KR20130098839A - 인간 ｌｐｉｎ３ 단백질 유래의 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 LPIN3 단백질 유래의 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템에 관한 것으로, (1)인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호(nuclear localization signal) 서열를 포함하는 세포막 투과 도메인, 및 (2)상기 세포막 투과 도메인과 융합된 재조합 카고를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 카고 전달 방법을 제공한다. 본 발명의 세포막 투과 도메인은 종래의 세포 투과 펩티드에 비하여 높은 효율로 카고 단백질을 세포 내로 도입할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 단백질에서 유래한 폴리펩티드 서열로서, 면역 반응 문제를 유발시킬 염려가 없는 바, 다양한 고분자 물질을 인체의 세포 내로 전달하는 신호서열로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

인간 ＬＰＩＮ３ 단백질 유래의 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템{Cell penetrating peptide derived from human LPIN3 protein and cargo delivery system using the same}

본 발명은 세포 투과 펩티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간 LPIN3 단백질 유래의 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템에 관한 것이다.

일반적으로, 살아있는 세포는 단백질 및 핵산과 같은 거대 분자에 대해서 불투과성이다. 일부 작은 물질들만이 매우 낮은 비율로 살아있는 세포의 세포막을 통과하여 세포 내부의 세포질 또는 핵으로 들어갈 수 있는 반면에, 거대분자는 세포 내부로 들어갈 수 없다는 사실은, 단백질 또는 핵산을 포함하는 거대분자를 이용한 치료, 예방 및 진단에 대한 제한 요인이 되고 있다. 한편, 대부분의 치료, 예방 및 진단의 목적으로 제조되는 물질들은, 이것의 진단, 예방 및 치료학적 유효량이 세포내로 전달되어야 하므로 이들을 세포 외부나 표적 세포의 표면에서 작용시켜 세포내로 전달시키기 위한 여러 가지 방법들이 개발되었다. 이와 같이, 생체 외(in vitro)에서 세포 내로 거대 분자를 전달하는 방법에는 전기충격(electroporatio), 리포좀을 이용한 막 융합, 표면에 DNA가 코팅된 미세 투사체를 이용한 고농도 투사법, 칼슘-인-DNA 침전체를 이용한 배양법, DEAE-덱스트란을 이용한 트랜스펙션(trasnfection), 변형된 바이러스 핵산을 이용한 감염, 단일 세포로 직접 미세 주입하는 방법 등이 있다. 그러나, 이러한 방법들은 전형적으로 거대 분자를 주입시키고자 하는 전체 세포 수 중에서 단지 일부에만 전달할 수 있을 뿐이며, 다른 많은 수의 세포에 바람직하지 않은 영향을 주는 경향이 있다. 또한, 생체 내에서 세포 내로 거대 분자를 실험적으로 이동시키는 방법으로서, 칼슘-인 침전, 라이포좀 등을 이용하는 방법이 있으나, 이러한 기술들은 생체 내에서 세포 내로 물질을 전달함에 있어 그 사용이 극히 제한적이라는 문제점이 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위한 연구의 결과로서 제시된 것으로 세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide, CPP)(단백질 전달 도메인(protein transduction domain, PTD) 또는 막 전달 서열(membrane translocating sequence, MTS)라고도 칭하나, 본 발명에서는 세포 투과 펩티드(CPP)로 통일하여 지칭하도록 한다.)가 있다. 이러한 CPP는 양전하를 띄는 짧은 길이의 펩티드로서, 세포막을 통과할 수 있다고 알려져 있으며, 단백질뿐 아니라 DNA, RNA, 지방, 탄수화물, 화합물 또는 바이러스까지도 효율적으로 세포 내로 전달할 수 있는 것으로 알려져 있다. CPP가 세포막을 투과하는 원리는 아직 밝혀지지 않았으나, 수용체 비의존적이고, 엔도사이토시스(endocytosis)나 파고사이토시스(phagocytosis)에 비의존적이라고 생각되고 있다.

종래 가장 널리 알려진 CPP로는 HIV-1 TAT, HSV-1 VP22, 초파리의 Antp, 쥐의 전사인자의 Mph-1(대한민국 특허공개번호 제2004-0083429호), 그리고 최근에 밝혀진 HP4(PCT특허 출원번호 PCT/KR2006/000759, PCT/KR2006/000790) 등이 있다. 그 중 HIV-1(Human immunodeficiency virus-1) Tat 단백질은 세포막을 투과하는 현상이 확인된 첫 번째 단백질이다(Mann, D. A. et al., Embo J 10 : 1733-1739, 1991). 상기 Tat 단백질이 세포막을 투과하는데 결정적인 역할을 하는 11개의 아미노산 서열인 'YGRKKRRQRRR'이 CPP이고, 이를 TAT이라 칭한다. 상기 TAT을 이용해 β-galactosidase, horseradish peroxidase, RNase A, PE 도메인(domain of Pseudomonas exotoxin A(PE)) 등을 세포 내로 전달해서 그 기능과 세포 내의 위치(localization)에 대한 연구가 진행된 바 있다(Fawell, S. et al., PNAS 91 : 664-668, 1994). 또 다른 CPP로 알려져 있는 것 중 HSV-1(Herpes simplex virus type 1)이 발현하는 단백질인 VP22로부터 유래한 동명의 세포막 투과 펩티드가 있다. 상기 BVP22는 'DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE'인 34개의 아미노산 서열로 이루어졌다. 상기 VP22 CPP 역시 단백질의 세포 내 전달 기작 연구 등을 위하여 Viral nucleoprotein, Bovine IFN-γ, Viral F protein 등을 세포내로 전달하는 실험에 이용된 바 있다(Dilber, M. S. et al., Gene Ther 6 : 12-21, 1999). 또한, 초파리의 발생과정에 필수적인 전사인자인 Antennapedia homeoprotein으로부터 유래한 16개의 아미노산 서열로 구성된 Penetratin(Antp)이라는 CPP, 그리고 인공적으로 조합/합성해낸 세포막 투과 펩티드인 27개의 아미노산 서열로 이루어진 Transportan이 있다(Barany-wallje, E. et al., Biophysical Journal 89 : 2513-2521, 2005, Pooga, M. et al., FASEB J 12 : 67-77, 1998). 뿐만 아니라, 인간과 가장 유사한 종인 쥐의 단백질로부터 유래된 세포막 투과 펩티드인 Mph-1(Hph-1)을 이용해서 면역 세포의 전사인자를 세포내로 전달해 면역 질환이 유도된 쥐의 질병 모델이 질병의 완화 및 치료 효과를 보인 연구결과도 있다(Choi, J. M. et al., Nat. Med. 12 : 574-579, 2006). CPP가 생체 내에서도 효과적으로 작용하며, 이를 이용한 단백질의 전달이 생체 내의 세포에서 효과적으로 그 기능을 수행함을 보인 연구라 할 수 있다.

상기와 같은 종래의 CPP들은 모두 세포 에너지를 이용하여 특정 수용체나 채널 분자의 도움 없이 외부로부터 세포 내로 단백질을 전달할 수 있게 해 준다(Kelly, M. S. et al., Org. Biomol. Chem. 6 : 2242-2255, 2008). 또한, 단백질 뿐만 아니라 핵산이나 지방 등의 다른 고분자들을 세포내로 전달하는 것도 가능하다고 알려져 있어, 이를 이용한 유전자의 세포내 도입 혹은 치료 약물의 세포내 전달 등에 의한 연구가 진행되고 있는 상황이다(Lim, S. J. et al., BioWave 8 : No 14, 2006).

상기와 같이, 세포 내로 단백질과 같은 고분자 물질을 세포내로 전달하기 위해 종래 수많은 연구를 통해 다양한 세포막 투과 펩티드들이 발견되거나 개발되어 왔다. 하지만 상기와 같이 종래의 세포막 투과 펩티드들은 HIV-1 또는 초파리 등과 같이 다른 종이 발현하는 단백질에서 유래한 것이거나, 세포막 투과 펩티드를 구성하는 아미노산 서열을 통해 인공적으로 합성해 낸 아미노산 서열이었다. 이와 같이 CPP로서 역할을 하는 펩티드들이 인간에서 유래하지 않았다는 점으로 인하여, 인체에 적용해서 사용할 때에 원하지 않는 면역반응이 일어나는 등 부작용이 발생할 여지가 있다. 또한 종래의 세포막 투과 펩티드들은 10개 이상(VP22의 경우 34개의 아미노산으로 구성됨)의 긴 아미노산 사슬로 이루어져 있기 때문에 상기와 같은 원치 않는 면역반응을 일으킬 가능성이 더 커지게 된다. 뿐만 아니라, 이렇게 긴 아미노산 서열의 CPP와 카고 물질이 융합된 재조합 물질의 상산에 비효율적인 영향을 나타낼 여지가 있다.

이에, 종래의 비인간 유래의 단백질에서 유래한 CPP들을 대체하면서도 높은 효율로 카고 물질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 인간 유래 CPP의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명의 목적은 높은 효율로 카고 물질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 인간 유래 세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide)를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호(nuclear localization signal) 서열를 포함하는 세포막 투과 도메인을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다른 측면은 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고 단백질이 융합된 재조합 카고 단백질을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 재조합 카고 단백질을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 카고 전달 방법을 제공한다.

본 발명의 인간 LPIN3 단백질 유래 세포막 투과 도메인은 종래의 세포 투과 펩티드에 비하여 높은 효율로 카고 단백질을 세포 내로 도입할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 단백질에서 유래한 폴리펩티드 서열로서, 면역 반응 문제를 유발시킬 염려가 없는 바, 다양한 고분자 물질을 인체의 세포 내로 전달하는 신호서열로서 유용하게 이용될 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제작한 인간 LPIN3 유래의 세포막 투과 도메인과 EGFP의 융합 단백질(재조합 EGFP 융합 단백질)을 코딩하는 PCR 산물인 766bp의 이중사슬 DNA 절편을 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인한 젤 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 제작한 재조합 EGFP 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 pRSET-b 벡터)를 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 절단하고 1% 아가로스 젤 전기영동하여, 상기 재조합 pRSET-b 벡터에 실시예 1에서 제작한 766bp의 재조합 EGFP 융합 단백질의 유전자가 제대로 삽입되었음을 확인한 젤 사진이다.
도 3은 재조합 pRSET-b 벡터의 맵을 나타내는 것으로서, LP3P는 인간 LPIN3 유래의 세포막 투과 도메인을 나타내는 것이고; LP3P-EGFP는 재조합 EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 4는 재조합 EGFP 융합 단백질과 야생형(wild type) EGFP 단백질을 12% SDS 젤로 전기영동한 젤 사진으로서, LP3P-EGFP는 재조합 EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이다.
도 5는 재조합 EGFP 융합 단백질이 농도 의존적으로 Jurkat 세포 내로 도입되었음을 나타내는 세포 내 형광 강도 분석 그래프로서, LP3P-EGFP는 재조합 EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이다.
도 6은 재조합 EGFP 융합 단백질이 시간 의존적으로 Jurkat 세포 내로 도입되었음을 나타내는 세포 내 형광 강도 분석 그래프로서, LP3P-EGFP는 재조합 EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이다.
도 7은 본 발명의 세포막 투과 도메인과 종래의 CPP들의 세포 내 도입 효율을 비교한 결과로서, (a)는 시간에 따른 카고의 전달 효율을 비교한 그래프이고, (b)는 2시간 경과 시점에서의 카고 전달 효율을 비교한 그래프이다. 상기 도 7의 (a) 및 (b)에서, EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이고; LP3P-EGFP는 재조합 EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; Hph-1-EGFP는 Hph-1과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이며, TAT-EGFP는 TAT과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 8은 온도의 변화(a) 및 배지 내 혈청 농도의 변화(b)에 따른 본 발명의 세포막 투과 도메인의 세포 내 카고 전달 효율의 변화를 종래의 세포막 투과 펩티드들과 비교한 그래프로서, EGFP는 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 나타내는 것이고; LP3P-EGFP는 재조합 EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; Hph-1-EGFP는 Hph-1과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이며, TAT-EGFP는 TAT과 EGFP의 융합 단백질을 나타내는 것이다.
도 9는 엔도사이토시스 저해제인 MβCD(a) 및 헤파린(Heparin)(b)의 처리에 따른 본 발명의 세포막 투과 도메인의 세포 내 카고 전달 효율의 변화를 종래의 세포막 투과 펩티드들과 비교한 그래프로서, 도 9의 (a)에서 Untreated는 아무 것도 처리하지 않은 것이고; LPIN-EGFP 5μM는 5 μM의 재조합 EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; LPIN-EGFP 5μM + MβCD 5mM은 5 μM의 재조합 EGFP 융합 단백질과 5 mM의 MβCD를 함께 처리한 것이며, 도 9의 (b)에서 Untreated는 아무 것도 처리하지 않은 것이고; LPIN-EGFP 5μM는 5 μM의 재조합 EGFP 융합 단백질을 나타내는 것이고; LPIN-EGFP 5μM + Heparin 5mM은 5 μM의 재조합 EGFP 융합 단백질과 5 mM의 헤파린을 함께 처리한 것을 나타낸다.
도 10은 재조합 EGFP 융합 단백질이 HeLa 세포 내로 전달되었음을 확인한 현미경 사진이다.
도 11은 재조합 EGFP 융합 단백질이 인 비트로(in vitro) 환경에서 뿐만 아니라, 인 비보(in vivo) 환경에서도 카고를 표적 세포 내로 전달할 수 있는지 여부를 확인한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.

먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.

본 발명에서 일컫는 '펩티드(peptide)'는 펩티드 결합에 의해 4개 내지 50개의 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 사슬 형태의 고분자를 의미하며, '폴리펩티드'와 상호 혼용가능한 의미이다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)'는 염기, 당, 인산의 세 가지 요소로 구성된 화학적 단량체인 뉴클레오티드가 다수의 인산에스테르 결합을 매개로 사슬 형태로 이어진 고분자 화합물을 의미한다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '세포막 투과 펩티드(cell penetrating peptide, CPP)'는 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상인 카고를 세포 내로 전달할 수 있는 능력을 가진 펩티드를 의미하며, '세포막 투과 도메인'과 상호 혼용가능한 의미이다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '카고(cargo)'는 상기 세포막 투과 도메인에 결합되어 세포 내로 전달됨으로써 생체 내의 모든 생리 현상을 조절하는 생물학적 활성을 갖는 기능조절 물질로서, 본래 세포 내로 도입될 수 없거나, 본래 유용한 속도로 세포 내로 도입될 수 없는 벡터, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 지방, 탄수화물, 및 항암제, 면역질환 치료제, 항바이러스 치료제, 동물의 성장, 발달 또는 분화인자 등과 같이 세포의 기능을 조절할 수 있는 화합물 등과 같은 화학 물질을 의미한다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '재조합 카고'란 세포막 투과 도메인 및 한 개 이상의 카고가 유전적 융합이나 화학 결합에 의해 재조합되어 형성된 복합체를 의미한다.

또한, 본 발명에서 일컫는 '접촉'이란 카고 또는 재조합 카고가 진핵 또는 원핵세포와 접하는 것을 의미하며, 이러한 접촉에 의하여 상기 카고 또는 재조합 카고가 상기 진핵 또는 원핵세포의 내로 전달된다.

아울러, 본 발명에서 단백질, 펩티드, 유기화합물 등을 세포 내로 '도입'시키는 것에 대하여 '운반', '침투', '수송', '전달', '투과' 또는 '통과'한다는 표현들과 상호 혼용한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고

본 발명의 일 측면은 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호(nuclear localization signal) 서열을 포함하는 세포막 투과 도메인을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 세포막 투과 도메인; 및 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 카고를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고를 제공한다.

본 발명의 세포막 투과 도메인은 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호(nuclear localization signal) 서열을 포함한다.

상기 세포막 투과 도메인은 9개 내지 50개의 아미노산으로 구성될 수 있고, 상기 세포막 투과 도메인은 9개 내지 30개의 아미노산으로 구성되는 것이 바람직하다. 상기 세포막 투과 도메인은 9개 내지 20개의 아미노산으로 구성되는 것이 더욱 바람직하고, 상기 세포막 투과 도메인은 9개 내지 15개의 아미노산으로 구성되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.

상기 세포막 투과 도메인이 9개 내지 50개의 아미노산으로 구성되는 경우, 상기 세포막 투과 도메인은 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열의 N-말단 또는 C-말단에 0개 내지 41개의 아미노산이 추가적으로 결합되어 구성될 수 있다. 상기와 같이 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열의 N-말단 또는 C-말단에 추가되는 아미노산 서열 또한 인간 LPIN3 단백질에서 유래한 것이 바람직하고, 서열번호 7로 구성되는 인간 LPIN3 단백질의 폴리펩티드 서열 중 연속되는 일부 서열로서, 핵 위치 신호 서열을 포함하는 서열일 수 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 상기 세포막 투과 도메인은 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열 자체만으로 구성될 수 있다.

상기 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열은 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 서열번호 1로 기재되는 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열은 851개의 아미노산으로 구성되는 서열번호 7의 인간 LPIN3 단백질 서열 중 141번째 내지 149번째 아미노산에 해당하는, 9개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이다. 상기 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열은 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상인 카고를 세포 내로 전달할 수 있는 능력이 있어 본 발명의 세포막 투과 도메인 자체 또는 그 일부로서 이용될 수 있다. 상기 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열은 상기 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이면 특별히 제한되지 아니하나, 상기 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열은 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 세포막 투과 도메인은 종래 잘 알려진 CPP인 TAT이나, Mph-1(Hph-1)에 비하여 카고를 세포 내로 도입시키는 효율이 우수하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 9개의 아미노산으로 이루어진 서열번호 1(RRKRRRRRK)로 구성된 세포막 투과 도메인을 EGFP 단백질에 융합하여 Jurkat 세포와 HeLa 세포에 처리한 결과, EGFP의 세포 도입 효율이 현저히 향상됨을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조). 또한, 종래의 TAT 서열이나 Mph-1(Hph-1) 서열에 비하여 EGFP의 세포 도입 효율이 더욱 향상됨을 확인하였다(도 7의 (a) 및 (b) 참조).

본 발명의 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에는 카고가 결합될 수 있다. 상기 카고는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 지방, 탄수화물, 및 항암제, 면역질환 치료제, 항바이러스 치료제, 동물의 성장, 발달 또는 분화인자 등과 같이 세포의 기능을 조절할 수 있는 화합물 등과 같은 화학 물질일 수 있다. 상기 카고는 상기 세포막 투과 도메인과 융합하거나, 화학적 또는 물리적 방법에 의해 결합됨으로써 진핵 또는 원핵세포 내로의 도입 효율이 향상된다. 특히, 상기 카고가 단백질(카고 폴리펩티드)인 경우, 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고 단백질(카고 폴리펩티드)이 융합된 재조합 카고 단백질(재조합 카고 폴리펩티드)이 되고, 야생형(wild type)의 카고 단백질에 비하여 세포 내 도입 효율이 향상된다.

상기 카고의 물리적 또는 화학적 성질은 카고의 세포 내 도입 효율에 큰 영향을 미치지 아니한다. 비록, 상기 카고는 크기에 따라 세포 내 도입 효율에 미차가 발생할 수 있으나, 이는 도입 효율의 차이일 뿐, 상기 카고는 크기에 관계없이 상기 세포막 투과 도메인에 의하여 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포막 투과 도메인에 결합되어 세포 내로 도입될 수 있는 카고의 종류에는 원칙적으로 제한이 없다. 특히, 상기 카고가 단백질(또는 폴리펩티드)인 경우, 상기 카고는 약물로 활용 가능성이 높은 인간 유래의 단백질 일 수 있고, 상기 인간 유래의 단백질은 그 크기가 약 150 kDa 이하인 것이 바람직하며 상기 세포막 투과 도메인에 의하여 효율적으로 세포 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 1로 기재되는 세포막 투과 도메인에 EGFP 단백질이 융합된 서열번호 6의 재조합 EGFP 융합 단백질과 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 각각 Jurkat 세포와 HeLa 세포에 처리하여 세포 내 도입 효율을 비교한 결과, 서열번호 6의 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율이 야생형의 EGFP 단백질에 비해 현저히 우수함을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조). 상기와 같은 결과로부터, 서열번호 1로 기재되는 세포막 투과 도메인에 의하여 카고 물질인 EGFP 단백질의 세포 내 도입 효율이 현저히 향상됨을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 1로 기재되는 세포막 투과 도메인에 EGFP 단백질이 융합된 서열번호 6의 재조합 EGFP 융합 단백질과 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 각각 마우스에 주입하여, 간, 신장, 장 및 복부 지방 조직의 세포 내부로 상기 EGFP가 도입 효율을 비교한 결과, 서열번호 6의 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율이 야생형의 EGFP 단백질에 비해 현저히 우수함을 확인하였다(도 11 참조). 상기와 같은 결과로부터, 서열번호 1로 기재되는 세포막 투과 도메인에 의하여 카고 물질인 EGFP 단백질의 세포 내 도입 효율이 인 비트로(in vitro) 환경에서 뿐만 아니라, 인 비보(in vivo) 환경에서도 현저히 향상됨을 알 수 있다.

2. 세포막 투과 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

본 발명의 다른 측면은 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목에서 설명된 세포막 투과 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고 단백질 발현용 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 상기 유전자 컨스트럭트는 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호(nuclear localization signal) 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

상기 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열에 관해서는 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 이하에서는 상기 유전자 컨스트럭트에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드 서열을 갖는 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이면 특별히 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

상기 유전자 컨스트럭트는 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 벡터를 이용하여 세포막 투과 도메인을 반복적으로 양산해 낼 수 있다. 뿐만 아니라, 세포 내로 도입되어야 하는 카고가 특히 단백질인 경우, 상기 유전자 컨스트럭트가 포함된 발현 벡터의 다중 클로닝 부위(multi-cloning site, MCS)에 상기 카고 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킴으로써, 세포막 투과 도메인과 상기 카고 단백질이 융합된 재조합 카고 단백질을 양산할 수 있다. 즉, 상기의 발현 벡터를 이용하여 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목에서 설명된 재조합 카고 단백질 용이하게 반복적으로 양산할 수 있는 것이다. 상기 벡터에 의하여 양산된 재조합 카고 단백질은 야생형(wild type)의 카고 단백질에 비하여 보다 높은 효율로 세포 내 도입될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 2로 기재되는 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 EGFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결합된 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 제조하고, 이를 pRSET-b 벡터에 삽입함으로써 도 2와 같은 맵의 재조합 발현 벡터를 제조하였다(도 2 참조). 상기 벡터를 대장균 BL21(DE3)star pLysS 균주에 형질전환하여 상기 재조합 EGFP 융합 단백질을 반복적으로 양산하였고, 이를 분리 및 정제하여 Jurkat 세포 및 HeLa 세포에 처리한 결과, EGFP의 세포 내 도입 효율이 야생형(wild type)에 비하여 향상됨을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조).

3. 세포막 투과 도메인을 이용한 세포 내로의 카고 전달 방법

본 발명의 또 다른 측면은 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고가 융합된 재조합 카고를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 재조합 카고를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 카고 전달 방법을 제공한다.

본 발명의 세포 내로의 카고 전달 방법은 1) 재조합 카고를 제조하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서 제조된 재조합 카고를 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다.

상기 단계 1)의 재조합 카고는 상기 "1. 세포막 투과 도메인 및 이를 포함하는 재조합 카고 " 항목에서 설명한 인간 LPIN3 유래의 세포막 투과 도메인과 카고가 유전적 융합 또는 화학적 결합에 의하여 재조합됨으로써 형성된 복합체를 의미하는 것으로서, 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고를 물리적 또는 화학적으로 결합하여 제조할 수 있다. 이러한 재조합 카고의 제조는 카고의 물리적 또는 화학적 성질에 따라 당업자가 적절한 방법을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 카고가 단백질인 경우에는 상기 세포막 투과 도메인과 카고를 인위적인 펩티드 결합으로 화학 결합시킬 수도 있지만, 상기 "2. 세포막 투과 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 " 항목에서 설명한 재조합 카고 단백질 발현용 발현 벡터를 이용함으로써 반복적으로 양산할 수 도 있다. 그러나, 이는 재조합 카고를 제조하는 한 예시일 뿐, 그 방법이 이에 한정되지 아니하고, 당업자가 적절한 방법을 선택하여 적절히 제조할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 서열번호 2로 기재되는 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 EGFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결합된 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드를 제조하고, 이를 pRSET-b 벡터에 삽입함으로써 도 2와 같은 맵의 재조합 발현 벡터를 제조하였다(도 2 참조). 상기 벡터를 대장균 BL21(DE3)star pLysS 균주에 형질전환하여 상기 재조합 EGFP 융합 단백질을 반복적으로 양산하였고, 이를 분리 및 정제하여 재조합 카고인 재조합 EFGP 단백질을 제조하였다.

상기 단계 2)의 재조합 카고와 세포의 접촉은 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 수행될 수 있다. 상기 접촉이 인 비트로(in vitro) 상에서 진행될 경우, 시험관 내의 세포에 재조합 카고가 포함된 배지를 처리하여 세포를 배양시키는 과정에 의해 상기 접촉이 이루어진다. 상기 접촉이 인 비보(in vivo) 상에서 진행될 경우, 상기 재조합 카고는 근육내(intramuscular), 복막내(intraperitoneal), 정맥내(intravein), 경구(oral), 비내(nasal), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 점막(mucosal) 또는 흡입(inhale) 등의 경로를 통해 생체 내로 주입(injection)되고, 생체 내에서 세포와 재조합 카고의 접촉이 이루어지게 된다.

상기 단계 2)의 재조합 카고와 세포의 접촉에 의하여 상기 재조합 카고가 세포 내로 도입되게 된다. 상기 재조합 카고의 도입은 ⅰ) 처리되는 재조합 카고의 농도가 높으면 높을수록 재조합 카고의 도입 양이 증가하고, ⅱ) 재조합 카고가 처리되는 시간이 길면 길수록 재조합 카고의 도입 양이 증가한다. 본 발명의 인간 LPIN3 단백질 유래 세포막 투과 도메인은 에너지-의존적이면서도, 다른 물질들과 상호 경쟁적인 작용 기작에 의하여 카고를 세포 내로 도입한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 재조합 EGFP 융합 단백질을 처리하고 온도를 달리하여 배양한 결과, 온도가 낮아질수록 재조합 EGFP 융합 단백질이 세포막을 통과하여 세포 안으로 도입되는 효율이 낮아지는 것을 확인하였다(도 8의 (a) 참조). 또한, 배지에 첨가한 혈청의 농도를 각각 10%, 50% 및 100%로 달리하여 5μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질을 제조하여 Jurkat 세포에 처리한 결과, 다른 단백질들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 세포막 투과 도메인의 카고 전달 효율이 영향을 받는 다는 점을 간접적으로 확인하였다(도 8의 (b) 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 Jurkat 세포에 재조합 EGFP 융합 단백질과 함께 MβCD 또는 헤파린을 첨가한 결과, 본 발명의 인간 LPIN3 단백질 유래 세포막 투과 도메인이 다른 단백질들과의 상호작용을 통해 엔도사이토시스되는 메커니즘으로 세포 내로 카고를 전달함을 간접적으로 확인하였다(도 9 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

인간 LPIN3 유래의 세포막 투과 도메인과 EGFP의 융합 단백질(재조합 EGF 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 제작

인간 LPIN3 단백질 유래의 세포막 투과 도메인과 EGFP의 융합단백질(재조합 EGFP 융합 단백질)을 코딩하는 염기 서열을 제작하기 위하여, ①NheI 제한효소 인식 부위, ②인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열(서열번호 1)을 코딩하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열, ③BamHI 제한효소 인식 부위 및 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 3의 정방향 프라이머를 제작하였고(코스모진텍), ①HindIII 제한효소 인식 부위 및 ②EGFP의 C-말단 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 4의 역방향 프라이머를 제작하였다(바이오닉스). 상기 서열번호 3의 정방향 프라이머에서 ①NheI 제한효소 인식 부위는 DNA 클로닝을 위한 것이고, ③BamHI 제한효소 인식 부위는 상기 ②서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 연결하기 위한 것이다. 또한, 상기 서열번호 4의 역방향 프라이머의 ①HindIII 제한효소 인식 부위도 DNA 클로닝을 위한 것이다.

EGFP유전자가 포함된 pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 인간 LPIN3 유래의 세포막 투과 도메인과 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하였다. 상기 PCR 반응은 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95℃에서 주형의 열 변성으로 20초, 50℃에서 프라이머와 주형의 결합으로 20초, 72℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 35주기를 PCR 반응기(Biorad)를 이용하여 수행하였다. 상기와 같이 제작된 폴리뉴클레오티드 서열은 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인하였다.

그 결과, 766bp의 폴리뉴클레오티드 절편이 제작되었음을 확인하였다(도 1).

재조합 EGFP 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 pRSET-b 벡터)의 제조

서열번호 6의 재조합 EGFP 융합 단백질을 발현시키기 위해 상기 실시예 1에서 제조한 766bp의 폴리뉴클레오티드 절편을 제한효소 및 연결효소를 이용하여 단백질 발현 벡터인 pRSET-b에 삽입하여 도 3과 같은 구조의 벡터를 제조하였다. 보다 구체적으로는 하기와 같이 제조된다.

상기 실시예 1에서 제조된 폴리뉴클레오티드 절편을 NheI과 HindIII(NEB)로 DNA의 5' 및 3' 말단이 접착성 말단(sticky end)이 되도록 효소 반응시키는 한편, 같은 두 개의 제한효소를 이용하여 pRSET-b 벡터를 효소 반응시켜 NheI, HindIII 삽입 부위를 갖는 선형의 pRSET-b 벡터를 만들었다. 각각의 효소 반응 이후에는 PCR 정제 키트(코스모진텍)를 이용하여 분리하였다. 상기와 같이 분리된 재조합 EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편과 pRSET-b 벡터를 5℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase(NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응시켰다. 상기와 같이 재조합 EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 삽입된 원형의 pRSET-b 벡터를 DH5α 대장균 균주에 형질전환 시켜 항생제인 50 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균 콜로니는 다시 50 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)을 포함하는 액체 LB 배지에 접종하여 배양하였으며, 이후 플라스미드 Mini Preparation 키트(코스모진텍)를 이용하여 플라스미드 벡터를 분리하였다.

상기와 같은 과정을 통해 분리된 플라스미드 벡터가 재조합 EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 삽입된 pRSET-b 벡터(재조합 pRSET-b 벡터)인지 여부를 확인하기 위하여 일차적으로 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 효소 반응시킨 후, 1% 아가로스 젤 전기영동시켜 확인하였고, 잘려진 단편의 염기 서열을 분석하였다.

그 결과, 766bp에 해당하는 재조합 EGFP 융합 단백질의 폴리뉴클레오티드 절편이 2.9kbp에 해당하는 pRSET-b 벡터에 삽입되어 있는 것을 확인하였고(도 2), 766bp에 해당하는 밴드를 일루션(elusion)하여 염기서열을 분석한 결과, 상기 벡터 내에 삽입된 폴리뉴클레오티드가 서열번호 5의 염기서열을 가짐을 확인하였다.

대장균을 이용한 재조합 EGFP 융합 단백질의 발현 및 정제

재조합 EGFP 융합 단백질을 발현 및 정제하기 위하여, 상기 실시예 2에서 제조된 재조합 pRSET-b 벡터를 액체 LB 배지 상태(100 ㎕)의 대장균 BL21(DE3)star pLysS 균주에 첨가해 준 뒤, 42℃로 가열한 항온 수조에서 45 초간 열 활성(Heat Shock)기법으로 형질전환 시킨 후 항생제인 34 ㎍/㎖의 클로람페니콜(chloramphenicol)과 50 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 평판 배지에서 형성된 콜로니를 액체 LB 배지 50 ㎖에 접종하여 37 ℃에서 14시간 배양한 다음, 이를 새로운 액체 LB 배지 500 ㎖에 접종하였다. 동일한 온도에서 O.D 값이 0.5가 될 때까지 대장균을 배양한 후, IPTG를 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하여 온도를 20℃로 낮추고, 150 rpm으로 회전하는 진탕 배양기에서 14 시간 동안 더 배양하여 대장균 내에서 pRSET-b 벡터에 삽입된 재조합 EGFP 융합 단백질이 발현되도록 하였다. 상기와 같이 대장균주에서 발현된 단백질은 pRSET-b 벡터에 의하여 자체적으로 재조합 EGFP 융합 단백질의 N-말단 부분에 발현되도록 코딩된 6X-His tag을 포함하고 있다. 상기 6X-His tag을 이용해 하기와 같은 방법으로 재조합 EGFP 융합 단백질을 정제하였다.

배양액을 원심분리로 모은 후 원 조건(native condition)의 용해용액(0.5M NaCl, 5mM imidazole, 20mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 재부유시켰다. 대장균의 세포벽과 세포막을 깨뜨리기 위해 용해용액에 부유해 있는 상태로 10분간 놓아둔 다음, 초음파 세포 파쇄기(VCX-130(Sonics & Materials))를 이용하여 세포를 분쇄하고 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액은 0.45㎛ 필터(Advantec)를 이용해 한번 거른 뒤, Ni-NTA 아가로스(agarose)(Qiagen)와 상온에서 1시간 동안 결합시키고, 히스티딘 칼럼(His-column, Biorad)을 이용해 Ni-NTA 아가로스(agarose)와 결합된 단백질 산물만이 컬럼(column)에 결합될 수 있도록 하였다. 20mM의 이미다졸(imidazole) 용액으로 세척한 뒤, 250mM의 이미다졸(imidazole) 용액을 이용해 최종적으로 용출(elution)해 내었다. 상기와 같이 용출된 단백질 산물은 PD-10 탈염 칼럼(Amersham Bioscience)에 적용하여 분리함으로써, 서열번호 6으로 기재되는 재조합 EGFP 융합 단백질을 정제하였다(도 4).

Jurkat 세포 내로의 재조합 EGFP 융합 단백질의 도입

상기 실시예 3에서 정제된 재조합 EGFP 융합 단백질을 암화된 인간 T 세포의 세포주인 Jurkat 세포주 내로 도입하면서 그 효율을 확인하였다. Jurkat 세포를 RPMI 배지(HyClone)로 배양하고, 350 ㎕의 RPMI 배지를 분주해 놓은 24-웰(24-well) 플레이트(SPL lifescience)의 각 웰에 세포수가 1×10⁶ 개만큼 들어있는 100㎕의 RPMI 배지를 첨가하여 세포를 분주했다. 처리할 재조합 EGFP 융합 단백질은 제조할 농도에 따른 적절한 양을 50 ㎕의 D-PBS(WelGen)와 혼합하여, 총 부피가 500㎕가 되도록 제조하여 상기 Jurkat 세포주에 처리하였다.

<4-1> 처리 농도에 따른 도입 효율 분석

재조합 EGFP 융합 단백질의 농도에 따른 도입 효율을 분석하기 위하여, 각각 1 μM 및 5 μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질을 5% CO₂ 세포 배양기에서 37℃로 2시간 동안 처리하였다. 대조군으로 인간 LPIN3 단백질 유래의 세포막 투과 도메인이 연결되어 있지 않은 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 처리하였다. 2시간 경과 후, 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고 원심분리를 이용해 상층액을 제거하였다. 또한, 세포 표면에 묻어있거나 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록 D-PBS 1㎖를 이용해 세척하며 재 부유시키고 원심분리 하는 과정을 2회 반복하였다. 상기와 같은 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 최종적으로 500 ㎕의 D-PBS로 재부유시켜 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScalibur)로 세포 내 형광을 측정하여 상기 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정하였다.

그 결과, 처리된 재조합 EGFP 융합 단백질의 농도에 의존적으로 상기 재조합 EGFP 융합 단백질이 Jurkat 세포 내로 전달되었음을 확인하였다(도면 5).

<4-2> 처리 시간에 따른 도입 효율 분석

5 μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질을 Jurkat 세포가 분주되어 있는 플레이트의 각 well에 처리하고 5% CO₂ 세포 배양기에서 37℃로 30분 내지 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로 인간 LPIN3 단백질 유래의 세포막 투과 도메인이 연결되어 있지 않은 야생형(wild type)의 EGFP 단백질을 처리하였다. 상기 각각의 시간 동안 단백질을 도입시킨 다음, 상기 실시예 <4-1>과 같은 방법으로 세포를 회수하여 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScalibur)로 세포 내 형광을 측정하여 상기 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정하였다.

그 결과, 재조합 EGFP 융합 단백질은 처리 시간에 의존적으로 상기 재조합 EGFP 융합 단백질이 Jurkat 세포 내로 전달되었음을 확인하였다. 특히, 9시간까지 세포 내로 도입된 단백질의 양이 꾸준히 증가됨을 확인하였다(도 6).

<4-3> 다른 종류의 세포막 투과 도메인과의 도입 효율 비교

인간 LPIN3 단백질 유래의 세포막 투과 도메인과 종래의 세포막 투과 도메인들의 도입 효율을 비교하기 위하여, 동일한 조건에서 다른 세포막 투과 도메인들을 이용하여 EGFP를 Jurkat 세포 내로 도입하였고, 그 도입 효율을 측정하였다. 보다 구체적으로, 하기 표 1의 재조합 단백질들을 5 μM의 농도로 Jurkat 세포에 처리하여 30분, 1시간, 2시간, 3시간 및 6시간 동안 5% CO₂ 세포 배양기에서 37℃로 배양한 다음, 상기 실시예 <4-1>과 같은 방법으로 세포를 회수하여 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScalibur)로 세포 내 형광을 측정함으로써 각 재조합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정하였다.

실시예 <4-3>에서 이용된 재조합 EFGP 단백질
음성 대조군	야생형 EGFP
실험군	실시예 3에서 정제한 재조합 EGFP 융합 단백질
양성 대조군	TAT-EGFP
	Mph-1(Hph-1)-EGFP

그 결과, 본 발명의 인간 LPIN3 단백질 유래 세포막 투과 도메인이 종래의 세포막 투과 도메인들에 비하여 높은 전달 효율로 EGFP를 세포 내로 도입시킴을 확인하였다(도 7의 (a) 및 (b)).

<4-4> 인간 LPIN3 단백질 유래 세포막 투과 도메인의 작용 기작 규명

<4-4-1> 온도 및 혈청 농도의 영향 확인

인간 LPIN3 단백질 유래의 세포막 투과 도메인이 어떠한 기작으로 세포막을 투과하여 단백질을 전달하는 것인지 확인하기 위하여, 상기 표 1에 기재된 재조합 단백질을 이용하여 온도 및 배지 내의 혈청 농도에 따른 EGFP 단백질의 도입 효율을 측정하였다.

먼저, 표 1의 재조합 단백질들을 5 μM의 농도로 Jurkat 세포에 2시간 동안 처리하되, 세포 배양 온도를 각각 독립적으로 4℃, 25℃ 및 37℃로 달리 하였다.

그 결과, 온도가 낮아질수록 상기 실시예 3에서 정제한 재조합 EGFP 융합 단백질이 세포막을 통과하여 세포 안으로 도입되는 효율이 낮아지는 것을 확인하였고, 모든 온도 조건에서 종래의 세포막 투과 도메인인 TAT 및 Mph-1보다 높은 도입 효율을 나타냄을 확인하였다(도 8의 (a)). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 인간 LPIN3 단백질 유래 세포막 투과 도메인이 에너지에 의존하여 단백질을 세포내로 전달하는 것임을 간접적으로 알 수 있다.

다음으로, RPMI 배지에 첨가한 혈청의 농도를 각각 10%, 50% 및 100%로 달리하여 5μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질을 제조하여 처리하고, 표 1에 기재된 각 단백질의 도입 효율을 분석하였다.

그 결과, 배지의 혈청 농도가 증가할수록 실시예 3에서 정제한 재조합 EGFP 융합 단백질이 세포막을 통과하여 세포 안으로 도입되는 효율이 낮아지는 것을 확인하였고, 모든 혈청 농도 조건에서 종래의 세포막 투과 도메인인 TAT 및 Mph-1보다 높은 도입 효율을 나타냄을 확인하였다(도 8의 (b)). 상기와 같은 결과로부터, 다른 단백질들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 본 발명의 세포막 투과 도메인이 카고 전달 효율에 영향을 받는다는 점을 간접적으로 알 수 있다.

<4-4-2> MβCD 및 헤파린(heparin)에 의한 영향 확인

상기 실시예 <4-4-1>의 결과로부터, 인간 LPIN3 단백질 유래의 세포막 투과 도메인이 엔도사이토시스(endocytosis)에 의한 세포내 전달이 이루어질 것으로 예상되어, 이를 확인하기 위하여, 엔도사이토시스 저해제인 MβCD와 헤파린(Heparin)을 각각 처리한 뒤 상기 실시예 3에서 정제한 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율을 측정하였다.

먼저, MβCD에 의한 세포내 도입 저해 여부를 관찰하기 위해, 50 ㎖ 튜브에서 미리 30분 동안 Jurkat 세포주가 5mM의 MβCD와 반응하도록 얼음 속에서 배양한 뒤, 5 μM의 재조합 EGFP 융합 단백질을 처리하여 37℃의 세포 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 Jurkat 세포주를 D-PBS로 3회 세척하고, 유세포분석기로 세포내 형광의 강도를 측정하였다.

그 결과, 5 μM의 MβCD를 처리한 실험군에서는 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율이 현저히 감소하였다(도 9의 (a)). 이는 상기 MβCD가 세포막 콜레스테롤에 작용하여 지질뗏목(Lipid raft)의 형성을 저해함으로써, 상기 지질뗏목에 의한 재조합 EGFP 융합 단백질의 엔도사이토시스가 저해된 것으로 보인다. 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 인간 LPIN3 단백질 유래 세포막 투과 도메인은 지질뗏목에 의한 엔도사이토시스를 유도하여, 상기 인간 LPIN3 단백질 유래 세포막 투과 도메인에 연결된 카고 물질을 세포내로 전달하는 것임을 알 수 있다.

다음으로, 헤파린에 의한 세포내 도입 저해 여부를 관찰하기 위해, 1 × 10⁶개의 세포가 포함된 24웰 플레이트에, 5 μM 농도의 재조합 EGFP 융합 단백질과 50 ㎍/㎖ 농도의 헤파린을 처리하여 37℃의 세포 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 Jurkat 세포주를 D-PBS로 3회 세척하고, 유세포분석기로 세포내 형광의 강도를 측정하였다.

그 결과, 50 ㎍/㎖의 헤파린을 처리한 실험군에서는 재조합 EGFP 융합 단백질의 세포 내 도입 효율이 현저히 감소하였다(도 9의 (b)). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 인간 LPIN3 단백질 유래 세포막 투과 도메인과 다른 단백질(헤파란 황산염(Heparan Sulfate) 등)들의 경쟁이나 상호작용에 의해, 본 발명의 세포막 투과 도메인의 카고 전달 효율에 영향을 받는다는 점을 간접적으로 알 수 있다.

HeLa 세포 내로의 재조합 EGFP 융합 단백질의 도입

상기 실시예 4에서 확인한 인간 LPIN3 단백질 유래의 세포막 투과 도메인의세포막 투과 기능을 다시 한번 확인하면서, 상기 인간 LPIN3 단백질 유래의 세포막 투과 도메인에 의하여 도입된 재조합 단백질의 세포 내 위치를 확인하고, 실제로 세포 안으로 도입된 것인지 여부를 직접 확인하기 위하여, 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포 내로 실시예 3에서 정제한 재조합 EGFP 융합 단백질을 도입하고 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다. 보다 구체적으로, 12-웰 플레이트(12-well plate)(SPL lifescience)의 각 웰에 미리 현미경용 원형 커버글라스(Marin field)를 깔아두고 1×10⁵ 개의 HeLa 세포를 분주한 후, 18시간 동안 DMEM 배지(HyClone)에서 배양하여 HeLa 세포가 커버글라스에 부착될 수 있도록 하였다. 배지를 모두 흡입(suction)하여 버린 후 새로운 DMEM 450 ㎕를 넣어주고, 실시예 3에서 정제한 재조합 EGFP 융합 단백질을 D-PBS와 섞어 5 μM의 농도가 되도록 혼합하여 50 ㎕를 처리한 다음, 30분 동안 37℃의 5% CO₂ 세포 배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 세포외부의 단백질을 제거하기 위해 배지를 모두 흡입하여 버린 후, 1 ㎖의 D-PBS로 5회 반복 세척하고 포름알데히드(formaldehyde 37% solution, formalin, SIGMA) 1㎖로 세포를 고정하였다. 고정 후에도 1 ㎖의 D-PBS로 5회 반복 세척하고, 세포 내 핵의 위치를 확인하기 위하여 1:4000으로 희석한 500 ㎕의 Hoechst(Hoechst AG)를 이용해 핵이 형광을 띄도록 10분 동안 염색하고, 1 ㎖의 D-PBS로 5회 반복 세척하였다. 이렇게 준비된 커버 글라스는 Mounting medium (SIGMA)을 이용해 슬라이드 글라스 위에 마운팅하고 공초점 형광현미경(AX-10 (Fluorescence microscope, Carl zeiss))으로 EGFP가 세포 내로 도입되었는지 여부 및 세포 내에서의 위치를 확인하였다.

그 결과, 상기 실시예 3의 재조합 EGFP 융합 단백질은 세포막을 투과하여 HeLa 세포 내로 도입되었고, 상기 HeLa 세포 내에서 세포질(cytoplasm)에 위치해 있음을 확인하였다(도 10).

인 비보(in vivo) 상에서 재조합 EGFP 융합 단백질의 도입

상기 실시예 4 및 실시예 5에서 확인된 본 발명의 인간 LPIN3 단백질 유래의 세포막 투과 도메인이 인 비트로(in vitro) 환경에서 뿐만 아니라, 인 비보(in vivo) 환경에서도 카고를 표적 세포 내로 전달할 수 있는지 여부, 즉 약물 전달 시스템에 이용될 수 있는지 여부를 확인하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 3의 재조합 EGFP 융합 단백질 4 ㎎을 7주령의 C57bl/6(대한바이오링크, 한국) 마우스 2마리에 각각 복강주사한 다음, 각각 1시간 및 2시간이 경과한 후에 상기 마우스를 해부하였다. 상기 마우스에서 수득한 간(liver), 신장(kidney), 장(intestine) 및 복부 지방(adipose tissue)을 O.C.T. Compound(Tissue-Tek^™, Sakura, 일본)으로 동결시키고, 20시간 동안 -80℃에서 동결시킨 다음, 미세 절편기를 이용하여 5 ㎛의 두께로 조직의 절편화하여 슬라이드글라스에 붙였다. 그런 다음, 형광현미경을 이용하여 상기 실시예 3의 재조합 EGFP 융합 단백질이 세포 내부로 잘 전달되었는지 여부를 관찰하였다.

그 결과, 본 발명의 인간 LPIN3 단백질 유래의 세포막 투과 도메인이 연결되지 않은 EGFP를 처리한 경우에는 어떤 조직의 세포에서도 EGFP의 형광이 관찰되지 않은 반면, 상기 실시예 3의 재조합 EGFP 융합 단백질을 1시간 동안 처리한 쥐에서는 신장, 장, 복부지방에서 EGFP의 형광이 관찰되었고, 상기 실시예 3의 재조합 EGFP 융합 단백질을 2시간 동안 처리한 쥐에서는 간 신장, 장 및 복부지방 모두에서 EGFP의 형광이 관찰되었다(도 11).

상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 인간 LPIN3 단백질 유래의 세포막 투과 도메인은 인 비트로(in vitro) 환경에서 뿐만 아니라, 인 비보(in vivo) 환경에서도 카고를 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있음을 알 수 있고, 본 발명의 인간 LPIN3 단백질 유래의 세포막 투과 도메인이 약물 전달 시스템에 이용될 수 있음을 알 수 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Cell penetrating peptide derived from human LPIN3 protein and cargo delivery system using the same <130> HY110096NR <150> KR 10-2012-0020444 <151> 2012-02-28 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Arg Arg Lys Arg Arg Arg Arg Arg Lys 1 5 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cggaggaaga ggcgtcgcag gaggaaa 27 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for recombinant EGFP fusion protein <400> 3 ggctagccgg aggaagaggc gtcgcaggag gaaaggatcc gtgagcaagg gcgaggagct 60 gttcac 66 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for recombinant EGFP fusion protein <400> 4 caagctttta cttgtacagc tcgtc 25 <210> 5 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence coding for recombinant EGFP fusion protein <400> 5 atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gccggaggaa gaggcgtcgc 60 aggaggaaag gatccgtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 120 gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 180 gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 240 ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 300 gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 360 cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 420 ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 480 atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 540 aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 600 gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 660 cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 720 gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 780 ctatacaagt aa 792 <210> 6 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence coding for recombinant EGFP fusion protein <400> 6 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Arg Arg 1 5 10 15 Lys Arg Arg Arg Arg Arg Lys Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu 20 25 30 Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn 35 40 45 Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr 50 55 60 Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val 65 70 75 80 Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe 85 90 95 Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala 100 105 110 Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp 115 120 125 Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu 130 135 140 Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn 145 150 155 160 Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr 165 170 175 Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile 180 185 190 Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln 195 200 205 Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 210 215 220 Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg 225 230 235 240 Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu 245 250 255 Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 260 <210> 7 <211> 851 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Asn Tyr Val Gly Gln Leu Ala Glu Thr Val Phe Gly Thr Val Lys 1 5 10 15 Glu Leu Tyr Arg Gly Leu Asn Pro Ala Thr Leu Ser Gly Gly Ile Asp 20 25 30 Val Leu Val Val Lys Gln Val Asp Gly Ser Phe Arg Cys Ser Pro Phe 35 40 45 His Val Arg Phe Gly Lys Leu Gly Val Leu Arg Ser Arg Glu Lys Val 50 55 60 Val Asp Ile Glu Leu Asn Gly Glu Pro Val Asp Leu His Met Lys Leu 65 70 75 80 Gly Asp Ser Gly Glu Ala Phe Phe Val Gln Glu Leu Glu Ser Asp Asp 85 90 95 Glu His Val Pro Pro Gly Leu Cys Thr Ser Pro Ile Pro Trp Gly Gly 100 105 110 Leu Ser Gly Phe Pro Ser Asp Ser Gln Leu Gly Thr Ala Ser Glu Pro 115 120 125 Glu Gly Leu Val Met Ala Gly Thr Ala Ser Thr Gly Arg Arg Lys Arg 130 135 140 Arg Arg Arg Arg Lys Pro Lys Gln Lys Glu Asp Ala Val Ala Thr Asp 145 150 155 160 Ser Ser Pro Glu Glu Leu Glu Ala Gly Ala Glu Ser Glu Leu Ser Leu 165 170 175 Pro Glu Lys Leu Arg Pro Glu Pro Pro Gly Val Gln Leu Glu Glu Lys 180 185 190 Ser Ser Leu Gln Pro Lys Asp Ile Tyr Pro Tyr Ser Asp Gly Glu Trp 195 200 205 Pro Pro Gln Ala Ser Leu Ser Ala Gly Glu Leu Thr Ser Pro Lys Ser 210 215 220 Asp Ser Glu Leu Glu Val Arg Thr Pro Glu Pro Ser Pro Leu Arg Ala 225 230 235 240 Glu Ser His Met Gln Trp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Lys Val Ala Arg 245 250 255 Ala Glu Arg Pro Glu Ser Ser Val Val Leu Glu Gly Arg Ala Gly Ala 260 265 270 Thr Ser Pro Pro Arg Gly Gly Pro Ser Thr Pro Ser Thr Ser Val Ala 275 280 285 Gly Gly Val Asp Pro Leu Gly Leu Pro Ile Gln Gln Thr Glu Ala Gly 290 295 300 Ala Asp Leu Gln Pro Asp Thr Glu Asp Pro Thr Leu Val Gly Pro Pro 305 310 315 320 Leu His Thr Pro Glu Thr Glu Glu Ser Lys Thr Gln Ser Ser Gly Asp 325 330 335 Met Gly Leu Pro Pro Ala Ser Lys Ser Trp Ser Trp Ala Thr Leu Glu 340 345 350 Val Pro Val Pro Thr Gly Gln Pro Glu Arg Val Ser Arg Gly Lys Gly 355 360 365 Ser Pro Lys Arg Ser Gln His Leu Gly Pro Ser Asp Ile Tyr Leu Asp 370 375 380 Asp Leu Pro Ser Leu Asp Ser Glu Asn Ala Ala Leu Tyr Phe Pro Gln 385 390 395 400 Ser Asp Ser Gly Leu Gly Ala Arg Arg Trp Ser Glu Pro Ser Ser Gln 405 410 415 Lys Ser Leu Arg Asp Pro Asn Pro Glu His Glu Pro Glu Pro Thr Leu 420 425 430 Asp Thr Val Asp Thr Ile Ala Leu Ser Leu Cys Gly Gly Leu Ala Asp 435 440 445 Ser Arg Asp Ile Ser Leu Glu Lys Phe Asn Gln His Ser Val Ser Tyr 450 455 460 Gln Asp Leu Thr Lys Asn Pro Gly Leu Leu Asp Asp Pro Asn Leu Val 465 470 475 480 Val Lys Ile Asn Gly Lys His Tyr Asn Trp Ala Val Ala Ala Pro Met 485 490 495 Ile Leu Ser Leu Gln Ala Phe Gln Lys Asn Leu Pro Lys Ser Thr Met 500 505 510 Asp Lys Leu Glu Arg Glu Lys Met Pro Arg Lys Gly Gly Arg Trp Trp 515 520 525 Phe Ser Trp Arg Arg Arg Asp Phe Leu Ala Glu Glu Arg Ser Ala Gln 530 535 540 Lys Glu Lys Thr Ala Ala Lys Glu Gln Gln Gly Glu Lys Thr Glu Val 545 550 555 560 Leu Ser Ser Asp Asp Asp Ala Pro Asp Ser Pro Val Ile Leu Glu Ile 565 570 575 Pro Ser Leu Pro Pro Ser Thr Pro Pro Ser Thr Pro Thr Tyr Lys Lys 580 585 590 Ser Leu Arg Leu Ser Ser Asp Gln Ile Arg Arg Leu Asn Leu Gln Glu 595 600 605 Gly Ala Asn Asp Val Val Phe Ser Val Thr Thr Gln Tyr Gln Gly Thr 610 615 620 Cys Arg Cys Lys Ala Thr Ile Tyr Leu Trp Lys Trp Asp Asp Lys Val 625 630 635 640 Val Ile Ser Asp Ile Asp Gly Thr Ile Thr Lys Ser Asp Ala Leu Gly 645 650 655 His Ile Leu Pro Gln Leu Gly Lys Asp Trp Thr His Gln Gly Ile Thr 660 665 670 Ser Leu Tyr His Lys Ile Gln Leu Asn Gly Tyr Lys Phe Leu Tyr Cys 675 680 685 Ser Ala Arg Ala Ile Gly Met Ala Asp Leu Thr Lys Gly Tyr Leu Gln 690 695 700 Trp Val Ser Glu Gly Gly Cys Ser Leu Pro Lys Gly Pro Ile Leu Leu 705 710 715 720 Ser Pro Ser Ser Leu Phe Ser Ala Leu His Arg Glu Val Ile Glu Lys 725 730 735 Lys Pro Glu Val Phe Lys Val Ala Cys Leu Ser Asp Ile Gln Gln Leu 740 745 750 Phe Leu Pro His Gly Gln Pro Phe Tyr Ala Ala Phe Gly Asn Arg Pro 755 760 765 Asn Asp Val Phe Ala Tyr Arg Gln Val Gly Leu Pro Glu Ser Arg Ile 770 775 780 Phe Thr Val Asn Pro Arg Gly Glu Leu Ile Gln Glu Leu Ile Lys Asn 785 790 795 800 His Lys Ser Thr Tyr Glu Arg Leu Gly Glu Val Val Glu Leu Leu Phe 805 810 815 Pro Pro Val Ala Arg Gly Pro Ser Thr Asp Leu Ala Asn Pro Glu Tyr 820 825 830 Ser Asn Phe Cys Tyr Trp Arg Glu Pro Leu Pro Ala Val Asp Leu Asp 835 840 845 Thr Leu Asp 850

Claims (9)

1. 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호(nuclear localization signal) 서열을 포함하는 세포막 투과 도메인.
2. 제1항에 있어서, 상기 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열은 서열번호 1로 기재되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.
3. 제1항에 있어서, 상기 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열은 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 세포막 투과 도메인.
4. 제1항의 세포막 투과 도메인; 및 상기 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 카고를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고.
5. 제4항에 있어서, 상기 카고는 단백질인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고.
6. 제1항의 세포막 투과 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트.
7. 제6항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고 단백질 발현용 발현 벡터.
8. 제7항에 있어서, 상기 벡터는 인간 LPIN3 단백질의 핵 위치 신호 서열을 포함하는 세포막 투과 도메인과 카고 단백질이 융합된 재조합 카고 단백질이 발현될 수 있도록, 카고 단백질을 코딩하는 유전자를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포막 투과율이 향상된 재조합 카고 단백질 발현용 발현 벡터.
9. 제1항의 세포막 투과 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 카고가 융합된 재조합 카고를 제조하는 단계; 및
   상기 제조된 재조합 카고를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 카고 전달 방법.
   
   

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