CN106916812A - 一种磁珠法琼脂糖凝胶dna提取试剂盒及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁珠法琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒，以及其高通量快速提取琼脂糖凝胶DNA的方法。试剂盒，包括：溶胶结合液、磁珠分散液、清洗液Ⅰ、清洗液Ⅱ和洗脱液。本申请创新性的配合96孔板、96孔板用磁板架、96位磁棒爪、涡旋混合器共同完成，使得从琼脂糖凝胶中提取DNA的工作可以直接在96孔板中进行，实验过程中各缓冲试液的加液可以使用多通道自动加液器进行快速操作，一块96孔板可进行96份样品的DNA提取工作，使用该试剂盒以及高通量方法，单个实验人员同时操作6块96孔板的情况下，仅需要约70~80min，即可完成576个样品的DNA提取工作。

Description

一种磁珠法琼脂糖凝胶 DNA 提取试剂盒及其提取方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种磁珠法琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒，以及其高通量快速提取琼脂糖凝胶DNA的方法。

背景技术

在分子生物学实验中，从电泳后琼脂糖凝胶中回收、纯化DNA片段是最常用的技术之一，已经有近40年的发展历史。早期从琼脂糖凝胶中回收DNA的方法有低熔点琼脂糖凝胶法、透析带电洗脱法、DEAE纤维素膜纸片法等，这些方法都需要用到酚类、氯仿等有机试剂进行抽提，然后用乙醇沉淀，操作过程往往耗时较长，1份样品花费的时间就需要近2个小时，此类方法当前已很少有人使用。后来，柱式法DNA回收试剂盒的发展大大提高了DNA回收工作的便利性。其主要原理为利用包埋有纯化填料的纯化柱对DNA分子的吸附作用，将DNA分子分离，再经离心、洗涤、洗脱等步骤后实现对DNA的回收工作，操作速度得到了大大提升。当前，柱式法回收DNA应用广泛，但也有其自身缺陷，比如柱式法不利于回收大片段DNA，大片段DNA容易被机械剪切力破坏，柱式法中频繁的离心操作难以避免对大片段DNA的破坏作用；另外，随着基因测序产业的蓬勃发展，柱式法的操作速度又一次受到挑战，虽然柱式法操作效率较早期的DNA提取方法已经有了大大提高，但依然需要在ep管中进行操作，柱子需要频繁转出和转入ep管、以及操作过程中需配合大量的离心工作，导致操作时间随之增加，针对一个或几个样品其操作效率可以接受，但针对大规模高通量DNA提取工作依然不理想。当前，随着基因测序领域的快速发展，单个项目需要处理的DNA样品数量就可以达到几万、几十万甚至上百万个，柱式法DNA提取方法已经逐渐难以满足日益庞大的样品量对操作速度的迫切需求。

近年来，因操作的便利性，磁珠法应用在琼脂糖凝胶DNA提取中越来越受到关注。其原理为磁珠表面修饰有特殊化学基团，在不同条件下可以对DNA分子形成特异性吸附或者解吸附作用，再加上磁珠本身拥有顺磁性，在外加磁场作用下可方便、快捷的实现磁珠与目标操作母液的分离。专利CN200910022810公开了一种金磁微粒用于纯化回收琼脂糖凝胶中DNA的方法，方法提到将切胶后胶块放入ep管中，加入液溶胶后，再依次加入PEG8000和300~800ug金磁微粒进行DNA吸附，再经清洗和洗脱后获得目标DNA。该金磁微粒用于纯化回收琼脂糖凝胶中DNA的方法操作简便，其不足之处在于整个操作需在ep管中进行，当样品量增多时，则纯化耗时增长，实验人员的工作量明显增加，实验过程中人为误差也随之增大。

发明内容

本发明的目的之一在于提供了一种磁珠法琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒。该试剂盒可以从用TAE或TBE制成的琼脂糖凝胶中回收80bp及以上的DNA片段，回收效率高达85%以上，并且所得DNA产物纯度优良，可以直接应用于测序、连接、酶切、标记、PCR扩增等下游分子生物学实验。

本发明的目的之二在于提供了一种磁珠法琼脂糖凝胶DNA高通量快速提取的方法。配合96孔板、96孔板用磁板架、96位磁棒爪、涡旋混合器、真空干燥箱等常规设备快速完成。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种磁珠法琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒，包括：溶胶结合液、磁珠分散液、清洗液Ⅰ、清洗液Ⅱ和洗脱液；

所述溶胶结合液由NaI或异硫酸氰胍，与醋酸钠或醋酸钾组成，pH值为5.1；

所述磁珠分散液的磁珠采用内核为超顺磁性四氧化三铁，表面包覆有硅羟基，直径为200~800nm；

所述清洗液Ⅰ包括Tris-HCl、EDTA和异丙醇；

所述清洗液Ⅱ为乙醇溶液；

所述洗脱液为Tris碱或去离子水；

所述溶胶结合液中NaI或异硫酸氰胍的浓度为5~7mol/L，醋酸钠或醋酸钾的浓度为0.02~0.05 mol/L。优选的由6 mol/L的NaI或者异硫酸氰胍、0.03 mol/L的醋酸钠组成；

所述磁珠分散液浓度为20~40μg/uL，溶剂为蒸馏水。优选的浓度为20μg/uL，直径为500~550nm；

所述清洗液Ⅰ中Tris-HCl的浓度为30~100m mol/L的，EDTA的浓度为6~20mmol/L，异丙醇为45%~65%。优选的由40m mol/L的Tris-HCl、10m mol/L的EDTA和50% (v/v)的异丙醇组成；

所述清洗液Ⅱ，乙醇溶液的浓度为70%~80% (v/v)。优选浓度为80%的乙醇溶液(v/v)；

所述洗脱液，Tris碱的浓度为0.9~1.1mM。优选1.0mM的Tris碱溶液，pH值为8.0。

上述试剂盒高通量快速提取DNA的方法，包括以下步骤：

步骤一：在紫外灯下，将电泳后的琼脂糖凝胶中的DNA条带切下，胶块质量小于400mg，将胶块放入96孔板样品孔中；

步骤二：用多通道自动加液器向96孔板样品孔中分别加入结合液，后将96孔板置于65℃水浴中温热至胶块完全溶化；

步骤三：取出96孔板，用多通道自动加液器，向96孔板中分别加入磁珠分散液，之后将96孔板置于涡旋混合仪上900rpm振荡5分钟后，将96孔板放置到96孔板用磁板架上静置20秒，保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣弃去上清液，然后呈倒扣状置于吸水纸上，彻底去除上清液；

步骤四：将96孔板从磁板底座上取下，用多通道自动加液器向样品孔中分别加入清洗液Ⅰ，之后将96孔板置于涡旋混合仪上900rpm振荡25秒，将96孔板重新放置于磁板架上静置20秒，保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣弃去上清液，然后呈倒扣状置于吸水纸上，彻底弃去上清液；用清洗液Ⅱ重复以上清洗操作两次；

步骤五：将清洗完毕的96孔板连同磁板架一起置于45℃真空烘箱中真空干燥8分钟，取出96孔板，用多通道自动加液器向样品孔中分别加入洗脱液，将96孔板置于涡旋混合仪上900rpm振荡1分钟；

步骤六：将96孔板从涡旋混合仪上取下，向96孔板中准确插入已经装入磁爪套的96位磁棒爪，静置20秒，从96孔板中移出磁棒爪，弃磁珠，获得目标DNA产物于澄清洗脱液中。

96孔板为市售2.2mL的标准96孔圆孔板或圆底方孔板； 96孔板用磁板架、96位磁棒爪为配套96孔板使用的磁性分离装置，对超顺磁性纳米材料通过外加磁场快速吸附聚集；涡旋混合器为市售96孔PCR板用高速涡旋混合器，涡旋速率大于1500转/分。

96孔板用磁板架，上面安装有按照4X6排列的24根3mmX3mm的磁棒，磁棒高度为6~8mm，从背面插入到96孔板后，可在20秒内将对样品孔中磁珠实现磁场吸附聚集，所述96位磁棒爪，配合磁棒套插入到96孔板后，可在20秒内对样品孔中磁珠进行吸附，并将磁珠快速转移出洗脱液。

本申请创新性的配合96孔板、96孔板用磁板架、96位磁棒爪、涡旋混合器共同完成，使得从琼脂糖凝胶中提取DNA的工作可以直接在96孔板中进行，实验过程中各缓冲试液的加液可以使用多通道自动加液器进行快速操作，一块96孔板可进行96份样品的DNA提取工作，使用该试剂盒以及高通量方法，单个实验人员同时操作6块96孔板的情况下，仅需要约70~80min，即可完成576个样品的DNA提取工作。

本发明的有益效果：

（1）DNA提取回收率高，可达85%以上。该方法基于磁珠法开发，磁珠表面修饰有可以对DNA进行特异性吸附的化学基团，在高盐、低pH值下可以实现快速吸附，在低盐、高pH值下又可以快速解离，DNA提取回收率高，可达85%以上。

（2）操作简洁。在配合96孔板用磁板架和96位磁棒爪的使用，使得从琼脂糖凝胶提取DNA的工作可以直接在96孔板中进行，不需要样品的转移，96孔板每个样品孔可以进行一份DNA样品的提取实验，一块板可以同时进行96个DNA样品的提取操作，方便了电动移液枪的自动加液。

（3）可以高通量、大规模提取，工作效率大幅提高。该试剂盒配合高通量操作方法，操作简洁高效，单个实验人员同时操作6块96孔板的情况下，仅需要约70~80min，即可完成576个样品的DNA提取工作，且出错率极地。

（4）该方法所需实验器材简单，成本低，有明显经济效果。

对比使用当前应用最广泛的柱式法进行576个DNA样品的提取实验，或者配合甩板离心机等昂贵设备，依然需要大于4.5小时方可完成；或者使用柱式法，操作人员进行如此数量样品量操作，需花费大量时间用于柱子转入和转出ep管的操作，工作将非常繁忙，容易产生误差。因此，该发明提供的磁珠法琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒及高通量快速提取方法，工作效率得到了大幅度提升，非常适合进行高通量实验。

附图说明

图1是实施例1中从琼脂糖凝胶中提取600bp DNA产物的电泳胶图（A1-A2：Axygen柱式法对照；Y1-Y4：4份平行测试样本）。

图2是实施例2中从琼脂糖凝胶中高通量提取96份600bp DNA产物的电泳胶图。

具体实施方式

基于上述试剂盒中各溶液优选的参数，结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：磁珠法琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒：

磁珠法琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒包括：

溶胶结合液：pH值为5.2、6M的NaI、和0.03M的醋酸钠的混合溶液。具体配制方法：称取90g碘化钠和0.25g醋酸钠，加入足够蒸馏水进行充分溶解，继续加入蒸馏水定容到100mL，用冰醋酸调节pH值至5.2。

磁珠分散液：浓度为20μg/uL的磁珠混悬液，磁珠内核为四氧化三铁(Fe₃O₄)，表面包覆了SiO₂层。具体配制方法：称取2g磁珠，加入到100mL蒸馏水中，超声分散均匀。

清洗液Ⅰ：40mM的Tris-HCl、10mM的EDTA和50% (v/v)的异丙醇水溶液。具体配制方法：称取0.63g Tris-HCl和0.29g EDTA，加入足够50% (v/v)的异丙醇水溶液进行充分溶解，继续加入50% (v/v)的异丙醇水溶液定容到100mL。

清洗液Ⅱ：80% (v/v)的乙醇溶液。

洗脱液：1mM的Tris碱水溶液，pH值为8.0。具体配制方法：称取12mg Tris碱，加入足够蒸馏水进行充分溶解，继续加入蒸馏水定容到100mL，用浓盐酸调节pH值至8.0。

600bp DNA片段的琼脂糖凝胶DNA提取，并与Axygen柱式法对比。

步骤一：样品准备

取6uL浓度为50ng/uL的600bp DNA片段，用1%的琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中进行电泳，电泳完成后，在紫外灯下小心将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，保持胶块重量小于400mg，将胶块分别放入干净的96孔圆孔板中，平行4份样品。

步骤二：溶胶

用移液器向4份样品孔中分别加入500uL结合液，将96孔板置于65℃水浴中8分钟至溶胶完全。

步骤三：磁珠与DNA结合

将96孔板从水浴中取出，向4份样品孔中分别加入50uL磁珠分散液。加毕将96孔板置于涡旋混合仪上，900rpm下振荡5分钟。取下96孔板，放到96孔板用磁板架上，静置20秒。保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣96孔板弃去上清液，然后呈倒扣状放置于吸水纸上片刻，彻底弃去上清液。

步骤三：清洗

将96孔板从磁板架上取下，向4份样品孔中分别加入550uL清洗液Ⅰ，900rpm下涡旋振荡25秒，取下96孔板并装入磁板底座静置20秒。保持96孔板固定于磁板底座上直接倒扣96孔板弃上清液，然后呈倒扣状置于吸水纸上，彻底弃去上清液。

用清洗液Ⅱ重复以上清洗操作两次。

步骤四：洗脱

将弃去清洗液Ⅱ后的96孔板连同磁板架一起置于45℃真空烘箱中干燥8分钟，取出96孔板，用移液器向4份样品孔中分别加入35uL洗脱液，900rpm涡旋震荡1分钟。

步骤五：转移获得DNA产物

将96孔板重新装回磁板底座上，静置约20s，待磁珠完全吸附于96孔板侧壁后，用移液器小心将洗脱液转移至另一洁净96孔板中得目的DNA回收产物，弃去磁珠。

实验同时使用了Axygen柱式法琼脂糖胶DNA回收试剂盒，对相同DNA样品进行了对照实验。

琼脂糖凝胶电泳检测：对所得4份DNA回收产物，分别取2uL上样，进行琼脂糖凝胶电泳，胶图（见图1）显示所获得DNA产物条带清晰完整，平行性好，每份提取的DNA条带亮度与Axygen柱式法结果相当。

OD值检测：使用超微量紫外-可见光分光光度计对4份DNA回收样品进行了OD值检测（见表1）。检测结果显示使用本方法对琼脂糖凝胶电泳后DNA进行提取得到的DNA产物含量高且纯度良好。

表1：实施例1中从琼脂糖凝胶中提取600bp DNA产物的OD值检测结果

（A1、A2：Axygen柱式法对照；Y1-Y4：4份平行测试样本）

样品	A260/230	A260/280	浓度(ng/uL)
				A1	0.24	1.82	7.59
Y1	0.36	1.77	7.42
				Y2	0.42	1.88	7.67
Y3	0.45	1.83	7.78
				Y4	0.27	1.77	7.69
A2	0.20	1.87	7.75

实施例2：对96份600bp DNA片段电泳后的琼脂糖凝胶高通量DNA提取。

使用实施例1 所述试剂盒进行提取。

步骤一：样品准备

分别取96份50ng/uL X 6uL的600bp DNA片段上样，用1%的琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中进行电泳，电泳完成后，在紫外灯下小心将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，保持胶块重量小于400mg，将胶块分别放入干净的96孔圆孔板中，共平行96份样品。

步骤二：溶胶

用多通道自动加液器向96份样品孔中分别加入500uL结合液。将96孔板置于65℃水浴中10分钟。

步骤三：磁珠与DNA结合

将96孔板从水浴中取出，用8道自动加液器向96份样品孔中分别加入50uL磁珠分散液。加毕将96孔板置于涡旋混合仪上，900rpm下振荡5分钟。取下96孔板，放置到96孔板用磁板架上，静置20秒。保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣96孔板弃去上清液，然后呈倒扣状放置于吸水纸上片刻，彻底弃去上清液。

步骤四：清洗

将96孔板从磁板底座上取下，用8通道自动加液器分别向96份样品孔中加入550uL清洗液Ⅰ，900rpm下涡旋振荡25秒，取下96孔板并放到磁板架上静置20秒。保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣96孔板弃去上清液，然后呈倒扣状放置于吸水纸上片刻，彻底弃去上清液。

用清洗液Ⅱ重复以上清洗操作两次。

步骤五：洗脱

将弃去清洗液Ⅱ后的96孔板连同磁板底座一起置于45℃真空烘箱中干燥9分钟，取出96孔板，用8道电动加液器向96份样品孔中分别加入35uL洗脱液，900rpm涡旋震荡1分钟。

步骤六：转移获得DNA产物

将96孔板从涡旋混合仪上取下，向96孔板中准确插入已经装入磁爪套的96位磁棒爪，静置20秒后，从96孔板中移出磁棒爪，弃磁珠，获得目标DNA产物于澄清洗脱液中。

琼脂糖凝胶电泳检测：对所得96份DNA回收产物及回收前样品作为对照，分别取2uL上样，进行琼脂糖凝胶电泳，胶图（见图2）显示所获得DNA产物条带清晰完整，平行性好，回收率在90%左右。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但实施例并不是用来限定本发明，任何熟悉此技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，自当可作各种变化或润饰，但同样在本发明的保护范围之内。因此本发明的保护范围应当以本申请的权利要求保护范围所界定的为准。

Claims (7)

1.一种磁珠法琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒，其特征在于包括：溶胶结合液、磁珠分散液、清洗液Ⅰ、清洗液Ⅱ和洗脱液；

所述溶胶结合液由NaI或异硫酸氰胍，与醋酸钠或醋酸钾组成，pH值为5.1；

所述磁珠分散液的磁珠采用内核为超顺磁性四氧化三铁，表面包覆有硅羟基，直径为200~800nm；

所述清洗液Ⅰ包括Tris-HCl、EDTA和异丙醇；

所述清洗液Ⅱ为乙醇溶液；

所述洗脱液为Tris碱或去离子水。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述溶胶结合液中NaI或异硫酸氰胍的浓度为5~7mol/L，醋酸钠或醋酸钾的浓度为0.02~0.05 mol/L。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述磁珠分散液浓度为20~40μg/uL水溶液。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述清洗液Ⅰ中Tris-HCl的浓度为30~100m mol/L的，EDTA的浓度为6~20mmol/L，异丙醇体积浓度为45%~65% 。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述乙醇溶液的体积浓度为70%~80%。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Tris碱的浓度为0.9~1.1mmol/L。

7.一种根据权利要求1至6任一所述的试剂盒高通量快速提取DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一：在紫外灯下，将电泳后的琼脂糖凝胶中的DNA条带切下，胶块质量小于400mg，将胶块放入96孔板样品孔中；

步骤二：用多通道自动加液器向96孔板样品孔中分别加入结合液，后将96孔板置于65℃水浴中温热至胶块完全溶化；

步骤三：取出96孔板，用多通道自动加液器，向96孔板中分别加入磁珠分散液，之后将96孔板置于涡旋混合仪上900rpm振荡5分钟后，将96孔板放置到96孔板用磁板架上静置20秒，保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣弃去上清液，然后呈倒扣状置于吸水纸上，彻底去除上清液；

步骤四：将96孔板从磁板底座上取下，用多通道自动加液器向样品孔中分别加入清洗液Ⅰ，之后将96孔板置于涡旋混合仪上900rpm振荡25秒，将96孔板重新放置于磁板架上静置20秒，保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣弃去上清液，然后呈倒扣状置于吸水纸上，彻底弃去上清液；用清洗液Ⅱ重复以上清洗操作两次；

步骤五：将清洗完毕的96孔板连同磁板架一起置于45℃真空烘箱中真空干燥8分钟，取出96孔板，用多通道自动加液器向样品孔中分别加入洗脱液，将96孔板置于涡旋混合仪上900rpm振荡1分钟；

步骤六：将96孔板从涡旋混合仪上取下，向96孔板中准确插入已经装入磁爪套的96位磁棒爪，静置20秒，从96孔板中移出磁棒爪，弃磁珠，获得目标DNA产物于澄清洗脱液中。