズしない限りは、100%のMRSA及び100%のMRSEがそれぞれ保有する、mecA遺伝子における、標的DNA配列以外のどのDNA配列をも用いることができる。通常、MRSAのfemA遺伝子(femA-SA)及びMRSEのfemA遺伝子(femA-SE)等の遺伝子の標的DNA配列、又はMRSA及びMRSEの遺伝子の他の標的DNA配列であって互いに関連しないものを、標的DNA配列として用いることができる。好ましくは、MRSAのfemA遺伝子(femA-SA)の、及びMRSEのfemA遺伝子(femA-SE)の標的DNA配列を用いることができる。
【００２８】
通常、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列、及びmecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーが、約100±50ヌクレオチドの増幅産物を生成するために、設計される。プライマー及びプローブの配列は、標準的なプログラム及びプライマー解析ソフトウェア、例えば「Primer Express」(Perkin Elmer)を用いることにより得ることができ、自動化DNAシンセサイザー等の標準的な方法を用いて合成することができる。
【００２９】
MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子に標的DNA配列に特異的なプライマーは、通常13〜30、好ましくは20〜26ヌクレオチド長で構成される。MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブは、通常、15〜40、好ましくは25〜35ヌクレオチド長で構成される。
【００３０】
mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列に、及びmecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列に特異的なプライマーは、通常、13〜30、好ましくは20〜26ヌクレオチド長で構成され、通常、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列を、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列から区別するための、＞3のミスマッチを含有するように選択される。mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列に、及びmecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列に特異的なプローブは、通常、15〜40、好ましくは25〜35ヌクレオチド長で構成され、通常、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列を、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列から区別するための、＞3のミスマッチを含有するように選択される。
【００３１】
全てのプライマー及びプローブは、お互いに、及び他のプライマー及びプローブのセットとコンパチブルになるよう選択し、自己ハイブリダイゼーション又は異なるプライマー及び/又はプローブ間のハイブリダイゼーション、ループ形成、および偽プライミング部位を避けることができる。選択後、プライマー及びプローブを対としてテストし、それらの感受性及び特異性を評価することができ、通常50〜900nMの濃度で組み合わせ、増幅における最適な反応条件を規定することができる。
【００３２】
MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーで好ましいものは、配列番号1及び2を含むプライマー、及び配列番号3を含むプローブ、それと相補的な配列、その一部であって少なくとも10、好ましくは15、もっとも好ましくは20ヌクレオチド長のもの、及びそれらの変異物を含むものから選択される。MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的な、特に好ましいプローブ及び/又はプライマーは、配列番号1及び2を含むプライマー及び配列番号3を含むプローブである。
【００３３】
mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列に特異的な、好ましいプローブ及び/又はプライマーは、プローブ及び/又はプライマー、それらに相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部、及びそれらの変異物であって、MRSAのfemA遺伝子の標的DNA配列に特異的なものである。
【００３４】
MRSAのfemA遺伝子の標的DNA配列に特異的な、特に好ましいプローブ及び/又はプライマーは、配列番号4及び5を含むプライマー及び配列番号6を含むプローブ、及び配列番号10及び11を含むプライマー及び配列番号12を含むプローブ、それらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長のそれらの一部、並びにそれらの変異物から選択される。最も好ましいものは、配列番号4及び5を含むプライマー及び配列番号6を含むプローブ及び配列番号10及び11を含むプライマー及び配列番号12を含むプローブ、特に配列番号10及び11を含むプライマーおよび配列番号12を含むプローブである。
【００３５】
mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列に特異的な好ましいプローブ及び/又はプライマーは、プローブ及び/又はプライマー、それと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部並びにそれらの変異物であって、MRSEのfemAの標的DNA配列に特異的なものである。
【００３６】
MRSEのfemA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーで特に好ましいものは、配列番号7及び8を含むプライマー及び配列番号9を含むプローブ及び配列番号13および14を含むプライマー及び配列番号15を含むプローブ、これらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部、ならびにそれらの変異物から選択される。最も好ましいものは、配列番号7及び8を含むプライマー及び配列番号9を含むプローブ及び配列番号13及び14を含むプライマー及び配列番号15を含むプローブであり、特に配列番号13及び14を含むプライマーおよび配列番号15を含むプローブである。
【００３７】
増幅
前記標的DNA配列の増幅を可能とする条件は当業者によく知られている。通常、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ネストPCR又はマルチプレックスPCR、リガーゼ連鎖反応、核酸配列基準増幅(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)、自己維持配列複製(self-sustained sequence replication, 3SR)、ストランド変位増幅(strand displacement amplification, SDA)、分枝DNAシグナル増幅(bDNA)、転写媒介増幅(transcription-mediated amplification, TMA)又はサイクリングプローブ技術(cycling probe technology, CPT)等の増幅方法を用いることができる。好ましくは、マルチプレックスPCRが用いられる。マルチプレックスPCRにおいては、前記プローブ及び/又はプライマーが、単一PCR反応においてリリースされたDNAと共に組み合わせて用いられる。
【００３８】
増幅方法としてPCR方法が用いられる場合、例えばTaqDNAポリメラーゼ(Perkin Elmer)又はAmpliTaq(PE Applied Biosystems)、Hot GoldStar Taqポリメラーゼ(Eurogentec)、AmpliTaq Goldポリメラーゼ(PE Applied Biosystems)、SureStart Taq(Stratagene)又はPlatinum Taq(Gibco)等のDNAポリメラーゼを用いることができる。好ましくは、Hot GoldStar Taq DNAポリメラーゼが用いられる。変性させ単一ストランドDNAとする処理は、通常熱処理である。通常のPCR条件は、例えば、0.5〜5分40〜60°、好ましくは1.5〜2.5分45〜55°のインキュベーションと、続いての5〜15分90〜97°、好ましくは8〜12分95°のインキュベーションと、続いての5〜30秒90〜97°、好ましくは10〜20秒95°のインキュベーションと、続いての0.1〜5分50〜70°、好ましくは0.5〜2分55〜65°のインキュベーションで、最後の2つのインキュベーション工程が100回まで、好ましくは50回繰返されるような熱サイクル条件である。DNAポリメラーゼが用いられる場合、さらなる変性工程を第1のインキュベーション工程として追加することができる。
【００３９】
通常、インキュベーションの前に、商業的に入手可能な反応緩衝液を、プローブ及び/又はプライマーと組み合わされた、リリースされたDNAに添加することができる。プローブ及び/又はプライマーは通常、リリースされたDNAに過剰に添加される。それぞれの標的DNA配列についてのプローブ及びプライマーの通常の比率は、1/3〜2/1の間である。それぞれの標的DNA配列についての、1つのプライマーの、他に対する比率は、通常1/3〜3/1の間である。
【００４０】
増幅された標的DNA配列の存在及び量は、例えば、以下の方法により検出することができる：増幅された標的DNA配列のサイズを電気泳動により確認する方法；増幅された標的DNA配列を、増幅された標的の配列と相補的な配列を有する、ラベルされたプローブとハイブリダイズする方法；又はリアルタイムPCR、ここで増幅された標的DNA配列は増幅中に、例えば異なる波長で発光する様々な蛍光色素を用いて増幅中の蛍光を測定することにより検出される。TaqMan(登録商標)(Perkin Elmer)、ABI Prism Sequence Detection Systems (Applied Biosystems)、SmartCycler(登録商標)(Cepheid)、I-Cycler (BioRad)、Light Cycler (Roche)、R.A.P.I.D. (Idaho Technologies)、DNA Engine Opticon (MJ Research)、Rotor Gene (Corbett Research)、及びMX400(Stratagene)等のリアルタイムPCRシステムが、好ましい方法である。特に好ましいのは、ABI Prism Sequence Detection Systems、TaqMan(登録商標)及びSmartCycler(登録商標)システムである。最も好ましいのはABI Prism Sequence Detection Systemsである。異なる蛍光色素及び非蛍光クエンチャーを、システムに用いられるリアルタイムPCRに応じて、例えばそれぞれの前記プローブと増幅前にカップリングできる。例えば、FAM(6-カルボキシフルオレセイン)、HEX(6-カルボキシ-2',4,4',5',7,7'-ヘキサクロロフルオレセイン)、TET(6-カルボキシ-4,7,2',7'-テトラクロロ-フルオレセイン)、JOE(6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシ フルオレセイン)又はTexas-Red(登録商標)等の蛍光色素をプローブの5'-末端にカップリングし、TAMRA(6-carboxy-N,N,N',N'-テトラメチルロダミン)等の蛍光クエンチャー又はDABCYL(4-((4-(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸)等の非蛍光クエンチャーをプローブの3'-末端にカップリングすることができる。リアルタイムPCRが用いられる場合、通常増幅された標的DNA配列のサイクル閾値(Ct)が検出され、ここで、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列について得られたCtと、mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列について得られたCtとの差が、MRSAの存在及び量を示す。それぞれのDNA標的配列の3例分(triplicates)におけるCt値が、MRSAの存在及び量を決定するのに通常用いられる。
【００４１】
MRSAの存在及び量を示す好ましい条件は、下記全ての要件が満たされた場合である：
1) MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についての最も小さいCt＜40
2) mecA遺伝子以外のMRSAの標的DNA配列についての最も小さいCt＞40
3) MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についてのCtと、mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列についてのCtとの間の差（MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列Ct-mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列Ct)≦0
【００４２】
好ましくはMRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についてのCtと、mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列についてのCtとの間の差は＜0であり、より好ましくは＜0と-1との間であり、特には-0.25と-0.75との間である。
【００４３】
他の全ての条件において、MRSAは不存在である。
【００４４】
通常、対照株からのDNAを特異的プローブ及び/又はプライマーと合わせ、上記のDNA標的配列についてのものと同一の条件下で増幅し、それによりそれぞれのDNA標的配列についてのCtを決定する。対照株としては、例えば、MRSA、MRSE、MSSE、MSSA株、特にATCC33591(MRSA)、ATCC25923(MSSA)、鼻腔拭取物からの臨床的単離物(MRSE)及びATCC12228(MSSE)を用いることができる。
【００４５】
ここで用いられるサイクル閾値(Ct)の用語は、増幅産物の一義的な検出を可能とする、バックグラウンドの標準偏差の6〜12倍、好ましくは8倍として計算される、特定の増幅サイクルを示す。
【００４６】
DNA標的配列についてのCtは、通常、それぞれの蛍光色素についてのバックグラウンドを、3〜18サイクル、好ましくは3〜12サイクルの測定平均蛍光値として決定することにより決められる。バックグラウンドを差し引いた後、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列についてのサイクル閾値を、バックグラウンドの標準偏差の6〜12倍、好ましくは8倍として計算することができる。同様の計算を、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列について行なうことができる。mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列についての閾値を、MRSE対照株から得られたCtと対比することができる。続いてmecA遺伝子のDNA標的配列についての閾値を調整し、それによりmecA遺伝子のDNA標的配列についてのCtを、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列についてのCtと同じにすることができる。この調整は、通常、MRSA対照株から得られた、mecA遺伝子の標的DNA配列及びmecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列についてのCtと対比することにより行なわれる。通常、対照株の100pgの総DNAを実行される各増幅に用い、mecA遺伝子の標的DNA配列について、MRSAの標的DNAについて、及びMRSEの標的DNA配列についてのCtを決定する。好ましくは、通常1〜100pg、好ましくは1pgの、mecAの標的DNA配列以外の標的DNA配列、好ましくはATCC25923(MSSA)などのMSSA株からの、MSSAのfemA遺伝子の標的DNA配列を、増幅方法を実行する前に反応緩衝液に添加することにより、内部コントロールを用いる。内部コントロールを用いる場合、MRSAの存在及び量は、通常以下の場合に示される：
【００４７】
1) MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についての最少のCt＜40
2) mecA遺伝子以外のMRSAの標的DNA配列についての最少のCt＜40
3) MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についてのCtと、mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列についてのCtとの間の差(MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列Ct - mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列Ct)＜0
【００４８】
他の全ての条件において、MRSAは不存在である。内部コントロールが用いられる場合、MRSAの存在及び量は、好ましくは、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についてのCtと、mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列についてのCtとの差(MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列Ct - mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列Ct)が＜0及び-1の間、より好ましくは -0.25〜-0.75の間である場合に示される。したがって、内部コントロールの追加は、MRSAの存在及び量を示すための、ただ2つのCt、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についてのCt、及びmecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列についてのCtのみでの決定を可能とする。mecA遺伝子以外のMRSAの標的DNA配列についてのCtは追加的に決定することができ、実行が有効なものであることを見るために＜40とする必要がある。
【００４９】
本発明のさらなる目的は、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプライマー及び/又はプローブであって、配列番号1及び2の配列を含むプライマー及び配列番号3の配列を含むプローブ、それらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部並びにそれらの変異物から選択されるもの；MRSAのfemA遺伝子標的DNA配列に特異的なプライマー及び/又はプローブであって、配列番号4及び5の配列を含むプライマー及び配列番号6の配列を含むプローブ、及び配列番号10及び11の配列を含むプライマー及び配列番号12の配列を含むプローブ、それらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、さらに好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部並びにそれらの変異物から選択されるもの；及びMRSEのfemA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプライマー及び/又はプローブであって配列番号7及び8の配列を含むプライマー及び配列番号9の配列を含むプローブ及び配列番号13及び14の配列を含むプライマー及び配列番号15の配列を含むプローブ、それらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部並びにそれらの変異物から選択されるものである。
【００５０】
さらなる本発明の目的は、標本中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出のための診断キットであって、配列番号1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14及び15のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、それらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部、並びにそれらの変異物のいずれかの適切な組み合わせを含み、さらに上記抗タンパクA抗体を含むものである。好ましくは、本キットは、上記抗タンパクA抗体に加えてガラスビーズを含む。
【実施例】
【００５１】
実施例 1
プライマー及びプローブの選択及び合成
MRSAのmecA遺伝子の、MRSAのfemA遺伝子の、及びMRSEのfemA遺伝子の標的DNA配列を、Genbank配列データベースから選択した。MRSEのfemA遺伝子(femA-SE、Genbank配列U23713より)及びMRSAのfemA遺伝子(femA-SA、Genbank配列X17688より)のGenbank配列は、"Clustal"整列法(Baylor College of Medicine)を用いて整列され、最も乏しいレベルの相同性を示した領域を検出した。これらの部分配列に限定されたプライマー及びプローブの研究は、"Primer Express"(Taqman(登録商標)の適用のために開発されたPerkin Elmerソフトウェア)を用いて行なわれた。プローブ及びプライマーは、短いPCRフラグメント(およそ100±50ヌクレオチド)を生成することを目論み設計された。femA-SA及びfemA-SEの標的DNA配列に特異的なプローブ及びプライマーは、femA-SA及びfemA-SEの配列を区別するための、少なくとも＞3ミスマッチを含むヌクレオチドから構成されるよう設計された。
【００５２】
対照株ATCC25923(MSSA)及びATCC12228(MSSE)の純粋なDNA調製物は、選択されたプライマー/プローブの特異性をテストすることを可能とした。記載されたプローブ及び/又はプライマーを用いた、Taqman(登録商標)増幅アッセイにおいて、交差反応は何も記録されなかった。配列番号4、5及び6は、femA-SAのヌクレオチド651〜788の領域を増幅した。配列番号7、8及び9は、femA-SEのヌクレオチド1403から1547の領域を増幅した。配列番号10、11及び12は、femA-SAのヌクレオチド1600〜1694の領域を増幅した。配列番号13、14及び15は、femA-SEのヌクレオチド1315〜1414の領域を増幅した。
【００５３】
mecA遺伝子の増幅された領域は、321〜419であった(mecA、Genbank配列Y14051より)。mecAの既知の配列にもとづくと、この領域は黄色ブドウ球菌(Y14051)及びスタフィロコッカス・エピデルミディス(Genbank配列X52592)において高度に保存される。
【００５４】
全てのヌクレオチドは、Expedite(商標)自動合成機を用いて合成され、Eurogentec(Seraing, Belgium)により蛍光的にラベルされた。精製技術は、HPLCを用いて得られるものと同等もしくはそれ以上のものが得られる、内的に開発された(Eurogentec)クロマトグラフィーシステムに基づいた。全てのヌクレオチド(OliGold、商標)は凍結乾燥して送達され、保護を外され、逆相クロマトグラフィーにより精製された。塩、アンモニウム及び酸残基の不存在もまたチェックされた。オリゴヌクレオチド合成について用いられた全ての試薬は、Glen Researchカタログに記載される通りに品質管理された。用いられた色素FAM,TET,HEX,JOE又はTexasRed(登録商標)(プローブの5'末端に結合)及びクエンチャーTAMRA又はDABCYL(3'末端に結合)は、適切なホスホールアミダイト又はスクシンイミジルエステル誘導体を用いてカップリングされる(FAM：6-カルボキシフルオレセイン、TAMRA：6-カルボキシ-N,N,N',N'-テトラメチルロダミン、HEX：6-カルボキシ-2',4,4',5',7,7'-ヘキサクロロフルオレセイン、TET：6-カルボキシ-4,7,2',7'-テトラクロロ-フルオレセイン、JOE：6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、DABCYL：4-((4-(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸、又はTexas Red(登録商標))。
【００５５】
プライマー及びプローブは、自己ハイブリダイゼーション又は異なるプライマ−及び/又はプローブ間のハイブリダイゼーション、ループ形成および偽プライミング部位を避けるため、それら同士、及び他のプライマー及びプローブのセット(マルチプレキシング(multiplexing))と相互にコンパチブルであるかどうかテストされた。プライマー及びプローブは続いて、それらの感受性及び特異性を評価するため、対にしてテストされた。それらは続いて、異なる濃度(50〜900nM)で組み合わされ、最適な反応条件が決定された。
【００５６】
実施例 2
試料の前処理
鼻腔/鼠径の拭取物に含まれていた試料を集め、場合によっては各患者について、CS培地(コリスチン及び2.5%NaClを含む脳-心臓浸出液)に懸濁することによりプールした。事前の研究は、塩に富むこの細菌培地、殺菌及び栄養剤は、以下の工程に影響せず、生理食塩水(0.9%NaCl)と同等にふるまうことを示していた。続いてこれらの試料(1ml)に、50μlの20%ヒト血清アルブミン(注射可能グレード、スイス赤十字より)を加えた。試料の前処理は、約5分を必要とした。
【００５７】
試料の濃縮
続いて、スタフィロコッカスタンパクAに対して惹起されたマウス ビオチニル化モノクローナル抗体(Sigma) 1.5μlを、全ての試料に添加し、さらに、ロータリーシェーカー上、室温条件で45分間インキュベートした。続いて試料を10分間5000gで遠心した。上清を除いてから1%ヒト血清アルブミンを含む200μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS-HSA)を添加した。試料を10μlのストレプトアビジン被覆磁石ビーズ(径1μm、Merck)と混合し、ロータリーシェーカー上、周囲条件下で45分間インキュベートした。試料を続いて96ウェルプレートに移し、磁気ホルダー上に5分間保持した(Milian)。上清を除き、常磁性ビーズをPBS-HSAで2回洗浄した。試料の濃縮は、約95分を要した。
【００５８】
細菌の溶解及び DNA のリリース
続いて常磁性ビーズを96ウェルプレート中400μlのカオトロピック緩衝液(QiagenのキットQIampからのATL緩衝液)に懸濁し、清浄なエッペンドルフチューブに移した。100mgのガラスビーズ(径100〜200μm、Schieritz and Hauenstein AG、CH-4144 Arlesheim)を添加し、細菌を、ミキサー装置(Mixer Mill、Qiagen)で、各45秒の均質化サイクル2回で溶菌させた。5000gで10分遠心後、液相を清浄なチューブに入れ、200μlの室温の純粋なエタノールと混合した。DNAをQIampカラム(Qiagen)に固定化し、製造元が記述する通りに洗浄し、100μlの純粋に溶出させた。抽出物を、続いてエバポレーター(UniVapo 100H、UniEquip)で1時間乾燥させ、20μlの純粋中に再懸濁した。細菌の溶解及びDNAのリリースには、約30分を要した。
【００５９】
リアルタイム PCR による核酸の検出と分析
分析を確固たるものとするため、リリースされたDNAを含有する各試料は、3例分に分けて分析された。検出及び分析は、約150分を要した。TaqMan(商標)システム(Perkin Elmer)と、Hot GoldStar Taq DNAポリメラーゼ(Eurogentec)とを、試料の増幅に用いた。
【００６０】
A.増幅されたターゲット
【００６１】
【表１】
【００６２】
順行プライマーA1は配列番号1に対応する。逆行プライマーB1は配列番号2に対応する。プローブC1は配列番号3に対応する。順行プライマーA2は配列番号4に対応する。逆行プライマーB2は配列番号5に対応する。プローブC2は配列番号6に対応する。順行プライマーA3は配列番号7に対応する。逆行プライマーB3は配列番号8に対応する。プローブC3は配列番号9に対応する。
【００６３】
PCR混合物の終体積は25μlであり、下記のものを含んでいた：
・反応緩衝液2X：12.5μl(Eurogentecにより市販)
・A1：75nM、B1：75nM及びC1：100nM
・A2：100nM、B2：100nM及びC2：100nM
・A3：100nM、B3：100nM及びC3：100nM
・試料6μl、増幅の実行は即座に行なわれた。
【００６４】
プローブにリンクした蛍光色素は下記のものであった：
C1(mecA) 5'-HEX及び3'-TAMRA
C2(femA-SA) 5'-FAM及び3'-TAMRA
C3(femA-SE) 5'-TET及び3'-TAMRA
【００６５】
B.増幅条件
アッセイは、(特異性を損なわずに)感受性を増加させるために50サイクルを用いた点を除き、Applied Biosystemsの仕様に従って進められた。
【００６６】
インキュベーション1 →2分50℃
インキュベーション2 →10分95℃
インキュベーション3 →15秒95℃
インキュベーション4 →1分60℃
(3及び4を50回反復)
【００６７】
C.分析
得られたデータを目視で見たのち、各蛍光リポーターのバックグラウンドを、サイクル3〜12の間に測定された平均蛍光値として決定した。バックグラウンドを差し引いた後、femA-SAについての閾値を、バックグラウンドの標準偏差の6〜12倍(好ましくは8倍)として計算した。同様の計算を、femA-SEについて行なった。femA-SEについてのCtを、対照MRSE株(鼻腔拭取物から単離)からの100pgDNA/ウェルを用いて、A及びBで記載したのと同じ条件で決定した。mecAについての閾値を、mecAについてのCt=femA-SAについてのCtとなるよう調整した。この決定は、対照MRSA株(ATCC 33591)からの100pgDNA/ウェルを用いて、A及びBで記載したのと同じ条件で行なった。femA-SA、mecA及びfemA-SEについてのスクリーンショットから、各DNA標的配列についての3例分のうちの最少のCtを決定した。下記全ての条件が満たされた場合にMRSAが存在した：
【００６８】
1) mecAについての最少のCt＜40
2) femA-SAについての最少のCt＜40
3) mecAについてのCt − femA-SEについてのCt≦0
【００６９】
全ての他の条件においてMRSAは不存在であった。
【００７０】
実施例 3
細菌溶解及び DNA リリースの変法
実施例1の細菌溶解及びDNAのリリースを、下記の通り変更して行なった：
a) 細菌溶解を、0.9%塩化ナトリウム(NaCl)溶液中のガラスビーズを用いて行なった。溶菌後、上清を捨て、ビーズを200〜400μlの純粋に懸濁した。激しく撹拌した後、溶出したDNA(ここでは液相中)を、蒸発により濃縮し、20μlの水に溶解し、Taqman(登録商標)増幅アッセイに直接用いた。
b) 0.9%NaClの存在下での細菌溶解後、ビーズを同一の溶液で2回洗浄し、続いて100μlの生理食塩水に懸濁した。ビーズ懸濁液の6μlのアリコートを、Taqman(登録商標)増幅アッセイに直接導入した。
c) 細菌溶解を、200〜400μlの純粋中にガラスビーズ懸濁して行なった。激しく撹拌した後、溶出したDNA(ここでは液相中)を蒸発により濃縮し、20μlの水に溶解し、Taqman(登録商標)増幅アッセイに直接用いた。
【００７１】
実施例 4
感受性の評価
既知量のMRSA及びMRSEを加えた試料を用いた実験では、100%の特異性及び1ゲノムコピーの感受性が明らかになった。10ngから0.1〜0.2fg/反応(1ゲノムコピーは、1.65x10-15gに相当)の、幅広い範囲の添加量についてテストした。
【００７２】
実施例 5
分子検出と、標準的な培養に基づいた方法との対比
分子検出を、標準的な培養に基づいた方法(Laboratoire Central de Microbiologie, LCB, Geneva University Hospitalにより行なわれた)と対比する、中規模スケールの研究(38試料が同時に処理された)において、全ての陽性の培養物のケースの検出ができた(11/11)。培養によっては陰性であった2つの試料が、実施例1の分子技術を用いて陽性であることが分かった。これら2患者について、LCBはMRSAの存在を他の採取部位において見出した。
【００７３】
実施例 6
A.MRSA 及び MRSE を含有する混合試料の、常磁体による濃縮
試料に、異なる比率のMRSA及びMRSE(1/1〜1/1000)を加えた。試料を、直接溶菌(手順a)するか、抗タンパクA抗体及び常磁性ビーズを用いた実施例1記載の方法で濃縮し(手順b)、実施例2に記載される通りの増幅に供した。
【００７４】
得られた結果は、1/1比について、手順bの追加工程にも拘らず、Ctは濃縮なし(手順a)の1〜2サイクル増加したことを示した。このことは、手順aに対する手順bの増加した感受性を示唆する。1/5比について、femA-SAについてのCtは、濃縮なし(手順a)の2〜2.5サイクル増加した。この増加した感受性は、MRSA/MRSE比が減少した際により顕著であった。1/5より低い比において、手順aを用いたら、試験された範囲の添加細菌ではfemA-SAシグナルは何も記録されなかった。手順bを用いたら、femA-SEについての有意なシグナルは、1/5より低い比率の場合でさえ、何も記録されなかった。このことは、大過剰のMRSEの存在にあってさえも良好な濃縮を示す。
【００７５】
B. シュードモナス・アエルギノーサ存在下での MRSA 及び MRSE の検出
この実験は、臨床診断において一般的に見られる、患者がシュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)に感染した状況に基づく。シュードモナス・アエルギノーサがAに示された比率で添加されたどの場合も、手順bを使用しない限りはfemA SAシグナルが何も記録できなかった。
【００７６】
手順bを用いた全ての条件について、femA SAのCt及びmecAのCtは、殆ど同じであり、その解釈は直接的(straightforward)なものであり、正確で感受性の高い検出のためにこの工程の絶対的必要性を裏付けた。
【００７７】
実施例 7
試料がPBSに懸濁され、続いて50μlの20%ヒト血清アルブミン(注射可能グレード、スイス赤十字より)が補われた点を除き、試料の前処理及び濃縮を、実施例2に記載される通りに行った。濃縮された試料を50μlの純水に再懸濁してからガラスビーズを添加した点を除き、細菌溶解及びDNAリリースを実施例3a)に記載される通りに行った。せん断力による破壊の後、液相に含まれるDNA(10μl)を、増幅混合物に直接添加し、Taqman(登録商標)増幅アッセイに供した。
【００７８】
リアルタイム PCR による核酸の検出及び分析
分析を確固たるものとするため、リリースされたDNAを含有する各試料は、3例分に分けて分析された。検出及び分析は、約150分を要した。ABI Prism Sequence Detection System cycler (Applied Biosystems)と、Hot GoldStar Taq DNAポリメラーゼ(Eurogentec)とを、試料の増幅に用いた。
【００７９】
A.増幅されたターゲット
【表２】
【００８０】
順行プライマーA1は配列番号1に対応する。逆行プライマーB1は配列番号2に対応する。プローブC1は配列番号3に対応する。順行プライマーA4は配列番号10に対応する。逆行プライマーB4は配列番号11に対応する。プローブC4は配列番号12に対応する。順行プライマーA5は配列番号13に対応する。逆行プライマーB5は配列番号14に対応する。プローブC5は配列番号15に対応する。
【００８１】
PCR混合物の終体積は25μlであり、以下の化合物を含んでいた：
・反応緩衝液2X：12.5μl(Eurogentecにより市販)
・A1：100nM、B1：100nM及びC1：75nM
・A4：50nM、B4：50nM及びC4：50nM
・A5：400nM、B5：400nM及びC5：100nM
・試料10μl、増幅の実行は即座に行なわれた。
【００８２】
プローブに結合した蛍光色素は以下のものである：
C1(mecA) 5'-JOE及び3'-DABCYL
C4(femA-SA) 5'-FAM及び3'-DABCYL
C5(femA-SE) 5'-Texas Red(登録商標)及び3'-DABCYL
【００８３】
B. 増幅条件
アッセイは、(特異性を損なわずに)感受性を増加させるために50サイクルを用いた点を除き、Applied Biosystemsの仕様に従って進められた。
【００８４】
インキュベーション1 →2分50℃
インキュベーション2 →10分95℃
インキュベーション3 →15秒95℃
インキュベーション4 →1分60℃
(3及び4を50回反復)
【００８５】
C.分析
得られたデータを目視で見たのち、各蛍光リポーターのバックグラウンドを、サイクル3〜12の間に測定された平均蛍光値として決定した。バックグラウンドを差し引いた後、各蛍光リポーターについての閾値を、バックグラウンドの標準偏差の6〜12倍(好ましくは8倍)として計算した。同様の計算を、femA-SEについて行なった。femA-SEについてのCtを、対照MRSE株(鼻腔拭取物から単離)からの100pgDNA/ウェルを用いて、A及びBで記載したのと同じ条件で決定した。mecAについての閾値を、mecAについてのCt=femA-SAについてのCtとなるよう調整した。この決定は、対照MRSA株(ATCC 33591)からの100pgDNA/ウェルを用いて、A及びBで記載したのと同じ条件で行なった。femA-SA、mecA及びfemA-SEについてのスクリーンショットから、各DNA標的配列についての3例分のうちの最少のCtを決定した。下記全ての条件が満たされた場合にMRSAが存在した：
【００８６】
1) mecAについての最少のCt＜40
2) femA-SAについての最少のCt＜40
3) mecAについてのCt - femA-SEについてのCt＜0
【００８７】
全ての他の条件においてMRSAは不存在であった。
【００８８】
実施例 8
対比のため、実施例7で用いたのと同一の試料を、実施例2のセクションA(表1)のプライマー及びプローブ、ならびに実施例7セクションA(表2)のプライマー及びプローブを用いて、平行して分析した。
【００８９】
【表３】
【００９０】
【表４】
【００９１】
実施例7で用いられたプライマー及びプローブは、同様の解釈を提供したが、増加した感受性を与えた。即ち、測定した3つの標的遺伝子において、Ct値がより小さかった。
【００９２】
実施例 9
実施例9は、内部コントロールとしてMSSA株ATCC25923から抽出した1pgのゲノムDNAを反応緩衝液に添加した点を除いて、実施例7と同様に行った。増幅後、mecAについて得られたCt及びfemA-SEについてのCtに基づいて分析を行った。100pgから1pgにわたる異なる添加量をテストし、この濃度範囲での決定の直線性を確認し、femA-SAについてのCtは24及び30〜31であった。ABI Prism Sequence Detection Systems (Applied Biosystems)又はSmart Cycler (Cepheid)の両方において検出及び分析を行った。両方が、同様の直線的な結果を与えた。mecAについてのCt - femA-SAについてのCtの差が＜０である場合に、MRSAの存在及び量が示された。他の全ての条件において、MRSAは不存在であった。1pgの、MSSAからの添加ゲノムDNAを利用し、femA-SAについてのCtを測定し、増幅が適切に働いていることを確認した。
【０００１】
本発明は、標本からのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)の検出及び定量の新規な方法に関する。さらに、本発明は、MRSAの検出及び定量のための新しいプライマー及びプローブ及び診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
MRSAは病原性の細菌であり、多剤耐性細菌のクラスに属する。MRSAの罹患率の増加は、主要な臨床上の問題となっている。したがって、臨床標本中のMRSAの迅速で正確な検出及び同定は、感染性疾患の予防及び治療に重要であると考えられている。
【０００３】
MRSAの検出及び同定の方法は、既に開示されている。例えば、スタフィロコッカス属の、及びメチシリン耐性をコードする抗生剤耐性遺伝子(mecA遺伝子)の、種特異的検出、同定及び定量のための、PCR及び増幅プライマーを採用したDNAに基く方法が、WO98/20157に記載されている。
【０００４】
WO99/16780は、マルチプレックスPCRを用いた増幅のための、mecA遺伝子に特異的なプライマー、及び細胞壁代謝に関与する調節遺伝子であるfemA遺伝子についてのスタフィロコッカス種特異的プライマーの使用を開示する。気管吸引物を標本として採り、感受性の黄色ブドウ球菌及びメチシリン耐性コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス属が、電気泳動により検出された。
【０００５】
US5702895は、黄色ブドウ球菌を他のスタフィロコッカス属から区別するマーカーであるmecA及びspa遺伝子についての、ビオチンラベル化及びジニトロフェニルラベル化プライマーを用いたMRSAの検出のためのマルチプレックスPCR方法を開示する。標本は、単離された細菌の培養物から採られ、増幅されたDNAは吸光により検出された。
【０００６】
この開示された方法は、単離された細菌及び滅菌したサイトの培養物から採られた標本の分析のためのみに用いられている。しかしながら滅菌していない標本を用いた場合、含まれるMRSAの数が少なく、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus, MSSA)及びメチシリン感受性スタフィロコッカス・エピデルミス(methicillin-sensitive Staphylococcus epidermis, MSSE)並びにメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミス(methicillin-resistant Staphylococcus epidermis, MRSE)等のさらなるスタフィロコッカス属が存在しうる。このような状況下では、この開示される方法は、mecA遺伝子の存在が、MRSAの存在と、明示的かつ一義的にはリンクしないという点において不利である。さらに、このような条件下では、非特異的増幅のリスクを完全には排除できず、この方法の感受性は低下する。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の目的は、標本が非滅菌サイトからのものであっても、MRSAの高感受性の定量を可能とする、標本からのMRSAの検出及び定量のための改善された方法を提供することにある。
【０００８】
この目的は、請求項1による新規な方法により達成される。
【０００９】
本発明によれば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌は、下記工程を含む方法で標本から検出及び定量される：
a)標本を抗タンパクA抗体と接触させ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌を吸着させる工程
b)標本から、前記メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌が吸着した前記抗体を分離する工程
c)前記抗体に吸着されたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌を溶菌して、それらのDNAをリリースする工程、
d)リリースされたDNAを(i)メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミス(Staphylococcus epidermis)のmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー、(ii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー及び(iii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外のメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーと合わせる工程であって、ここでメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の及びメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスの標的DNA配列が相同的でない工程、
e)リリースDNA及び特異的プローブ及び/又はプライマーを合わせたものを、前記標的DNA配列の増幅を可能とする条件に供する工程、
f)増幅された標的DNAの存在及び量を、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の存在及び量を示すものとして検出する工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
標本
本発明によりMRSAを検出及び定量しうる標本は、滅菌及び/又は非滅菌サイトからのものである。標本がとられうる滅菌サイトは、血液、尿、脳脊髄液、滑液、胸膜液、心膜液、眼内液、組織生検物又は気管内吸引物等の体液である。単離された細菌の培養物もまたここでは滅菌サイトとして規定される。標本が採られうる非滅菌サイトは、例えば、喀痰、便、例えば皮膚、鼠径部、鼻腔及び/又は喉からの拭取物である。好ましくは、非滅菌サイトからの、より好ましくは鼠径及び/又は鼻腔拭取物からの標本が、本発明で用いられる。
【００１１】
標本の、抗タンパク A 抗体との接触
通常標本は、抗タンパクA抗体との接触前に、例えば生理食塩水、ブロス(broth)溶液又はCS培地(コリスチン及び2.5%NaClを含む脳-心臓浸出液)等の細菌培養培地に再懸濁される。通常、例えば血清アルブミン等の保護剤を、再懸濁標本に添加する。
【００１２】
本発明において用いられる抗タンパクA抗体は、MRSA及びMSSAのタンパクAに対する抗体であり、通常モノクローナル抗体である。MRSA及び/又はMSSAの吸着を可能とするために、標本は、抗体と、通常5〜120分間、好ましくは10〜60分間接触させる。
【００１３】
MRSA及び/又はMSSAの吸着を行なった後、抗体は標本から分離される。採用される分離方法に応じて、抗タンパクA抗体又はビオチニル化等の改変をされた抗タンパクA抗体(どちらも商業的に入手可能)を本発明において用いることができる。標本及び抗体は、遠心、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー若しくは抗体の固定化又はこれらの方法の組み合わせにより分離することができる。固定化又はアフィニティークロマトグラフィーが用いられる場合、代わりに、まず抗体がアフィニティーカラムに固定化されたり又は相互作用することができ、それから標本と接触させることができる。
【００１４】
好ましくは、本発明において、抗タンパクA抗体の固定化は、吸着したMRSA及び/又はMSSAを有する抗体を、標本から分離するのに用いられる。特に、遠心の工程が、抗体の固定化の前に追加される。抗体は、常磁性のビーズ上に固定化することができる。ストレプトアビジン及びビオチンを結合パートナーとして、例えばビオチニル化した抗タンパクA抗体を、ストレプトアビジンで被覆した常磁性ビーズにリンクすることにより用いることができる。好ましくは、ビオチニル化した抗タンパクA抗体及びストレプトアビジン被覆常磁性ビーズは、抗体を固定化するのに用いられる。ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズは、商業的に入手可能である。通常、抗体及び常磁性ビーズは、抗体が常磁性ビーズに結合できるようインキュベートされ、続いて磁的に保持され、常磁性ビーズを洗浄することにより標本から分離される。インキュベーション時間は通常5〜120分間、好ましくは10〜60分間である。常磁性ビーズを磁気的に保持する時間は通常1〜60分間、好ましくは2〜20分間である。
【００１５】
抗体は、必要に応じて、分離の間に再懸濁することができる。再懸濁及び洗浄のために、例えばヒト血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水を用いることができる。
【００１６】
吸着された微生物を溶解しそれらの DNA をリリース
抗体に吸着されたMRSA及び/又はMSSAは、それらのDNAをリリースするために、例えばTween、Triton X-100等の界面活性剤、NaOH等のアルカリ、プロテイナーゼK等のプロテアーゼ若しくはカオトロープ及び/又はせん断力を適用することにより溶解することができる。溶解は、通常TE(Tris-HCl 10mM、pH=8及びEDTA 1mM)のような緩衝液中、又は水(分子級純度)中、又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)のような緩衝液中、又は生理食塩水中で行なわれる。
【００１７】
カオトロープとしては、例えばグアニジニウムイソチオシアネート、尿素、又は塩酸グアニジン、好ましくはグアニジニウムイソチオシアネートが用いられる。カオトロープが用いられる場合、Qiagenにより商品化されている、グアニジニウムイソチオシアネートを含むATL緩衝液が好ましく用いられる。カオトロープが用いられる場合、カオトロープは、例えばリリースされたDNAをQlamp(Qiagen)等のDNA結合カラムに接触させることにより、溶菌の後リリースされたDNAから除かれる。カラムから溶出されたDNAは、それからプローブ及び/又はプライマーと合わせることができ、又は事前に濃縮することができる。
【００１８】
例えばビーズを添加し溶液を混合することにより、せん断力を適用することができる。ビーズとしては、好ましくはガラスビーズを添加ことができ、より好ましくはSchieritz and Hauenstein AG (スイス)により市販される直径100〜200μmのガラスビーズを添加することができる。ガラスビーズの使用は特に有用である。なぜならば、溶菌がPBS中又は生理食塩水中で行なわれる場合、ガラスビーズ、特にSchieritz and Hauenstein AG (スイス)により市販される直径100〜200μmのガラスビーズは、リリースされたDNAに定量的に結合し、DNAを他のコンポネントから効率的に抽出することが見出されているからである。ガラスビーズに結合したDNAを水又はTEで溶出した後、溶出したDNAは、プローブ及び/又はプライマーと直接合わせることができ、又は事前に濃縮することができる。または、結合したDNAを伴なったガラスビーズをPBS中に又は生理食塩水中に懸濁することができ、プローブ及び/又はプライマーと直接合わせることができる。
【００１９】
さらに、TE(Tris-HCl 10mM、pH=8及びEDTA 1mM)中又は水(分子級純度)中においても、ビーズを、好ましくはガラスビーズを、さらに好ましくはSchieritz and Hauenstein AG (スイス)により市販される直径100〜200μmのガラスビーズを用いて、せん断力を適用した溶菌を実行することができる。この手順は、DNAの液相中での直接的な回収を可能とする。液相中のDNAは、プローブ及び/又はプライマーと直接合わせることができ、又は事前に濃縮することができる。
【００２０】
溶菌の好ましい実行方法は、せん断力を使用するものである。より好ましくは、溶菌は、PBSのような緩衝液又は生理食塩水中において、ガラスビーズ、特にSchieritz and Hauenstein AG (スイス)により市販される直径100〜200μmのガラスビーズを用い実行される。
【００２１】
プローブ及び / 又はプライマー
MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列、及びmecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列に特異的なものである本発明のプローブ及び/又はプライマーは、特定のプローブ及び/又はプライマーの特定の配列、それと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、さらに好ましくは20ヌクレオチド長を有するそれらの一部、及びそれらの変異物を包含する。変異物は、それぞれのプライマー又はプローブが特定の標的DNA配列に対しなお特異的である限りにおいて、1以上のヌクレオチド位置において変性された配列、欠失、挿入、及び置換を包含する。通常、プローブ及びプライマーは、それぞれの標的DNA配列に対し適用される。好ましくは、順行(forward)プライマー及び逆行(reverse)プライマーなどのプライマーの対、及びプローブが適用される。
【００２２】
本願において、「特異的プローブ及び/又はプライマー」又は「標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー」の用語は、増幅される特定の標的DNA配列に対し、60%より高い、好ましくは70%より高い、より好ましくは80%より高い、特には90%より高い相同性を有するプローブ、及び増幅される特定の標的DNA配列に隣接するDNAに対し、60%より高い、好ましくは70%より高い、より好ましくは80%より高い、特には90%より高い相同性を有するプライマーを表す。プローブ及びプライマーはそれぞれ、例えば55から65℃の間、好ましくは58から62℃の間の温度及び3から10mMの間、好ましくは4から6mMの間の所定の塩濃度といったストリンジェントな条件下で、それぞれ増幅される特定の標的DNA配列の相補物と、又は増幅される特定の標的DNA配列の相補物に隣接するDNAとハイブリダイズする。
【００２３】
(i)MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー、(ii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、MRSAの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー、及び(iii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、MRSEの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーを選択する基礎として、GenBank又はEMBL等のデータベース配列、文献に記載されるフラグメント又は対応する微生物の単離されたフラグメントを用いることができる。好ましくは、GenBank又はEMBL等のデータベース配列、より好ましくはGenBankが用いられる。特に、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーは配列番号Y14051(Genbank)に含まれるmecA遺伝子配列から選択され、(ii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、MRSAの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーは配列番号X17688(Genbank)に含まれるMRSAのfemA遺伝子配列から選択され、(iii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、MRSEの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーは配列番号U23713(Genbank)に含まれるMRSEのfemA遺伝子配列から選択される。
【００２４】
mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、MRSAの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーはまた、GenBank又はEMBL等のデータベース配列、文献中に記載されたフラグメント又は対応する微生物の単離されたフラグメントであって、MSSAの標的DNA配列を含むものからも選択することができる。ただしこれらの標的DNA配列はMRSAによっても保持されるものである。
【００２５】
mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、MRSEの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーはまた、GenBank又はEMBL等のデータベース配列、文献中に記載されたフラグメント又は対応する微生物の単離されたフラグメントであって、MSSEの標的DNA配列を含むものからも選択することができる。ただしこれらの標的DNA配列はMRSEによっても保持されるものである。
【００２６】
通常、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及びプライマーを設計するのには、MRSA又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列を1つ選択すれば十分である。なぜならば、mecA遺伝子は、MRSA及びMRSE間で、95%から100%の間で、通常97%より高く相同的だからである。好ましくは、選択されるmecA遺伝子の標的DNA配列は、MRSAからのものである。
【００２７】
相同的でないMRSA及びMRSEの標的DNA配列として、両方の標的DNA配列の相同性が90%未満、好ましくは85%未満、もっとも好ましくは80%未満であり、両方の配列が上記のストリンジェントな条件下で交差ハイブリダイズしない限りは、100%のMRSA及び100%のMRSEがそれぞれ保有する、mecA遺伝子における、標的DNA配列以外のどのDNA配列をも用いることができる。通常、MRSAのfemA遺伝子(femA-SA)及びMRSEのfemA遺伝子(femA-SE)等の遺伝子の標的DNA配列、又はMRSA及びMRSEの遺伝子の他の標的DNA配列であって互いに関連しないものを、標的DNA配列として用いることができる。好ましくは、MRSAのfemA遺伝子(femA-SA)の、及びMRSEのfemA遺伝子(femA-SE)の標的DNA配列を用いることができる。
【００２８】
通常、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列、及びmecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーが、約100±50ヌクレオチドの増幅産物を生成するために、設計される。プライマー及びプローブの配列は、標準的なプログラム及びプライマー解析ソフトウェア、例えば「Primer Express」(Perkin Elmer)を用いることにより得ることができ、自動化DNAシンセサイザー等の標準的な方法を用いて合成することができる。
【００２９】
MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子に標的DNA配列に特異的なプライマーは、通常13〜30、好ましくは20〜26ヌクレオチド長で構成される。MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブは、通常、15〜40、好ましくは25〜35ヌクレオチド長で構成される。
【００３０】
mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列に、及びmecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列に特異的なプライマーは、通常、13〜30、好ましくは20〜26ヌクレオチド長で構成され、通常、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列を、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列から区別するための、＞3のミスマッチを含有するように選択される。mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列に、及びmecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列に特異的なプローブは、通常、15〜40、好ましくは25〜35ヌクレオチド長で構成され、通常、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列を、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列から区別するための、＞3のミスマッチを含有するように選択される。
【００３１】
全てのプライマー及びプローブは、お互いに、及び他のプライマー及びプローブのセットとコンパチブルになるよう選択し、自己ハイブリダイゼーション又は異なるプライマー及び/又はプローブ間のハイブリダイゼーション、ループ形成、および偽プライミング部位を避けることができる。選択後、プライマー及びプローブを対としてテストし、それらの感受性及び特異性を評価することができ、通常50〜900nMの濃度で組み合わせ、増幅における最適な反応条件を規定することができる。
【００３２】
MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーで好ましいものは、配列番号1及び2を含むプライマー、及び配列番号3を含むプローブ、それと相補的な配列、その一部であって少なくとも10、好ましくは15、もっとも好ましくは20ヌクレオチド長のもの、及びそれらの変異物を含むものから選択される。MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的な、特に好ましいプローブ及び/又はプライマーは、配列番号1及び2を含むプライマー及び配列番号3を含むプローブである。
【００３３】
mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列に特異的な、好ましいプローブ及び/又はプライマーは、プローブ及び/又はプライマー、それらに相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部、及びそれらの変異物であって、MRSAのfemA遺伝子の標的DNA配列に特異的なものである。
【００３４】
MRSAのfemA遺伝子の標的DNA配列に特異的な、特に好ましいプローブ及び/又はプライマーは、配列番号4及び5を含むプライマー及び配列番号6を含むプローブ、及び配列番号10及び11を含むプライマー及び配列番号12を含むプローブ、それらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長のそれらの一部、並びにそれらの変異物から選択される。最も好ましいものは、配列番号4及び5を含むプライマー及び配列番号6を含むプローブ及び配列番号10及び11を含むプライマー及び配列番号12を含むプローブ、特に配列番号10及び11を含むプライマーおよび配列番号12を含むプローブである。
【００３５】
mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列に特異的な好ましいプローブ及び/又はプライマーは、プローブ及び/又はプライマー、それと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部並びにそれらの変異物であって、MRSEのfemAの標的DNA配列に特異的なものである。
【００３６】
MRSEのfemA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーで特に好ましいものは、配列番号7及び8を含むプライマー及び配列番号9を含むプローブ及び配列番号13および14を含むプライマー及び配列番号15を含むプローブ、これらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部、ならびにそれらの変異物から選択される。最も好ましいものは、配列番号7及び8を含むプライマー及び配列番号9を含むプローブ及び配列番号13及び14を含むプライマー及び配列番号15を含むプローブであり、特に配列番号13及び14を含むプライマーおよび配列番号15を含むプローブである。
【００３７】
増幅
前記標的DNA配列の増幅を可能とする条件は当業者によく知られている。通常、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ネストPCR又はマルチプレックスPCR、リガーゼ連鎖反応、核酸配列基準増幅(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)、自己維持配列複製(self-sustained sequence replication, 3SR)、ストランド変位増幅(strand displacement amplification, SDA)、分枝DNAシグナル増幅(bDNA)、転写媒介増幅(transcription-mediated amplification, TMA)又はサイクリングプローブ技術(cycling probe technology, CPT)等の増幅方法を用いることができる。好ましくは、マルチプレックスPCRが用いられる。マルチプレックスPCRにおいては、前記プローブ及び/又はプライマーが、単一PCR反応においてリリースされたDNAと共に組み合わせて用いられる。
【００３８】
増幅方法としてPCR方法が用いられる場合、例えばTaqDNAポリメラーゼ(Perkin Elmer)又はAmpliTaq(PE Applied Biosystems)、Hot GoldStar Taqポリメラーゼ(Eurogentec)、AmpliTaq Goldポリメラーゼ(PE Applied Biosystems)、SureStart Taq(Stratagene)又はPlatinum Taq(Gibco)等のDNAポリメラーゼを用いることができる。好ましくは、Hot GoldStar Taq DNAポリメラーゼが用いられる。変性させ単一ストランドDNAとする処理は、通常熱処理である。通常のPCR条件は、例えば、0.5〜5分40〜60°、好ましくは1.5〜2.5分45〜55°のインキュベーションと、続いての5〜15分90〜97°、好ましくは8〜12分95°のインキュベーションと、続いての5〜30秒90〜97°、好ましくは10〜20秒95°のインキュベーションと、続いての0.1〜5分50〜70°、好ましくは0.5〜2分55〜65°のインキュベーションで、最後の2つのインキュベーション工程が100回まで、好ましくは50回繰返されるような熱サイクル条件である。DNAポリメラーゼが用いられる場合、さらなる変性工程を第1のインキュベーション工程として追加することができる。
【００３９】
通常、インキュベーションの前に、商業的に入手可能な反応緩衝液を、プローブ及び/又はプライマーと組み合わされた、リリースされたDNAに添加することができる。プローブ及び/又はプライマーは通常、リリースされたDNAに過剰に添加される。それぞれの標的DNA配列についてのプローブ及びプライマーの通常の比率は、1/3〜2/1の間である。それぞれの標的DNA配列についての、1つのプライマーの、他に対する比率は、通常1/3〜3/1の間である。
【００４０】
増幅された標的DNA配列の存在及び量は、例えば、以下の方法により検出することができる：増幅された標的DNA配列のサイズを電気泳動により確認する方法；増幅された標的DNA配列を、増幅された標的の配列と相補的な配列を有する、ラベルされたプローブとハイブリダイズする方法；又はリアルタイムPCR、ここで増幅された標的DNA配列は増幅中に、例えば異なる波長で発光する様々な蛍光色素を用いて増幅中の蛍光を測定することにより検出される。TaqMan(登録商標)(Perkin Elmer)、ABI Prism Sequence Detection Systems (Applied Biosystems)、SmartCycler(登録商標)(Cepheid)、I-Cycler (BioRad)、Light Cycler (Roche)、R.A.P.I.D. (Idaho Technologies)、DNA Engine Opticon (MJ Research)、Rotor Gene (Corbett Research)、及びMX400(Stratagene)等のリアルタイムPCRシステムが、好ましい方法である。特に好ましいのは、ABI Prism Sequence Detection Systems、TaqMan(登録商標)及びSmartCycler(登録商標)システムである。最も好ましいのはABI Prism Sequence Detection Systemsである。異なる蛍光色素及び非蛍光クエンチャーを、システムに用いられるリアルタイムPCRに応じて、例えばそれぞれの前記プローブと増幅前にカップリングできる。例えば、FAM(6-カルボキシフルオレセイン)、HEX(6-カルボキシ-2',4,4',5',7,7'-ヘキサクロロフルオレセイン)、TET(6-カルボキシ-4,7,2',7'-テトラクロロ-フルオレセイン)、JOE(6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシ フルオレセイン)又はTexas-Red(登録商標)等の蛍光色素をプローブの5'-末端にカップリングし、TAMRA(6-carboxy-N,N,N',N'-テトラメチルロダミン)等の蛍光クエンチャー又はDABCYL(4-((4-(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸)等の非蛍光クエンチャーをプローブの3'-末端にカップリングすることができる。リアルタイムPCRが用いられる場合、通常増幅された標的DNA配列のサイクル閾値(Ct)が検出され、ここで、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列について得られたCtと、mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列について得られたCtとの差が、MRSAの存在及び量を示す。それぞれのDNA標的配列の3例分(triplicates)におけるCt値が、MRSAの存在及び量を決定するのに通常用いられる。
【００４１】
MRSAの存在及び量を示す好ましい条件は、下記全ての要件が満たされた場合である：
1) MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についての最も小さいCt＜40
2) mecA遺伝子以外のMRSAの標的DNA配列についての最も小さいCt＞40
3) MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についてのCtと、mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列についてのCtとの間の差（MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列Ct-mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列Ct)≦0
【００４２】
好ましくはMRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についてのCtと、mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列についてのCtとの間の差は＜0であり、より好ましくは＜0と-1との間であり、特には-0.25と-0.75との間である。
【００４３】
他の全ての条件において、MRSAは不存在である。
【００４４】
通常、対照株からのDNAを特異的プローブ及び/又はプライマーと合わせ、上記のDNA標的配列についてのものと同一の条件下で増幅し、それによりそれぞれのDNA標的配列についてのCtを決定する。対照株としては、例えば、MRSA、MRSE、MSSE、MSSA株、特にATCC33591(MRSA)、ATCC25923(MSSA)、鼻腔拭取物からの臨床的単離物(MRSE)及びATCC12228(MSSE)を用いることができる。
【００４５】
ここで用いられるサイクル閾値(Ct)の用語は、増幅産物の一義的な検出を可能とする、バックグラウンドの標準偏差の6〜12倍、好ましくは8倍として計算される、特定の増幅サイクルを示す。
【００４６】
DNA標的配列についてのCtは、通常、それぞれの蛍光色素についてのバックグラウンドを、3〜18サイクル、好ましくは3〜12サイクルの測定平均蛍光値として決定することにより決められる。バックグラウンドを差し引いた後、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列についてのサイクル閾値を、バックグラウンドの標準偏差の6〜12倍、好ましくは8倍として計算することができる。同様の計算を、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列について行なうことができる。mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSEの標的DNA配列についての閾値を、MRSE対照株から得られたCtと対比することができる。続いてmecA遺伝子のDNA標的配列についての閾値を調整し、それによりmecA遺伝子のDNA標的配列についてのCtを、mecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列についてのCtと同じにすることができる。この調整は、通常、MRSA対照株から得られた、mecA遺伝子の標的DNA配列及びmecA遺伝子の標的DNA配列以外のMRSAの標的DNA配列についてのCtと対比することにより行なわれる。通常、対照株の100pgの総DNAを実行される各増幅に用い、mecA遺伝子の標的DNA配列について、MRSAの標的DNAについて、及びMRSEの標的DNA配列についてのCtを決定する。好ましくは、通常1〜100pg、好ましくは1pgの、mecAの標的DNA配列以外の標的DNA配列、好ましくはATCC25923(MSSA)などのMSSA株からの、MSSAのfemA遺伝子の標的DNA配列を、増幅方法を実行する前に反応緩衝液に添加することにより、内部コントロールを用いる。内部コントロールを用いる場合、MRSAの存在及び量は、通常以下の場合に示される：
【００４７】
1) MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についての最少のCt＜40
2) mecA遺伝子以外のMRSAの標的DNA配列についての最少のCt＜40
3) MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についてのCtと、mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列についてのCtとの間の差(MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列Ct - mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列Ct)＜0
【００４８】
他の全ての条件において、MRSAは不存在である。内部コントロールが用いられる場合、MRSAの存在及び量は、好ましくは、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についてのCtと、mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列についてのCtとの差(MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列Ct - mecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列Ct)が＜0及び-1の間、より好ましくは -0.25〜-0.75の間である場合に示される。したがって、内部コントロールの追加は、MRSAの存在及び量を示すための、ただ2つのCt、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列についてのCt、及びmecA遺伝子以外のMRSEの標的DNA配列についてのCtのみでの決定を可能とする。mecA遺伝子以外のMRSAの標的DNA配列についてのCtは追加的に決定することができ、実行が有効なものであることを見るために＜40とする必要がある。
【００４９】
本発明のさらなる目的は、MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプライマー及び/又はプローブであって、配列番号1及び2の配列を含むプライマー及び配列番号3の配列を含むプローブ、それらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部並びにそれらの変異物から選択されるもの；MRSAのfemA遺伝子標的DNA配列に特異的なプライマー及び/又はプローブであって、配列番号4及び5の配列を含むプライマー及び配列番号6の配列を含むプローブ、及び配列番号10及び11の配列を含むプライマー及び配列番号12の配列を含むプローブ、それらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、さらに好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部並びにそれらの変異物から選択されるもの；及びMRSEのfemA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプライマー及び/又はプローブであって配列番号7及び8の配列を含むプライマー及び配列番号9の配列を含むプローブ及び配列番号13及び14の配列を含むプライマー及び配列番号15の配列を含むプローブ、それらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部並びにそれらの変異物から選択されるものである。
【００５０】
さらなる本発明の目的は、標本中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出のための診断キットであって、配列番号1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14及び15のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、それらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長であるそれらの一部、並びにそれらの変異物のいずれかの適切な組み合わせを含み、さらに上記抗タンパクA抗体を含むものである。好ましくは、本キットは、上記抗タンパクA抗体に加えてガラスビーズを含む。
【実施例】
【００５１】
実施例 1
プライマー及びプローブの選択及び合成
MRSAのmecA遺伝子の、MRSAのfemA遺伝子の、及びMRSEのfemA遺伝子の標的DNA配列を、Genbank配列データベースから選択した。MRSEのfemA遺伝子(femA-SE、Genbank配列U23713より)及びMRSAのfemA遺伝子(femA-SA、Genbank配列X17688より)のGenbank配列は、"Clustal"整列法(Baylor College of Medicine)を用いて整列され、最も乏しいレベルの相同性を示した領域を検出した。これらの部分配列に限定されたプライマー及びプローブの研究は、"Primer Express"(Taqman(登録商標)の適用のために開発されたPerkin Elmerソフトウェア)を用いて行なわれた。プローブ及びプライマーは、短いPCRフラグメント(およそ100±50ヌクレオチド)を生成することを目論み設計された。femA-SA及びfemA-SEの標的DNA配列に特異的なプローブ及びプライマーは、femA-SA及びfemA-SEの配列を区別するための、少なくとも＞3ミスマッチを含むヌクレオチドから構成されるよう設計された。
【００５２】
対照株ATCC25923(MSSA)及びATCC12228(MSSE)の純粋なDNA調製物は、選択されたプライマー/プローブの特異性をテストすることを可能とした。記載されたプローブ及び/又はプライマーを用いた、Taqman(登録商標)増幅アッセイにおいて、交差反応は何も記録されなかった。配列番号4、5及び6は、femA-SAのヌクレオチド651〜788の領域を増幅した。配列番号7、8及び9は、femA-SEのヌクレオチド1403から1547の領域を増幅した。配列番号10、11及び12は、femA-SAのヌクレオチド1600〜1694の領域を増幅した。配列番号13、14及び15は、femA-SEのヌクレオチド1315〜1414の領域を増幅した。
【００５３】
mecA遺伝子の増幅された領域は、321〜419であった(mecA、Genbank配列Y14051より)。mecAの既知の配列にもとづくと、この領域は黄色ブドウ球菌(Y14051)及びスタフィロコッカス・エピデルミディス(Genbank配列X52592)において高度に保存される。
【００５４】
全てのヌクレオチドは、Expedite(商標)自動合成機を用いて合成され、Eurogentec(Seraing, Belgium)により蛍光的にラベルされた。精製技術は、HPLCを用いて得られるものと同等もしくはそれ以上のものが得られる、内的に開発された(Eurogentec)クロマトグラフィーシステムに基づいた。全てのヌクレオチド(OliGold、商標)は凍結乾燥して送達され、保護を外され、逆相クロマトグラフィーにより精製された。塩、アンモニウム及び酸残基の不存在もまたチェックされた。オリゴヌクレオチド合成について用いられた全ての試薬は、Glen Researchカタログに記載される通りに品質管理された。用いられた色素FAM,TET,HEX,JOE又はTexasRed(登録商標)(プローブの5'末端に結合)及びクエンチャーTAMRA又はDABCYL(3'末端に結合)は、適切なホスホールアミダイト又はスクシンイミジルエステル誘導体を用いてカップリングされる(FAM：6-カルボキシフルオレセイン、TAMRA：6-カルボキシ-N,N,N',N'-テトラメチルロダミン、HEX：6-カルボキシ-2',4,4',5',7,7'-ヘキサクロロフルオレセイン、TET：6-カルボキシ-4,7,2',7'-テトラクロロ-フルオレセイン、JOE：6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン、DABCYL：4-((4-(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸、又はTexas Red(登録商標))。
【００５５】
プライマー及びプローブは、自己ハイブリダイゼーション又は異なるプライマ−及び/又はプローブ間のハイブリダイゼーション、ループ形成および偽プライミング部位を避けるため、それら同士、及び他のプライマー及びプローブのセット(マルチプレキシング(multiplexing))と相互にコンパチブルであるかどうかテストされた。プライマー及びプローブは続いて、それらの感受性及び特異性を評価するため、対にしてテストされた。それらは続いて、異なる濃度(50〜900nM)で組み合わされ、最適な反応条件が決定された。
【００５６】
実施例 2
試料の前処理
鼻腔/鼠径の拭取物に含まれていた試料を集め、場合によっては各患者について、CS培地(コリスチン及び2.5%NaClを含む脳-心臓浸出液)に懸濁することによりプールした。事前の研究は、塩に富むこの細菌培地、殺菌及び栄養剤は、以下の工程に影響せず、生理食塩水(0.9%NaCl)と同等にふるまうことを示していた。続いてこれらの試料(1ml)に、50μlの20%ヒト血清アルブミン(注射可能グレード、スイス赤十字より)を加えた。試料の前処理は、約5分を必要とした。
【００５７】
試料の濃縮
続いて、スタフィロコッカスタンパクAに対して惹起されたマウス ビオチニル化モノクローナル抗体(Sigma) 1.5μlを、全ての試料に添加し、さらに、ロータリーシェーカー上、室温条件で45分間インキュベートした。続いて試料を10分間5000gで遠心した。上清を除いてから1%ヒト血清アルブミンを含む200μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS-HSA)を添加した。試料を10μlのストレプトアビジン被覆磁石ビーズ(径1μm、Merck)と混合し、ロータリーシェーカー上、周囲条件下で45分間インキュベートした。試料を続いて96ウェルプレートに移し、磁気ホルダー上に5分間保持した(Milian)。上清を除き、常磁性ビーズをPBS-HSAで2回洗浄した。試料の濃縮は、約95分を要した。
【００５８】
細菌の溶解及び DNA のリリース
続いて常磁性ビーズを96ウェルプレート中400μlのカオトロピック緩衝液(QiagenのキットQIampからのATL緩衝液)に懸濁し、清浄なエッペンドルフチューブに移した。100mgのガラスビーズ(径100〜200μm、Schieritz and Hauenstein AG、CH-4144 Arlesheim)を添加し、細菌を、ミキサー装置(Mixer Mill、Qiagen)で、各45秒の均質化サイクル2回で溶菌させた。5000gで10分遠心後、液相を清浄なチューブに入れ、200μlの室温の純粋なエタノールと混合した。DNAをQIampカラム(Qiagen)に固定化し、製造元が記述する通りに洗浄し、100μlの純粋に溶出させた。抽出物を、続いてエバポレーター(UniVapo 100H、UniEquip)で1時間乾燥させ、20μlの純粋中に再懸濁した。細菌の溶解及びDNAのリリースには、約30分を要した。
【００５９】
リアルタイム PCR による核酸の検出と分析
分析を確固たるものとするため、リリースされたDNAを含有する各試料は、3例分に分けて分析された。検出及び分析は、約150分を要した。TaqMan(商標)システム(Perkin Elmer)と、Hot GoldStar Taq DNAポリメラーゼ(Eurogentec)とを、試料の増幅に用いた。
【００６０】
A.増幅されたターゲット
【００６１】
【表１】
順行プライマーA1は配列番号1に対応する。逆行プライマーB1は配列番号2に対応する。プローブC1は配列番号3に対応する。順行プライマーA2は配列番号4に対応する。逆行プライマーB2は配列番号5に対応する。プローブC2は配列番号6に対応する。順行プライマーA3は配列番号7に対応する。逆行プライマーB3は配列番号8に対応する。プローブC3は配列番号9に対応する。
【００６３】
PCR混合物の終体積は25μlであり、下記のものを含んでいた：
・反応緩衝液2X：12.5μl(Eurogentecにより市販)
・A1：75nM、B1：75nM及びC1：100nM
・A2：100nM、B2：100nM及びC2：100nM
・A3：100nM、B3：100nM及びC3：100nM
・試料6μl、増幅の実行は即座に行なわれた。
【００６４】
プローブにリンクした蛍光色素は下記のものであった：
C1(mecA) 5'-HEX及び3'-TAMRA
C2(femA-SA) 5'-FAM及び3'-TAMRA
C3(femA-SE) 5'-TET及び3'-TAMRA
【００６５】
B.増幅条件
アッセイは、(特異性を損なわずに)感受性を増加させるために50サイクルを用いた点を除き、Applied Biosystemsの仕様に従って進められた。
【００６６】
インキュベーション1 →2分50℃
インキュベーション2 →10分95℃
インキュベーション3 →15秒95℃
インキュベーション4 →1分60℃
(3及び4を50回反復)
【００６７】
C.分析
得られたデータを目視で見たのち、各蛍光リポーターのバックグラウンドを、サイクル3〜12の間に測定された平均蛍光値として決定した。バックグラウンドを差し引いた後、femA-SAについての閾値を、バックグラウンドの標準偏差の6〜12倍(好ましくは8倍)として計算した。同様の計算を、femA-SEについて行なった。femA-SEについてのCtを、対照MRSE株(鼻腔拭取物から単離)からの100pgDNA/ウェルを用いて、A及びBで記載したのと同じ条件で決定した。mecAについての閾値を、mecAについてのCt=femA-SAについてのCtとなるよう調整した。この決定は、対照MRSA株(ATCC 33591)からの100pgDNA/ウェルを用いて、A及びBで記載したのと同じ条件で行なった。femA-SA、mecA及びfemA-SEについてのスクリーンショットから、各DNA標的配列についての3例分のうちの最少のCtを決定した。下記全ての条件が満たされた場合にMRSAが存在した：
【００６８】
1) mecAについての最少のCt＜40
2) femA-SAについての最少のCt＜40
3) mecAについてのCt − femA-SEについてのCt≦0
【００６９】
全ての他の条件においてMRSAは不存在であった。
【００７０】
実施例 3
細菌溶解及び DNA リリースの変法
実施例1の細菌溶解及びDNAのリリースを、下記の通り変更して行なった：
a) 細菌溶解を、0.9%塩化ナトリウム(NaCl)溶液中のガラスビーズを用いて行なった。溶菌後、上清を捨て、ビーズを200〜400μlの純粋に懸濁した。激しく撹拌した後、溶出したDNA(ここでは液相中)を、蒸発により濃縮し、20μlの水に溶解し、Taqman(登録商標)増幅アッセイに直接用いた。
b) 0.9%NaClの存在下での細菌溶解後、ビーズを同一の溶液で2回洗浄し、続いて100μlの生理食塩水に懸濁した。ビーズ懸濁液の6μlのアリコートを、Taqman(登録商標)増幅アッセイに直接導入した。
c) 細菌溶解を、200〜400μlの純粋中にガラスビーズ懸濁して行なった。激しく撹拌した後、溶出したDNA(ここでは液相中)を蒸発により濃縮し、20μlの水に溶解し、Taqman(登録商標)増幅アッセイに直接用いた。
【００７１】
実施例 4
感受性の評価
既知量のMRSA及びMRSEを加えた試料を用いた実験では、100%の特異性及び1ゲノムコピーの感受性が明らかになった。10ngから0.1〜0.2fg/反応(1ゲノムコピーは、1.65x10-15gに相当)の、幅広い範囲の添加量についてテストした。
【００７２】
実施例 5
分子検出と、標準的な培養に基づいた方法との対比
分子検出を、標準的な培養に基づいた方法(Laboratoire Central de Microbiologie, LCB, Geneva University Hospitalにより行なわれた)と対比する、中規模スケールの研究(38試料が同時に処理された)において、全ての陽性の培養物のケースの検出ができた(11/11)。培養によっては陰性であった2つの試料が、実施例1の分子技術を用いて陽性であることが分かった。これら2患者について、LCBはMRSAの存在を他の採取部位において見出した。
【００７３】
実施例 6
A.MRSA 及び MRSE を含有する混合試料の、常磁体による濃縮
試料に、異なる比率のMRSA及びMRSE(1/1〜1/1000)を加えた。試料を、直接溶菌(手順a)するか、抗タンパクA抗体及び常磁性ビーズを用いた実施例1記載の方法で濃縮し(手順b)、実施例2に記載される通りの増幅に供した。
【００７４】
得られた結果は、1/1比について、手順bの追加工程にも拘らず、Ctは濃縮なし(手順a)の1〜2サイクル増加したことを示した。このことは、手順aに対する手順bの増加した感受性を示唆する。1/5比について、femA-SAについてのCtは、濃縮なし(手順a)の2〜2.5サイクル増加した。この増加した感受性は、MRSA/MRSE比が減少した際により顕著であった。1/5より低い比において、手順aを用いたら、試験された範囲の添加細菌ではfemA-SAシグナルは何も記録されなかった。手順bを用いたら、femA-SEについての有意なシグナルは、1/5より低い比率の場合でさえ、何も記録されなかった。このことは、大過剰のMRSEの存在にあってさえも良好な濃縮を示す。
【００７５】
B. シュードモナス・アエルギノーサ存在下での MRSA 及び MRSE の検出
この実験は、臨床診断において一般的に見られる、患者がシュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)に感染した状況に基づく。シュードモナス・アエルギノーサがAに示された比率で添加されたどの場合も、手順bを使用しない限りはfemA SAシグナルが何も記録できなかった。
【００７６】
手順bを用いた全ての条件について、femA SAのCt及びmecAのCtは、殆ど同じであり、その解釈は直接的(straightforward)なものであり、正確で感受性の高い検出のためにこの工程の絶対的必要性を裏付けた。
【００７７】
実施例 7
試料がPBSに懸濁され、続いて50μlの20%ヒト血清アルブミン(注射可能グレード、スイス赤十字より)が補われた点を除き、試料の前処理及び濃縮を、実施例2に記載される通りに行った。濃縮された試料を50μlの純水に再懸濁してからガラスビーズを添加した点を除き、細菌溶解及びDNAリリースを実施例3a)に記載される通りに行った。せん断力による破壊の後、液相に含まれるDNA(10μl)を、増幅混合物に直接添加し、Taqman(登録商標)増幅アッセイに供した。
【００７８】
リアルタイム PCR による核酸の検出及び分析
分析を確固たるものとするため、リリースされたDNAを含有する各試料は、3例分に分けて分析された。検出及び分析は、約150分を要した。ABI Prism Sequence Detection System cycler (Applied Biosystems)と、Hot GoldStar Taq DNAポリメラーゼ(Eurogentec)とを、試料の増幅に用いた。
【００７９】
A.増幅されたターゲット
【表２】
順行プライマーA1は配列番号1に対応する。逆行プライマーB1は配列番号2に対応する。プローブC1は配列番号3に対応する。順行プライマーA4は配列番号10に対応する。逆行プライマーB4は配列番号11に対応する。プローブC4は配列番号12に対応する。順行プライマーA5は配列番号13に対応する。逆行プライマーB5は配列番号14に対応する。プローブC5は配列番号15に対応する。
【００８１】
PCR混合物の終体積は25μlであり、以下の化合物を含んでいた：
・反応緩衝液2X：12.5μl(Eurogentecにより市販)
・A1：100nM、B1：100nM及びC1：75nM
・A4：50nM、B4：50nM及びC4：50nM
・A5：400nM、B5：400nM及びC5：100nM
・試料10μl、増幅の実行は即座に行なわれた。
【００８２】
プローブに結合した蛍光色素は以下のものである：
C1(mecA) 5'-JOE及び3'-DABCYL
C4(femA-SA) 5'-FAM及び3'-DABCYL
C5(femA-SE) 5'-Texas Red(登録商標)及び3'-DABCYL
【００８３】
B. 増幅条件
アッセイは、(特異性を損なわずに)感受性を増加させるために50サイクルを用いた点を除き、Applied Biosystemsの仕様に従って進められた。
【００８４】
インキュベーション1 →2分50℃
インキュベーション2 →10分95℃
インキュベーション3 →15秒95℃
インキュベーション4 →1分60℃
(3及び4を50回反復)
【００８５】
C.分析
得られたデータを目視で見たのち、各蛍光リポーターのバックグラウンドを、サイクル3〜12の間に測定された平均蛍光値として決定した。バックグラウンドを差し引いた後、各蛍光リポーターについての閾値を、バックグラウンドの標準偏差の6〜12倍(好ましくは8倍)として計算した。同様の計算を、femA-SEについて行なった。femA-SEについてのCtを、対照MRSE株(鼻腔拭取物から単離)からの100pgDNA/ウェルを用いて、A及びBで記載したのと同じ条件で決定した。mecAについての閾値を、mecAについてのCt=femA-SAについてのCtとなるよう調整した。この決定は、対照MRSA株(ATCC 33591)からの100pgDNA/ウェルを用いて、A及びBで記載したのと同じ条件で行なった。femA-SA、mecA及びfemA-SEについてのスクリーンショットから、各DNA標的配列についての3例分のうちの最少のCtを決定した。下記全ての条件が満たされた場合にMRSAが存在した：
【００８６】
1) mecAについての最少のCt＜40
2) femA-SAについての最少のCt＜40
3) mecAについてのCt - femA-SEについてのCt＜0
【００８７】
全ての他の条件においてMRSAは不存在であった。
【００８８】
実施例 8
対比のため、実施例7で用いたのと同一の試料を、実施例2のセクションA(表1)のプライマー及びプローブ、ならびに実施例7セクションA(表2)のプライマー及びプローブを用いて、平行して分析した。
【００８９】
【表３】
【表４】
実施例7で用いられたプライマー及びプローブは、同様の解釈を提供したが、増加した感受性を与えた。即ち、測定した3つの標的遺伝子において、Ct値がより小さかった。
【００９２】
実施例 9
実施例9は、内部コントロールとしてMSSA株ATCC25923から抽出した1pgのゲノムDNAを反応緩衝液に添加した点を除いて、実施例7と同様に行った。増幅後、mecAについて得られたCt及びfemA-SEについてのCtに基づいて分析を行った。100pgから1pgにわたる異なる添加量をテストし、この濃度範囲での決定の直線性を確認し、femA-SAについてのCtは24及び30〜31であった。ABI Prism Sequence Detection Systems (Applied Biosystems)又はSmart Cycler (Cepheid)の両方において検出及び分析を行った。両方が、同様の直線的な結果を与えた。mecAについてのCt - femA-SAについてのCtの差が＜０である場合に、MRSAの存在及び量が示された。他の全ての条件において、MRSAは不存在であった。1pgの、MSSAからの添加ゲノムDNAを利用し、femA-SAについてのCtを測定し、増幅が適切に働いていることを確認した。
Claims (12)
- 標本からのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)の検出定量方法であって
a)標本を抗タンパクA抗体と接触させ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌を吸着させる工程、
b)標本から、前記メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌を吸着した前記抗体を分離する工程、
c)前記抗体に吸着されたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌を溶菌して、それらのDNAをリリースする工程、
d)リリースされたDNAを(i)メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミス(Staphylococcus epidermis)のmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー、(ii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマー、及び(iii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、メチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーと合わせる工程であって、ここでメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の及びメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスの標的DNA配列が相同的でない工程、
e)リリースDNA及び特異的プローブ及び/又はプライマーを合わせたものを、前記標的DNA配列の増幅を可能とする条件に供する工程、
f)増幅された標的DNAの存在及び量を、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の存在及び量を示すものとして検出する工程
を含む方法。 - 前記メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌が、せん断力を適用することにより溶菌される請求項1記載の方法。
- 前記リリースされたDNAが(i)メチシリン耐性黄色ブドウ球菌及び/又はメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプローブ及びプライマー、(ii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の標的DNA配列に特異的なプローブ及びプライマー、及び(iii)mecA遺伝子の標的DNA配列以外の、メチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスの標的DNA配列に特異的なプローブ及びプライマー、と合わせられる請求項1又は2記載の方法。
- メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の及び/又はメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的な前記プローブ及び/又はプライマーが、配列番号１及び2の配列を含むプライマー及び配列番号3の配列を含むプローブ、これらと相補的な配列、少なくとも10ヌクレオチド長のこれらの一部、並びにこれらの変異物から選択される請求項1〜3のいずれかの方法。
- mecA遺伝子の標的DNA配列以外のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーが、プローブ及び/又はプライマー、これらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長のこれらの一部、並びにこれらの変異物であって、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌のfemA遺伝子の標的DNA配列に特異的なものである請求項1〜4のいずれかの方法。
- mecA遺伝子の標的DNA配列以外のメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスの標的DNA配列に特異的なプローブ及び/又はプライマーが、プローブ及び/又はプライマー、これらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長のこれらの一部、並びにこれらの変異物であって、メチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスのfemA遺伝子の標的DNA配列に特異的なものである請求項1〜5のいずれかの方法。
- 増幅された標的DNA配列の存在及び量が、リアルタイムPCRにより検出される請求項1〜6のいずれかの方法。
- 増幅された標的DNA配列のサイクル閾値が検出され、それによりMRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列について得られたサイクル閾値と、mecA遺伝子以外のメチシリン耐性スタフィロコッカス・エピデルミスの標的DNA配列について得られたサイクル閾値との差が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の存在及び量を示す、請求項7の方法。
- MRSA及び/又はMRSEのmecA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプライマー及び/又はプローブであって、配列番号1及び2の配列を含むプライマー及び配列番号3の配列を含むプローブ、これらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長のこれらの一部、並びにこれらの変異物から選択されるプライマー及び/又はプローブ。
- MRSAのfemA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプライマー及び/又はプローブであって、配列番号4及び5の配列を含むプライマー及び配列番号6の配列を含むプローブ、及び配列番号10及び11の配列を含むプライマー及び配列番号12の配列を含むプローブ、これらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長のこれらの一部、並びにこれらの変異物から選択されるプライマー及び/又はプローブ。
- MRSEのfemA遺伝子の標的DNA配列に特異的なプライマー及び/又はプローブであって、配列番号7及び8の配列を含むプライマー及び配列番号9の配列を含むプローブ及び配列番号13及び14の配列を含むプライマー及び配列番号15のプローブ、これらと相補的な配列、少なくとも10、好ましくは15、より好ましくは20ヌクレオチド長のこれらの一部、並びにこれらの変異物から選択されるプライマー及び/又はプローブ。
- 標本中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するための診断キットであって、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14及び15のいずれかのヌクレオチド配列を有する核酸、これらと相補的な配列、少なくとも10ヌクレオチド長のこれらの一部、並びにこれらの変異物のいずれかの適切な組み合わせを含み、さらに抗タンパクA抗体を含むキット。
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