CN112603908B - 一种基于氨基酸聚合物的纳米载药体系及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于氨基酸聚合物的纳米载药体系及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于氨基酸聚合物的纳米载药体系及其制备方法和应用。该氨基酸聚合物的制备方法为：在冰水浴条件下，将氯化亚砜缓慢滴加到溶剂中，然后缓慢加入氨基酸或其盐进行反应，得到氨基酸聚合物；或将氨基酸或其盐溶解到溶剂中，然后加入偶联剂和催化剂进行反应，得到氨基酸聚合物。该方法制得的氨基酸聚合物具有较好的生物相容性，载药量高且尺寸稳定，能够通过肿瘤组织的增强渗透滞留效应较好地聚集在肿瘤部位，在提高化疗药物的生物利用度、降低化疗药物对正常组织的毒性的同时增强了纳米药物载体对肿瘤细胞生长抑制，因此，该氨基酸聚合物可以作为药物载体用于纳米载药体系，为癌症及其他疾病的有效治疗开拓了一种新的途径。

Description

一种基于氨基酸聚合物的纳米载药体系及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，特别涉及一种基于氨基酸聚合物的纳米载药体系及其制备方法和应用。
背景技术
化疗是肿瘤学中最常用的治疗方法之一，化疗效果的好坏在很大程度上取决于是否有足够的浓度化疗药物到达整个肿瘤部位。作为一个具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物，紫杉醇(PTX)新颖复杂的化学结构、广泛而显著的生物活性、全新独特的作用机制、奇缺的自然资源使其受到了植物学家、化学家、药理学家、分子生物学家的极大青睐，是一种在临床上应用较广的细胞周期非特异性抗肿瘤化疗药物，主要用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗等。与抗有丝分裂抗肿瘤药物相反，PTX是发现的第一个能与微管蛋白聚合体相互作用的药物，即通过与微管紧密地结合，使它们稳定而起作用。即通过促进微管稳定化，导致细胞周期停滞，并进一步导致癌细胞凋亡。但PTX水溶性差和选择性差，常导致不令人满意的治疗效果和严重的毒副作用，如在全身循环中被快速清除并且对癌细胞和健康细胞具有相似的细胞毒性。因此治疗肿瘤的同时会导致多种不良反应，包括过敏反应，骨髓抑制，皮肤反应，液体潴留，周围神经病变，脱发，心脏疾病和疲倦等副作用。虽然用特定的溶剂系统，例如乙醇和吐温80的溶液来促进PTX溶解，但这种溶剂体系会导致过敏、肿瘤组织摄取不佳、以及身体副作用等。因此，寻求一种方法来增加PTX的体内循环时间、在保证对肿瘤细胞杀伤作用的同时降低药物对正常细胞的毒性成为关键瓶颈。
纳米递送系统依赖于实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR)来改善药代动力学特征和靶位点积累，有望彻底改变肿瘤的诊断和治疗。近年来，文献中报道了许多不同的天然聚合物材料，尤其是基于氨基酸的纳米载体的蓬勃发展，为开发靶向纳米药物递送系统提供了较大的机会。目前合成聚氨基酸多以α-氨基酸N-羧基酸酐(NCA)的开环聚合反应合成，即使用醇，胺和相关化合物来引发NCA聚合，伯胺是最常见的引发剂。近年来，报道了有关NCA聚合的拓展研究包括通过使用过渡金属络合物，六甲基二硅氮烷和三甲基甲硅烷基衍生物，Al-席夫碱络合物，稀土金属络合物，铵盐和胺-硼烷路易斯对等作为引发剂引发开环聚合。以及探索改进的反应条件，例如低温，高真空和氮气流。尽管有这些创新，但由于NCA聚合条件相对苛刻且对水分高度敏感，因此NCA开环聚合仍然具有挑战性并且通常需要在特定装置中操作。因此，急需开发一个制备简单，生物相容好、多功能性和可生物降解的聚氨基酸纳米载体库，来降低疾病风险，改善人类健康。
发明内容
本发明的第一个目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种氨基酸聚合物的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供上述氨基酸聚合物在制备药物载体中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种氨基酸聚合物药物输送载体的制备方法。
本发明的第四个目的在于提供一种氨基酸聚合物的纳米载药体系。
本发明的第五个目的在于提供上述氨基酸聚合物的纳米载药体系的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种氨基酸聚合物的制备方法，通过如下任一种方式实现：
S1、在冰水浴条件下，将氯化亚砜缓慢滴加到溶剂中，搅拌混合均匀，得到混合溶液；其中，溶剂为无水吡啶或二甲基甲酰胺的二氯甲烷溶液；
S2、将氨基酸或其盐缓慢加入到步骤S1中得到的混合溶液中，在0～55℃条件下搅拌反应，得到氨基酸聚合物；
或
S3、将氨基酸或其盐溶解到溶剂中，然后加入偶联剂和催化剂，在0～55℃条件下进行反应，得到氨基酸聚合物。
在本发明较佳的实施例中，步骤S1中所述的搅拌混合反应需在冰水浴中进行，温度过高会导致放热严重使氯化亚砜挥发且后续加入苯丙氨酸或其盐时导致副产物增加，致使产物产率和纯度较低，纳米粒稳定性较差。
在本发明较佳的实施例中，步骤S1中所述的冰水浴的温度为0～4℃。
在本发明较佳的实施例中，步骤S1中所述的反应需要在无水条件下进行，水的存在会与氯化亚砜反应，使产率降低，因此，步骤S1中的溶剂选自吡啶或含有一定量的二甲基甲酰胺的二氯甲烷溶液。
在本发明较佳的实施例中，步骤S1中所述的氯化亚砜的滴加速度为0.2～2mL/min。氯化亚砜要缓慢滴加至用冰水浴孵育的溶剂中，以防止加入过快导致放热严重使氯化亚砜挥发且后续加入氨基酸或其盐时导致副产物增加，致使产物产率和纯度较低，纳米粒稳定性较差。
在本发明较佳的实施例中，步骤S1中所述的吡啶量不可过多，否则会导致后续处理较复杂。
在本发明较佳的实施例中，步骤S1中得到氯化亚砜的混合液后，将其转移到设置的温度环境中，以待与氨基酸或其盐反应。
在本发明较佳的实施例中，步骤S1中所述的搅拌的时间为10～30min。
在本发明较佳的实施例中，步骤S2和S3中所述的氨基酸或其盐为疏水性氨基酸、疏水性氨基酸衍生物和疏水性氨基酸盐中的至少一种；进一步优选为苯丙氨酸、苯丙氨酸衍生物、苯丙氨酸盐、甲硫氨酸、甲硫氨酸衍生物、甲硫氨酸盐、缬氨酸、缬氨酸衍生物、缬氨酸盐、亮氨酸、亮氨酸衍生物、亮氨酸盐、色氨酸、色氨酸衍生物和色氨酸盐盐中的至少一种；更进一步优选为苯丙氨酸、苯丙氨酸衍生物和苯丙氨酸盐中的至少一种；再进一步优选为苯丙氨酸、苯丙氨酸盐酸盐和苯丙氨酸硫酸盐中的至少一种；最优选为L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸或L,D-苯丙氨酸。
在本发明较佳的实施例中，步骤S2中所述的氨基酸或其盐与所述氯化亚砜的摩尔比为1～2：0.5～6；优选为1：1～3；更优选为1:1.2。氯化亚砜与氨基酸或其盐的摩尔比和反应温度会显著影响合成的聚合物PPhe的产率和稳定性，如果氯化亚砜加入过量，则会产生较多副产物以及低聚体，致使产物产率和纯度较低，纳米粒稳定性较差。
在本发明较佳的实施例中，步骤S2中所述的反应的温度优选为25～40℃；更优选为35℃。
在本发明较佳的实施例中，步骤S2中所述的反应的时间为0.5～24h；优选为3h。
在本发明较佳的实施例中，所述的氨基酸聚合物的制备方法，在步骤S2之后还包括纯化和干燥的步骤，具体为：将步骤S2中得到的氨基酸聚合物倒入水中搅拌，以终止反应，然后离心，除去未反应单体和溶剂，重复3～4次，再用四氢呋喃(THF)复溶，真空干燥，得到氨基酸聚合物。
在本发明较佳的实施例中，所述的离心的转速为3000～8000rpm。
在本发明较佳的实施例中，所述的真空干燥的条件为：50～80℃真空干燥12～24h。
在本发明较佳的实施例中，步骤S2中所述的氨基酸聚合物为聚苯丙氨酸(PPhe)，其聚合度为2～10(优选为5～8)，分子量为312～1488。聚合物的聚合度和分子量会影响其自组装成纳米粒子时的粒径大小等，当聚合物PPhe的聚合度为5～8时，其自组装成纳米粒子时粒径均一、尺寸合适，能充分发挥载药纳米粒的EPR效应，增强抗肿瘤效果。
在本发明较佳的实施例中，步骤S3中所述的偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或二环己基碳二亚胺(DCC)。
在本发明较佳的实施例中，步骤S3中所述的溶剂为水，二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)中的至少一种。
在本发明较佳的实施例中，步骤S3中所述的偶联剂与氨基酸或其盐的摩尔比为1.2～1.5:1。
在本发明较佳的实施例中，步骤S3中所述的催化剂为1-羟基苯并三唑(HOBT)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)中的至少一种。
在本发明较佳的实施例中，步骤S3中所述的催化剂与氨基酸或其盐的摩尔比是1:1。
在本发明较佳的实施例中，步骤S3中所述的反应的温度优选为25～40℃；更优选为25℃。
在本发明较佳的实施例中，步骤S3中所述的反应的时间为0.5～24h；优选为24h。
在本发明较佳的实施例中，所述的氨基酸聚合物的制备方法，在步骤S3之后还包括纯化和干燥的步骤，具体为：将步骤S3得到的氨基酸聚合物加入透析袋中，然后放入水中进行透析，冻干，得到氨基酸聚合物。
在本发明较佳的实施例中，所述的透析的截留分子量为3500Da。
在本发明较佳的实施例中，所述的透析的时间为优选3d，每8h换一次水。
在本发明较佳的实施例中，所述的氨基酸聚合物在制备过程需严格控制反应条件和反应比例，反应温度显著影响获得的聚合材料的性能效果，如果反应温度过高或时间过长，材料内部的功能键生成速率加快，会造成其分子量分布变宽，从而得到的产品稳定性能会下降；而反应温度过低或时间过短，造成其内部不能形成足够且有效的功能结构，进而影响其递药及释药性能。
所述的方法制备得到的氨基酸聚合物在制备药物载体中的应用。
所述的方法制备得到的氨基酸聚合物作为药物载体的应用，所述的应用的环境为体内外环境。
一种聚氨基酸药物输送载体的制备方法，通过如下任一种方式实现：
(1)将上述氨基酸聚合物溶于有机溶剂中，得到氨基酸聚合物溶液；然后在搅拌条件下，将氨基酸聚合物溶液滴加至含有稳定剂的水溶液中，使其自组装成纳米粒，得到氨基酸聚合物药物输送载体；
或
(2)将上述氨基酸聚合物和稳定剂分别溶解于有机溶剂中，得到氨基酸聚合物溶液和稳定剂溶液；然后将两者混合均匀后滴加至水中，使其自组装成纳米粒，得到聚氨基酸药物输送载体。
在本发明较佳的实施例中，方式(1)和(2)中所述的稳定剂为聚乙烯醇(PVA)，两性离子活性剂或DSPE-PEG(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)；优选为DSPE-PEG2000。
在本发明较佳的实施例中，所述的两性离子活性剂优选为羧基甜菜碱或磺基甜菜碱。
在本发明较佳的实施例中，方式(1)和(2)中所述的稳定剂的用量为占氨基酸聚合物质量的0～75％(不包括0)；优选为占氨基酸聚合物质量的25～50％；更优选为占氨基酸聚合物质量的50％。
在本发明较佳的实施例中，方式(I)和(II)中所述的有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和四氢呋喃(THF)中的一种或多种；优选为二甲基亚砜(DMSO)。
在本发明较佳的实施例中，方式(1)和(2)中所述的氨基酸聚合物溶液的浓度为5～50mg/mL；优选为10～50mg/mL；更优选为10～20mg/mL。
在本发明较佳的实施例中，方式(1)和(2)中所述的稳定剂溶液的浓度为5～50mg/mL；优选为10～50mg/mL；更优选为10～20mg/mL。
在本发明较佳的实施例中，所述的氨基酸聚合物药物输送载体的制备方法，还包括将得到的氨基酸聚合物药物输送载体去除溶剂的步骤，具体为：将自组装成纳米粒置于超滤管中，离心，重复3次以上，使有机溶剂的含量在千分之一以下，得到去除溶剂后的聚氨基酸药物输送载体。
在本发明较佳的实施例中，所述是超滤管为截留分子量为100kDa的超滤管。
在本发明较佳的实施例中，所述的离心的条件为：2000～3000rpm离心8～10min；优选为：3000rpm离心10min。
一种聚氨基酸的纳米载药体系，包括上述方法制得的聚氨基酸以及抗肿瘤药物。
在本发明中，对所载的抗肿瘤药物没有特殊限制，所述的抗肿瘤药物包括亲水性药物和疏水性药物；所述亲水性药物包括但不限于盐酸阿霉素、盐酸吉西他滨、盐酸伊立替康、氟尿嘧啶或香菇多糖等药物；所述疏水性药物包括但不限于紫杉醇(PTX)、多西紫杉醇、甲氨蝶呤、喜树碱、阿霉素、姜黄素等药物。
在本发明较佳的实施例中，所述的聚氨基酸纳米载药体系还含有一定量的稳定剂；所述的稳定剂为聚乙烯醇(PVA)，两性离子活性剂或DSPE-PEG(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)；优选为DSPE-PEG2000。
在本发明较佳的实施例中，所述的两性离子活性剂优选为羧基甜菜碱或磺基甜菜碱。
所述的聚氨基酸的纳米载药体系，通过如下任一种方法制备得到：
(I)将上述氨基酸聚合物、抗肿瘤药物和稳定剂分别溶解到有机溶剂中，得到氨基酸聚合物溶液、抗肿瘤药物溶液和稳定剂溶液；然后将三种溶液混合均匀后滴加至水中，使其自组装成载药纳米粒，得到聚氨基酸纳米载药体系；
或
(II)将上述氨基酸聚合物和抗肿瘤药物分别溶解到有机溶剂中，得到聚氨基酸溶液和抗肿瘤药物溶液；然后将氨基酸聚合物溶液和抗肿瘤药物溶液滴加到含有稳定剂的水溶液中，使其自组装成纳米粒，得到聚氨基酸纳米载药体系。
在本发明较佳的实施例中，方式(I)和(II)中所述的稳定剂为聚乙烯醇(PVA)，两性离子活性剂或DSPE-PEG(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)；优选为DSPE-PEG2000。
在本发明较佳的实施例中，所述的两性离子活性剂优选为羧基甜菜碱或磺基甜菜碱。
在本发明较佳的实施例中，方式(I)和(II)中所述的有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和四氢呋喃(THF)中的一种或多种；优选为二甲基亚砜(DMSO)。
在本发明较佳的实施例中，方式(I)和(II)中所述的氨基酸聚合物溶液的浓度为5～50mg/mL；优选为10～50mg/mL；更优选为10～20mg/mL。
在本发明较佳的实施例中，方式(I)和(II)中所述的抗肿瘤药物溶液的浓度为5～50mg/mL；优选为10～50mg/mL；更优选为10～20mg/mL。
在本发明较佳的实施例中，方式(I)和(II)中所述的稳定剂溶液的浓度为5～50mg/mL；优选为10～50mg/mL；更优选为10～20mg/mL。
在本发明较佳的实施例中，方式(I)和(II)中所述的氨基酸聚合物与抗肿瘤药物的质量比为1：0.05～0.50；优选为1：0.30。氨基酸聚合物和抗肿瘤药物的质量比过大，则载药量较低，所成纳米粒粒子数较少，过小则包封率较小，造成药物的浪费，并且所得纳米粒不稳定，易沉淀。
在本发明较佳的实施例中，方式(I)和(II)中所述的稳定剂的用量占氨基酸聚合物质量的0～75％(不包括0)；优选为占氨基酸聚合物质量的25～50％；更优选为占氨基酸聚合物质量的50％。
在本发明较佳的实施例中，所述的氨基酸聚合物的纳米载药体系，还包括将得到的氨基酸聚合物的纳米载药体系进行纯化的步骤，具体为：将自组装成纳米粒置于超滤管中，离心，重复3次以上，以除去未包封的抗肿瘤药物以及使有机溶剂的含量在千分之一以下，得到纯化后的氨基酸聚合物的纳米载药体系。
在本发明较佳的实施例中，所述是超滤管为截留分子量为100kDa的超滤管。
在本发明较佳的实施例中，所述的离心的条件为：2000～3000rpm离心8～10min；优选为：3000rpm离心10min。
在本发明中，所述的聚氨基酸纳米载药体系(载药纳米粒)的粒径在200nm以下(优选为50～200nm，更优选为50～150nm)，拥有较高的比表面积，载药量高，是优良的载药体系，可增强药物的疗效，而且该载药纳米粒子能够利用EPR效应增强药物在肿瘤部位的靶向性。
本发明中的聚氨基酸纳米载药体系所需原料易得，制备工艺纯熟，易于操作，不需要昂贵的仪器，且制备的纳米复合物尺寸适中、生物相容性好，不仅实现了疏水药物的可控载药，改善了药物的溶解性，极大的提高了疏水药物的可利用性，还可以大大提高纳米粒在血液中的循环时间，从而提高肿瘤部位的药物聚积，提高治疗效果。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明针对抗肿瘤药物的递送及聚氨基酸合成条件相对苛刻的问题，提供一种能够快速而简便地制备且适用于抗肿瘤药物递送的纳米载药体系。本发明以苯丙氨酸为例，即以苯丙氨酸和氯化亚砜(SOCl2)为原料，通过一步缩聚法在吡啶(碱性环境中)快速而简便地发生缩聚反应来制备聚苯丙氨酸(PPhe)。该聚合物具有较好的生物相容性，制备而成的纳米粒载体具有载药量高且尺寸稳定，能够通过肿瘤组织的增强渗透滞留效应(EPR)较好地聚集在肿瘤部位，在提高化疗药物的生物利用度且降低化疗药物对正常组织的毒性的同时增强了纳米药物载体对肿瘤细胞生长抑制的特点。与开环聚合制备聚氨基酸相比，本发明具有反应周期短、条件温和、重复性好等优势，具有良好的应用前景和发展空间，为癌症及其他疾病的有效治疗开拓了一种新的途径。
(2)本发明材料来源于生物相容性好的氨基酸，安全性有保障，其制备方法简单，聚苯丙氨酸(PPhe)抗肿瘤递药体系改善了药物的溶解性，极大的提高了疏水药物的可利用性，还可以大大提高纳米粒在血液中的循环时间，从而提高肿瘤部位的药物聚积，并且载药量高，一定的酸响应性，绿色安全，易于实现，且降低了化疗药物对正常组织的毒性，拓宽了其在抗肿瘤方面的应用范围。
(3)本发明从机体内大量存在的苯丙氨酸出发，合成基于苯丙氨酸的新型生物相容性高、生物可降解的高分子，同时改善了药物的溶解性，极大的提高了疏水药物的可利用性，还可以大大提高纳米粒在血液中的循环时间，从而提高肿瘤部位的药物聚积。另外，肿瘤组织具有不同于正常组织的微环境，与正常细胞相比，肿瘤组织呈弱酸性，酰胺键在肿瘤细胞质中较低pH下会加快药物释放，从而引发药物的释放至肿瘤细胞，并且随后可高效诱导肿瘤细胞凋亡。同时，本发明使用的具有较好疏水性的L-苯丙氨酸可将肿瘤药物分子直接导入癌瘤区，大大增强了靶向性，这样既可以抑制癌瘤生长，又可以降低药物的毒副作用。
(4)本发明从机体内大量存在的苯丙氨酸出发，合成基于苯丙氨酸的新型生物相容性高、生物可降解的高分子，实现以PTX为代表的疏水性抗肿瘤药物的高效传递、以及其在肿瘤细胞内的释放。该纳米载药体系具有很好的生物安全性、生物可降解性和长循环稳定性，具备高效肿瘤靶向和高效抑制肿瘤细胞生长的特点，可有效解决纳米药物载体的溶解性差、靶向性差和体循环稳定性较差的问题。
(5)不同的聚合物结构对于载药和递送性能有不同程度的影响，本发明所制备的纳米递药体系中，充分将聚合物的结构、性能和亲疏水性等因素考虑在内，通过调整材料的物理化学性质，制备出粒径合适、亲水性适宜、生物可降解聚苯丙氨酸，再与抗癌药物复合形成纳米结构，可以实现抗癌药物的高效负载和可控释放，表现出良好的生物安全性，体内循环稳定性好，同时由于本发明载药纳米颗粒具有一定的酸响应性，其在肿瘤细胞较低pH环境中，可导致聚合物纳米粒的快速崩解和包载药物的迅速释放，增强了肿瘤细胞对于抗癌药物的利用，从而在增强肿瘤细胞杀伤作用的同时，达到降低化疗药物对正常组织毒性的目的。
附图说明
图1为实施例1制备的聚苯丙氨酸PPhe的核磁氢谱解析图。
图2为实施例1制备的聚苯丙氨酸PPhe的红外光谱解析图。
图3为通过低分辨质谱对实施例1制备的聚苯丙氨酸PPhe的分子量表征图。
图4为实施例2制备的聚苯丙氨酸PPhe(药物输送载体)的纳米载体粒经分布及透射电镜图。
图5为实施例2制备的聚苯丙氨酸PPhe(药物输送载体)的生物相容性表征图；其中，A为材料对正常细胞3T3的毒性实验结果；B为溶血实验结果。
图6为不同条件下制备的PTX@PPhe NPs的稳定性试验结果图。
图7为CT26对实施例4制备得到的载药纳米粒的摄取情况图。
图8为实施例4制备得到的载药纳米粒的PTX@PPhe作用于CT26细胞的凋亡结果图。
图9为实施例4制备得到的载药纳米粒PTX@PPhe对CT26肿瘤小鼠的抑瘤效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明提供了一种聚氨基酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)在冰水浴条件下，将一定量的氯化亚砜缓慢滴加(滴加速度0.2～2mL/min)于盛有一定量的无水吡啶反应瓶中搅拌10～30min，得到混合溶液；其中，氯化亚砜与无水吡啶的体积比为1：20～30；
(2)在一定温度下，将一定量的疏水性氨基酸或其盐(本发明中以苯丙氨酸为例)缓慢加入到上述混合溶液，继续搅拌一定时间，得到聚苯丙氨酸(PPhe)；其中，氯化亚砜与苯丙氨酸(或其盐)的摩尔比为0.5～6：1～2(优选为1：1～2，更优选为1.2：1)，反应温度为0～55℃(优选为25～40℃时，更优选为35℃)，反应时间为0.5～24h(优选为3h)，此条件下获得的聚合物PPhe的产率较高、稳定性高；
(3)将反应所得聚苯丙氨酸(PPhe)倒入水中搅拌，以终止反应，之后将产物置于离心管中3000～8000rpm条件下离心，除去未反应单体和吡啶，重复3～4次后用四氢呋喃(THF)复溶，在50～80℃真空干燥12～24h，得到棕黄色粉末状聚合物(PPhe)。
除上述方法外，还可以将氨基酸或其盐与偶联剂和催化剂反应得到氨基酸聚合物(此方法合成材料周期相对较长些，产率相对较低些)，具体为：
(I)在一定温度下，将一定量的疏水性氨基酸或其盐(以苯丙氨酸为例)加入到溶剂(水，DMF或DMSO)中，然后加入偶联剂EDC(或DCC)和催化剂HOBT(NHS或DMAP)进行反应；其中，偶联剂与氨基酸的摩尔比为1.2～1.5:1；催化剂与氨基酸的摩尔比是1:1；反应温度为0～55℃(优选为25～40℃时，更优选为25℃)，反应时间为0.5～24h(优选为24h)。
(II)反应结束后，将步骤(I)获得的产物加入透析袋(截留分子量为3500Da)中，之后放入水中透析3d，每8h换一次水，冻干，得到氨基酸聚合物。
实施例1聚合物PPhe的制备
1、一种聚合物PPhe的制备方法，包括以下步骤：
(1)在冰水浴条件下，将氯化亚砜缓慢滴加(滴加速度0.2～2mL/min)于盛有无水吡啶的反应瓶中搅拌10～30min，得到混合溶液；
(2)将苯丙氨酸(本实施例中的氨基酸为L-苯丙氨酸)缓慢加入到上述混合溶液，继续搅拌10～30min，得到聚苯丙氨酸(PPhe)；其中，氯化亚砜与苯丙氨酸的摩尔比分别为2:1、1：1、1.2：1、1：2、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1，反应温度为35℃，反应3h。
(3)将反应所得聚苯丙氨酸(PPhe)倒入水中搅拌，以终止反应，之后将产物置于离心管中3000～8000rpm条件下离心，除去未反应单体和吡啶，重复3～4次后用四氢呋喃(THF)复溶，在50～80℃真空干燥12～24h，得到一系列棕黄色粉末状聚合物(PPhe)。
2、结果
本实施例利用400M超导核磁共振波谱仪(Ascend TM 400)和布鲁克红外光谱仪(VERTEX70)表征实施例1制备的聚合物PPhe的结构。
结果如图1所示，图1的核磁氢谱图中，在约8.25ppm处的峰对应聚苯丙氨酸酰胺键上的-NH的峰；在7.25ppm左右的峰则是苯环上氢的峰，在4.5ppm左右的峰则是苯丙氨酸上的-CH上的氢，而3.0ppm左右的峰则对应于与苯环相连是亚甲基上的氢，核磁氢谱表明该聚合物已被成功制备。进一步的结构信息则由红外表征，见图2红外测试结果(图中仅以氯化亚砜与苯丙氨酸的比为1.2:1为代表进行表征，图中未显示其他比例的结果)，3300cm-1左右的峰为聚合物酰胺键中N-H的伸缩振动，3000-3100cm-1、1455cm-1以及700cm-1为PPhe中苯环的特征吸收峰；而1250cm-1为酰胺键上C-N伸缩振动；1641cm-1为酰胺Ⅰ吸收带。以上结果表明聚合物PPhe被成功合成。
另外，当氯化亚砜与苯丙氨酸的摩尔比为1～2：1时，更优选为1.2:1时，所得聚合物PPhe结构稳定、生物相容性更好，能包载不同亲疏水性的药物，所制备的聚合物PPhe具有粒径小、稳定性高的特征，在作为肿瘤药物传递载体方面具有良好应用前景。
结果如图3所示，本实施例所制备聚合物PPhe的聚合度是2～10，分子量范围在312～1488。聚合物的聚合度和分子量会影响其自组装成纳米粒子时的粒径大小等。当聚合物PPhe的聚合度是5～8时，其自组装成纳米粒子时粒径均一、尺寸合适，能充分发挥载药纳米粒的EPR效应，增强抗肿瘤效果。
本实施例聚合物PPhe在制备过程需严格控制反应条件，氯化亚砜需在冰水浴条件下缓慢加入吡啶溶液中，温度过高会使氯化亚砜蒸出，磁力搅拌一定时间使其充分混匀。苯丙氨酸粉末加入过程要缓慢，且快速搅拌以防止成环或者“夹生”，致使产物产率和纯度较低，纳米粒稳定性较差。
实施例2聚苯丙氨酸纳米粒的制备
1、聚苯丙氨酸纳米粒的制备过程包括以下步骤：
(1)将实施例1制备得到的不同的聚苯丙氨酸PPhe(本实施例选用氯化亚砜与苯丙氨酸摩尔比为1.2：1制备得到的PPhe)和表面稳定剂DSPE-PEG2000分别溶于二甲基亚砜(DMSO)中，分别配成10mg/mL的溶液备用；
(2)将上述配制的聚苯丙氨酸PPhe与表面稳定剂DSPE-PEG2000溶液按照一定比例混合后在1000rpm转速下缓慢滴加至水溶液中，该复合物在水溶液中通过纳米沉淀法自组装形成纳米体系；其中，DSPE-PEG2000的质量为PPhe质量的50％；
(3)将所得纳米粒溶液置于截留分子量(MWCO＝100kDa)的超滤管中，3000rpm超滤3次，每次10min，使DMSO含量在千分之一以下，最后得到PPhe纳米粒。
2、物理性质表征、细毒性实验和溶血实验
(1)利用纳米粒经仪和透射电镜对其物理性质进行表征。
(2)对该纳米粒子进行细毒性实验和溶血实验，具体步骤为：
细毒性实验：将状态良好的3T3细胞(北京北纳创联生物技术研究院)接种在96孔板中(每孔5,000个细胞)，并培养24小时。然后用不同浓度(10，20，50，100，200μg/mL)的PPhe处理细胞24h，往每孔添加20μL MTT，再孵育4h，之后弃去培养基，向每个孔中添加180μL DMSO。随后，将板轻轻摇动15分钟以溶解甲瓒，并在490nm测吸光度。
溶血实验：根据已报道的方案并稍作修改对聚苯丙氨酸的溶血活性进行评估。简而言之，用0.9％生理盐水稀释新鲜SD大鼠(中山大学实验动物中心，250～300g)的血液，通过离心法从血清中分离出红细胞(RBC)将红细胞清洗后，配成一定浓度的红细胞悬液加入PPhe溶液中并温和地涡旋混合使其达到设定浓度(10，50，100，200μg/mL)；将混合物在37℃下保持在5％CO2气氛中3h，然后将样品离心并转移至96孔板；使用酶标仪在540nm处测量上清液中的游离血红蛋白的吸光度，此实验用0.9％生理盐水和超纯水作为阴性和阳性对照进行实验。
3、结果
(1)利用纳米粒经仪和透射电镜对其物理性质进行表征。结果如图4所示：所制得的纳米粒子粒径80nm，呈类圆形，大小相对均一。
(2)细毒性实验和溶血实验结果如图5所示：图5A表明该纳米粒子具有较好的生物相容性，所制备的纳米粒用作药物载体具有较好的应用前景；图5B表明所制备的纳米粒子具有较好的生物相容性，能够用于动物体内。
实施例3聚苯丙氨酸纳米粒的制备
方法同实施例2步骤1，不同之处在于：将聚苯丙氨酸PPhe溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并控制聚苯丙氨酸PPhe的浓度分别为5mg/mL、10mg/mL、50mg/mL，最后得到的聚苯丙氨酸PPhe纳米粒。
实施例4聚苯丙氨酸纳米载药体系的制备
1、聚苯丙氨酸纳米载药体系的制备过程包括以下步骤：
(1)本实施例以抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)为代表进行制备，将PTX、表面稳定剂DSPE-PEG2000，实施例1制备得到的不同的聚苯丙氨酸聚合物PPhe分别溶于DMSO中，分别配成相同浓度的溶液(10mg/mL)备用；
(2)将等浓度三种溶液，按照聚合物PPhe和抗肿瘤药物的质量比为1：0.05、1：0.10、1：0.20、1：0.30、1：0.40、1：0.50不同比例混合后，按DSPE-PEG2000占聚合物PPhe质量的0～75％进行混合，在1000rpm转速下缓慢滴加至水溶液中，该复合物在水溶液中通过纳米沉淀法自组装形成纳米体系；其中，本案例较佳DSPE-PEG2000质量为PPhe质量的50％；
(3)将所得纳米粒溶液置于截留分子量(MWCO＝100kDa)的超滤管中，3000rpm超滤3次，每次10min，以除去未包封的PTX并使DMSO含量在千分之一以下，最后得到PTX@PPheNPs载药纳米粒。
2、结果
在聚合物PPhe和其他条件相同的条件下，以聚合物PPhe与PTX的质量比为单变量，考察发现随着聚合物材料和PTX质量比对纳米粒稳定性、载药量有显著影响，当PTX含量逐渐增加时，载药量先是增加后逐渐降低且纳米粒稳定性下降(图6)，聚合物和PTX质量比为1：0.30时较好(表1)。本发明所制备的纳米载药体系具有载药量高且能够通过EPR效应聚集在肿瘤部位并进入肿瘤细胞诱导其凋亡的能力，能够明显降低化疗药物的毒副作用并提高抗肿瘤效果。
表1
PPhe与PTX的质量比 粒径(nm) 包封率(％) 载药量(％)
PPhe:PTX＝10:1 104.0±0.9 39.85±0.14 3.62±0.01
PPhe:PTX＝10:2 107.1±1.4 42.01±0.78 7.01±0.13
PPhe:PTX＝10:3 118.4±1.6 51.01±0.17 12.00±0.04
PPhe:PTX＝10:4 131.3±3.7 35.94±0.49 10.27±0.14
实施例5载药纳米粒PTX@PPhe的抗肿瘤效果评价
(1)对实施例4制备得到的纳米载药体系(聚合物PPhe和PTX质量比为1：0.30，DSPE-PEG2000质量为聚合物PPhe质量的50％)对小鼠结肠癌(CT26)细胞进行细胞作用评价，具体步骤如下：
1)将CT26细胞(北京北纳创联生物技术研究院)接种在玻璃底皿中(每孔2.0×105细胞)。接种培养24小时后，将细胞用C6@PPhe NPs纳米颗粒(C6为香豆素6(Coumarin-6)，C6@PPhe NPs纳米颗粒按照实施例4的方法，将C6替换PTX制备得到；使用浓度为0.4μg/ml)处理，并孵育不同的时间间隔。然后，去除培养基，并用PBS洗涤细胞三次以去除未被细胞吸收的游离纳米颗粒。此后，根据供应商提供的标准方案，将细胞在室温下用4％(w/v)低聚甲醛固定20分钟，然后用Hochest33342染色。最后，将细胞用PBS洗涤两次，并通过激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)获得染色细胞的荧光照片。
2)根据Annexin V-FITC双染细胞凋亡检测试剂盒的对细胞进行染色并用流式细胞分析仪检测来检验细胞凋亡。具体为：将2mL密度为每孔5×105个细胞的小鼠结肠癌(CT26)细胞接种在6孔板中，在37℃5％CO2/95％O2的气氛中培养24h后，将细胞用新鲜培养基(作为空白对照)，PTX，PPhe，PTX@PPhe NPs(按照PTX为5μg/ml的浓度与细胞共培养)处理24h；然后消化细胞并重悬于缓冲液中，向细胞悬液中加入5μL AnnexinV-FITC，避光条件下温育15min后；向混合物中加入5μL碘化丙啶(PI)；最后，使用FACScan流式细胞仪进行分析，每个组测定三次。
结果如图7和8所示：图7表明细胞摄取实验表明纳米粒能够被细胞较好的摄取，这为其发挥作用奠定基础；图8为载药纳米粒的PTX@PPhe诱导CT26细胞凋亡的图，与游离PTX相比，载药纳米粒PTX@PPhe诱导CT26细胞调亡的能力更强。
(2)对实施例4制备得到的纳米载药体系进行体内抗肿瘤作用评价：
为了在体内评估抗肿瘤效率和安全性，参考文献(Wang L,You X,Lou Q,etal.Cysteine-Based Redox-Responsive Nanoparticles for Small-Molecule AgentDelivery[J].Biomaterials Science,2019,7(10).)，通过在BALB/C小鼠的右侧面皮下注射CT26细胞(约2×106)建立了荷瘤小鼠模型。动物实验根据中山大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议(证书编号，SYSU-IACUC-2019-000152)进行。当荷瘤小鼠的肿瘤体积达到约100mm3时，将它们随机分为四组(n＝5)，并隔日通过尾部静脉内注射生理盐水，PTX，PPhe，PTX@PPhe NPs(按照PTX为5mg/kg)治疗21天。之后将小鼠处死，进行组织切片染色、血生化指标检测、免疫荧光染色等处理，来对其进行体内抗肿瘤作用评价。
体内抑瘤效果如图9所示：说明载药纳米粒子具有更好的抑瘤效果，本发明制备的纳米载药体系在肿瘤治疗领域有一定的应用潜力。
上述结果说明，本发明将具有生理活性的疏水性苯丙氨酸在溶有氯化亚砜的吡啶溶剂中，一步法快速简便的制备聚苯丙氨酸。该聚苯丙氨酸具有较好的疏水性，在提高载药量和延长血液循环时间的同时，可将抗癌药物分子通过EPR效应导入癌症部位，达到既可以快速抑制癌瘤生长，又可以降低药物毒副作用的目的。
上述实施例中，所述的抗肿瘤药物除可以选择紫杉醇外，也可以选择喜树碱、盐酸阿霉素、多西紫杉醇、盐酸吉西他滨、盐酸伊立替康、氟尿嘧啶或香菇多糖、姜黄素等抗肿瘤药物，亦得到相同或相近的结果。实际应用中，可根据具体的癌症类型选择相应的抗肿瘤药物与聚苯丙氨酸PPhe按照本发明的方法合成纳米递药体系，增强抗肿瘤药物的治疗效果的有效性、可控性和安全性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种聚氨基酸的纳米载药体系，其特征在于，通过如下任一种方法制备得到：
(I)将氨基酸聚合物、抗肿瘤药物和稳定剂分别溶解到有机溶剂中，得到聚氨基酸溶液、抗肿瘤药物溶液和稳定剂溶液；然后将三种溶液混合均匀后滴加至水中，使其自组装成载药纳米粒，得到聚氨基酸纳米载药体系；
或
(II)将氨基酸聚合物和抗肿瘤药物分别溶解到有机溶剂中，得到聚氨基酸溶液和抗肿瘤药物溶液；然后将聚氨基酸溶液和抗肿瘤药物溶液滴加到含有稳定剂的水溶液中，使其自组装成纳米粒，得到聚氨基酸纳米载药体系；
方式(I)和(II)中所述的氨基酸聚合物通过如下方法制备得到：
S1、在冰水浴条件下，将氯化亚砜缓慢滴加到溶剂中，搅拌混合均匀，得到混合溶液；其中，溶剂为无水吡啶或含有二甲基甲酰胺的二氯甲烷溶液；
S2、将氨基酸缓慢加入到步骤S1中得到的混合溶液中，在0～55℃条件下搅拌反应，得到氨基酸聚合物；
步骤S2中所述的氨基酸为苯丙氨酸；
步骤S2中所述的氨基酸与所述氯化亚砜的摩尔比为1：1～2；
方式(I)和(II)中所述的抗肿瘤药物为紫杉醇；
方式(I)和(II)中所述的稳定剂为DSPE-PEG2000；
方式(I)和(II)中所述的氨基酸聚合物与抗肿瘤药物的质量比为1：0.20～0.40。
2.根据权利要求1所述的聚氨基酸的纳米载药体系，其特征在于：
步骤S2中所述的氨基酸为L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸或L,D-苯丙氨酸；
步骤S2中所述的反应的温度为25～40℃；
步骤S2中所述的反应的时间为0.5～24h。
3.根据权利要求1所述的聚氨基酸的纳米载药体系，其特征在于：
方式(I)和(II)中所述的有机溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃中的一种或多种；
方式(I)和(II)中所述的氨基酸聚合物溶液的浓度为5～50mg/mL；
方式(I)和(II)中所述的抗肿瘤药物溶液的浓度为5～50mg/mL；
方式(I)和(II)中所述的稳定剂溶液的浓度为5～50mg/mL；
方式(I)和(II)中所述的稳定剂的用量占氨基酸聚合物质量的0～75％，不包括0。
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