CN111154847A - 一种基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法 - Google Patents

一种基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，属于核酸测序鉴定方法技术领域。它包括以下步骤：(1)提取样品中的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用16S rDNA序列扩增的通用引物，在PCR反应试剂盒中进行PCR扩增反应；(3)分析PCR扩增产物。本发明提供一种适用范围广、通量高、检出阳性率高而且成本低的细菌基因组粗提方法，用于PCR扩增细菌16S rDNA，然后进行测序、鉴定菌种，整个操作快速、简便，且对设备要求低，可扩增细菌16s rDNA全长序列，能够覆盖革兰氏阳性菌和阴性菌，且鉴定成功率高，并对菌种的量要求不高，此外通量高，可同时处理多达几百个样品。

Description

一种基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法
技术领域
本发明属于核酸测序鉴定方法技术领域，具体地说，涉及一种基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法。
背景技术
16S rDNA鉴定是指用利用细菌16S rDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定，是一种快速获得细菌种属信息的方法。它包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
细菌rRNA(核糖体RNA)按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。16S rDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
目前，《美国药典》(USP 40<1113>)、《欧洲药典》(EP 9.0<5.1.6>)、《日本药典》(JP17<General Information G4>)、《中国药典》(通则9204)中均收载了分子生物学技术用于药品微生物质量控制的相关章节。以16S rRNA核酸测序技术为基础的微生物鉴定方法已经建立，并应用于临床分离菌株的研究，但其用于药品质量控制及药品生产环境中常见污染菌的鉴定还鲜有报道；以16S rRNA核酸测序方法进行微生物鉴定的文献中，所选取的测序靶点和测序引物各异，符合药品质量控制要求的具有鉴定和分类意义的DNA特征序列片段尚不清晰明确；现有研究中的核酸测序结果多数是通过Blast分析法与Genebank数据库中的核酸序列进行比对，对于测序结果的质量核查和Genebank数据库中序列信息的准确性关注度较小，测序结果的判定依据尚不规范统一。
此外，目前市面上已经有很多商业化的试剂盒，一些文献也报道过碱裂解法用于提取细菌的基因组，还有一些实验室广泛使用的水煮法粗提取细菌的基因组用于后续的16S rDNA PCR扩增，测序进行菌种鉴定。具体如下：
1)试剂盒提取细菌基因组的缺点：成本高，通量小，提取时间长；
2)文献中报道的一些碱裂解法提取的细菌基因组PCR扩增的方法，步骤也不够简便，适用范围也具有局限性；
3)常规水煮方法难以有效破坏革兰氏阳性菌细胞壁，使得基因组DNA提取效率极低，无法用于PCR法检测。
发明内容
1、要解决的问题
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种适用范围广、通量高、检出阳性率高而且成本低的细菌基因组粗提方法，用于PCR扩增细菌16S rDNA，然后进行测序、鉴定菌种，整个操作快速、简便，且对设备要求低，可扩增细菌16s rDNA全长序列，能够覆盖革兰氏阳性菌和阴性菌，且鉴定成功率高，并对菌种的量要求不高，此外通量高，可同时处理多达几百个样品。
2、技术方案.
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，
包括以下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用16S rDNA序列扩增的通用引物，在PCR反应试剂盒中进行PCR扩增反应；
(3)分析PCR扩增产物。
上述基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法中，步骤(1)中样品为待鉴定细菌菌株的平板划线菌或者培养物。
上述基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法中，步骤(1)中样品中DNA的提取方法为将平板划线菌或者培养物加入试管中，其中每个试管中加入20uL细胞裂解液振荡混匀，室温下静置10min-30min，接着稀释10倍-50倍，并再次振荡混匀，然后高速离心2min，取离心后的上清液作为待检测DNA模板。
上述基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法中，所述细胞裂解液为氢氧化钠溶液与十二烷基硫酸钠溶液的混合液，其中氢氧化钠溶液的质量浓度为0.1M-0.5M，其中十二烷基硫酸钠溶液的质量百分比浓度为1％-3％。
上述基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法中，步骤(2)中所述通用引物如下：
所述通用引物的上游引物27F如SEQ ID No.1所示，
所述通用引物的下游引物1492R如SEQ ID No.2所示。
上述基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法中，
步骤(2)中PCR扩增反应的反应体系以30uL计为：
Figure BDA0002367199780000031
上述基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法中，
步骤(2)中PCR扩增反应的扩增程序为：
Figure BDA0002367199780000032
重复25个循环；
72℃ 延伸7min；
4℃ 终止反应并保存。
上述基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法中，
步骤(3)中分析PCR扩增产物的方法如下：
(A)取PCR扩增产物，配制琼脂糖凝胶并进行电泳，电泳结束后，使用凝胶成像仪观察，拍照并记录实验结果；
(B)将步骤(A)中电泳后琼脂糖凝胶的核酸扩增产物切下，提取并纯化核酸；
(C)将步骤(B)中纯化后的核酸，采用通用性序列拼接软件，获得拼接序列，随后将拼接序列进行PCR扩增反应，将PCR扩增反应的产物进行测序和序列拼接，获得16S rDNA序列；
(D)将步骤(C)中相应片段的DNA序列导入标准核酸序列数据库进行序列比对，进行细菌菌株的鉴定。
上述基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法中，
步骤(B)中提取并纯化核酸的方法如下：
将切下来的核酸扩增产物加入凝胶回收试剂盒中的溶胶液，水浴完全溶解，加入磁珠吸附核酸片段，再用80％酒精洗涤两次，晾干，收集纯化好的核酸。
上述基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法中，
步骤(C)中PCR扩增反应的扩增程序为：
Figure BDA0002367199780000041
重复30个循环；
12℃ 终止反应并保存。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明建立了常见细菌污染物的核酸测序鉴定方法，并明确了16S rRNA中具有鉴定和分类意义的DNA特征序列的范围和长度；本发明可用于细菌污染物从分离纯化到核酸测序前的全部操作过程，实现细菌污染物的快速、一体化鉴定，解决了现有常规技术存在检测方法所需时间较长、对仪器设备依懒性高、检测结果假阳性高的现象，为常见细菌微生物的快速检测提供有力技术支持。
附图说明
图1为实施例1中采用试剂盒法进行试验下的琼脂糖凝胶电泳图；其中图中自上至下的样品分别为土壤1、土壤2、土壤3、土壤4、2K marker、药渣微生物1、药渣微生物2、2Kmarker、大肠杆菌1、大肠杆菌2、阴性对照；
图2为实施例2中采用水煮法进行试验下的琼脂糖凝胶电泳图；其中图中自上至下的样品分别为土壤1、土壤2、土壤3、土壤4、2K marker、药渣微生物1、药渣微生物2、2Kmarker、大肠杆菌1、大肠杆菌2、阴性对照；
图3为实施例3中采用本发明方法进行试验下的琼脂糖凝胶电泳图；其中图中自上至下的样品分别为土壤1、土壤2、土壤3、土壤4、2K marker、药渣微生物1、药渣微生物2、2Kmarker、大肠杆菌1、大肠杆菌2、阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
本发明中基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，
包括以下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用16S rDNA序列扩增的通用引物，在PCR反应试剂盒中进行PCR扩增反应；
(3)分析PCR扩增产物。
实施例1
提取样品中的DNA
样品为待鉴定细菌菌株的平板划线菌或者培养物；
将平板划线菌或者培养物加入试管中，其中每个试管中加入20uL细胞裂解液振荡混匀，室温下静置10min-30min，接着稀释10倍-50倍，并再次振荡混匀，然后高速离心2min，取离心后的上清液作为待检测DNA模板。
此外，所述细胞裂解液为氢氧化钠溶液与十二烷基硫酸钠溶液的混合液，其中氢氧化钠溶液的质量浓度为0.1M-0.5M，其中十二烷基硫酸钠溶液的质量百分比浓度为1％-3％。
实施例2
PCR扩增反应
所述通用引物如下：
所述通用引物的上游引物27F如SEQ ID No.1所示，
所述通用引物的下游引物1492R如SEQ ID No.2所示。
PCR扩增反应的反应体系以30uL计为：
Figure BDA0002367199780000051
PCR扩增反应的扩增程序为：
Figure BDA0002367199780000052
重复25个循环；
72℃ 延伸7min；
4℃ 终止反应并保存。
需要注意的是，通用引物的序列如下：
正向引物27F(SEQ ID No.1)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，
反向引物1492R(SEQ ID No.2)：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
实施例3
分析PCR扩增产物
具体方法如下：
(A)取PCR扩增产物，配制琼脂糖凝胶并进行电泳，电泳的电压为100V，电泳结束后，使用凝胶成像仪观察，拍照并记录实验结果；
(B)将步骤(A)中电泳后琼脂糖凝胶的核酸扩增产物切下，提取并纯化核酸；
(C)将步骤(B)中纯化后的核酸，采用通用性序列拼接软件，获得拼接序列，随后将拼接序列进行PCR扩增反应，将PCR扩增反应的产物进行测序和序列拼接，获得16S rDNA序列；
(D)将步骤(C)中相应片段的DNA序列导入标准核酸序列数据库进行序列比对，进行细菌菌株的鉴定。
需要注意的是，琼脂糖凝胶配制方法为，称取1.5g琼脂糖置于100mL TAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60℃左右时，均匀铺板，制成1％的琼脂糖凝胶。
需要注意的是，本发明的验证试验中，核酸扩增产物位琼脂糖凝胶的1500bp处。
需要注意的是，Sanger测序PCR扩增产物的产物序列，并采用通用性序列拼接软件获得拼接序列。
需要注意的是，将下机的PCR产物进行乙醇沉淀纯化，然后上3730xl遗传分析仪。测序结束后使用seq6.0分析序列，通用软件lasergene7.0进行序列拼接，获得16S rDNA的全长序列。
需要注意的是，把测序获得的16S rDNA全长序列导入NCBI的genebank的微生物16S库中进行blast分析，给出与系统中同源度最高的两种菌种的种属信息和genebank ID。
实施例4
核酸的提取和纯化
具体方法如下：
将切下来的核酸扩增产物加入凝胶回收试剂盒中的溶胶液，水浴完全溶解，加入磁珠吸附核酸片段，再用80％酒精洗涤两次，晾干，收集纯化好的核酸。
实施例5
拼接序列的PCR扩增反应
PCR扩增反应的扩增程序为：
Figure BDA0002367199780000071
重复30个循环；
12℃ 终止反应并保存。
实施例6
采用实施例1-6所述的方法，并与常规的试剂盒法(全式金试剂)、水煮法进行比对。
需要注意的是，样品分别为四种不同土壤、两种不同药渣微生物、两种不同大肠杆菌。
在同等条件下，试验结果分别如图1、图2及图3所示，上述检测结果表明，仅本发明的方法才能有效扩增出特异性的目标条带，而其他方法虽然能部分扩增目标条带，但整个试验周期长或者条件不清晰，例如试剂盒法的目标条带出现拖尾现象，且整个试验需要1h，又例如水煮法的整个试验时间虽短至20min，但多个样品没有出现相应的目标条带；这表明本发明的试验方法的阳性检测率与试剂盒法一样，都达到100％，远高于常规使用的水煮法，但比试剂盒法的成本低，需要的设备少。
此外，采用成本分析，上述十种样品(10个已分离好的细菌菌株)，使用试剂盒法提取细菌基因组DNA耗时2h，成本，每个菌大于15元，扩增PCR鉴定成功率为100％；使用水煮法提取细菌基因组DNA耗时15min-20min，成本每个菌小于1元，扩增PCR鉴定成功率仅为62.5％；使用本申请介绍的碱裂解法提取细菌基因组DNA耗时30min，成本每个菌小于1.5元，扩增PCR鉴定成功率为100％。
综上所述，由实施例1-6可见，本发明建立了常见细菌污染物的核酸测序鉴定方法，并明确了16S rRNA中具有鉴定和分类意义的DNA特征序列的范围和长度；本发明可用于细菌污染物从分离纯化到核酸测序前的全部操作过程，实现细菌污染物的快速、一体化鉴定，解决了现有常规技术存在检测方法所需时间较长、对仪器设备依懒性高、检测结果假阳性高的现象，为常见细菌微生物的快速检测提供有力技术支持。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
Figure BDA0002367199780000081
SEQUENCE LISTING
<110> 北京睿博兴科生物技术有限公司
<120> 一种基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法
<130> 20200101
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (10)

1.一种基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，其特征在于：
包括以下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用16S rDNA序列扩增的通用引物，在PCR反应试剂盒中进行PCR扩增反应；
(3)分析PCR扩增产物。
2.根据权利要求1所述的基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，其特征在于：
步骤(1)中样品为待鉴定细菌菌株的平板划线菌或者培养物。
3.根据权利要求2所述的基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，其特征在于：
步骤(1)中样品中DNA的提取方法为将平板划线菌或者培养物加入试管中，其中每个试管中加入20uL细胞裂解液振荡混匀，室温下静置10min-30min，接着稀释10倍-50倍，并再次振荡混匀，然后高速离心2min，取离心后的上清液作为待检测DNA模板。
4.根据权利要求3所述的基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，其特征在于：
所述细胞裂解液为氢氧化钠溶液与十二烷基硫酸钠溶液的混合液，其中氢氧化钠溶液的质量浓度为0.1M-0.5M，其中十二烷基硫酸钠溶液的质量百分比浓度为1％-3％。
5.根据权利要求1所述的基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，其特征在于：
步骤(2)中所述通用引物如下：
所述通用引物的上游引物27F如SEQ ID No.1所示，
所述通用引物的下游引物1492R如SEQ ID No.2所示。
6.根据权利要求5所述的基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，其特征在于：
步骤(2)中PCR扩增反应的反应体系以30uL计为：
Figure FDA0002367199770000011
7.根据权利要求6所述的基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，其特征在于：
步骤(2)中PCR扩增反应的扩增程序为：
Figure FDA0002367199770000021
8.根据权利要求1所述的基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，其特征在于：
步骤(3)中分析PCR扩增产物的方法如下：
(A)取PCR扩增产物，配制琼脂糖凝胶并进行电泳，电泳结束后，使用凝胶成像仪观察，拍照并记录实验结果；
(B)将步骤(A)中电泳后琼脂糖凝胶的核酸扩增产物切下，提取并纯化核酸；
(C)将步骤(B)中纯化后的核酸，采用通用性序列拼接软件，获得拼接序列，随后将拼接序列进行PCR扩增反应，将PCR扩增反应的产物进行测序和序列拼接，获得16S rDNA序列；
(D)将步骤(C)中相应片段的DNA序列导入标准核酸序列数据库进行序列比对，进行细菌菌株的鉴定。
9.根据权利要求8所述的基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，其特征在于：
步骤(B)中提取并纯化核酸的方法如下：
将切下来的核酸扩增产物加入凝胶回收试剂盒中的溶胶液，水浴完全溶解，加入磁珠吸附核酸片段，再用80％酒精洗涤两次，晾干，收集纯化好的核酸。
10.根据权利要求8所述的基于细菌16S rDNA序列的快速核酸提取测序鉴定方法，其特征在于：
步骤(C)中PCR扩增反应的扩增程序为：
Figure FDA0002367199770000022
Figure FDA0002367199770000031
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