KR20220161041A - 세포투과성 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 세포투과성 펩티드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 사이토카인 유래 세포투과성 펩티드와 이의 용도에 관한 것으로, 생체 외, 내에서 식세포 특히 대식세포 내로 효과적으로 생물학적 활성 물질을 전달할 수 있으며, 세포투과성 펩티드로써 상용되고 있는 TAT 펩티드 또는 dNP2 펩티드와 비교하였을 때 더욱 높은 효율로 대식세포 내로 생물학적 활성 물질을 전달할 수 있다.

Description

세포투과성 펩티드 및 이의 용도{Novel Cell Penetrating Peptides and Uses Thereof}
본 발명은 신규 세포투과성 펩티드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 사이토카인 유래 세포투과성 펩티드와 이의 용도에 관한 것이다.
대식세포(macrophage)는 우리 몸을 구성하는 중요한 선천면역세포 중 하나로, 모든 조직에 다양한 형태로 분포하며 정상상태에서는 침입한 외부 병원체 및 독성물질에 대한 포식작용을 통해 몸을 보호하는 역할을 수행한다. 또한, 이러한 대식세포의 작용은 적응면역, 상처 치료, 염증 반응 등 주요 면역반응들에도 매우 중요하다고 알려져 있다. 대식세포의 형태와 역할은 매우 다양하며 뇌에서 미세아교세포(microglial cells) 혹은 간에서는 쿠퍼세포(Kupffer cells) 등으로 알려진 특이적으로 조직내 상주하는 대식세포(macrophage)와 혈액을 통해 순환하며 역할을 수행하는 단핵구(monocyte)로 나눌 수 있다. 두 종류의 대식세포는 모두 인접한 다른 세포들과의 상호작용을 통해 활성이 조절될 수 있으며, 반대로 활성화된 대식세포가 주변 환경에 영향을 미치는 경우도 있다. 이처럼 대식세포는 우리 몸의 항상성 유지를 위해 중요한 기능들을 수행하며, 이러한 대식세포의 기능에 이상이 생기게 되면 다양한 질병을 야기할 수 있으므로 대식세포를 이해하기 위한 연구들이 활발하게 진행되고 있다.
세포투과성 펩티드(Cell Permeable Peptide)는 일종의 신호 펩티드(Signal Peptide)로서 단백질, DNA, RNA 등과 같은 고분자 물질을 세포내로 전달하고자 하는 목적으로 사용되는 일종의 특정 아미노산 서열의 조합인 펩티드이다. 세포투과성 펩티드는 7 내지 30 개 정도의 아미노산 서열로 이루어진다.
세포투과성 펩티드로 잘 알려진 TAT 펩티드는 HIV 바이러스에서 유래된 TAT 단백질에 존재하는 11개 아미노산 서열의 b-galactosidase(120 kDa)로, 세포 치료제나 진단시약 같은 다양한 방면에서 응용되어 사용되고 있다. 이외에 대표적인 1세대 세포투과성 펩티드로는 초파리의 단백질에서 유래한 Antennapedia(Penetratin), HSV-1 바이러스로부터 유래된 VP22, Simian Virus 40 large antigen T 로부터 유래한 Pep-1가 있다. 또한, 폴리 아르기닌(poly Arginine), 폴리 라이신(poly Lysine)과 같이 단순히 아르기닌, 라이신과 같은 양이온성 아미노산이 반복적으로 여러개 연결된 펩티드도 세포투과능력이 뛰어난 것으로 보고된 바 있다. 그러나 대부분의 세포투과성 펩티드는 인간단백질 유래의 서열이 아니며, 면역원성, 독성의 가능성을 내포하고 있고, 인간세포에 전달되는 효능이 떨어지는 단점이 있다. 따라서, 인간단백질 유래의 새로운 세포투과성 펩티드에 대한 연구가 진행되어져왔으며, Hph-1, Vectocell, Lactoferrin, Sim-2, LPIN3, 2IL-1a, dNP2와 같은 세포투과성 펩티드는 인간 단백질 유래의 서열로서 2세대 세포투과성 펩티드로 여겨진다.
이러한 종래 세포투과성 펩티드들은 HIV-1과 같은 바이러스 단백질로부터 유래한 서열이거나, 초파리와 같은 다른 종이 발현하는 단백질로부터 유래한 것들이거나, 종래 세포투과성 펩티드를 구성하는 아미노산 서열 분석을 통해 특징적인 아미노산 서열을 선정, 인공적으로 합성해 낸 아미노산 서열이라는 점에서, 인체에 적용해서 사용할 때에 면역 반응 등의 부작용을 일으킬 소지가 있었다.
또한 이들은 비교적 긴 아미노산 사슬로 이루어져 있어서 원치 않는 면역반응을 일으킬 가능성이 더 크고, 전달하고자 하는 단백질의 구조 및 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 세포 내로 전달하고자 하는 생물학적 활성 물질과 연결할 때에 효율이 저하되는 문제가 있었다.
본 발명의 발명자들은 인간 사이토카인 단백질에서 유래한 펩티드 서열이 세포투과성 펩티드인 TAT나 종래 공지된 피부 투과성 펩티드에 비하여 대식세포에 대한 전달효율이 현저히 우수하다는 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.
특허문헌 1. 한국공개특허공보 제10-2010-00011091호
본 발명의 목적은 종래 세포투과성 펩티드와 달리 면역세포, 특히 대식세포에 대한 친화력이 높아, 대식세포에 대한 생물학적 활성 물질의 전달 효율이 뛰어난 세포투과성 펩티드를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포투과성 펩티드를 이용한 생물학적 활성 물질 전달용 조성물, 유전자 치료용 조성물, 생물학적 활성 물질의 전달 방법 및 유전자 치료 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 펩티드를 제공한다.
[일반식 1]
(Xaa1)a-Arg-Xaa2-Arg-Leu-Arg-Arg-Xaa3-His-(Xaa4)b
상기 일반식에서
Xaa1은 각각 독립적으로 류신, 아르기닌 및 라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되며, Xaa2는 알라닌, 글리신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌 또는 발린으로 이루어진 군에서 선택되며, Xaa3은 알라닌, 글리신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 발린, 세린, 트리오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 또는 글루타민으로 이루어진 군에서 선택되고, Xaa4는 각각 독립적으로 아르기닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이고, 상기 a는 0 내지 5 중의 어느 하나의 정수이고, 상기 b는 0 내지 5 중의 어느 하나의 정수이다.
상기 세포투과성 펩티드는 8 내지 12 개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.
상기 Xaa1은 각각 독립적으로 류신일 수 있다.
상기 Xaa3은 알라닌 또는 시스테인이며, 상기 Xaa4는 아르기닌일 수 있다.
상기 Xaa2는 류신 또는 메티오닌 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 세포투과성 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 세포투과성 펩티드;와 생물학적 활성 물질;가 결합된 융합체를 제공한다.
상기 융합체는 대식세포, B 림프구, T 림프구, 비만세포, 단핵구, 수지상 세포, 호산구, 자연살해세포, 호염기구, 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 면역세포를 타겟으로 하는 것일 수 있다.
상기 융합체는 세포투과성 펩티드에 의해 대식세포에 특이적으로 작용하여 생물학적 활성 물질을 대식세포 내로 효율적으로 전달하는 것일 수 있다.
상기 생물학적 활성 물질은 단백질, 핵산, 펩티드, 지질, 당지질, 미네랄, 당, 나노 입자, 생물학적 제제, 조영물질, 형광물질, 약물(drugs) 및 화학 물질(compounds)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 생물학적 활성 물질은 NF-kB 신호전달을 억제하는 제제 및 인플라마솜(inflammasome) 신호전달을 억제하는 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 생물학적 활성 물질은 상기 세포투과성 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 연결되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 융합체를 유효성분으로 함유하는 면역세포 내 생물학적 활성 물질 전달용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 상기 생물학적 활성 물질의 대식세포 국소 전달을 수행하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 융합체를 유효성분으로 함유하는 약물 보조용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 세포투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질이 융합된 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 세포투과성 펩티드를 코딩하는 DNA와 생물학적 활성 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 세포투과성 펩티드를 생물학적 활성 물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 전달 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계;를 포함하여 이루어지는 생물학적 활성 물질의 전달방법을 제공한다.
본 발명은 상기 세포투과성 펩티드를 유전물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 전달 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계;를 포함하여 이루어지는 유전자 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 세포투과성 펩티드는 생체 외, 내에서 식세포 특히 대식세포 내로 효과적으로 생물학적 활성 물질을 전달할 수 있으며, 세포투과성 펩티드로써 상용되고 있는 TAT 펩티드 또는 dNP2 펩티드와 비교하였을 때 더욱 높은 효율로 대식세포 내로 생물학적 활성 물질을 전달할 수 있다.
또한, 대식세포 내에 치료 목적으로 사용되는 종래 약물과의 병용투여를 통해, 약물의 효과를 증진시킬 수도 있다.
도 1 및 도 2는 C10-LRR이 패혈증에 작용하는 약리기전을 개략적으로 도시한 도면(도 1)과 매커니즘을 도시한 도면(도 2)이다.
도 3은 설계된 C10-EGFP, TP-EGFP, TB-EGFP, TAT-EGFP의 DNA 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 1, 비교예 1, 2, 3로부터 제조된 재조합 단백질(C10-EGFP, TP-EGFP, TB-EGFP, TAT-EGFP) 및 EGFP에 대한 SDS-PAGE 결과이다.
도 5는 Jurkat 세포에 C10-EGFP, TP-EGFP, TB-EGFP, TAT-EGFP를 처리하고 1 시간 배양한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과이다.
도 6은 Hela 세포에 C10-EGFP, TP-EGFP, TB-EGFP, TAT-EGFP를 처리하고 1 시간 배양한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과이다.
도 7은 C10 세포투과성 펩티드의 세포선호도를 분석하기 위하여, 마우스 비장세포(mouse splenocytes)에 재조합 단백질을 처리하여 비장세포로의 단백질 전달을 확인하기 위한 실험 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 8은 CD11bhighF4/80+ 대식세포, CD11bmedF4/80+ 대식세포, MHCIIhighCD11c+ 정통 수지상세포(cDCs; classical DCs), Ly6G+ 호중구(neutrophils)로 분류되는 비장세포에 재조합 단백질(C10-EGFP, TAT-EGFP, dNP2-EGFP), EGFP(비교군), PBS(대조군)을 처리하고 유세포 분석으로 분석한 결과이다.
도 9는 비장세포에서 림프세포로 분류된 CD19+ B 세포, CD4+ T 세포 및 NK1.1+ 세포에 재조합 단백질(C10-EGFP, TAT-EGFP, dNP2-EGFP), EGFP(비교군), PBS(대조군)을 처리하고 유세포 분석으로 분석한 결과이다.
도 10a는 수지상세포 대비 CD11bhigh 대식세포에서의 상대적 세포내 전달효율을 비교한 그래프이고, 도 10b는 수지상세포 대비 CD11bmed 대식세포에서의 상대적 세포내 전달효율을 비교한 그래프이며, 도 10c는 수지상세포 대비 호중구 세포에서의 상대적 세포내 전달효율을 비교한 그래프이다.
도 11은 C10 세포투과성 펩티드의 생체내 분포도를 확인하기 위한 실험 설계를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 12는 마우스 복강 내 C10-dTomato, TAT-dTomato, dTomato를 주사하고, 2 시간뒤 마우스로부터 분리한 조직을 α-F4/80 항체로 염색한 후 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 13은 마우스 복강 내 C10-dTomato, TAT-dTomato, dTomato를 주사하고, 2 시간뒤 마우스로부터 분리한 조직을 α-CD3 항체로 염색한 후 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 14는 건강 또는 패혈증 환자로부터 PBMC 시료에서 NLRX1 발현을 분석한 그래프이다.
도 15는 본 C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP의 재조합 단백질의 약리기전을 개략적으로 도시한 것이다.
도 16은 C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP의 재조합 단백질 인코팅 DNA 구조와, 이를 12% SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 17은 일차 복강 대식세포(primary peritoneal macrophages)에 C10-LRR, TAT-LRR, LRR 및 PBS(대조군)을 처리하고 1 시간 배양한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과이다.
도 18은 HeLA cell에서 C10-LRR을 처리하였을 때, 세포 내에서의 분포를 공초점 현미경으로 확인한 결과이다.
도 19, 도 20은 Jurkat 세포에 실시예 4 내지 9의 재조합 단백질, TAT-EGFP 및 EGFP(대조군)을 처리하고 1 시간 배양한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과이다.
도 21, 도 22는 Hela 세포에 실시예 4 내지 9의 재조합 단백질, TAT-EGFP 및 EGFP(대조군)을 처리하고 1 시간 배양한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과이다.
도 23은 패혈증 동물모델의 실험 설계를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 24는 1군(PBS), 2군(C10-EGFP), 3군(C10-NBD) 및 4군(C10-LRR)으로 구분되는 동물모델의 생존율을 7 일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 1군(PBS), 2군(C10-EGFP), 3군(C10-NBD) 및 4군(C10-LRR)으로 구분되는 동물모델의 무게를 7 일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 26은 2시간 후에 1군(PBS), 2군(C10-EGFP), 3군(C10-NBD) 및 4군(C10-LRR)으로 구분되는 동물모델에 대한 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 발현정도를 ELISA로 측정한 결과 그래프이다.
도 27은 24시간 후에 1군(PBS), 2군(C10-EGFP), 3군(C10-NBD) 및 4군(C10-LRR)으로 구분되는 동물모델에 대한 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 발현정도를 ELISA로 측정한 결과 그래프이다.
도 28은 2시간 후에 1군(PBS), 2군(C10-EGFP), 3군(C10-NBD) 및 4군(C10-LRR)으로 구분되는 동물모델에서 AST 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 29는 4군(C10-LRR)과 5군(C10-LRR 0.2 mg/kg)으로 구분되는 동물모델의 생존율을 6 일 동안 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 30 및 도 31은 복강 대식세포에 LPS와 각 재조합 단백질을 처리한 후, L-6, TNF-α의 수준을 측정한 ELISA 그래프이다.
도 32는 복강 대식세포에 LPS와 각 재조합 단백질을 처리한 후, 세포 생존율을 분석한 그래프이다.
도 33은 복강 대식세포를 1 μM C10-LRR과 1 mg/ml LPS를 처리하고, 15분과 30 분 동안 배양한 후, 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도 34 및 도 35는 PMA-자극된 THP-1 세포에 C10-LRR과 LPS를 처리하고, IL-6과 TNF-α의 수준을 ELISA로 분석한 결과 그래프이다.
도 36은 THP-1 세포에 1 μM C10-LRR과 1 mg/ml LPS을 30 분 동안 처리하고, 이로부터 발현되는 PlκBα Ser32, IκBα, p65 Ser536, p65 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하여 나타낸 결과이다.
도 37은 복강 대식세포에 LPS 및 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP) 또는 니제리신을 첨가하여 배양한 후, IL-1β의 수준을 ELISA로 측정한 그래프이다.
도 38은 복강 대식세포에서 인플라마좀 활성화(inflammasome activation)에 대한 C10-LRR의 저해효과를 확인하기 위한 실험 설계도이다.
도 39는 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-EGFP)을 투여한 복강 대식세포를 대상으로 한 Prim+Stim 그룹, Prim 그룹, Stim 그룹에서의 IL-1β 수준을 ELISA로 분석한 결과 그래프이다.
도 40은 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-EGFP)을 투여한 MEF(murine embryonic fibroblast) 세포를 대상으로 한 Prim+Stim 그룹, Prim 그룹, Stim 그룹에서의 IL-1β 수준을 ELISA로 분석한 결과 그래프이다.
도 41은 LPS와 니제리신으로 염증 유도된 복강 대식세포에 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-EGFP)을 첨가하여 배양한 후, Pro-Casp1, Casp1 P20의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 42는 LPS와 니제리신으로 염증 유도된 미토콘드리아 분획물과 전체세포용해물(Whole cell lysate)에 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD)을 첨가하여 배양한 후, Pro-Casp1, Casp1 P20의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 43은 C10-LRR 재조합 단백질과 αTNFαAb에 따른 패혈증 치료효과를 확인하기 위한 실험 설계를 개략적으로 도시한 것이다.
도 44는 1군(PBS), 2군(C10-LRR), 3군(αTNFαAb) 및 4군(C10-LRR+αTNFαAb)으로 구분되는 동물모델의 생존율을 7 일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 45는 1군(PBS), 2군(C10-LRR), 3군(αTNFαAb) 및 4군(C10-LRR+αTNFαAb)으로 구분되는 동물모델의 무게를 7 일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 46은 C10-LRR 재조합 단백질과 αTNFαAb의 투여횟수를 달리하였을 때, 패혈증 치료효과를 확인하기 위한 실험 설계를 개략적으로 도시한 것이다.
도 47은 1군(PBS), 2군(C10-LRR), 3군(αTNFαAb) 및 4군(C10-LRR+αTNFαAb)으로 구분되는 동물모델의 생존율을 7 일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 48은 1군(PBS), 2군(C10-LRR), 3군(αTNFαAb) 및 4군(C10-LRR+αTNFαAb)으로 구분되는 동물모델의 무게를 7 일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대해서 상세히 설명하도록 한다.
본 발명에서 용어 '펩티드(peptide)'는 펩티드 결합에 의해 4개 내지 1000개의 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 사슬 형태의 고분자를 의미하며, '폴리펩티드'와 상호 혼용가능한 의미이다.
또한, 본 발명에서 용어 '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)'는 염기, 당, 인산의 세 가지 요소로 구성된 화학적 단량체인 뉴클레오티드가 다수의 인산에스테르 결합을 매개로 사슬 형태로 이어진 고분자 화합물을 의미한다.
또한, 본 발명에서 용어 '세포투과성 펩티드(cell penetrating peptide, CPP)'는 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상인 카고를 세포 내로 전달할 수 있는 능력을 가진 펩티드를 의미하며, '세포막 투과 도메인' 또는 '세포막 투과 펩티드'와 상호 혼용가능한 의미이다.
또한, 본 발명에서 용어 '카고(cargo)'는 상기 세포투과성 펩티드에 결합되어 세포 내로 전달됨으로써 생체 내의 모든 생리 현상을 조절하는 생물학적 활성을 갖는 기능조절 물질로서, 세포투과 효율을 높이길 원하는 모든 물질을 의미하며, '생물학적 활성 물질'과 상호 혼용 가능한 의미이다. 상기 생물학적 활성 물질로는 구체적으로 단백질, 핵산, 펩티드, 지질, 당지질, 미네랄, 당, 나노입자, 미네랄, 생물학적 제제, 조영물질, 약물(drugs) 및 화학 물질(compounds)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 더 구체적으로 일반적인 경로를 통해서는 세포 내로 이동이 용이하지 않은 물질일 수 있다.
또한, 본 발명에서 용어 '생물학적 활성'은 세포 내 또는 생체 내로 전달되어 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 나타내는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에서 용어 '재조합 카고'란 세포투과성 펩티드 및 한 개 이상의 카고가 유전적 융합이나 화학결합에 의해 재조합되어 형성된 복합체를 의미한다.
또한, 본 발명에서 용어 '접촉'이란 카고 또는 재조합 카고가 진핵 또는 원핵세포와 접하는 것을 의미하며, 이러한 접촉에 의하여 상기 카고 또는 재조합 카고가 상기 진핵 또는 원핵세포의 내로 전달된다.
아울러, 본 발명에서 단백질, 펩티드, 유기화합물 등을 세포 내로 '도입'시키는 것에 대하여 '운반', '침투', '수송', '전달', '투과' 또는 '통과'한다는 표현들과 상호 혼용한다.
본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 펩티드에 관한 것이다.
상기 세포투과성 펩티드는 인간 사이토카인인 IL-10 유래의 서열로서, 인체에 적용하여 사용할 때에 면역 반응 등의 부작용을 일으킬 가능성이 낮고, 아미노산 서열의 N 말단과 C 말단에 인간 사이토카인 IL-10에서 유래한 고유의 아미노산을 더 추가하더라도 효율적인 세포 전달이 가능하다. 또한 상기 세포투과성 펩티드에 인간 사이토카인 IL-10에서 유래한 고유의 아미노산 뿐만 아니라 다른 아미노산을 추가할 수 있다.
[일반식 1]
(Xaa1)a-Arg-Xaa2-Arg-Leu-Arg-Arg-Xaa3-His-(Xaa4)b
상기 일반식에서
Xaa1은 각각 독립적으로 류신, 아르기닌 및 라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
Xaa2는 알라닌, 글리신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌 또는 발린으로 이루어진 군에서 선택되며,
Xaa3은 알라닌, 글리신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 발린, 세린, 트리오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 또는 글루타민으로 이루어진 군에서 선택되고,
Xaa4는 각각 독립적으로 아르기닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이고,
상기 a 및 b는 각각 서로 독립적으로 0 내지 10 중의 어느 하나의 정수이고, 바람직하게 상기 a 및 b는 각각 서로 독립적으로 0 내지 5 중의 어느 하나의 정수이고, 보다 바람직하게는 0 또는 1의 정수이며, 가장 바람직하게는 1의 정수이다.
상기 세포투과성 펩티드에서 Xaa1은 각각 독립적으로 무극성 또는 양전하 아미노산 중의 어느 하나로서, 알라닌(Ala, A), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 페닐알라닌(Phe, F), 류신(Leu, L), 이소류신(Ile, I), 메티오닌(Met, M), 발린(Val, V), 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K) 또는 히스티딘(His, H)이며, 바람직하게는 류신, 아르기닌, 라이신 중에서 선택되는 어느 하나 이상이고, 가장 바람직하게는 류신일 수 있다.
상기 세포투과성 펩티드에서 Xaa2는 무극성 아미노산 중의 어느 하나로서, 알라닌(Ala, A), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 페닐알라닌(Phe, F), 류신(Leu, L), 이소류신(Ile, I), 메티오닌(Met, M), 발린(Val, V) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 류신, 메티오닌 중에서 선택되는 어느 하나이다.
상기 세포투과성 펩티드에서 Xaa3은 무극성 또는 극성 아미노산 중의 어느 하나로서, 알라닌(Ala, A), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 페닐알라닌(Phe, F), 류신(Leu, L), 이소류신(Ile, I), 메티오닌(Met, M), 발린(Val, V), 세린(Ser, S), 트리오닌(Thr, T), 시스테인(Cys, C), 티로신(Tyr, Y), 아스파라긴(Asn, N) 및 글루타민(Gln, Q) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 알라닌 또는 시스테인 중에서 선택되는 어느 하나 이상이며, 가장 바람직하게는 시스테인일 수 있다.
상기 세포투과성 펩티드에서 Xaa4는 각각 독립적으로 양전하 아미노산 중의 어느 하나로서, 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K) 또는 히스티딘(His, H)이며, 바람직하게는 아르기닌이다.
상기 (Xaa1)a는 Xaa1에 해당하는 a개의 아미노산이 결합된 것으로, a개의 아미노산은 동일 아미노산이 a개 존재하는 것뿐만 아니라 각기 다른 아미노산이 a개 존재하는 것도 포함한다. 마찬가지로 상기 (Xaa4)b는 각기 다른 아미노산이 b개 존재하는 것도 포함한다.
상기 세포투과성 펩티드는 8 내지 30개의 아미노산으로 이루어지거나, 8 내지 20개의 아미노산으로 이루어지거나, 보다 바람직하게는 8 내지 12 개의 아미노산으로 이루어지거나, 가장 바람직하게는 10 개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.
상기 세포투과성 펩티드는 매우 작은 펩티드로, 혹시 발생할 수 있는 활성 물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다. 상기 세포투과성 펩티드는 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내, 바람직하게는 세포 내, 보다 바람직하게는 식세포 내, 가장 바람직하게는 대식세포 내로 투과 및 전달될 수 있다.
상기 세포투과성 펩티드는 특정 세포, 조직 또는 장기, 특히 면역세포, 가장 바람직하게 대식세포에 특이적으로 생물학적 활성 물질을 효율적으로 전달할 수 있기 때문에, 별도의 리간드, 수용체 등이 요구되지 않는 장점을 갖는다.
또한 상기 세포투과성 펩티드는 생물학적 활성 물질을 더 포함할 수 있는데, 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩티드와 생물학적 활성 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결될 수 있다.
상기 세포투과성 펩티드는 바람직하게는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있는데, 바람직하게는 서열번호 1, 3, 5 및 9 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 세포투과성 펩티드는 천연에서 추출하거나 합성하거나 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 세포투과성 펩티드;와 생물학적 활성 물질;이 결합된 융합체에 관한 것이다.
본 발명의 융합체는 종래 생물학적 활성 물질이 쉽게 통과할 수 없었던 세포막을 통과하여 세포 내에 직접 작용할 수 있게 할 뿐만 아니라, 세포 중에서도 대식세포, B 림프구, T 림프구, 비만세포, 단핵구, 수지상 세포, 호산구, 자연살해세포, 호염기구, 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 면역세포를 타겟으로 하여 생물학적 활성 물질을 면역세포 내에 작용할 수 있도록 전달할 수 있다. 따라서 상기 융합체는 약물전달체계(drug delivery system)의 발전에 획기적인 계기가 될 수 있다.
상기 융합체는 바람직하게 세포투과성 펩티드에 의해 면역세포 중에서도 대식세포에 친화적으로 작용하므로, 생물학적 활성 물질을 대식세포 내로 특이적이고 효율적으로 전달할 수 있다.
본 발명에서 생물학적 활성 물질은 앞서 언급한 바와 같이, 상기 세포투과성 펩티드에 결합되어 세포 내로 전달됨으로써 생체 내의 모든 생리 현상을 조절하는 생물학적 활성을 갖는 기능조절 물질로서, 세포투과 효율 특히 대식세포로의 특이적 전달효율을 높이길 원하는 모든 물질을 의미하며, 구체적으로 단백질, 핵산, 펩티드, 지질, 당지질, 미네랄, 당, 나노입자, 미네랄, 생물학적 제제, 조영물질, 형광물질, 약물(drugs) 및 화학 물질(compounds)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 더 구체적으로 일반적인 경로를 통해서는 세포 내로 이동이 용이하지 않거나, 세포 내 이동이 용이하더라도 대식세포로의 특이적 전달 효율이 낮은 물질일 수 있다.
상기 생물학적 활성 물질이 펩티드 또는 단백질일 경우, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 신경전달펩티드, 백신, 항체, 항체 단편, 효소, 효소 저해제, 가용성 수용체, 신호 전달 단백질, 전사인자, 보조 활성화 인자, 전사 억제 단백질, 미토콘드리아 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 경우, 펩티드를 발현하는 DNA에 본 발명에 따른 세포투과성 펩티드를 발현하는 DNA를 결합시킨 후 이를 한번에 발현시킴으로써, 생물학적 활성 물질과 세포투과성 펩티드를 융합 단백질의 형태로 세포투과성 펩티드에 생물학적 활성 물질을 결합시킬 수 있다.
상기 생물학적 활성 물질이 핵산일 경우, 자연발생적 또는 인공적 DNA 또는 RNA 분자일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 하나 이상일 수 있는데, 동일한 유형의(예를 들면, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는) 핵산 분자일 수도 있고, 다른 유형으로 핵산 분자들일 수도 있다. 구체적으로, 핵산은 cDNA, decoy DNA, cfDNA, ctDNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, 안티센스 올리고머, 플라스미드 및 그 외 변형된 핵산 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생물학적 활성 물질이 형광 물질일 경우, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC, fluorescein isothiocyanate) 또는 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)일 수 있다.
상기 조영물질은 의학적 영상 촬영에서 생체 내 구조 또는 유체의 조영을 위해 사용되는 모든 물질을 의미한다. 상기 조영물질은 방사선 비투과 조영물질, 상자성 조영물질, 초상자성 조영물질, CT 조영물질 또는 기타 조영물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
상기 생물학적 활성 물질이 조영물질 또는 형광물질일 경우, 생체 내, 외에서 대식세포의 존재 유무 또는 대식세포의 위치를 효율적으로 표지할 수 있다는 장점을 갖는다.
상기 생물학적 활성 물질은 대식세포 매개 질환에 대한 치료 또는 예방 효과를 갖는 것이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 인플라마좀 활성 또는 NF-κB 활성을 억제하는 것일 수 있고, 구체적으로 NF-kB 신호전달을 억제하는 제제, 인플라마솜(inflammasome) 신호전달을 억제하는 제제일 수 있다.
상기 NF-kB 신호전달 억제는 목적하는 세포, 바람직하게는 면역세포, 특히 대식세포에서 NF-κB(nuclear factor k-light-chain-enhancer of activated B cells)의 활성화를 억제하는 것을 의미하며, 구체적으로 상기 NF-κB 활성화를 억제하거나 전사를 억제하는 것이라면 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 NF-κB 신호전달을 억제하는 제제는 NEMO(NF-κB Essential Modulator), NF-κB의 NLS(Nuclear localization sequence) 또는 p65의 기능을 저해 또는 방해하는 물질을 의미한다. 이와 같은 저해 또는 방해는 NEMO, NLS 또는 p65 유전자의 전사를 방해하거나, NEMO, NLS 또는 p65 유전자의 mRNA 번역을 저해함으로써 이루어질 수 있다. 또는 NEMO, NLS 또는 p65 단백질의 활성 부위에 특이적으로 결합하거나, 단백질 구조 변형을 일으켜 NEMO, NLS 또는 p65 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화 시키는 것일 수 있다. NEMO, NLS 또는 p65의 활성을 감소 또는 방해하는 물질이라면 화합물, 단백질, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 당, 지질, 핵산 등 특별히 제한되지 않는다.
상기 인플라마솜 신호전달의 억제는 목적하는 세포, 바람직하게는 면역세포, 특히 대식세포에서 인플라마좀 활성화의 저하 또는 인플라마좀 활성의 억제를 야기하는 것을 의미하며, 구체적으로 상기 인플라마좀 생성 억제, 인플라마좀으로 인한 사이토카인 생성 억제 또는 ASC(adaptor protein apoptosis-associated spec-like protein containing a caspase-recruitment domain) 중합체(oligomer) 형성 억제하는 것이라면 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 인플라마좀 신호전달을 억제하는 제제는 인플라마좀 생성 전 단계에 해당하는 ASC 중합체(oligomer) 형성 억제를 통한 인플라마좀 활성을 억제하는 제제일 수 있다.
상기 인플라마좀 활성을 억제하는 제제는, 상기 ASC 유전자 또는 ASC 단백질의 기능을 저해 또는 방해하는 물질을 의미한다. 이와 같은 저해 또는 방해는 ASC 유전의 전사를 방해하거나, ASC 유전자의 mRNA 번역을 저해함으로써 이루어질 수 있다. 또는 ASC 단백질의 활성 부위에 특이적으로 결합하거나, 단백질 구조 변형을 일으켜 ASC 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화 시키는 것일 수 있다. ASC 유전의 발현 또는 ASC 단백질의 활성을 감소 또는 방해하는 물질이라면 화합물, 단백질, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 당, 지질, 핵산 등 특별히 제한되지 않는다.
상기 제제는 ASC 유전자에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miRNA, dsRNA, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 것일 수 있다.
상기 ASC 유전자의 발현을 억제하는 물질은 상기 mRNA의 번역을 억제하는 물질로서 저분자 화합물, 안티센스 핵산 서열의 제조나 RNAi 테크닉을 이용한 RNA, siRNA 또는 shRNA 등을 이용하는 것일 수 있다. 또한 상기 ASC 유전자의 발현을 억제시키는 물질은 상기 ASC 유전자의 전사를 조절한다고 알려져 있는 프로모터, 인핸서(enhancer), 또는 전사조절인자에 결합하는 단백질 또는 화합물을 이용하는 것일 수 있다.
상기 제제는 ASC 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 앱타머를 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, ASC 단백질의 활성을 억제하는 물질은 예를 들면 ASC 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 그의 항원 결합 특성을 갖는 항체 단편 및 그의 결합 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한 상기 물질은 ASC 단백질에 상보적으로 결합하는 앱타머, 화합물, 펩티드, 또는 펩티드 미메틱스를 포함할 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 ASC 단백질의 활성을 억제하는 물질은 NLRP3 PYD 및 ASC PYD의 결합을 차단하는 것으로, ASC PYD 도메인에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 펩티드, 앱타머일 수 있다.
상기 생물학적 활성 물질로 보다 더 바람직한 것은 NLRX1 단백질일 수 있으며, 구체적으로 상기 NLRX1 단밸질로부터 유래한 LRR 도메인 영역일 수 있으며, 이는 서열번호 25로 표시되는 것일 수 있다.
상기 NLRX1 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 NLRX1 단백질은 서열번호 23로 표시되는 NLRX1 단백질일 수 있다. 또한, 상기 NLRX1 단백질로부터 유래된 LRR 도메인은 서열번호 25로 표시되는 NLRX1 단백질의 단편으로, 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다. 보다 구체적인 예로 서열번호 25에 기재된 아미노산 서열, 또는 상기 서열의 활성을 가지면서도 상동성을 가지는 것일 수 있다. 또한, 상기 NLRX1 단백질로부터 유래된 LRR 도메인은 상기 서열번호 25와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다 그러나, 상기 기술된 예에 제한되지 않는다.
상기 생물학적 활성 물질이 약물(drugs)일 경우, 상기 약물은 특별히 그 종류가 제한되지 않으나, 구체적으로 대식세포와 관련된 질환에 적용되는 것이라면 바람직하다. 상기 약물의 일예로 비스테로이드 항염증제, (NSAIDs) 및 항암제일 수 있고, 상기 비스테로이드 항염증제는 아스피린, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 나프록센, 페노프로펜, 케토프로펜, 덱스케토프로펜, 플루비오프로펜, 옥사프로진, 록소프로펜, 인도메타신, 톨메틴, 술리닥, 에토돌락, 케토록락, 디클로페낙 및 아세클로페낙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 또한 상기 항암제는 시스플라틴(cisplain), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 도세탁셀(docetaxel), 카바지탁셀(cabazitaxel), 파클리탁셀(paclitaxel) 및 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 상기 생물학적 활성 물질은 세포투과성 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 결합할 수 있으며, 공유 또는 비공유 결합되는 것을 것일 수 있다.
상기 세포투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩티드와 생물학적 활성 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다.
본 발명에서, 다양한 종류와 길이를 갖는 세포투과성 펩티드를 인실리코 방식을 통해 선별하고(실험예 1), 상기 선별된 세포투과성 펩티드 후보서열에 EGFP가 연결된 재조합 단백질을 제조하여, 종래 세포투과성 펩티드와 비교하여 특정 세포에 대한 세포투과성이 현저히 개선되었음을 확인하였다(도 5, 6). 본 발명에 따른 융합체는 종래의 세포투과성 펩티드 대비 면역세포 특히 대식세포에 대한 선호도와 해당 세포에 대한 세포전달 효율이 현저히 개선된 점에 특징이 있다.
본 발명에 의해 새롭게 확인된 세포투과성 펩티드의 현저한 세포 투과효과는 다음과 같이 설명될 수 있다.
종래의 세포투과성 펩티드의 경우, 세포막 투과 도메인을 유래로 하고 있기 때문에 대식세포를 포함하는 면역세포 뿐만 아니라 피부세포 등 일반 세포에 대해서도 일반적인 수준의 전달 효율을 나타낸다. 반면, 본 발명의 세포투과성 펩티드의 경우 생체 내 또는 생체 외 공간과 무관하게 대식세포(macrophages), 수지상세포(dendritic cell) 및 호중구(neutrophils)와 같은 골수세포(myeloid cell) 뿐만 아니라 림프세포를 포함하는 면역세포에 대해서 종래 세포투과성 펩티드보다 세포전달 효과가 우수하였고, 그 중에서도 대식세포에 대해 특이적인 전달효율이 나타났으며, 대식세포의 전달효율은 종래 세포투과성 펩티드보다 유의하게 높은 것을 확인하였다(도 8, 9). 즉 본 발명의 세포투과성 펩티드는 종래 세포투과성 펩티드와 달리 세포 중에서 대식세포에 대해 특이적이고 우수한 전달효율을 갖고 있다는 것을 확인하였다.
생체 내에서(in vivo), 본 발명의 세포투과성 펩티드의 분포를 살펴본 결과, 종래 세포투과성 펩티드와 달리 대식세포에 대한 전달효율이 유의적으로 높다는 것을 확인하였다(도 12).
따라서 본 발명의 세포투과성 펩티드를 이용한 융합체 및 이를 유효성분으로 하는 생물학적 활성 물질을 전달하는 시스템은 생체 내(in vivo) 또는 임상 조건에서 종래 세포투과성 펩티드, 이의 융합체 또는 이를 이용한 전달 시스템 대비 현저히 개선된 특징(대식세포 특이성 및 세포전달 효율 개선)을 갖는다.
본 발명은 상기 세포투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질이 융합된 융합체를 유효성분으로 하는, 상기 생물학적 활성 물질을 세포내로 전달하기 위한 생물학적 활성 물질 전달용 조성물 및 유전자 치료용 조성물로서의 용도를 제공한다. 상기 용도는 치료적 용도일 수 있고, 비치료적 용도일 수 있다.
상기 조성물은 상기 융합체에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 하나 이상 더 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 융합체의 생물학적 활성 물질로 항염증성을 갖는 물질이 결합되어 있다면, 상기 유효성분으로는 항-IL-6, IL-1β, 항염증성 활성을 갖는 항체 등 염증성 사이토카인의 기능을 저해할 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다.
상기 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 하나 이상 더 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 리포좀으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 조성물은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.01 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일 회 내지 수 회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명은 상기 융합체를 유효성분으로 함유하는 약물 보조용 조성물을 제공한다. 상기 용도는 치료적 용도일 수 있고, 비치료적 용도일 수 있다.
본 발명에서 약물 보조용은 종래 약물의 효과를 극대화시키기 위해 약물과 병용하는 보조제로서의 용도를 의미한다. 상기 약물을 단독으로 투여할 때에는 의약적 효과가 상대적으로 낮지만, 본 발명에 따른 융합체와 병용투여될 경우 약물의 효능을 현저히 개선하는 용도를 의미한다.
본 발명에 따른 융합체는 패혈증에 대한 면역조절성 약물의 치료 효능을 현저히 강화시키고 있음을 확인한 바, 본 발명의 세포투과성 펩티드 및 생물학적 활성 물질이 융합된 융합체가 실제 대식세포 표적 약물 보조제로 유용하게 활용될 수 있다는 것을 알 수 있다.
상기 약물은 특별히 그 종류가 제한되지 않으나, 상기 융합체와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 약물일 수 있다. 일 예로, 상기 융합체의 생물학적 활성 물질로 항염증성을 갖는 물질이 결합되어 있다면, 상기 약물로는 항-IL-6, IL-1β, 항염증성 활성을 갖는 항체 등 염증성 사이토카인의 기능을 저해할 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다. 상기 항염증성 물질로는 상기 비스테로이드 항염증제를 포함할 수 있고, 상기 비스테로이드 항염증제는 아스피린, 이부프로펜, 덱시부프로펜, 나프록센, 페노프로펜, 케토프로펜, 덱스케토프로펜, 플루비오프로펜, 옥사프로진, 록소프로펜, 인도메타신, 톨메틴, 술리닥, 에토돌락, 케토록락, 디클로페낙 및 아세클로페낙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 융합체의 생물학적 활성 물질로 항암 기능을 갖는 물질이 결합되어 있다면, 상기 약물로는 항암 기능을 갖는 물질이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 상기 약물로는 시스플라틴(cisplain), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 도세탁셀(docetaxel), 카바지탁셀(cabazitaxel), 파클리탁셀(paclitaxel) 및 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 항암제일 수 있다.
상기 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 하나 이상 더 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 리포좀으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 조성물은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다.
본 발명의 투여량은 단독 투여시 또는 다른 약물과 병용시 효과적인 의약적 효과를 발휘하는 약물 투여량을 의미한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 병용 투여되는 약물의 종류와 양, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 및 조사되는 방사선량을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 세포투과성 펩티드와 생물학적 활성 단백질이 융합된 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터 및 세포투과성 펩티드를 코딩하는 DNA와 생물학적 활성 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
상기 생물학적 활성 단백질은 세포 내 또는 생체 내로 전달되어 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 나타내는 것일 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터는 상기 세포투과성 펩티드와 생물학적 활성 단백질의 서열 및 상기 융합 단백질의 정제를 용이하게 하는 태그(tag) 서열 예를 들어, 연속된 히스티딘 코돈, 말토우즈 바인딩 단백질 코돈 및 Myc 코돈 등을 포함할 수 있고, 융합체의 가용성(solubility)을 증가시키기 위한 융합파트너(partner) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 재조합 단백질의 전체적 구조와 기능의 안정 또는 각 유전자가 코딩하는 단백질의 유연성(flexibility)을 위하여 스페이서(spacer) 아미노산 또는 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 스페이서의 예로는 AAY(P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) 또는, 하나에서 다수의 리신(lysine) 잔기들(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715)을 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
또한 상기 재조합 단백질의 불필요한 부분을 제거하기 위하여 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열, 발현 조절 서열 및 세포 내 전달을 확인하기 위한 마커(marker) 또는 리포터 유전자 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 발현벡터에 사용되는 발현 조절 서열은 목적 DNA 및/또는 RNA가 선택적으로 전달 또는 발현되는 세포, 조직, 장기에 특이적인 프로모터를 포함하는 조절 도메인(regulatory domain)으로 구성될 수 있다.
본 발명은 상기 세포투과성 펩티드를 생물학적 활성 물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및 상기의 전달 복합체를 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 생물학적 활성 물질의 전달 방법을 제공한다.
상기 세포투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩티드와 생물학적 활성 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다. 상기 펩티드와 생물학적 활성 물질의 전달 복합체를 생체 또는 세포 내 주입은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 수행될 수 있다. 상기 전달 방법은 배양 세포뿐만 아니라 일반적인 생체 내 전달, 즉 동물 세포, 동물 조직 및 동물체로의 전달시에도 충분히 확대 적용될 수 있다.
본 발명은 상기 세포투과성 펩티드를 유전물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 전달 복합체를 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 유전자 치료 방법을 제공한다.
상기 세포투과성 펩티드와 유전물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다. 상기 유전물질의 전달 복합체를 생체 또는 세포 내 주입은 앞서 기재된 것과 동일한 경로로 투여 가능하다. 상기 치료 방법은 배양 세포뿐만 아니라 일반적인 생체 내 전달, 즉 동물 세포, 동물 조직 및 동물체로의 전달시에도 충분히 확대 적용될 수 있다.
상기 유전물질의 전달 복합체는 비면역원성, 비감염성이며, 레트로바이러스 또는 아데노 바이러스와 같은 벡터 유기체에 DNA가 패키징되어 있지 않기 때문에 플라스미드 크기에 제한을 받지 않는다. 따라서 어떤 실용적인크기의 재조합 유전자 발현 구조물에도 사용될 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예 1. C10-EGFP 재조합 단백질 제작
C10와 EGFP 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 제작
C10-EGFP 재조합 단백질을 제조하기 위하여, 하기와 같이 수행하였다. ①NheI 제한효소 인식 부위, ②C10 폴리펩티드(서열번호 1)를 코딩하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열, ③BamHI 제한효소 인식 부위 및 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 29의 정방향 프라이머를 제작하였고(바이오닉스), ①HindIII 제한효소 인식 부위 및 ②EGFP의 C-말단 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 방향으로 순차 포함된 서열번호 30의 역방향 프라이머를 제작하였다(바이오닉스). 상기 서열번호 29의 정방향 프라이머에서 ①NheI 제한효소 인식 부위는 DNA 클로닝을 위한 것이고, ③BamHI 제한효소 인식 부위는 상기 ②서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 ④EGFP의 N-말단의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 연결하기 위한 것이다. 또한, 상기 서열번호 30의 역방향 프라이머의 ①HindIII 제한효소 인식 부위도 DNA 클로닝을 위한 것이다.
EGFP유전자가 포함된 pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 29 및 서열번호 30의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 인간 IL-10 유래의 C10 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 31의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하였다. 상기 PCR 반응은 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95℃에서 주형의 열 변성으로 20초, 50℃에서 프라이머와 주형의 결합으로 20초, 72℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 35주기를 PCR 반응기(Biorad)를 이용하여 수행하였다.
재조합 발현벡터 제조
C10-EGFP 융합단백질을 발현시키기 위하여 단백질 발현 벡터인 pRSETb에 상기로부터 제조된 유전자(DNA) 절편을 제한효소로 자른 후 연결효소(ligase)를 이용하여 벡터에 삽입하였다. 증폭된 DNA 절편을 NheI과 HindIII(NEB)를 이용하여 DNA의 5′/ 3′ 말단을 접착성 말단(sticky end)이 되도록 효소 반응 시켰다. 한편, 같은 두 개의 제한효소를 이용하여 pRSETb를 효소 반응시켜 NheI, HindIII 삽입 부위를 갖는 선형의 pRSETb 벡터를 만들었다. 각각의 효소 반응 이후에는 PCR 정제 키트(코스모진텍)를 이용하여 분리하였다.
분리된 C10-EGFP 융합 단백질 이중사슬 DNA 절편과 pRSET-b 벡터는 25 ℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase (NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응시켰다.
이렇게 연결시킨 C10-EGFP가 삽입된 원형의 pRSETb 벡터를 DH5α 대장균 균주에 형질전환 시켜 항생제인 암피실린 50 μg/㎖이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균 콜로니는 다시 암피실린 50 μg/㎖을 포함하는 액체 LB 배지에 접종하여 배양했으며 이후 플라스미드 Mini Preparation키트(코스모진텍)를 이용하여 플라스미드 벡터를 분리하였다.
상기와 같이 제작된 재조합 C10-EGFP_pRSET-b 벡터를 주형으로 하고, 상기 서열번호 29 및 서열번호 30의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 인간 IL-10 유래의 C10 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득하였고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 코스모진텍에 DNA 서열분석을 의뢰해 벡터가 정확히 제조되었는지 확인하였다.
재조합 단백질 분리 및 정제
상기 단계를 통해 얻은 대장균으로부터 6-His 태그된 재조합 단백질을 발현시키기 위해, 각각의 콜로니를 암피실린 50 μg/㎖이 포함된 LB 액체배지에 접종하여 37 ℃에서 10 시간 배양하였고, 이를 새로운 LB 액체배지 500 ml에 옮겨 담은 후, IPTG를 농도가 0.2 mM이 되도록 첨가한 후 온도를 20 ℃로 낮추고, 150 rpm으로 14시간을 더 배양하였다. 배양이 완료된 후, 배양액을 회수하였다.
상기 대장균에서 발현된 6-His 태그된 재조합 단백질을 분리정제하기 위하여, Ni-NTA 친화크로마토그래피(affinity chromatography)를 사용하였다. 상기 대장균 배양액을 원심분리하여 펠렛을 얻고, 상기 펠렛에 용해액(lysis buffer)(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)을 처리한 다음, 초음파 처리를 통해 세포벽을 파괴하였다. 세포 파쇄액을 원심분리하여 상청액을 회수한 후, Ni-NTA 아가로스(Qiagen) 비드에 배양하였다.
상기 재조합 단백질이 결합된 비드를 wash buffer(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0)로 세척한 후, 용리액(elution buffer)(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)으로 처리하고, 회수한 용액은 PD-10 Sephadex G-25 column(GE Healthcare)을 사용하여 탈염해주었다. 정제된 재조합 단백질에서 미생물 엔도톡신 오염정도(contamination)를 측정하기 위해, 상기 탈염된 재조합 단백질을 1% Triton X-114에서 4 ℃, 30 분 동안 배양하였다, 상기 용액에서 응집물을 원심분리를 통해 분리하고, 상기 과정을 4번 반복한 다음, PD-10 Sephadex G-25 column을 사용해 탈염해주었다. 단백질 농도를 Bradford assay를 통해 정량적으로 측정한 후, 실험 전까지 10% glycerol을 포함하는 HBSS 용액에 넣어 ?? 80 ℃에서 보관하였다.
실시예 2. C10-LRR 재조합 단백질 제작
서열번호 29의 정방향 프라이머와 서열번호 30의 역방향 프라이머 대신에 NLRX1 단백질 N 말단의 2022 bp가 결손된 NRR 도메인(903 bp)(서열번호 25)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 26)이 5'-> 3'방향으로 포함하는 서열번호 32의 정방향 프라이머와 서열번호 33의 역방향 프라이머를 통해 인간 IL-10 유래의 C10 폴리펩티드와 LRR의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 34의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작한 것을 제외하고는 모두 실시예 1과 동일하게 하여 C10-LRR의 재조합 단백질을 얻었다. 상기 재조합 단백질은 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
실시예 3. C10-NBD 재조합 단백질 제작
서열번호 29의 정방향 프라이머와 서열번호 30의 역방향 프라이머 대신에 NLRX1 단백질 C 말단의 일부가 결손된 NACHT 도메인(NBD)(서열번호 27)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 28)이 5'-> 3'방향으로 포함하는 서열번호 35의 정방향 프라이머와 서열번호 36의 역방향 프라이머를 통해 인간 IL-10 유래의 C10 폴리펩티드와 NBD의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 37의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작한 것을 제외하고는 모두 실시예 1과 동일하게 하여 C10-NBD의 재조합 단백질을 얻었다. 상기 재조합 단백질은 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
실시예 4. C10-dTomato 재조합 단백질 제작
서열번호 29의 정방향 프라이머와 서열번호 30의 역방향 프라이머 대신에 dTomato을 포함하는 서열번호 38의 정방향 프라이머와 서열번호 39의 역방향 프라이머를 통해 인간 IL-10 유래의 C10 폴리펩티드와 dTomat의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 40의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작한 것을 제외하고는 모두 실시예 1과 동일하게 하여 C10-dTomato의 재조합 단백질을 얻었다. 상기 재조합 단백질은 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
실시예 5 내지 10. C10의 변이체와 EGFP의 재조합 단백질 제작
C10을 구성하는 각 아미노산의 역할에 대해 알아보기 위하여 다양한 변이체들을 만들어 비교 분석해보았다.
먼저 C10을 구성하는 시스테인(C), 류신(L), 아르기닌(R)을 치환하거나 결손시킨 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13의 아미노산 서열로 표시되는 변이체들을 만든 뒤, EGFP와 C10-EGFP, TAT-EGFP를 대조군으로 하여 비교하였고, 구체적인 실험은 실험예 3에서 수행하였고, 그 결과는 도 5 내지 도 10에서 확인할 수 있다.
상기 변이체들과 EGFP의 재조합 단백질은 ② 대신에 변이체(서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13)를 코딩하는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하며, 이를 위해 서열번호 41, 44, 47, 50, 53, 56의 정방향 프라이머와 서열번호 42, 45, 48, 51, 54, 57의 역방향 프라이머를 사용하여 서열번호 43, 46, 49, 52, 55, 58의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작 것을 제외하고는 모두 실시예 1과 동일하게 하여 각각의 변이체-EGFP의 재조합 단백질을 얻었다. 상기 재조합 단백질은 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
비교예 1. TP-EGFP 재조합 단백질 제작
② 대신에 TP 폴리펩티드(서열번호 15)를 코딩하는 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하며, 이를 위해 서열번호 59의 정방향 프라이머와 서열번호 60의 역방향 프라이머를 사용하여 TP 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 61의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하는 것을 제외하고는 모두 실시예 1과 동일하게 하여 TP-EGFP의 재조합 단백질을 얻었다. 상기 재조합 단백질은 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
비교예 2. TB-EGFP 재조합 단백질 제작
② 대신에 TB 폴리펩티드(서열번호 17)를 코딩하는 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하며, 이를 위해 서열번호 62의 정방향 프라이머와 서열번호 63의 역방향 프라이머를 사용하여 TB 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 64의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하는 것을 제외하고는 모두 실시예 1과 동일하게 하여 TB-EGFP의 재조합 단백질을 얻었다. 상기 재조합 단백질은 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
비교예 3. TAT-EGFP 재조합 단백질 제작
② 대신에 TAT 폴리펩티드(서열번호 19)를 코딩하는 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하며, 이를 위해 서열번호 65의 정방향 프라이머와 서열번호 66의 역방향 프라이머를 사용하여 TAT 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 67의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하는 것을 제외하고는 모두 실시예 1과 동일하게 하여 TAT-EGFP의 재조합 단백질을 얻었다. 상기 재조합 단백질은 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
비교예 4. TAT-dTomato 재조합 단백질 제작
서열번호 65의 정방향 프라이머와 서열번호 66의 역방향 프라이머 대신에 dTomato을 포함하는 서열번호 68의 정방향 프라이머와 서열번호 69의 역방향 프라이머를 통해 TAT 폴리펩티드와 dTomat의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 70의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작한 것을 제외하고는 모두 비교예 3과 동일하게 하여 TAT-dTomato의 재조합 단백질을 얻었다. 상기 재조합 단백질은 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
비교예 5. dNP2-EGFP 재조합 단백질 제작
② 대신에 dNP2 폴리펩티드(서열번호 21)를 코딩하는 서열번호 22의 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하며, 이를 위해 서열번호 71의 정방향 프라이머와 서열번호 72의 역방향 프라이머를 사용하여 dNP2 폴리펩티드와 EGFP의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 73의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작하는 것을 제외하고는 모두 실시예 1과 동일하게 하여 dNP2-EGFP의 재조합 단백질을 얻었다.
비교예 6. TAT-LRR 재조합 단백질 제작
서열번호 29의 정방향 프라이머와 서열번호 30의 역방향 프라이머 대신에 TAT 펩타이드(서열번호 19)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 20)와 NLRX1 단백질 N 말단의 2022 bp가 결손된 NRR 도메인(903 bp)(서열번호 25)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 26)이 5'-> 3'방향으로 포함하는 서열번호 74의 정방향 프라이머와 서열번호 75의 역방향 프라이머를 통해 TAT 폴리펩티드와 LRR의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 76의 폴리뉴클레오티드 서열을 제작한 것을 제외하고는 모두 실시예 1과 동일하게 하여 TAT-LRR의 재조합 단백질을 얻었다. 상기 재조합 단백질은 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
실험예 1. CPP 후보서열(candidate sequences) 스크리닝
다양한 인간 사이토카인의 아미노산 서열 분석을 통해 인간 기원 세포투과성 펩티드(CPP)를 발견하고자 하였다. 이를 위해 SVM(support vector machines) 점수와 아르기닌, 라이신 또는 류신의 비율을 사용하여 모든 시퀀스를 필터링하였다. 상기 SVM 점수는 인 실리코(in silico) CPP 예측 도구인 CellPPD(available online:)를 사용하여 분석하였다.
상기 스크리닝을 통해 인간 사이토카인 47개로부터 확보된 10,000 시퀀스를 확보하였고, 각각 사이토카인에서 SVM 점수를 비교하였을 때 가장 높은 시퀀스 47개를 1차적으로 선별하였다. 다음, 1차 선별된 47개의 시퀀스 중에서 SVM 점수가 0.6 이상이고, R, K 또는 L의 비율이 60%이거나 R 또는 K의 비율이 50%인 시퀀스를 2차 선별하여 27개의 시퀀스를 얻었다. 최종적으로, 27개의 시퀀스 중에서 SVM 점수가 0.6 이상이고, R, K 또는 L의 비율이 80%이면서 R 또는 K의 비율이 50%인 시퀀스를 3차 선별하였고, 그 결과 IL-10 유래의 C10(서열번호 1), TSLP 유래의 TP(서열번호 15), TGFβ 유래의 TB(서열번호 17)의 세가지 CPP 후보서열을 확보하였다.
실험예 2. 스크리닝을 통해 선정된 CPP 후보서열의 재조합단백질 분리 및 정제
실험예 1에서 스크리닝을 통해 세가지 CPP 후보서열을 선정하고, 6xHis 태그와 녹색형광단백질(EGFP)을 갖는 CPP 후보서열을 인코딩하는 DNA를 설계하였다(C10-EGFP, TP-EGFP, TB-EGFP, TAT-EGFP). 도 3은 설계된 C10-EGFP, TP-EGFP, TB-EGFP, TAT-EGFP의 DNA 구조를 나타낸 도면이다. 상기 설계된 DNA를 이용하여 재조합 단백질을 실시예 1, 비교예 1, 2, 3에 따라 분리 및 정제하였다.
도 4는 실시예 1, 비교예 1, 2, 3로부터 제조된 재조합 단백질(C10-EGFP, TP-EGFP, TB-EGFP, TAT-EGFP) 및 EGFP에 대한 SDS-PAGE 결과로, 이에 따르면 재조합 단백질은 모두 효과적으로 제작 및 정제되었음을 확인하였으며, 각각의 재조합 단백질 크기는 25 내지 35 kDa인 것을 확인하였다.
실험예 3. C10-EGFP, TP-EGFP, TB-EGFP, TAT-EGFP에 대한 세포투과효율 분석
세포주와 배양
HeLa 및 Jurkat 세포는 ATCC로부터 구매하여 사용하였고, DMEM 또는 RPMI(Corning) 배지상에 보관하였다. 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 배양배지를 사용하였다. 세포는 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건하에서 배양하였다.
유세포 분석(Flow cytometry)
Jurkat 세포 또는 HeLa 세포를 96-웰 플레이트 또는 12-웰 플레이트에 2 × 105 cells의 농도로 분주하고, 각 웰에 5 μM 재조합 단백질(C10-EGFP, TP-EGFP, TB-EGFP, TAT-EGFP)을 각각 첨가한 다음 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건에서 1 시간동안 배양하였다. 이후, 원심분리를 통해 세포를 회수하고, PBS 완충액으로 2번 세척하였다. 세척 후, 세포를 37 ℃에서 10분 동안 트립신을 처리하여 세포막에 부착된 단백질을 제거하였다. 다음으로, 트립신을 중화시키기 위해 상기 세포에 10% FBS를 포함하는 DMEM 배양액을 첨가하였다. 세포를 회수한 후, PBS로 세척하고 유세포 분석(flow cytometry)(FACS Canto II, BD Bioscience)을 수행하였다. 데이터는 Flowjo software(Tree Star)를 사용하여 분석하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 two-tailed Student's t-test, one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적 차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. MFI는 중앙형광강도(median fluorescence intensity)를 나타내며, 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 5는 Jurkat 세포에 C10-EGFP, TP-EGFP, TB-EGFP, TAT-EGFP를 처리하고 1 시간 배양한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과이고, 도 6은 Hela 세포에 C10-EGFP, TP-EGFP, TB-EGFP, TAT-EGFP를 처리하고 1 시간 배양한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과이다.
도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 세포투과효율은 세포내 형광강도를 통해 확인할 수 있다. C10-EGFP, TP-EGFP의 재조합 단백질이 처리된 세포는, PBS, TB-EGFP와 EGFP에 비해 유의적으로 세포투과효율이 높은 것을 확인하였다. Junkat 세포에서는 세포투과효율이 C10-EGFP 재조합 단백질보다 TAT-EGFP가 유의적으로 높았으나, Hela 세포에서는 C10-EGFP 재조합 단백질이 TAT-EGFP보다 유의적으로 현저히 우수하다는 것을 알 수 있다.
즉, 본 발명의 C10 세포투과성 펩티드는 Hela 세포에 대한 선호도가 현저히 높다는 것을 확인하였고, 이를 통해 최종적으로 C10 세포투과성 펩티드를 선발하였다.
실험예 4. C10 세포투과성 펩티드의 세포선호도 분석
C10 세포투과성 펩티드의 세포선호도를 분석하기 위하여, 다음과 같이 실험을 수행하였다(도 7).
한양대학교 SPF 사육시설(Specific pathogen free animal facility)에서 사육된 7주령에서 8주령의 수컷 또는 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한양대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Hanyang University)의 동물실험운영규정을 준수하여 수행하였다. 상기 마우스로부터 비장 조직을 분리하고, 상기 조직으로부터 단일세포를 분리하고자 40 μm cell strainer(SPL)을 사용하여 필터링하여, 비장세포(splenocytes)를 분리하였다.
상기 마우스 비장세포(웰당 1×106 세포)를 24 웰 플레이트에 분주한 후, 5 μM 재조합 단백질(C10-EGFP, TAT-EGFP, dNP2-EGFP), EGFP(비교군), PBS(대조군)을 각각 처리한 다음, 1 시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 세포를 회수하고, PBS로 세척한 다음 α-CD11c, MHCII, CD11b, F4/80, CD4, NK1.1 또는 CD19(Biolegend, 1:1000 diluted)로 염색하였다. 세포내 형광은 유세포분석(flow cytometry)(FACS Canto II, BD Bioscience)을 수행하여 분석하였다. 데이터는 Flowjo software(Tree Star)를 사용하였다.
실험의 통계분석을 위하여 two-tailed Student's t-test, one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적 차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. MFI는 중앙형광강도(median fluorescence intensity)를 나타내며, 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 7은 C10 세포투과성 펩티드의 세포선호도를 분석하기 위하여, 마우스 비장세포(mouse splenocytes)에 재조합 단백질을 처리하여 비장세포로의 단백질 전달을 확인하기 위한 실험 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 8은 CD11bhighF4/80+ 대식세포, CD11bmedF4/80+ 대식세포, MHCIIhighCD11c+ 정통 수지상세포(cDCs; classical DCs), Ly6G+ 호중구(neutrophils)로 분류되는 비장세포에 재조합 단백질(C10-EGFP, TAT-EGFP, dNP2-EGFP), EGFP(비교군), PBS(대조군)을 처리하고 유세포 분석으로 분석한 결과이다.
도 7 및 8에 나타난 바와 같이, dNP2 세포투과성 펩티드는 전반적인 면역세포 모두에 대해 전달효율을 가졌으나, 본 발명의 C10 세포투과성 펩티드는 대식세포에 대해서만 유의적 효과를 가지고 있다는 것을 알 수 있다. 본 발명의 C10 세포투과성 펩티드는 dNP2 세포투과성 펩티드와 달리 대식세포에 대한 특이적 전달 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 이러한 생체 내 대식세포 특이적 기능은 생체 내 대식세포 기능에 기반한 질환을 치료하는데 매우 유용하다. 예를 들어 급성패혈증과 같이 대식세포 기능에 문제가 생겨 유발되는 질환의 경우, 대식세포의 염증성 싸이토카인을 조절하는 것이 중요한데, 만약 특정 약물이 생체 내로 전달되었을 때 T 세포와 같은 전혀 상관없는 세포에 전달될 경우 예기치 못한 부작용이 발생할 수 있다. 즉 대식세포 기반 질환에 대해 dNP2 세포투과성 펩티드는 면역세포 모두에 전달되기 때문에 예상하지 못한 부작용이 나타날 위험이 크고, TAT 세포투과성 펩티드는 모든 면역세포에 전달 효율이 낮기 때문에 충분한 약효를 얻을 수 없는 문제가 있다. 그러나 본 발명의 C10 세포투과성 펩티드는 대식세포에 대해 특이적으로 높은 전달 효율을 나타내고 있기 때문에 dNP2 세포투과성 펩티드와 비교하여 낮은 농도의 약물을 처리하더라도 높은 약효를 나타낼 수 있고, 다른 면역세포에 대한 부작용을 방지/차단/억제/감소시키거나, 최소화할 수 있는 등의 장점을 갖는다.
도 9는 비장세포에서 림프세포로 분류된 CD19+ B 세포, CD4+ T 세포 및 NK1.1+ 세포에 재조합 단백질(C10-EGFP, TAT-EGFP, dNP2-EGFP), EGFP(비교군), PBS(대조군)을 처리하고 유세포 분석으로 분석한 결과이다.
도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, 대식세포(macrophages), 수지상세포(dendritic cell) 및 호중구(neutrophils)와 같은 골수세포(myeloid cell) 뿐만 아니라 림프세포 모두에서, TAT 세포투과성 펩티드보다 C10 세포투과성 펩티드가 현저히 효과가 우수하다는 것을 확인하였다. 다만 C10 세포투과성 펩티드는 대식세포에서 가장 높은 세포 전달 효율을 나타내었으며, 림프세포, 수지상세포와 호중구에서는 전달효율이 대식세포에 비해 낮은 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 C10 세포투과성 펩티드는 세포 중에서도 대식세포에 대해 선호도를 가지고 있다는 것을 알 수 있다.
또한, C10 세포투과성 펩티드는 대식세포에서 우수한 전달효율을 갖는다고 알려진 종래 dNP2 세포투과성 펩티드와도 동등한 전달효율을 나타내는 것으로 확인되었다.
실험예 5. 대식세포에서 재조합 단백질의 전달효율 비교
dNP2와 TAT에 대한 C10 세포투과성 펩티드의 정확한 세포내 전달효율을 비교하기 위하여, 실험예 3의 결과로부터 수지상세포 대비 대식세포에서의 세포내 전달효율을 상대적으로 분석하여 도 10에 나타내었다.
실험의 통계분석을 위하여 two-tailed Student's t-test, one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적 차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 10a는 수지상세포 대비 CD11bhigh 대식세포에서의 상대적 세포내 전달효율을 비교한 그래프이고, 도 10b는 수지상세포 대비 CD11bmed 대식세포에서의 상대적 세포내 전달효율을 비교한 그래프이며, 도 10c는 수지상세포 대비 호중구 세포에서의 상대적 세포내 전달효율을 비교한 그래프이다.
도 10에 나타난 바와 같이 대식세포에서 dNP2, TAT보다 C10 세포투과성 펩티드의 전달효율이 유의적으로 현저하게 우수하다는 것을 확인하였다. 그러나 호중구에서는 dNP2와 TAT와 C10 세포투과성 펩티드의 전달효율에 유의적 차이가 없다는 것을 확인하였다.
상술한 결과를 통해, 본 발명은 C10 세포투과성 펩티드가 종래 세포투과성 펩티드와 달리 대식세포에 대한 선호도를 갖는 세포투과성 펩티드라는 것을 확인하였다.
실험예 6. C10 세포투과성 펩티드의 생체내 분포
실험동물
한양대학교 SPF 사육시설(Specific pathogen free animal facility)에서 사육된 7주령에서 8주령의 수컷 또는 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한양대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Hanyang University)의 동물실험운영규정을 준수하여 수행하였다.
시료의 투여 및 샘플링
C10-dTomato, TAT-dTomato, dTomato 5 ㎍을 각각의 마우스 복강 내 주사(intraperitoneally)하였다. 2 시간 뒤에, 마우스를 희생시키고, 10 ㎖의 PBS로 혈관을 관류시켜 조직의 잔여 혈액을 제거하였다. 조직을 수확하고, 세척한 후, 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 고정된 조직은 최적의 절단 온도 화합물로 냉동시켰다. 냉동된 조직을 7-10 ㎛ 두께로 슬라이스하고, α-F4/80 또는 α-CD3 랫트 모노클로날 항체(Abcam, 1:200 diluted)와 α-rat IgG Alexa Fluor 488 antibody(Invitrogen, 1:200 diluted)로 염색하였다. 핵산(nuclei)는 0.01% Hoechst 33342를 포함하는 PBS에서 10분 동안 염색하였다. 세포질(cytoplasm)과 핵(nucleus)에서의 형광신호는 C2si 공초점 현미경(Nikon) 또는 형광현미경(fluorescence microscopy)(Leica DMi8)을 사용하여 분석하였다(도 11). 스케일바는 100 ㎛이다.
도 12는 마우스 복강 내 C10-dTomato, TAT-dTomato, dTomato를 주사하고, 2 시간뒤 마우스로부터 분리한 조직을 α-F4/80 항체로 염색한 후 공초점 현미경으로 촬영한 사진이고, 도 13은 마우스 복강 내 C10-dTomato, TAT-dTomato, dTomato를 주사하고, 2 시간뒤 마우스로부터 분리한 조직을 α-CD3 항체로 염색한 후 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 12에 나타난 바와 같이, 다양한 조직에서 C10-dTomato 신호는 대부분 F4/80+ 대식세포와 함께 위치하고 있다는 것을 알 수 있다. 이는 TAT-dTomato를 처리한 것보다 더 형광신호가 강하다는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 C10 세포투과성 펩티드는 종래 세포투과성 펩티드 대비 생체 내에서 대식세포에 대한 카고(cargo) 분자 전달 효율이 가장 우수하다는 것을 알 수 있다.
도 13에 나타난 바와 같이, CD3+ T 세포와 C10-dTomato 신호는 함께 위치하지 않다는 점을 통해 T 세포가 아닌 대식세포에 매우 특이적으로 전달이 되는 것을 확인할 수 있다.
결과적으로 C10 세포투과성 펩티드는 종래 세포투과성 펩티드에서는 볼 수 없었던 생체 내에서 카고 분자를 대식세포에 특이적으로 전달할 수 있는 새로운 세포투과성 펩티드라는 것을 확인할 수 있다.
실험예 7. C10-LRR 융합단백질 설계, 제조 및 정제
공개 단일세포 RNA 시퀀싱(Public single-cell RNA sequencing)(scRNA-seq)
공개 ScRNA-seq 데이터는 식별자 SCP548(subject PBMCs)를 사용하여 Broad Institute Single Cell Portal( 다운받을 수 있다[M. Reyes, M.R. Filbin, R.P. Bhattacharyya, K. Billman, T. Eisenhaure, D.T. Hung, B.D. Levy, R.M. Baron, P.C. Blainey, M.B. Goldberg, N. Hacohen, An immune-cell signature of bacterial sepsis, Nat Med 26(3) (2020) 333-340.]. PBMC 시료는 3개의 코호트(건강한 대조군, n=19; 패혈증, n=4; 패혈증-ICU, n=8)를 사용하여 분석하였다.
도 14는 건강 또는 패혈증 환자로부터 PBMC 시료에서 NLRX1 발현을 분석한 그래프로, 이는 공개 단일세포 RNA 시퀀싱을 참고하여(Reyes et al., 2020), Single Cell Portal(https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell)을 사용하여 분석한 결과이다.
도 14에 나타난 바와 같이, 공개된 단일세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 데이터(PBMC 시료는 3개의 코호트(건강한 대조군, n=19; 패혈증, n=4; 패혈증-ICU, n=8))의 분석을 기반으로, 건강한 대조군에 비해 패혈증 환자에서 NLRX1가 감소되는 것을 확인하였다. 즉 NLRX1은 NF-κB 신호전달과 염증조절복합체(inflammasome) 활성화(activation)에 대해 음성 조절자로 작용한다는 것을 확인하였다.
NLRX1을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있다면, NLRX1이 세포 내에서 NF-κB와 염증조절복합체(inflammasome) 신호를 조절하여, 패혈증 관련 염증반응을 효과적으로 제어할 것이라는 것을 예측하였다. 이에 본 발명에 따른 C10 세포투과성 펩티드와 NLRX1의 융합체(재조합 단백질)을 제조하여, 본 발명의 C10 세포투과성 펩티드가 실제 생체 외, 내에서 NLRX1 카고 분자를 세포 내로 효율적으로 전달하는지, 전달된 카고 분자가 실제 효과를 나타내는지를 확인하고자 하였다. 이를 위해 NLRX1(LRR-NBD)의 두 도메인과 C10을 결합시킨 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP)을 인코딩하는 DNA를 설계하였다(도 16). EGFP는 대조군으로 사용하였다.
도 16은 C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP의 재조합 단백질 인코팅 DNA 구조와, 이를 12% SDS-PAGE로 분석한 결과로, 이에 따르면 C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP 재조합 단백질은 모두 제대로 제작되었음을 확인하였다.
본 발명의 C10 세포투과성 펩티드와 NLRX1 단백질의 융합체로 설계 및 제조된 C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP의 재조합 단백질의 약리기전에 대해서는 도 15에 개략적으로 도시하였다.
실험예 8. C10-LRR 융합단백질에 대한 전달효율 분석-1
실험동물
한양대학교 SPF 사육시설(Specific pathogen free animal facility)에서 사육된 7주령에서 8주령의 수컷 또는 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한양대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Hanyang University)의 동물실험운영규정을 준수하여 수행하였다.
시료의 투여 및 샘플링
상기 마우스로부터 복강 대식세포(peritoneal macrophages)를 분리하기 위해, 마우스 복강내에 PBS 5 ㎖를 투여하고, 복강액을 얻은 후, 배양 플레이트에 분주하고 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건에서 2 시간동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 상청액을 제거하고, 세포를 PBS로 세척한 다음 미부착 세포를 측정하였다. 부착세포는 일차 복강 대식세포(primary peritoneal macrophages)이다.
상기 과정을 통해 얻은 일차 복강 대식세포(primary peritoneal macrophages)를 96-웰 플레이트 또는 12-웰 플레이트에 2 × 105 cells의 농도로 분주하고, 각 웰에 C10-LRR, TAT-LRR 재조합 단백질, LRR 또는 PBS(대조군)을 2 μM 첨가한 다음 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건에서 1 시간동안 배양하였다. 배양 후, 원심분리를 통해 세포를 회수하고, PBS 완충액으로 2번 세척하였다. 세포막에 부착된 단백질을 제거하기 위하여, 세포를 37 ℃에서 10분 동안 트립신을 처리하였고, 10% FBS를 포함하는 37 ℃ DMEM 배양배지를 통해 트립신을 중화시켰다. 세포는 PBS로 세척한 후, 유세포분석(flow cytometry)(FACS Canto II, BD Bioscience)을 수행하였다. 데이터는 Flowjo software(Tree Star)를 사용하여 분석하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 two-tailed Student's t-test, one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. MFI는 중앙형광강도(median fluorescence intensity)를 나타내며, 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 17은 일차 복강 대식세포(primary peritoneal macrophages)에 C10-LRR, TAT-LRR, LRR 및 PBS(대조군)을 처리하고 1 시간 배양한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과이다.
도 17에 나타난 바와 같이, 마우스 복강 대식세포(peritoneal macrophages)에서, LRR 단백질이 효과적으로 C10 세포투과성 펩티드에 의해 전달되는 것을 확인하였다. 이에 반해 TAT 세포투과성 펩티드를 사용한 경우에는 LRR 단백질이 제대로 전달되지 않는다는 것을 확인하였다. 본 실험을 통해 C10 세포투과성 펩티드는 대식세포 특이적 세포전달을 유의적으로 행하는 것을 알 수 있다.
실험예 9. C10-LRR 융합단백질에 대한 전달효율 분석-2
세포주와 배양
HeLa 세포는 ATCC로부터 구매하여 사용하였고, DMEM 또는 RPMI(Corning) 배지상에 보관하였다. 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 배양배지를 사용하였다. 세포는 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건하에서 배양하였다.
형광현미경 분석
Hela 세포를 6웰 플레이트에 2 × 105 세포 농도로 분주하고, C10-LRR을 2 μM 첨가하고, 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건에서 1 시간동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS로 세차례 세척하고, 4% 파라포름알데히드 포스페이트 완충용액(paraformaldehyde phosphate buffer solution)(Wako)으로 10분동안 고정하였다. 핵산(Nuclei)을 0.01% Hoechst를 포함하는 PBS에 10분동안 염색하고, 세포를 PBS로 두 차례 세척하였다. 세포질(cytoplasm)과 핵(nucleus)에서의 형광신호는 C2si 공초점 현미경(Nikon)으로 분석하였다. 스케일바는 100 ㎛이다.
도 18은 HeLA cell에서 C10-LRR을 처리하였을 때, 세포 내에서의 분포를 공초점 현미경으로 확인한 결과로, 적색은 Mitotracker로, 미토콘리아(세포질)에서 형광신호를 나타내고, 푸른색은 Hoechst로, 핵에서 형광신호를 나타내며, 녹색은 anti 6His로, C10-LRR의 형광신호를 나타낸다.
도 18에 나타난 바와 같이, C10-LRR은 세포질과 핵 모두에 분포하는 것을 알 수 있다. 이는 엔도시토시스(endocytosis)를 통해 세포내로 C10-LRR이 들어간 후, 확산되어 존재하는 것으로 여겨진다.
실험예 7 및 실험예 8을 통해, C10 세포투과성 펩티드를 NLRX1 단백질과 같은 카고 물질과 결합시킬 경우, 효과적으로 일차 대식세포내로 선택적 전달이 가능하다는 것을 확인하였다.
실험예 10. C10 변이체에 대한 분석
C10을 구성하는 각 아미노산의 역할에 대해 알아보기 위하여 다양한 변이체들을 만들어 비교 분석해보았다(실시예 4-9).
세포주와 배양
HeLa 및 Jurkat 세포는 ATCC로부터 구매하여 사용하였고, DMEM 또는 RPMI(Corning) 배지상에 보관하였다. 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 배양배지를 사용하였다. 세포는 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건하에서 배양하였다.
유세포 분석(Flow cytometry)
Jurkat, HeLa 세포를 96-웰 플레이트 또는 12-웰 플레이트에 2 × 105 cells의 농도로 분주하고, 각 웰에 실시예 4 내지 9의 재조합 단백질을 각각 5 μM 첨가한 다음 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 원심분리를 통해 세포를 회수하고, PBS 완충액으로 2번 세척하였다. 세척 후, 세포를 37 ℃에서 10분 동안 트립신을 처리하여 세포막에 부착된 단백질을 제거하였다. 다음으로, 트립신을 중화시키기 위해 상기 세포에 10% FBS를 포함하는 DMEM 배양액을 첨가하였다. 세포를 회수한 후, PBS로 세척하고 유세포분석(flow cytometry)(FACS Canto II, BD Bioscience)을 수행하였다. 데이터는 Flowjo software(Tree Star)를 사용하여 분석하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 two-tailed Student's t-test, one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. MFI는 중앙형광강도(median fluorescence intensity)를 나타내며, 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 19, 도 20은 Jurkat 세포에 실시예 4 내지 9의 재조합 단백질, TAT-EGFP 및 EGFP(대조군)을 처리하고 1 시간 배양한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과이고, 도 21, 도 22는 Hela 세포에 실시예 4 내지 9의 재조합 단백질, TAT-EGFP 및 EGFP(대조군)을 처리하고 1 시간 배양한 후, 유세포 분석으로 분석한 결과이다.
도 19 내지 22에 나타난 바와 같이, Jurkat 세포에서는 실시예 4 내지 9의 재조합 단백질은 일반적인 세포투과효율을 가지고 있다는 것을 확인하였고, 각각의 재조합 단백질 간의 유의적인 세포투과효율 차이가 관찰되지 않았다. 게다가 Jurkat 세포에서 실시예 4 내지 9의 재조합 단백질은 종래 세포투과성 펩티드(TAT)와 세포투과효율의 차이가 크지 않은 것을 확인하였다. 반면 Hela 세포에서는 실시예 4 내지 9의 재조합 단백질이 TAT 세포투과성 펩티드보다 유의적으로 현저히 우수한 세포투과효율을 나타내는 것을 확인하였다.
특히 서열번호 1로 표시되는 C10 세포투과성 펩티드가 이의 변이체들에 비해 세포투과효율이 유의적으로 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있다. 구체적으로 실시예 4 내지 9의 재조합 단백질의 세포투과효율을 살펴보면, 첫 번째 위치하는 류신(leucine) 잔기가 결손(deletion)된 경우, 기존 C10 보다 효율이 가장 감소하는 것으로 보아 AP의 세포내 단백질 전달의 역할에 있어 첫 번째 아미노산 잔기로는 류신이 바람직하다는 것을 확인하였다.
또한 첫 번째 아미노산 잔기를 세포투과성 펩티드에 주로 사용되는 아르기닌(R)과 라이신(K)으로 치환한 경우, TAT 세포투과성 펩티드보다 전달 효율이 우수하나, 서열번호 1의 C10 세포투과성 펩티드 보다는 유의적으로 낮은 세포투과효율을 갖고 있는 것을 확인하였다. 이는 류신이 C10에 있어 매우 중요한 기능 및 역할을 하고 있음을 의미하는 것이다.
다음으로, 10 번째 위치하는 아르기닌 잔기가 결손된 경우(서열번호 9), 8 번째 위치하는 시스테인 잔기가 알라닌으로 치환된 경우(서열번호 5), TAT 세포투과성 펩티드 및 서열번호 7, 11, 13의 변이체 보다 세포투과효율은 우수하였으나 서열번호 1의 C10 세포투과성 펩티드 보다는 유의적으로 낮은 세포투과효율을 갖고 있는 것을 확인하였다. 이는 10번째 위치하는 아르기닌과 8번째 위치하는 시스테인이 C10에 있어 두 번째로 중요한 기능 및 역할을 하고 있음을 의미하는 것이다.
또한 세 번째 위치하는 류신 잔기가 메티오닌으로 치환된 경우(서열번호 3)에는 TAT 세포투과성 펩티드 및 C10의 다른 변이체들 보다 세포투과효율은 우수하였다. 그러나 서열번호 1의 C10 세포투과성 펩티드 보다는 유의적으로 낮은 세포투과효율을 갖고 있으므로 C10에 있어 첫 번째 류신보다는 그 중요성이 낮지만, 세포전달효율에 있어서는 중요한 기능과 역할을 담당하고 있다는 것을 알 수 있다.
실험예 11. 패혈증 동물모델에서의 C10 세포투과성 펩티드 기능 분석
본 발명에서 개발된 C10 세포투과성 펩티드가 생체 내에서도 생물학적 활성물질 전달 기능을 갖는 것을 확인하기 위하여, 상기에서 밝힌 NLRX1 단백질의 LRR 도메인 또는 NBD 도메인과 융합시켜(C10-LRR, C10-NBD), 패혈증 동물모델의 복강주사로 주입하여 질환에 대한 효과를 나타내는지 여부를 확인하였다. 대조군으로 PBS와 C10-EGFP를 사용하였다.
실험동물
한양대학교 SPF 사육시설(Specific pathogen free animal facility)에서 사육된 7주령에서 8주령의 수컷 또는 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한양대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Hanyang University)의 동물실험운영규정을 준수하여 수행하였다.
시료의 투여 및 샘플링
시료의 투여를 위하여 마우스는 무작위로 24마리씩 네 그룹으로 나누어 진행하였다. PBS는 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 PBS(1 mg/kg)를 복강 내로 주사(I.P injection)하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 PBS(1 mg/kg)를 복강 내로 주사 음성대조군이고, C10-EGFP 투여 그룹은 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 C10-EGFP 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 주사(I.P injection)하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-EGFP 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 주사하였고, C10-LRR 투여 그룹은 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 주사(I.P injection)하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 주사하였고, C10-NBD 투여 그룹은 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 C10-NBD 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 주사(I.P injection)하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-NBD 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 주사하였다. 추가적으로 C10-LRR 재조합 단백질의 투여용량을 1 mg/kg에서 0.2 mg/kg으로 달리한 C10-LRR 0.2 mg/kg 투여 그룹을 제조하였다. 상기 그룹들은 총 7일 동안 24시간마다 생존율과 무게 변화를 측정하였다. 5 시간에 시료를 주입하고 난 후, 2 시간 또는 24 시간 후에 혈액을 수확하여 사이토카인 수준과 AST 활성을 분석하였다. Sham 군은 아무것도 처리하지 않은 정상군이다.
5개 군의 동물모델
1군(PBS) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 PBS(1 mg/kg)를 복강 내로 투여하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 PBS(1 mg/kg)를 복강 내로 투여
2군(C10-EGFP) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 C10-EGFP 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 투여하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-EGFP 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 투여
3군(C10-NBD) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 C10-NBD 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 투여하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-NBD 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 투여
4군(C10-LRR) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 투여하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 투여
5군(C10-LRR) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(0.2 mg/kg)을 복강 내로 투여, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(0.2 mg/kg)을 복강 내로 투여
ELISA
2 시간 또는 24 시간 후 동물모델로부터 결막하 출혈(eye bleeding)을 통하여 혈액을 채취하였다. 회수한 혈액을 원심분리하여 혈청(serum)을 분리하고, ELISA를 통해 분석하였다. 혈청에서 IL-6, TNFα 및 IL-1β의 수준을 측정하기 위해서, ELISA 키트(BioLegend)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 two-tailed Student's t-test, one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. MFI는 중앙형광강도(median fluorescence intensity)를 나타내며, 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 23은 패혈증 동물모델의 실험 설계도로, LPS로 유도된 치명적인 패혈증(lethal sepsis) 동물모델을 제조하고, 상기 동물모델에 C10-LRR를 생체 내로 주입하여 효과를 확인하고자 하였다. 염증조절복합체(inflammasome) 신호전달(signaling)과 파이롭토시스(pyroptosis)는 패혈증과 패혈증과 관련된 사망(mortality)의 초기 단계에서 매우 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서도 치명적인 패혈증 동물모델을 제조하기 위해, Caspase-11과 Caspase-1에 기반한(mediated) 염증조절복합체(inflammasome) 신호전달(signaling)이 유도되도록 LPS를 일차/자극(prime/challenge) 주사 모델을 사용하여 치명적인 패혈증 동물모델을 제조하였다. 구체적으로 처음 2 mg/kg LPS를 복강 내로 1차 투여하고, 5 mg/kg을 5 시간 뒤에 복강 내로 2차 투여(challenge)하였다. 이 경우 비장, 간, 신장, 폐, 복막(peritoneum)에서 단핵구 대비 대식세포의 활성이 증가하고 외부적 증상 등을 종합하였을 때, 패혈증이 유발되는 것을 확인하였다. 재조합 단백질(1 mg/kg C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP) 또는 PBS를 LPS의 투여와 동일한 시간에 투여하고, 동물모델의 생존율과 무게 등을 모니터링하였다.
도 24는 1군(PBS), 2군(C10-EGFP), 3군(C10-NBD) 및 4군(C10-LRR)으로 구분되는 동물모델의 생존율을 7 일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 25는 1군(PBS), 2군(C10-EGFP), 3군(C10-NBD) 및 4군(C10-LRR)으로 구분되는 동물모델의 무게를 7 일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 24에 나타난 바와 같이, C10-LRR을 처리한 4군의 경우, C10-EGFP, C10-NBD 대비 유의적으로 생존율이 향상된다는 것을 확인하였다.
도 25에 나타난 바와 같이, C10-LRR을 처리한 4군의 경우, C10-EGFP, C10-NBD와 달리 48시간부터 무게가 유의적으로 회복된다는 것을 확인하였다. 본 발명의 C10-LRR은 LPS에 의해 유도된 패혈증의 심각한 염증반응과 비정상이던 생리기능을 회복시키고 있다는 것을 확인하였다.
도 26은 2시간 후에 1군(PBS), 2군(C10-EGFP), 3군(C10-NBD) 및 4군(C10-LRR)으로 구분되는 동물모델에 대한 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 발현정도를 ELISA로 측정한 결과 그래프이고, 도 27은 24시간 후에 1군(PBS), 2군(C10-EGFP), 3군(C10-NBD) 및 4군(C10-LRR)으로 구분되는 동물모델에 대한 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 발현정도를 ELISA로 측정한 결과 그래프이다.
도 26에 나타난 바와 같이, LPS 5 mg/kg(cahllenge) 주입하고 2 시간이 지난 후, C10-LRR을 처리한 4군이 다른 군들에 비해 유의적으로 혈청 IL-1β 수준이 감소되는 것을 확인하였다.
도 27에 나타난 바와 같이, LPS 5 mg/kg(cahllenge) 주입하고 24 시간이 지난 후, C10-LRR을 처리한 4군이 다른 군들에 비해 유의적으로 혈청 IL-6 수준이 감소되는 것을 확인하였다. 본 발명에 따른 C10-LRR 재조합 단백질은 생체 내에서, IL-1β 및 IL-6 수준을 감소시켜 패혈증을 예방 또는 치료하는 효과를 달성할 수 있다는 것을 확인하였다.
도 28은 2시간 후에 1군(PBS), 2군(C10-EGFP), 3군(C10-NBD) 및 4군(C10-LRR)으로 구분되는 동물모델에서 AST 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 28에 나타난 바와 같이 간 독성 때문에 LPS 5 mg/kg을 주입하면 혈액 내에서 AST의 수준이 상승한다. 그런데 C10-LRR을 처리한 4군은 CAST 수치가 Sham 군(정상군)과 유사한 수준을 유지하고 있다는 것을 확인하였다. 나머지 군들은 Sham(정상군) 대비 AST 수준이 유의적으로 증가하고 있다는 것을 알 수 있다.
도 29는 4군(C10-LRR)과 5군(C10-LRR 0.2 mg/kg)으로 구분되는 동물모델의 생존율을 6 일 동안 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 29에 나타난 바와 같이, C10-LRR을 서로 다른 투여용량으로 처리한 결과, LPS로 유도된 패혈증 동물모델에서 C10-LRR의 효과는 용량의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 12. 대식세포의 NF-κB 활성화 및 IL-6 생산에 대한 C10-LRR 저해효과
ELISA
복강 대식세포(Peritoneal macrophages)를 96 웰 플레이트 또는 12 웰 플레이트에 분주하고, 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건에서 부착할때까지 배양하였다. 부유세포(Floating cells)를 PBS를 사용하여 제거하고, 부착된 대식세포(macrophages)에 인플라마좀 활성화(inflammasome activation)를 위해 1 mg/ml의 LPS와 함께 분주된 대식세포를 4시간동안 배양하였다. 이때, LPS와 함께 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP)을 각각 함께 처리하여 배양하였다. 배양 후(stimulation) 배양 상청액을 ELISA를 위해 회수하였다. 배양 상청액에서 IL-6, TNFα 및 IL-1β의 수준을 측정하기 위해서, ELISA 키트(BioLegend)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하였다.
독성 분석(Cytotoxicity assay)
1 × 105 복강 대식세포를 96 웰 플레이트 상에 분주하고, 1 mg/ml LPS(O55:B5, Sigma L2880)와 함께 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP)을 각각 첨가하여 24 시간 배양하였다. 배양 후, CCK-8(cell counting kit-8) 용매(Dojindo) 10 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 450 nm의 흡광을 4 시간동안 30분마다 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)(iMark, Bio-Rad)를 사용하여 모니터링하였다. 이를 통해 살아있는 세포의 수를 확인하였다. 본 실험에서 사용한 복강 대식세포는 실험예 8과 동일한 방법으로 얻어 사용하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 two-tailed Student's t-test, one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. MFI는 중앙형광강도(median fluorescence intensity)를 나타내며, 에러바는 S.D를 나타낸다.
앞서 LPS로 유도된 패혈증 동물모델에 C10-LRR을 처리한 경우, IL-6 수준이 감소한 것을 확인하였고, 이를 기반으로 생체 외에서(in vitro) 대식세포의 기능을 평가하고자 하였다.
복강 대식세포를 분리하고, LPS와 각각의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP)을 함께 첨가하여 4 시간동안 배양하고, 배양 상청액을으로부터 IL-6, TNF-α를 측정하였다.
도 30 및 도 31은 복강 대식세포에 LPS와 각 재조합 단백질을 처리한 후, L-6, TNF-α의 수준을 측정한 ELISA 그래프로, 이에 따르면 C10-LRR을 처리한 경우 IL-6의 수준이 다른 재조합 단백질을 처리하였을 때보다 유의적으로 현저히 감소된 것을 확인하였다.
TNF-α는 C10-LRR과 다른 재조합 단백질을 처리한 경우 간의 유의적 차이가 관찰되지 않았다.
도 32는 복강 대식세포에 LPS와 각 재조합 단백질을 처리한 후, 세포 생존율을 분석한 그래프로, C10-LRR, C10-EGFP, C10-NBD 모두 세포에 대한 독성은 나타내지 않는 것을 확인하였다.
실험예 13. 시간과 THP-1에 대한 NF-κB 활성화 및 IL-6 생산에 대한 C10-LRR 저해효과
웨스턴 블롯-1
본 실험에서 사용한 복강 대식세포는 실험예 8과 동일한 방법으로 얻어 사용하였다. 복강 대식세포(Peritoneal macrophages)를 96 웰 플레이트 또는 12 웰 플레이트에 분주하고, 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건에서 부착할 때까지 배양하였다. 부유세포(Floating cells)를 PBS를 사용하여 제거하고, 부착된 대식세포(macrophages)에 인플라마좀 활성화(inflammasome activation)를 위해 1 mg/ml의 LPS와 함께 분주된 대식세포를 4 시간 동안 배양하였다. 이때, LPS와 함께 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP)을 각각 함께 처리하여 배양하였다. 배양 후(stimulation) 4 ℃에서 30 분 동안 세포를 RIPA 완충액(Cell Signaling Technology)로 용해시킨 후, 용해물의 단백질 양을 Pierce BCA protein assay kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 분석하였다. SDS-PAGE 후, 단백질을 PVDF 막(Bio-Rad)에 옮긴 다음, 막을 5% skim milk와 0.1% Tween-20를 포함하는 TBS 완충액(Tris-buffered saline; TBS-T)으로 처리하였다. 그리고 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다: IκBα(Cell Signaling, 1:1000 diluted) 항체를 사용하였다. 막을 TBS-T로 세척하고 2차 항체로 상온에서 1 시간동안 배양하였다. 막을 TBS-T로 세척하고, EZ-Western Lumi Pico 또는 Femto reagent(DoGen)로 처리하였다. 밴드 세기를 측정하기 위하여 Fusion-Solo software(Vilber)을 사용하여 제조사의 프로토콜대로 분석하였다.
웨스턴 블롯-2
THP-1 세포는 ATCC로부터 구매하여 사용하였고, DMEM 또는 RPMI(Corning) 배지상에 보관하였다. 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 배양배지를 사용하였다. 세포는 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건하에서 배양하였다.
상기 THP-1 세포를 1 mg/ml LPS(O55:B5, Sigma L2880)로 15분에서 5시간까지 활성화하였다. 이때, LPS와 함께 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP)을 각각 함께 처리하여 배양하였다. 4 ℃에서 30 분 동안 세포를 RIPA 완충액(Cell Signaling Technology)로 용해시킨 후, 용해물의 단백질 양을 Pierce BCA protein assay kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 분석하였다. SDS-PAGE 후, 단백질을 PVDF 막(Bio-Rad)에 옮긴 다음, 막을 5% skim milk와 0.1% Tween-20를 포함하는 TBS 완충액(Tris-buffered saline; TBS-T)으로 처리하였다. 그리고 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다: IκBα(Cell Signaling, 1:1000 diluted), pIκBα Ser32(Cell Signaling, 1:1000 diluted), p65 (Cell Signaling, 1:1000 diluted), p65 Ser536 (Cell Signaling, 1:1000 diluted), PI3K p110β (Cell Signaling, 1:1000 diluted), pAKT Ser473, caspase(Adipogen, 1:1000 diluted), MAVS (Cell Signaling, 1:1000 diluted), NLRP3(Adipogen, 1:1000 diluted), 또는 VDAC (Cell Signaling, 1:1000 diluted) 항체를 사용하였다. 막을 TBS-T로 세척하고 2차 항체로 상온에서 1 시간동안 배양하였다. 막을 TBS-T로 세척하고, EZ-Western Lumi Pico 또는 Femto reagent(DoGen)로 처리하였다. 밴드 세기를 측정하기 위하여 Fusion-Solo software(Vilber)을 사용하여 제조사의 프로토콜대로 분석하였다.
ELISA
본 실험에서 사용한 복강 대식세포는 실험예 8과 동일한 방법으로 얻어 사용하였다. 복강 대식세포(Peritoneal macrophages)를 96 웰 플레이트 또는 12 웰 플레이트에 분주하고, 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건에서 부착할때까지 배양하였다. 부유세포(Floating cells)를 PBS를 사용하여 제거하고, 부착된 대식세포(macrophages)에 인플라마좀 활성화(inflammasome activation)를 위해 1 mg/ml의 LPS와 함께 분주된 대식세포를 4시간동안 배양하였다. 이때, LPS와 함께 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP)을 각각 함께 처리하여 배양하였다. 배양 후(stimulation) 배양 상청액을 ELISA를 위해 회수하였다. 배양 상청액에서 IL-6, TNFα 및 IL-1β의 수준을 측정하기 위해서, ELISA 키트(BioLegend)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 two-tailed Student's t-test, one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. MFI는 중앙형광강도(median fluorescence intensity)를 나타내며, 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 33은 복강 대식세포에 1 μM C10-LRR과 1 mg/ml LPS를 처리하고, 15 분과 30 분 동안 배양한 후, 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도 33에 나타난 바와 같이, C10-LRR을 처리한 경우에는 시간에 상관없이 유의하게 IκB 분해를 억제하는 것을 확인하였다. 인간 대식세포, 즉 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 자극된 THP-1 세포에서도 확인할 수 있다.
도 34 및 도 35는 PMA-자극된 THP-1 세포에 C10-LRR과 LPS를 처리하고, IL-6과 TNF-α의 수준을 ELISA로 분석한 결과 그래프이다.
도 34에 나타난 바와 같이, C10-LRR을 처리한 경우 IL-6 생산을 유의적으로 현저히 억제하고 있다는 것을 확인하였다. 이에 반해 TNF-α의 생산에 대해서는 유의적인 차이가 관찰되지 않았다.
도 36은 THP-1 세포에 1 μM C10-LRR과 1 mg/ml LPS을 30 분 동안 처리하고, 이로부터 발현되는 PlκBα Ser32, IκBα, p65 Ser536, p65 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하여 나타낸 결과이다.
도 36에 나타난 바와 같이, C10-LRR을 처리한 THP-1세포는 lκBα Ser32의 인산화, IκBα의 분해 및 p65 Ser536의 인산화를 포함한 NF-κB 신호전달의 활성화를 현저하게 감소된다는 것을 확인하였다.
상술한 실험을 통해, C10-LRR은 LPS가 처리된 대식세포에서 IL-6 생성을 억제하고, NF-κB 신호전달을 음성적으로 조절하는 역할을 수행한다는 것을 알 수 있다.
실험예 14. 대식세포에서 IL-1β 변화에 대한 C10-LRR 저해 효과
본 실험에서 사용한 복강 대식세포는 실험예 8과 동일한 방법으로 얻어 사용하였다. 복강 대식세포(Peritoneal macrophages)를 96 웰 플레이트 또는 12 웰 플레이트에 분주하고, 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건에서 부착할 때까지 배양하였다. 부유세포(Floating cells)를 PBS를 사용하여 제거하고, 부착된 세포에 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP)을 각각 처리하고 4 시간동안 배양하였다. 배양 후(stimulation), 배양 상청액을 ELISA를 위해 회수하고, 인플라마좀 활성화(inflammasome activation)를 위해 1 mg/ml의 LPS와 함께 분주된 대식세포를 4 시간 동안 1차 배양하였다. 1차 배양후, 세포를 5 μM 니제리신(nigericin)으로 2 시간 동안 활성화시키고, 상기 배양 상청액을 ELISA를 위해 회수하였다. 배양 상청액에서 IL-6, TNFα 및 IL-1β의 수준을 측정하기 위해서, ELISA 키트(BioLegend)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하였다.
실험의 통계분석을 위하여 two-tailed Student's t-test, one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. MFI는 중앙형광강도(median fluorescence intensity)를 나타내며, 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 37은 복강 대식세포에 LPS 및 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP) 또는 니제리신을 첨가하여 배양한 후, IL-1β의 수준을 ELISA로 측정한 그래프이다.
상기 실험에서 패혈증 동물모델에서 감소된 IL-1β가 C10-LRR에 의한 인플라마좀 활성화의 조절과 관련이 있는지 확인하기 위하여, 본 발명에서 LPS으로 priming한 후, 니제리신을 처리하여 대식세포에 IL-1β 변화를 살펴보았다. 그 결과 도 37에서와 같이, LPS만 처리된 경우에는 IL-1β 변화가 유의적인 차이를 나타나지 않았으나, LPS와 니제리신으로 처리한 경우에는 IL-1β 변화가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
C10-LRR 처리된 경우에는 IL-1β를 유의하게 억제하는 것으로 확인되었다.
실험예 15. 대식세포에서 NLRP3-인플라마좀(inflammaseom)에 대한 C10-LRR 저해 효과-11
시료의 투여
시료의 투여를 위하여 아홉 그룹으로 나누어 진행하였다. 복강 대식세포(Peritoneal macrophages) 또는 MEF(murine embryonic fibroblasts)를 96 웰 플레이트 또는 12 웰 플레이트에 분주하고, 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건에서 부착할 때까지 배양하였다.
본 발명의 실험은 프라이밍 단계(LPS 1 mg/ml 복강내 투여, 4 시간), 자극 단계(5 μM 니제리신 복강 내 투여, 2 시간)로 구성된다(도 38). Prim+Stim은 프라이밍 단계와 자극 단계 각각에 동일 농도의 재조합 단백질(C10-LRR 또는 C10-EGFP)을 처리한 후 배양하여 수행한 그룹이다(처리한 농도는 그래프에 표기하였고, prim 단계와 stim 단계에 각각 1회씩(총 2회) 투여하였다-0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM).
Prim은 프라이밍 단계에만 해당 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-EGFP)을 함께 처리하여 배양한 그룹이고, Stim은 자극 단계에만 해당 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-EGFP)을 함께 처리하여 배양한 그룹이다.
각각의 시료의 처리 유무는 그래프에서 -(처리 안함)와 +(처리함)로 표기하였다.
ELISA
상기 각각의 시료 투여군으로부터 배양 상청액을 ELISA를 위해 회수하였다. 배양 상청액에서 IL-6, TNFα 및 IL-1β의 수준을 측정하기 위해서, ELISA 키트(BioLegend)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 수행하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 two-tailed Student's t-test, one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. MFI는 중앙형광강도(median fluorescence intensity)를 나타내며, 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 38은 복강 대식세포에서 인플라마좀 활성화(inflammasome activation)에 대한 C10-LRR의 저해효과를 확인하기 위한 실험 설계도이다. 상기 실험은 프라이밍 단계(LPS 1 mg/ml 복강내 투여, 4 시간), 자극 단계(5 μM 니제리신 복강 내 투여, 2 시간)로 구성된다. 본 발명에서 실험은 총 세 가지로 설계하였는데, Prim+Stim은 프라이밍 단계와 자극 단계 모두에서 재조합 단백질을 처리한 그룹이고, Prim은 프라이밍 단계에만 재조합 단백질을 처리한 그룹이며, Stim은 자극 단계에만 재조합 단백질을 처리한 그룹이다. 이때, 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP) 처리시, LPS도 함께 처리하였다. 프라이밍 단계는 NF-κB 활성화가 진행되고 자극 단계는 인플라마좀 활성화가 진행되는 것으로 여겨진다.
도 39는 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-EGFP)을 투여한 복강 대식세포를 대상으로 한 Prim+Stim 그룹, Prim 그룹, Stim 그룹에서의 IL-1β 수준을 ELISA로 분석한 결과 그래프이고, 도 40은 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-EGFP)을 투여한 MEF(murine embryonic fibroblast) 세포를 대상으로 한 Prim+Stim 그룹, Prim 그룹, Stim 그룹에서의 IL-1β 수준을 ELISA로 분석한 결과 그래프이다.
도 39 및 도 40에 나타난 바와 같이, LPS와 니제리신 처리에 의해 IL-1β의 생산이 유도되는 것을 확인하였다. 또한 C10-LRR 처리할 경우, C10-LRR 용량에 따라 IL-1β 생산이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다.
상술한 결과를 통해, C10-LRR은 인플라마좀 신호전달과 NF-κB 신호전달 모두를 저해하는 효과를 갖고 있다는 것을 알 수 있다. 이에 반해 C10-EGFP를 처리한 경우에는 IL-1β 변화에 유의적인 차이가 관찰되지 않았다.
실험예 16. 대식세포에서 NLRP3-인플라마좀(inflammaseom)에 대한 C10-LRR 저해 효과-12
미토콘드리아 분획물의 분리(Isolation of mitochondrial fraction)
미토콘드리아 분획물(Mitochondrial fraction)은 Qproteome mitochondrial isolation kit(Qiagen)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 분리하였다. 간략하게, 복강 대식세포(peritoneal macrophages)를 용해액(lysis buffer)에서 회수하고, 4 ℃, 1,000 g로 10 분 동안 원심분리 하였다. 상청액(supernatant)을 버리고, 펠렛(pellet)에 23-게이지 바늘로 10 차례 통과시켜(passages) 분쇄한 다음, 4 ℃, 1,000 g로 10 분 동안 원심분리 하였다. 상기 상청액을 4 ℃, 8,000 g로 15 분 동안 원심분리하고, 상기 펠렛을 세척한 뒤, 미토콘드리아 분획물을 얻었다. 비교를 위해 전체세포용해물(Whole cell lysate)도 별도로 회수하여 보관하였다.
웨스턴 블롯
복강 대식세포 또는 미토콘드리아 분획물 또는 전체세포용해물(Whole cell lysate)을 96 웰 플레이트 또는 12 웰 플레이트에 분주하고, 5% CO2 배양기에서 37 ℃ 조건에서 부착할때까지 배양하였다. 부유세포(Floating cells)를 PBS를 사용하여 제거하고, 부착된 세포에 인플라마좀 활성화(inflammasome activation)를 위해 1 mg/ml의 LPS와 함께 분주된 대식세포를 4 시간 동안 배양하였다. 이때, LPS와 함께 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD, C10-EGFP)을 각각 함께 처리하여 배양하였다. 배양 후, 상기 세포에 니제리신(nigericin) 5 μM을 처리하고 2 시간동안 배양하였다. 4 ℃에서 30 분 동안 세포를 RIPA 완충액(Cell Signaling Technology)로 용해시킨 후, 용해물의 단백질 양을 Pierce BCA protein assay kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 분석하였다. SDS-PAGE 후, 단백질을 PVDF 막(Bio-Rad)에 옮긴 다음, 막을 5% skim milk와 0.1% Tween-20를 포함하는 TBS 완충액(Tris-buffered saline; TBS-T)으로 처리하였다. 그리고 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다: pro-Casp1(Adipogen, 1:1000 diluted), casp1P20(Adipogen, 1:1000 diluted), MAVS (Cell Signaling, 1:1000 diluted), NLRP3(Adipogen, 1:1000 diluted), 또는 VDAC(Cell Signaling, 1:1000 diluted) 항체를 사용하였다. 막을 TBS-T로 세척하고 2차 항체로 상온에서 1 시간동안 배양하였다. 막을 TBS-T로 세척하고, EZ-Western Lumi Pico 또는 Femto reagent(DoGen)로 처리하였다. 밴드 세기를 측정하기 위하여 Fusion-Solo software(Vilber)을 사용하여 제조사의 프로토콜대로 분석하였다. 본 실험에서 사용한 복강 대식세포는 실험예 8과 동일한 방법으로 얻어 사용하였다.
통계
실험의 통계분석을 위하여 two-tailed Student's t-test, one-way ANOVA 또는 two-way ANOVA를 사용하여 그룹 간 평균수치 유의차를 확인하였으며, 0.05보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 *, 0.01보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 **, 0.001보다 낮은 p 값을 가질 경우에는 ***로, 유의적차이가 없는 경우 N.S로 유의적 차이를 표기하였다. MFI는 중앙형광강도(median fluorescence intensity)를 나타내며, 에러바는 S.D를 나타낸다.
도 41은 LPS와 니제리신으로 염증 유도된 복강 대식세포에 다양한 농도(0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM)의 재조합 단백질(C10-LRR, C10-EGFP)을 첨가하여 배양한 후, Pro-Casp1, Casp1 P20의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
caspase-1 p20은 Pro-IL-1β의 N 말단을 절단하여, 분비가능한 형태의 성숙한(mature) IL-1β를 생성하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 C10-LRR과 caspase-1 p20의 관련성을 분석하고자 하였다.
도 41에 나타난 바와 같이, LPS와 니제리신이 처리된 경우 정상군대비 caspase-1 p20의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이에 반해 C10-LRR을 처리한 경우, LPS와 니제리신에 의해 증가된 caspase-1 p20의 발현수준이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 비교군인 C10-EGFP의 경우 LPS와 니제리신이 처리된 군과 유의적 차이가 관찰되지 않았다.
도 42는 LPS와 니제리신으로 염증 유도된 미토콘드리아 분획물과 전체세포용해물(Whole cell lysate)에 재조합 단백질(C10-LRR, C10-NBD)을 첨가하여 배양한 후, Pro-Casp1, Casp1 P20의 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다. 'Mito'는 미토콘드리아 분획물이고, WCL은 전체세포용해물(Whole cell lysate)이다.
MAVS는 미토콘드리아의 외막에서 NLRP3-inflammasome을 조절하는 역할을 수행하는 것으로 널리 알려져 있다. 따라서 C10-LRR을 처리하였을 때 미토콘드리아와 세포질에서 NLRP3 및 MAVS 수준을 조사하였다.
도 42에 나타난 바와 같이, 니제리신과 LPS로 자극된 경우에는 미토콘드리아 MAVS 수준이 유의적으로 증가하였고, MCL에서는 차이가 없는 것을 확인하였다.
C10-LRR을 처리한 경우, 미토콘드리아에서 MAVS 발현이 완전히 저해되는 것을 확인하였고, WCL에서도 MAVS와 NLRP3의 수준이 유의적으로 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 상술한 결과를 통해 C10-LRR은 인플라마좀(inflammasome) 신호와 IL-1β 생산을 부정적으로 조절한다는 것을 알 수 있다.
실험예 17. 종래 약물과 C10-LRR의 병용투여에 대한 패혈증 개선 효과 분석-2회 투여
실험동물
한양대학교 SPF 사육시설(Specific pathogen free animal facility)에서 사육된 7주령에서 8주령의 수컷 또는 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한양대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Hanyang University)의 동물실험운영규정을 준수하여 수행하였다.
시료의 투여 및 샘플링
시료의 투여를 위하여 마우스는 무작위로 5마리씩 네 그룹으로 나누어 진행하였다. PBS는 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 PBS(1 mg/kg)를 복강 내로 주사(I.P injection)하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 PBS(1 mg/kg)를 복강 내로 주사 음성대조군이고, C10-LRR 투여 그룹은 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 주사(I.P injection)하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 주사하였고, αTNFαAb 투여 그룹은 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 αTNFαAb(1 mg/kg)을 복강 내로 주사(I.P injection)하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 αTNFαAb(1 mg/kg)을 복강 내로 주사하였고, C10-LRR+αTNFαAb 투여 그룹은 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)과 αTNFαAb(1 mg/kg)을 복강 내로 주사(I.P injection)하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)과 αTNFαAb(1 mg/kg)을 복강 내로 주사하였다. 상기 그룹들은 총 7일 동안 24시간마다 생존율과 무게 변화를 측정하였다. αTNFαAb는 TNFα 중화항체(TNFα neutralizing antibody)를 의미한다.
4개 군의 동물모델
1군(PBS) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 PBS(1 mg/kg)를 복강 내로 투여하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 PBS(1 mg/kg)를 복강 내로 투여
2군(C10-LRR) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 투여하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 투여
3군(αTNFαAb) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 αTNFαAb(1 mg/kg)을 복강 내로 투여하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 αTNFαAb(1 mg/kg)을 복강 내로 투여
4군(C10-LRR+αTNFαAb) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)과 αTNFαAb(1 mg/kg)을 복강 내로 투여하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)과 αTNFαAb(1 mg/kg)을 복강 내로 투여
앞선 실험을 통해, 본 발명의 C10-LRR은 IL-6 및 IL-1β을 음성으로 조절하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 나아가 본 발명에서는 C10-LRR를 종래 약물과 병용투여한다면, 상승효과를 유도할 것이라 여겼으며, 이에 대한 실험을 진행하였다.
도 43은 C10-LRR 재조합 단백질과 αTNFαAb에 따른 패혈증 치료효과를 확인하기 위한 실험 설계를 개략적으로 도시한 것이고, 도 44는 1군(PBS), 2군(C10-LRR), 3군(αTNFαAb) 및 4군(C10-LRR+αTNFαAb)으로 구분되는 동물모델의 생존율을 7 일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 45는 1군(PBS), 2군(C10-LRR), 3군(αTNFαAb) 및 4군(C10-LRR+αTNFαAb)으로 구분되는 동물모델의 무게를 7 일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 43 및 도 44에 나타난 바와 같이, C10-LRR 또는 αTNFαAb 처리할 경우, 생존율이 크게 향상되는 것을 확인할 수 있다. 또한 C10-LRR 또는 αTNFαAb로 처리한 경우(72 시간), PBS를 처리한 군(120 시간)보다 체중 회복이 유의적으로 빨라지는 것을 확인하였다. 나아가 C10-LRR과 αTNFαAb를 함께 사용하는 경우에는 생존율이 100%로 회복되었으며, 체중 역시 가장 빠른 시간(48 시간)에서 회복되는 것을 확인하였다.
따라서 C10-LRR은 단독으로도 유의적으로 우수한 효과를 나타내며, 종래 약물과 병용투여할 경우에는 현저히 우수한 상승효과를 도모할 수 있다는 것을 확인하였다.
실험예 18. 종래 약물과 C10-LRR의 병용투여에 대한 패혈증 개선 효과 분석-1회 투여
실험동물
한양대학교 SPF 사육시설(Specific pathogen free animal facility)에서 사육된 7주령에서 8주령의 수컷 또는 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였으며, 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 모든 동물실험은 한양대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Hanyang University)의 동물실험운영규정을 준수하여 수행하였다.
시료의 투여 및 샘플링
시료의 투여를 위하여 마우스는 무작위로 5마리씩 네 그룹으로 나누어 진행하였다. PBS는 0 시간에 LPS(2 mg/kg)을 복강 내로 주사(I.P injection)하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 PBS(1 mg/kg)를 복강 내로 주사 음성대조군이고, C10-LRR 투여 그룹은 0 시간에 LPS(2 mg/kg)를 복강 내로 주사(I.P injection)하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 주사하였고, αTNFαAb 투여 그룹은 0 시간에 LPS(2 mg/kg)를 복강 내로 주사(I.P injection)하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 αTNFαAb (1 mg/kg)을 복강 내로 주사하였고, C10-LRR+αTNFαAb 투여 그룹은 0 시간에 LPS(2 mg/kg)를 복강 내로 주사(I.P injection)하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)과 αTNFαAb (1 mg/kg)을 복강 내로 주사하였다. 상기 그룹들은 총 7일 동안 24시간마다 생존율과 무게 변화를 측정하였다. αTNFαAb는 TNFα 중화항체(TNFα neutralizing antibody)를 의미한다.
4개 군의 동물모델
1군(PBS) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)를 복강 내로 투여하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 PBS(1 mg/kg)를 복강 내로 투여
2군(C10-LRR) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)를 복강 내로 투여하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)을 복강 내로 투여
3군(αTNFαAb) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)를 복강 내로 투여하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 αTNFαAb(1 mg/kg)을 복강 내로 투여
4군(C10-LRR+αTNFαAb) : 0 시간에 LPS(2 mg/kg)를 복강 내로 투여하고, 5 시간에 LPS(5 mg/kg)과 C10-LRR 재조합 단백질(1 mg/kg)과 αTNFαAb(1 mg/kg)을 복강 내로 투여
본 발명에서는 투여횟수를 달리하였을 때, 병용투여 효과를 분석하고자 하였다. 도 46은 C10-LRR 재조합 단백질과 αTNFαAb의 투여횟수를 달리하였을 때, 패혈증 치료효과를 확인하기 위한 실험 설계를 개략적으로 도시한 것이고, 도 47은 1군(PBS), 2군(C10-LRR), 3군(αTNFαAb) 및 4군(C10-LRR+αTNFαAb)으로 구분되는 동물모델의 생존율을 7 일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 48은 1군(PBS), 2군(C10-LRR), 3군(αTNFαAb) 및 4군(C10-LRR+αTNFαAb)으로 구분되는 동물모델의 무게를 7 일 동안 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 47 및 도 48에 나타난 바와 같이, C10-LRR과 αTNFαAb을 함께 투여한 4군의 경우, 단독으로 투여한 2군 및 3군보다 생존율이 유의적으로 증가하였고, 무게는 유의적으로 빠르게 회복되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 LPS 유도된 패혈증을 예방 또는 치료하기 위해서는 C10-LRR과 종래 약물(TNF-α 항체)과의 병용투여가 매우 효과적이라는 것을 나타낸다.
본 발명에서 개발된 C10 세포투과성 펩티드는 대식세포에 대한 선택적 전달효과를 가지며, 상기 C10과 LRR의 융합하면 LRR이 대식세포로 효율적으로 전달되는 것을 확인하였다. 상기 C10-LRR은 대식세포에 선택적으로 작용함으로써, NF-κB 및 염증성 신호전달을 조절하여 IL-1β 및 IL-6의 생산을 저해하기 때문에, 패혈증과 같이 전신에 걸쳐 염증반응 연속적으로 야기되는 질환의 치료 또는 예방하는 효과를 성공적으로 나타낸다는 것을 확인하였다. 더 나아가 본 발명의 C10-LRR는 C10 세포투과성 펩티드가 결합되지 않은 종래 약물(αTNFα Ab)과 병용투여될 경우, 패혈증 치료에 대한 상승효과를 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.
<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Novel Cell Penetrating Peptides and Uses Thereof <130> HPC9820 <160> 76 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C10, h <400> 1 Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C10, h <400> 2 ctcaggctga ggctacggcg ctgtcatcga 30 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C10, m <400> 3 Leu Arg Met Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C10, m <400> 4 ctcaggatgc ggctgaggcg ctgtcatcga 30 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C10, C>A <400> 5 Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Ala His Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C10, C>A <400> 6 ctcaggctga ggctacggcg cgctcatcga 30 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C10, L del <400> 7 Arg 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reverse primer of C10(L>R)-EGFP <400> 54 cccaagcttt tattacttgt acagctcgtc catgccgaga gtgatcccgg cggcggtcac 60 gaactccag 69 <210> 55 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding C10(L>R)-EGFP <400> 55 atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcaagaggct gaggctacgg 60 cgctgtcatc gaggatccgt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 120 ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 180 ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 240 gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 300 cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 360 gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 420 gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 480 aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 540 gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 600 agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 660 ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 720 cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 780 gagctgtaca agtaa 795 <210> 56 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of C10(L>K)-EGFP <400> 56 ctagctagcc ggaggctgag gctacggcgc tgtcatggat ccgtgagcaa gggcgag 57 <210> 57 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of C10(L>K)-EGFP <400> 57 cccaagcttt tattacttgt acagctcgtc catgccgaga gtgatcccgg cggcggtcac 60 gaactccag 69 <210> 58 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding C10(L>K)-EGFP <400> 58 atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gccggaggct gaggctacgg 60 cgctgtcatc gaggatccgt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 120 ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 180 ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 240 gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 300 cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 360 gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 420 gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 480 aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 540 gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 600 agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 660 ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 720 cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 780 gagctgtaca agtaa 795 <210> 59 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TP-EGFP <400> 59 ctagctagca agaagaggag aaaaaggaaa ggatccgtga gcaagggcga g 51 <210> 60 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TP-EGFP <400> 60 cccaagcttt tattacttgt acagctcgtc catgccgaga gtgatcccgg cggcggtcac 60 gaactccag 69 <210> 61 <211> 786 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding TP-EGFP <400> 61 atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcaagaagag gagaaaaagg 60 aaaggatccg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 120 ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 180 acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 240 cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 300 atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 360 atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 420 accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 480 gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 540 aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 600 ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 660 aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 720 atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 780 aagtaa 786 <210> 62 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TB-EGFP <400> 62 ctagctagcc tgcgtctgct gaggctcaag ttaaaaagga tccgtgagca agggcgag 58 <210> 63 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TB-EGFP <400> 63 cccaagcttt tattacttgt acagctcgtc catgccgaga gtgatcccgg cggcggtcac 60 gaactccag 69 <210> 64 <211> 792 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding TB-EGFP <400> 64 atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcctgcgtct gctgaggctc 60 aagttaaaag gatccgtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg 120 gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc 180 gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg 240 ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc 300 gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag 360 cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag 420 ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac 480 atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac 540 aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc 600 gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg 660 cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc 720 gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag 780 ctgtacaagt aa 792 <210> 65 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TAT-EGFP <400> 65 ctagctagct atggacgcaa gaagcgccgc cagcgccgcc gcggatccgt gagcaagggc 60 gag 63 <210> 66 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TAT-EGFP <400> 66 cccaagcttt tattacttgt acagctcgtc catgccgaga gtgatcccgg cggcggtcac 60 gaactccag 69 <210> 67 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding TAT-EGFP <400> 67 atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gctatggacg caagaagcgc 60 cgccagcgcc gccgcggatc cgtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 120 atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 180 gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 240 cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 300 taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 360 caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 420 ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 480 ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 540 gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 600 ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 660 ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 720 aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 780 gacgagctgt acaagtaa 798 <210> 68 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TAT-dTomato <400> 68 cgcggatcca tggtgagcaa ggg 23 <210> 69 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TAT-dTomato <400> 69 cccaagcttt cactacttgt acagctc 27 <210> 70 <211> 786 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding TAT-dTomato <400> 70 atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gctatggacg caagaagcgc 60 cgccagcgcc gccgcggatc catggtgagc aagggcgagg aggtcatcaa agagttcatg 120 cgcttcaagg tgcgcatgga gggctccatg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag 180 ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggcggc 240 cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc ccccagttca tgtacggctc caaggcgtac 300 gtgaagcacc ccgccgacat ccccgattac aagaagctgt ccttccccga gggcttcaag 360 tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggtctggtga ccgtgaccca ggactcctcc 420 ctgcaggacg gcacgctgat ctacaaggtg aagatgcgcg gcaccaactt cccccccgac 480 ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct ccaccgagcg cctgtacccc 540 cgcgacggcg tgctgaaggg cgagatccac caggccctga agctgaagga cggcggccac 600 tacctggtgg agttcaagac catctacatg gccaagaagc ccgtgcaact gcccggctac 660 tactacgtgg acaccaagct ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa 720 cagtacgagc gctccgaggg ccgccaccac ctgttcctgt acggcatgga cgagctgtac 780 aagtag 786 <210> 71 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of dNP2-EGFP <400> 71 ctagctagca aaattaaaaa agtcaagaag aaaggaagaa aaggatccaa aattaaaaaa 60 gtcaagaaga aaggaagaaa aggatccgtg agcaagggcg ag 102 <210> 72 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of dNP2-EGFP <400> 72 cccaagcttt tattacttgt acagctcgtc catgccgaga gtgatcccgg cggcggtcac 60 gaactccag 69 <210> 73 <211> 837 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding dNP2-EGFP <400> 73 atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcaaaattaa aaaagtcaag 60 aagaaaggaa gaaaaggatc caaaattaaa aaagtcaaga agaaaggaag aaaaggatcc 120 gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 180 gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 240 aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 300 gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 360 cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 420 aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 480 aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 540 ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 600 atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 660 cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 720 ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 780 ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaa 837 <210> 74 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TAT-LRR <400> 74 ctagctagct atggacgcaa gaagcgccgc cagcgccgcc gcgtcgacct tcttgaccat 60 ctc 63 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TAT-LRR <400> 75 aggttctgga cacgaattcc gg 22 <210> 76 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> necleic acid sequence encoding TAT-LRR <400> 76 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggctagct atggacgcaa gaagcgccgc cagcgccgcc gcgtcgacct tcttgaccat 120 ctcttcttcc actatgagtt ccagaaccag cgcttctcag ctgaggtgct gggctcccta 180 cgccagctca atttagcagg ggtgcgcatg acacccctca agtgcacagt ggtagcctct 240 gtactgggaa gtggaaggca ccccctggat gaggtgaact tggcctcctg ccagctggat 300 cccgctgggc tacacactct catgcctgtc ctcctgcgtg cccggaaact ggggttgcaa 360 ctcaacaatc tgggccccga ggcctgcaga gacctccgag acctgctctt acacgatcaa 420 tgccagatca ccactcttag gctctccaac aacccactga cagcagctgg tgtgggctta 480 ctgatggacg ggctggcagg aaacacttcg gtgacacacc tgtctctgct gcacactgac 540 cttggagacg agggactgga actgctggct gcccagctgg accgaaacaa acaactgcag 600 gagctgaacg tggcctacaa cggtgctggt gacacagtgg ctctggcctt ggctaaggct 660 gctcgggagc acccttccct ggagctgctg cacctctact tcaatgagct gagttcagag 720 ggccgccagg tcctgcggga tttggggggc tctggtgaag gtggtgcccg ggtcgtagcc 780 tcgctgacag aagggacggc ggtgtctgag tactggtcag tgatccttag tgaagtccag 840 cgcaacgtcc acagctggga cccgctccgg gtccagaggc atctcaagct gctgctccgt 900 gatctggagg acagccgggg cgccaccctt aatccctggc gcaaggctca gcttctgcga 960 gtggagggcg aggtcaagac tcttctggag cagctgggag gttctggaca cgaattcgat 1020 tacaaggatg acgatgacaa gctcgagcac caccaccacc accactga 1068

Claims (18)

  1. 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성 펩티드.
    [일반식 1]
    (Xaa1)a-Arg-Xaa2-Arg-Leu-Arg-Arg-Xaa3-His-(Xaa4)b
    상기 일반식에서
    Xaa1은 각각 독립적으로 류신, 아르기닌 및 라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    Xaa2는 알라닌, 글리신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌 또는 발린으로 이루어진 군에서 선택되며,
    Xaa3은 알라닌, 글리신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 발린, 세린, 트리오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 또는 글루타민으로 이루어진 군에서 선택되고,
    Xaa4는 각각 독립적으로 아르기닌, 라이신 및 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이고,
    상기 a는 0 내지 5 중의 어느 하나의 정수이고, 상기 b는 0 내지 5 중의 어느 하나의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포투과성 펩티드는 8 내지 12개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포투과성 펩티드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 Xaa1은 각각 독립적으로 류신인 것을 특징으로 하는 세포투과성 펩티드.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 Xaa3은 알라닌 또는 시스테인이며, 상기 Xaa4는 아르기닌인 것을 특징으로 하는 세포투과성 펩티드.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 Xaa2는 류신 또는 메티오닌 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포투과성 펩티드.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포투과성 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포투과성 펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중에서 선택되는 어느 한 항의 세포투과성 펩티드;와 생물학적 활성 물질;가 결합된 융합체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 융합체는 대식세포, B 림프구, T 림프구, 비만세포, 단핵구, 수지상 세포, 호산구, 자연살해세포, 호염기구, 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 면역세포를 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는 융합체.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 융합체는 세포투과성 펩티드에 의해 대식세포에 특이적으로 작용하여 생물학적 활성 물질을 대식세포 내로 효율적으로 전달하는 것을 특징으로 하는 융합체.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 물질은 단백질, 핵산, 펩티드, 지질, 당지질, 미네랄, 당, 나노 입자, 생물학적 제제, 조영물질, 형광물질, 약물(drugs) 및 화학 물질(compounds)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 융합체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 물질은 NF-kB 신호전달을 억제하는 제제 및 인플라마솜(inflammasome) 신호전달을 억제하는 제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 융합체.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 생물학적 활성 물질은 상기 세포투과성 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 융합체.
  13. 제7항의 융합체를 유효성분으로 함유하는 면역세포 내 생물학적 활성 물질 전달용 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 생물학적 활성 물질의 대식세포 국소 전달을 수행하는 것을 특징으로 하는 생물학적 활성 물질 전달용 조성물.
  15. 제8항의 융합체를 유효성분으로 함유하는 약물 보조용 조성물.
  16. 제1항의 세포투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질이 융합된 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터.
  17. 제1항의 세포투과성 펩티드를 생물학적 활성 물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 전달 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계;를 포함하여 이루어지는 생물학적 활성 물질의 전달방법.
  18. 제1항의 세포투과성 펩티드를 유전물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및
    상기 제조된 전달 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계;를 포함하여 이루어지는 유전자 치료 방법.
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