KR102490748B1 - 화물분자 수송 도메인 rmad1, 이의 변이체, 재조합 화물분자 및 이를 이용한 화물분자 수송 방법 - Google Patents

화물분자 수송 도메인 rmad1, 이의 변이체, 재조합 화물분자 및 이를 이용한 화물분자 수송 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 ADARB2 유래의 세포 투과 펩타이드 및 이를 이용한 화물분자 전달 시스템에 관한 것으로, 인간 ADARB2 유래 RMAD1 또는 그의 변이체를 포함하는 화물분자 수송 도메인 및 상기 화물분자 수송 도메인과 융합된 재조합 화물분자를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 화물분자 전달 방법을 제공한다. 본 발명의 화물분자 수송 도메인은 종래의 세포 침투성 펩타이드에 비하여 높은 효율로 화물분자를 세포 내로 도입할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 단백질에서 유래한 폴리펩타이드 서열로서 면역 반응 문제를 유발할 우려가 없으므로 다양한 고분자 물질을 인체 세포 내로 전달하는데 유용하다.

Description

화물분자 수송 도메인 RMAD1, 이의 변이체, 재조합 화물분자 및 이를 이용한 화물분자 수송 방법 {Cargo molecule transport domain RMAD1, variant thereof, recombinant cargo molecule and cargo molecule transport method using the same}
본 발명은 인간 ADARB2 유래의 화물분자 수송 도메인 RMAD1, 이의 변이체, 이를 암호화하는 유전자 구조체, 벡터, 재조합 화물분자 및 이를 이용한 화물분자 수송 방법에 관한 것으로, 인간 ADARB2 유래 RMAD1 또는 그의 변이체를 포함하는 화물분자 수송 도메인 및 상기 화물분자 수송 도메인과 화물분자가 융합된 재조합 화물분자를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 화물분자 전달 방법을 제공한다.
단백질 전달기술이란 단백질 수송 도메인 (Protein Transduction Domain; PTD) 또는 세포 침투성 펩타이드 (Cell penetrating Peptide; CPP)라 불리며 대개 5∼30개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 단백질이나 유전자 등의 고분자와 융합하여 포유류 세포, 조직, 혈액 등 생체 안으로 손쉽게 전달할 수 있는 새로운 개념의 전달 시스템이다.
비록 구체적인 기작은 아직 정확히 밝혀지지 않았지만, 단백질 전달기술은 치료용 단백질을 인 비트로와 인 비보로, 세포 또는 조직 내로 전달하는데 많이 사용되어 왔으며 매우 다양한 단백질 수송 도메인이 알려져 있다. 단백질 수송 도메인과 생물학적 화물분자 (예를 들면, 핵산, 단백질, 펩타이드, 작은 분자, 세포독성 약물 등) 간의 결합은 공유결합 외에도 이온결합, 정전기적 결합 등의 다양한 방법으로 이루어질 수 있다.
단백질 수송 도메인은 리포좀이나 폴리머 등 다른 전달체에 비하여 낮은 독성을 나타내고 면역거부반응이 적다는 장점이 있다. 그러나, 지금까지도 임상 등에 이용되는 단백질 수송 도메인은 드물다.
이중 가닥 RNA 특이적 에디타제 B2 (RNA-editing deaminase-2; "RED2" 또는 "ADARB2"로 약칭함)는 인간에서 ADARB2 유전자에 의해 암호화되는 효소이다. 이 효소는 편집 활성이 부족하며, 다른 ADAR 효소가 시험관 내 표적에 결합하는 것을 방지하고 이러한 효소의 효율성을 감소시킨다. ADARB2 단백질은 dsRNA뿐만 아니라 ssRNA에도 결합할 수 있다. ADARB2는 RNA 편집 효소의 이중 가닥 RNA (dsRNA) 아데노신 디아미네이즈 계열의 구성원이다. pre-mRNA의 아데노신 탈아미노화는 유전자 산물의 아미노산 서열에 변화를 가져오며, 이는 게놈 DNA 서열에 의해 예측된 것과 다르다.
그러나 ADARB2 단백질의 일부 서열이 화물분자 수송 도메인으로 이용될 수 있다는 가능성에 대해서는 현재까지 알려진 바 없다.
본 발명은 높은 효율로 세포 또는 조직 내로 화물분자를 투과시키며, 인체에 이용시 부작용이 없거나 적은 화물분자 수송 도메인, 이 화물분자 수송 도메인과 융합한 재조합 화물분자 및 이 화물분자 수송 도메인을 이용하여 화물분자를 세포 또는 조직 내로 투과시키는 방법을 제공하려는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 수많은 인간 유래 후보 펩타이드를 선정하여 시험한 결과, 본 발명자들은 인간 ADARB2 단백질 유래 CKSKRRRRRRSKRKD의 15개 아미노산으로 구성된 펩타이드 (이하, 본 발명에서 "RMAD1"으로 칭함) 또는 이 중 일부 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 펩타이드가 단백질, 핵산 등의 고분자를 세포, 조직, 혈액 등의 생체 내로 원활하게 투과시킬 수 있으며, 상기 RMAD1 또는 이의 변이체 펩타이드가 HIV-Tat 펩타이드와 비교하여 세포 및 조직 투과능이 현저히 우수함을 확인하였다.
본 발명자들은 인간 ADARB2 단백질 유래 세포 투과 펩타이드 RMAD1을 이용하여 자체 투과 효능을 검증하기 위하여 FITC를 합성하여 FACS 실험을 진행하였으며, 그 결과, RMAD1 펩타이드가 HIV-Tat 펩타이드보다 월등하게 세포 안으로 잘 투과하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 RMAD1 펩타이드가 화물분자와 결합하여 세포 내로 잘 투과하고 화물분자를 세포 내로 전달하는지를 평가하기 위하여 시험용 화물분자로 EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) 단백질을 부착하여 실험을 진행하였다. EGFP와 RMAD1의 융합 단백질 벡터 디자인 및 정제를 통해 순도 높은 융합 단백질을 제조하였고, 이 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯팅, FACS, 공초점 현미경과 같은 다양한 검증 방법을 이용하여 EGFP-RMAD1 융합 단백질이 HIV-Tat 펩타이드와 비교하여 화물분자를 세포 내로 전달하는 능력이 우수하다는 것을 확인하였다.
본 발명의 설명 및 청구범위 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"화물분자"란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는, 화물분자 수송 도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 화물분자 수송 도메인과 융합되기 전의 목표 분자 그 자체 또는 화물분자 수송 도메인-목표 분자 복합체의 목표 분자 부분을 의미한다. 화물분자로는 항체를 비롯한 단백질, 항원 또는 항원성 에피토프를 비롯한 펩타이드, 아미노산, 핵산, 탄수화물, 지질 등의 고분자, 압타머, 리포좀 그리고 엑소좀 및 이들 중 1종 이상의 혼합물 중 선택된 것을 의미한다.
"아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 천연 아미노산, 비천연 아미노산 또는 변형된 아미노산을 의미한다. 달리 언급되지 않는 한, 아미노산에 대한 모든 언급은 일반적으로 또는 명칭에 따라 특이적으로 D 및 L 입체이성질체(구조가 이같은 입체이성질체 형태를 허용하는 경우) 양쪽 모두에 대한 언급을 포함한다. 천연 아미노산에는 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라긴 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 라이신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 타이로신 (Tyr) 및 발린(Val)이 포함된다. 비천연 아미노산에는 N-말단 아미노기 또는 측쇄기 상에서 화학적으로 변형된, 또는 가역적 또는 비가역적으로 화학적으로 차단된 변형 아미노산 잔기, 예컨대 N-메틸화 D 및 L 아미노산 또는 측쇄 관능기가 또다른 관능기로 화학적으로 변형된 잔기가 포함된다.
"화물분자 단백질"이란 화물분자가 단백질인 경우를 말하는 용어이다.
"화물분자"에 포함되는 개념으로서, "목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없으며, 화물분자 수송 도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 화물분자 수송 도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 화물분자 수송 도메인-목표 분자 복합체의 목표 분자 부분을 의미한다. 목표 분자로서는 폴리펩타이드, 단백질, 펩타이드를 포함한다. 목표 분자에 속하는 목표 단백질의 예로는 EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈, 상피세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 카탈라제 등을 들 수 있으나, 이는 목표 단백질을 일부 예시한 것일 뿐, 목표 단백질이 이에 제한되는 것이 아님은 통상의 기술자에게 자명하다.
"재조합 화물분자"란 화물분자 수송 도메인 및 한 개 이상의 화물분자 부분을 포함하며, 화물분자 수송 도메인과 화물분자의 유전적 융합이나 화학결합으로 형성된 복합체를 의미한다. "융합 단백질"이란 화물분자 단백질과 화물분자 수송 도메인과 유전적 융합이나 화학결합으로 형성된 재조합 화물분자를 의미한다. 본 명세서에서 재조합 화물분자 단백질과 동일한 의미로 사용하였다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다. 또한, "표적 세포"란 화물분자 수송 도메인에 의해 화물분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.
본 발명에서의 "화물분자 수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등의 화물분자와 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 화물분자들을 세포 또는 조직 내로 도입시킬 수 있는 펩타이드를 말한다. 본 발명의 설명에서 "화물분자 수송 도메인"은 "단백질 수송 도메인" 또는 "세포 투과 도메인"과 혼용하였다.
또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드 등의 화물분자를 세포 또는 조직 내로 "도입"하는 것에 대하여 "침투", "수송", "투과"한다는 표현들과 혼용하였다.
본 명세서에서 "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 화물분자 수송 도메인의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 화물분자 수송 도메인의 변형을 의미한다.
본 명세서에서 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.
기타 본 명세서, 청구범위 및 도면에 기재된 용어는 특별히 명시되지 않은 경우 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 사용하는 의미로 사용되었음을 밝힌다.
본 발명은
1) 인간 ADARB2 유래의 서열번호 1로 이루어진 RMAD1 펩타이드; 또는
2) RMAD1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된, 8 ~ 50개 아미노산으로 이루어진 RMAD1 변이체 펩타이드;로서,
화물분자와 결합하여 포유류의 세포 내 또는 조직 내로 화물분자를 수송하는 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 RMAD1 변이체 펩타이드에서 아미노산 치환에 제한은 없으나, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환인 것을 특징으로 하는, 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 RMAD1 변이체 펩타이드가 서열번호 1의 라이신 잔기 위치가 독립적으로 아르기닌 잔기로 치환되고/되거나 서열번호 1의 아르기닌 잔기 위치가 독립적으로 라이신 잔기로 치환된 서열인 것을 특징으로 하는, 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 RMAD1 변이체 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실된 펩타이드 서열에서 결실 아미노산에 특별한 제한은 없으며, 바람직하게는 RMAD1 펩타이드의 아미노산 중 라이신 잔기 및 아르기닌 잔기 중 하나 내지 여섯 개가 결실된, 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 RMAD1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실 및/또는 부가된 펩타이드 서열이 서열의 중간, N 말단 및 C 말단 중 어느 한 곳 이상에서 아미노산 결실 및/또는 부가가 일어나는 것인, 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인간 ADARB2 유래의 서열번호 1로 이루어진 RMAD1 펩타이드; 또는 RMAD1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된, 8 ~ 50개 아미노산으로 이루어진 RMAD1 변이체 펩타이드;를 포함하며, 화물분자와 결합하여 포유류의 세포 내 또는 조직 내로 화물분자를 수송하는 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다. 서열번호 1의 RMAD1 펩타이드의 아미노산 서열은 "CKSKRRRRRRSKRKD"와 같다. 또한, RMAD1 펩타이드 변이체 중 아미노산 변이 서열은 위 서열번호 1의 각 아미노산 잔기 위치에서 개별적으로 아미노산 변이가 일어난 펩타이드 서열을 의미한다. 또한, RMAD1 펩타이드 변이체 중 아미노산이 결실된 서열은 위 서열번호 1의 아미노산 서열 중 적게는 1개 내지 많게는 7개의 아미노산이 독립적으로 결실된 펩타이드 서열을 의미한다. 아미노산 결실은 서열의 양 말단 또는 중간 어디에서나 일어날 수 있으며, 연속 또는 비연속인 아미노산이 결실될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 RMAD1 펩타이드 변이체의 아미노산 변이 서열이 바람직하게는 서열번호 1의 라이신 잔기 위치가 독립적으로 아르기닌 잔기로 치환되고/되거나 서열번호 1의 아르기닌 잔기 위치가 독립적으로 라이신 잔기로 치환된 서열인, 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 RMAD1 펩타이드 변이체 중 적게는 1개 내지 많게는 7개 이하의 아미노산이 결실된 서열은 바람직하게는 RMAD1 펩타이드의 아미노산 중 라이신 잔기 및 아르기닌 잔기 중 연속하거나 비연속인 하나 내지 일곱 개가 결실된 서열인, 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 상기 RMAD1 펩타이드 변이체는 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 부가가 중첩되어 일어난 것일 수 있다. 예컨대, RMAD1 아미노산 치환 변이체에서 더하여 아미노산 부가 및 결실이 일어날 수 있다. 또한, RMAD1 아미노산 결실 변이체에 아미노산 부가가 일어날 수 있다. 다만, 이와 같이 다양한 조합의 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 부가를 통하더라도 화물분자 수송 기능을 보유하고 있음에는 변함이 없다.
본 발명의 화물분자 수송 도메인의 구체예로서 서열번호 1~11의 펩타이드를 들 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
또한, 본 발명의 화물분자 수송 도메인은 상기 화물분자 수송 도메인이 i) RMAD1 펩타이드, 또는 ii) RMAD1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된, 8 ~ 50개 아미노산으로 이루어진 RMAD1 변이체 펩타이드; 중 선택된 하나 이상이 링커 없이 또는 링커를 통해 이량체 이상의 다량체 형태로 결합된 것을 특징으로 하는 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다. 예컨대, 본 발명의 화물분자 수송 도메인으로는 상기 i) RMAD1 펩타이드, 또는 ii) RMAD1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된, 8 ~ 50개 아미노산으로 이루어진 RMAD1 변이체 펩타이드; 서열을 들 수 있으며, 또한, 상기 i) 또는 ii)의 펩타이드가 두 번 이상 반복되는 서열을 들 수 있고, 그 밖에도 상기 i) 펩타이드 및 ii) 펩타이드가 연결된 화물분자 수송 도메인을 들 수 있으나, 본 발명의 화물분자 수송 도메인이 위에 예시된 펩타이드로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
또한, 상기 링커는 상기 화물분자 수송 도메인의 활성이 유지되는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 각 화물분자 수송 도메인 단량체를 연결시킬 수 있고, 좀 더 바람직하게는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등이 여러 개 연결된 링커를 이용하여 연결할 수 있으며, 가장 바람직하게는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다. 위와 같은 아미노산 링커, 펩타이드 링커 외에도 상기 화물분자 수송 도메인의 활성이 유지되는 한 화학적 링커의 사용도 가능하다.
또한, 본 발명은 화물분자; 및 상기 화물분자의 N-말단 및 C-말단 중 어느 한 곳 이상에 상기 어느 하나의 화물분자 수송 도메인이 융합된, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자에 관한 것이다.
상기 화물분자와 화물분자 수송 도메인은 링커 없이 또는 링커의 존재 하에 융합될 수 있다. 또한, 상기 링커는 상기 화물분자 수송 도메인의 화물분자 수송 활성 및 화물분자의 활성이 유지되는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 화물분자 수송 도메인과 화물분자를 연결시킬 수 있고, 좀 더 바람직하게는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등이 여러 개 연결된 링커를 이용하여 연결할 수 있으며, 가장 바람직하게는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다. 위와 같은 아미노산 링커, 펩타이드 링커 외에도 상기 화물분자 수송 도메인의 활성이 유지되는 한 화학적 링커의 사용도 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자가 펩타이드, 단백질, 또는 핵산인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자가 치료용 단백질, 항원성 단백질 또는 에피토프 펩타이드인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자가 항산화 단백질인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 화물분자를 포함하는 질병 예방용 또는 치료용 약제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 화물분자를 포함하는 화장료에 관한 것이다. 본 발명의 화장료는 화장수, 크림, 에센스, 수중유형 또는 유중수형 에멀젼, 연고 등의 기초 화장료 외에도 파운데이션, 립스틱, 아이섀도우 등의 색조 화장료도 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 화물분자를 포함하는 의료기기에 관한 것이다. 본 발명의 의료기기는 창상피복재, 필러, 복합 필러 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자 수송 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 구조체에 관한 것이다.
본 발명의 화물분자 수송 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 구체예로서 서열번호 12~22의 펩타이드를 들 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 구조체를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자 단백질 발현용 발현 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 벡터가 상기 화물분자 수송 도메인과 화물분자 단백질이 융합된 재조합 화물분자 단백질이 발현될 수 있도록, 화물분자 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자 단백질 발현용 발현 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 화물분자의 N-말단 및 C-말단 중 어느 한 곳 이상에 상기 화물분자 수송 도메인이 융합된 재조합 화물분자를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 재조합 화물분자를 세포와 접촉시키는 단계;를 포함하는 세포 내로 화물분자를 전달하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자가 질병 예방 또는 치료용 단백질임을 특징으로 하는 세포 내로 화물분자를 전달하는 방법에 관한 것이다. 질병 예방 또는 치료용 단백질로는 상피세포 성장인자 등의 성장인자, 항체, 항체 의약품, 항체의 Fc를 포함하는 융합 단백질, 항체-의약품 복합체, 단백질 의약품, 효소 등을 의미하지만, 이러한 예시에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자가 항산화 단백질임을 특징으로 하는 세포 내로 화물분자를 전달하는 방법에 관한 것이다. 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈, 카탈라제 등의 항산화 단백질을 의미하지만, 이러한 예시에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자 수송 도메인이 서열번호 1 내지 11 중 하나인 것을 특징으로 하는 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자 수송 도메인을 암호화하는 유전자 구조체가 서열번호 12 내지 22 중 하나의 폴리뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자 수송 도메인이 폴리펩타이드가 두 번 포함되는 것을 특징으로 하는 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
본 발명에 따른 화물분자 수송 도메인은 RMAD1 펩타이드의 특정 아미노산 잔기 위치에서 아미노산 잔기가 보존적으로 치환된 변이체 또는 RMAD1 펩타이드나 이 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단 및/또는 중간에서 1~5개의 아미노산이 결실된 펩타이드도 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명의 화물분자 수송 도메인은 보존적 아미노산 치환을 갖더라도 여전히 활성을 보유할 수 있음이 예상된다.
또한, 본 발명에 따른 화물분자 수송 도메인 변이체는 본 발명에 따른 화물분자 수송 도메인과 실질적으로 동일한 기능 및/또는 효과를 가지며, 80% 또는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 화물분자 수송 도메인 변이체들 또는 이의 절편들도 포함하는 의미로 해석된다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자가 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 등의 핵산, 탄수화물, 지질 및 이들 중 1종 이상의 혼합물 중 선택된 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자 수송 도메인과 화물분자의 화학결합이 공유결합 또는 비공유결합임을 특징으로 한다. 상기 화학결합은 공유결합 또는 비공유결합일 수 있다. 비공유결합으로는 이온결합 또는 정전기적 인력에 의한 결합 또는 소수성 상호작용에 의한 결합 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 이온결합 또는 정전기적 인력으로 화물분자 수송 도메인과 결합할 수 있는 물질은 DNA 또는 RNA와 같이 전하를 띠는 물질일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자 수송 도메인이 서열번호 1 내지 서열번호 11 중 선택된 1종임을 특징으로 하는 세포 내 또는 조직 내로 투과가 용이한 재조합 화물분자에 관한 것이다. 본 발명의 화물분자 수송 도메인은 서열번호 1 내지 11에 한정되는 것이 아니나, 실험의 편의를 위하여 대표적인 펩타이드들을 표 1에 예시한 것임을 분명히 밝힌다.
또한, 본 발명은 화물분자 수송 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 서열번호 12 내지 서열번호 22 중 선택된 1종임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 화물분자 수송 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12 내지 22에 한정되는 것이 아니나, 실험의 편의를 위하여 대표적인 폴리뉴클레오타이드들을 표 2에 예시한 것임을 분명히 밝힌다.
본 발명의 재조합 화물분자, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 피부 외용제, 경구, 스프레이, 패치 또는 주사 등 다양한 형태로 제형화할 수 있다. 예를 들면 경구용 조성물로는 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명을 통해 새로 발굴된 화물분자 수송 도메인은 세포 투과능이 우수하고 화물분자 전달 물질로 유용하며, 인체에서 유래한 물질이므로 인체에 투여시 면역반응을 일으킬 우려가 없어 안전하다.
도 1은 RMAD1 세포 투과 펩타이드의 2차 구조 예측도를 나타낸다. A는 Pep-fold3 프로그램을 이용하여 예측한 펩타이드의 2차 구조이다. B는 펩타이드의 Pepfold를 나타내는 그래프이다.
도 2의 A, B는 3T3, B16F10의 두 가지 세포주를 이용하여 2.5 uM의 FITC가 접합된 RMAD1 및 2.5 uM의 FITC가 접합된 TAT을 처리한 후 세포 내로 투과된 FITC RMAD1의 양(형광값)을 측정한 결과이다. C는 RMAD1 및 그 변이체들을 각각 FITC와 접합시킨 후 2.5 uM로 처리한 후 세포 내로 투과된 FITC RMAD1 및 변이체의 양(형광값)을 측정한 결과이다. 무처리 대조군 외에 FITC TAT 2.5 uM로 처리한 것을 대조군으로 사용하였다.
도 3은 EGFP가 융합된 RMAD1의 벡터 맵 및 정제된 단백질의 순도를 나타낸다. A는 EGFP-RMAD1가 어떤 제한효소를 사용하여 pET28a 벡터에 sub-cloning 되었는지를 나타낸다. B는 정제된 EGFP-RMAD1의 분자량을 Coomassie blue를 통해 확인한 결과이다. C는 정제된 EGFP-RMAD1의 분자량 및 정제가 잘 되었음을 확인할 수 있는 웨스턴 블롯 결과이다. D는 정제된 EGFP-RMAD1, EGFP, EGFP-TAT을 HaCaT 세포에 처리 후 EGFP의 전달률을 웨스턴 블롯팅을 이용해 EGFP, EGFP-TAT과 비교 확인한 결과이다.
도 4는 FACS를 이용하여 세포 투과성을 확인한 결과를 나타낸다. A는 HaCaT 세포에 2.5 uM의 EGFP-RMAD1, EGFP, EGFP-TAT을 각 처리한 후 세포에 전달된 EGFP의 양을 FACS를 통해 확인한 결과이다. B는 도 4a에서 나온 형광수치값을 히스토그램으로 나타낸 결과이다. C는 EGFP-RMAD1, EGFP, EGFP-TAT의 세포 투과성을 도스별로 2 시간 처리한 후 FACS로 확인한 결과이다. D는 EGFP-RMAD1, EGFP, EGFP-TAT의 세포 투과성을 시간별로 2.5 uM 처리한 후 FACS로 확인한 결과이다.
도 5a는 HaCaT 세포에 2.5 uM의 EGFP-RMAD1, EGFP, EGFP-TAT을 각 처리한 후 세포에 전달된 EGFP의 이미지를 공초점 현미경을 통해 세포 투과성을 확인한 결과이다. 도 5b는 도 5a와 같은 방법으로 융합단백질을 처리한 후 lysotracker 또는 mitotracker를 이용하여 융합단백질의 위치를 형광 현미경으로 확인한 결과이다.
도 6은 SOD1이 융합된 RMAD1의 벡터 맵 및 정제된 단백질의 순도를 나타낸다. A는 SOD1-RMAD1이 어떤 제한효소를 사용하여 pET29a 벡터에 sub-cloning 되었는지를 나타낸다. B는 정제된 SOD1-RMAD1의 분자량을 Coomassie blue를 통해 확인한 결과이다. C는 정제된 SOD1-RMAD1의 분자량 및 정제가 잘 되었음을 확인할 수 있는 웨스턴 블롯 결과이다. D는 정제된 SOD1-RMAD1, SOD1, SOD1-TAT을 500 ng/ml의 LPS로 처리한 HaCaT 세포에 처리 후 활성산소종 상대적 생성률을 웨스턴 블롯팅을 이용해 비교 확인한 결과이다. E는 세포를 무혈청 배지에서 1시간 배양한 후 0.5, 1, 2.5 uM의 SOD1-RMAD1으로 각 웰에 2시간 동안 처리한 다음, 각 웰에 LPS를 500 ng/ml씩 16시간 동안 처리하고 이후, 배지를 회수하여 1,000 g에서 10분간 원심 분리한 후 TNF-α를 검출한 결과이다.
도 7은 RMAD-1과 펩타이드 항원을 융합하여 항암 백신 효능을 확인한 실험 및 실험결과를 나타낸다. A는 마우스에 TC-1 세포를 피하 주사하고, 6일과 13일에 각각 E7 항원과 MPLA를 주사하고, 19일에 희생하는 실험 절차를 나타낸다. B는 대조군(Con), E7 항원 투여군(E7), E7-RMAD1 융합 펩타이드 처리군(E7AD),E7 항원 + MPLA(면역보조제이자 TLR4 작용제) 처리군(E7+MPLA), E7-RMAD1 융합 펩타이드 + MPLA 처리군(E7AD+MPLA)에 따른 종양의 크기 변화를 나타내는 그래프이다. C와 D는 마우스 비장에서 면역세포를 분석한 결과 RMAD1이 포함된 E7AD, 그리고 E7AD + MPLA 처리군에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 수가 증가함을 확인하였으며 IFN-γ의 발현 증가 확인을 통해 CD8+ T세포의 활성화를 확인하였다. E는 혈액의 면역세포를 이용하여 기존 화물분자 수송 도메인인 TAT과 결합한 E7-TAT과 비교, 분석한 결과, E7-RMAD1 처리군에서 효과적으로 항원 특이적 CD8 + T세포를 증가시킴을 보여준다.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
1. 세포 배양
HaCaT 그리고 RAW264.7세포는 DMEM 배지에 10% 우태혈청 (fetal bovine serum; FBS)과 항생물질용액 (100 units/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신)이 첨가된 세포 배양액을 통해 배양되었다. TC-1 세포는 RPMI 배지에 10% 우태혈청 (fetal bovine serum; FBS)과 항생물질용액 (100 units/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신) G418 (0.4 mg/ml)이 첨가된 세포 배양액을 통해 배양되었다. 세포는 37℃, 95% 습도, 5% CO2가 유지되는 조건에서 배양하였고, 세포가 배양접시에 70-80% 유착되었을 때 트립신-EDTA를 처리하여 계대 배양하였다. HaCaT 세포는 카톨릭대학교 의과대학 김태운 교수에게서 분양받아 배양하였으며, 3T3와 B16F10 세포는 서울대학교 세포주은행으로부터 분양받아 배양하였고, RAW264.7 세포와 TC-1은 삼육대학교 약학대학 김상범 교수 실험실로부터 분양 받아 배양하였다.
2. RMAD1 구축
다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 94℃에서 5분, 그 후 25℃에서 1시간 어닐링하였다.
센스 올리고뉴클레오타이드:
5'-agctttgcaagtccaagaggaggaggaggcggaggtccaagcggaaagatc-3' (서열번호 23)
안티센스 올리고뉴클레오타이드:
5'-tcgagatctttccgcttggacctccgcctcctcctcctcttggacttgcaa-3' (서열번호 24)
이후 pET-28a벡터의 HindIII와 XhoI 부위를 절단하고, 위에서 제조한 RMAD1 코딩 올리고뉴클레오타이드 쌍을 연결하였다. 재조합된 RMAD1을 대장균 Escherichia coli 균주 DH5α (RH618)에 형질전환하였다. 형질전환된 세포에서 분리한 DNA는 BamHI과 Hind III 부위를 절단하여 EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) 유전자를 연결하였다.
3. 단백질 정제
EGFP-RMAD1, EGFP, EGFP-TAT 단백질은 N-, C- 말단 6X his 태그를 함유하는 pET28a 플라스미드 벡터를 이용하여 정제하였다. BL21- 코돈 플러스 세포로 형질 전환시키고 콜로니를 배지에 접종하여 키웠다. OD 600이 0.5에 도달할 때까지 대규모의 세포를 LB 배지에서 배양하였고, 4℃에서 16시간 동안 0.5 mM의 IPTG를 사용하여 단백질 발현을 유도하였다. 원심분리로부터 세포 펠렛을 획득하고, 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM Tris 완충액 pH 7.5에서 초음파 처리하여 파쇄하였다. 그 후, 20,000 g에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이를 Ni-NTA 수지 칼럼 위에 부었다. 300 mM NaCl, 5 % 글리세롤 및 15 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM Tris 완충액, pH 7.5로 세척 단계를 수행하였다. 용출 완충액 (50 mM Tris pH 7.5, 300 mM NaCl, 글리세롤 5 %, 300 mM 이미다졸) 10 ml를 사용하여 단백질을 칼럼으로부터 분리한 다음, Mustang 컬럼 (Pall, MSTG25E3)을 사용하여 endotoxin을 제거하고, LAL (limulus amebocyte lysate) 분석으로부터 0.5 EU/mg 이하의 적정 단백질을 전체 실험에 사용하였다.
4. FACS를 이용한 EGFP-RMAD1 융합단백질의 세포 도입
HaCaT 피부세포에서 RMAD1의 세포투과율을 평가하기 위해 12시간 전 24웰 플레이트에 1 x 105 양의 HaCaT 세포를 부착시켰다. 그 후, 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 세포를 세척한 후 무혈청 배지 안에 2.5 uM의 단백질을 2시간 동안 처리하였다. 2시간 이후, 무혈청 배지로 총 3번 세척해 주었고 이후 150 ul의 트립신을 처리하여 세포를 플레이트에서 떨어트린 후 850 ul의 혈청이 들어간 배지를 넣어 중화하였다. 이후 500 g로 10분간 원심분리를 한 다음, 배지를 제거하였으며 이후 500 ul의 FACS 완충액 (1% BSA, 0.1% sodium azide)을 통해 세포에 묻은 단백질을 제거하였다. 2번 세척을 반복한 후 FACS 완충액을 넣어 FACS 분석을 진행하였다.
5. 공초점 및 형광 현미경을 이용한 EGFP - RMAD1 융합단백질의 세포 도입
HaCaT 피부세포에서 RMAD1의 세포투과율을 평가하기 위해 12시간 전 24웰 플레이트에 9 mm 커버슬립을 올린 이후 1 x 105 양의 HaCaT 세포를 부착하였다. 그 후, 세포를 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 세포를 세척한 후 무혈청 배지 안에 2.5 uM의 단백질을 2시간 동안 처리하였다. 2시간 이후, 무혈청 배지로 총 3번 세척했고, 이후 hoechst를 1:1000 비율로 PBS에 희석하여 5분간 염색하였다. 이후 PBS를 이용하여 총 5번 세척하였으며 웰에서 글라스 커버 슬립을 분리하여 물기를 제거하고 mounting을 진행하였다. 이후 공초점 현미경을 이용하여 이미지를 얻었으며 형광 발현을 확인하였다. 형광현미경의 경우 96웰 플레이트에 1 x 104 양의 HaCaT 세포를 전날 부착시켰으며 이후 위와 같은 방법으로 단백질을 처리하였다. 이후 실험이 끝나기 30분 전, 무혈청 배지로 세척 후 Mitotracker-deep red FM (1:2000) 또는 Lysotracer Red DND-99 (1:2000)를 처리하였으며, 실험이 끝나기 5분 전 hoechst를 1:1000 비율로 PBS에 희석하여 5분간 염색하였다. 이후 BioTek 사의 Lionheart FX automated microscope 장비를 사용하여 형광 신호를 관찰하였다.
6. 웨스턴 블롯팅
HaCaT 피부세포에서 RMAD1의 세포투과율을 평가하기 위해 12시간 전 12웰 플레이트에 3 x 105 양의 HaCaT 세포를 부착하였다. 그 후, 세포를 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 세포를 세척한 후 무혈청 배지 안에 1 uM의 단백질을 2시간 동안 처리하였다. 2시간 이후, 세포 표면에 묻어있을 수 있는 단백질들을 제거하기 위해 무혈정 배지를 이용하여 총 3번 세척하였다. 이후 RIPA 용균 완충액과 원심분리를 통해 상층액에서의 단백질을 정량하였고 이후 30 ug의 단백질을 5X 시료 완충액과 혼합하였다. 준비된 단백질 시료는 10분간 끓였으며 12 %의 SDS-PAGE gel을 이용하여 분자량에 따라 분리하였다. 전기영동이 끝난 이후 PVDF 멤브레인으로 단백질을 옮긴 후 5% 탈지유를 포함하는 TBS-T 완충액을 이용하여 1시간 동안 블로킹하였다. 이후 단백질 발현 측정을 위해 1차 항체로 GFP 항체를 사용하였으며 이후 2차 항체로 양고추냉이 퍼옥시데이즈가 결합된 항-토끼 항체를 이용하여 반응시켰다. 이후 TBS-T 완충액으로 세척 후 각 단백질의 세포 투과율을 측정하였다.
7. SOD1-RMAD1 융합단백질을 이용한 항산화 효능 개선 평가
RAW 264.7 대식세포에서 RMAD1의 항산화 효능을 평가하기 위해 12시간 전 24웰 플레이트에 5 x 104 양의 RAW264.7 세포를 부착하였다. 이후, 세포를 무혈청 배지에서 1시간 배양한 후 SOD1-RMAD1 0.5, 1, 2.5 uM으로 각 웰에 2시간 동안 처리하였다. 그 다음, 각 웰에 LPS (lipopolysaccharide)를 500 ng/ml씩 16시간 동안 처리하였다. 이후 무혈청 배지로 총 3번 세척하고, 150 ul의 트립신을 처리하여 세포를 떨어뜨린 후 850 ul의 혈청이 들어간 배지를 첨가하여 중화하였다. 500 X g로 10분간 원심분리를 진행한 후 배지를 제거하였으며, 이후 500 ul의 HBSS를 이용해 세척하였다. 이후 CM-H2DCFDA (Thermo, C6827)를 이용하여 10분간 염색을 진행하였으며 이후 FACS 완충액을 통해 2번 세척한 이후 FACS 분석을 진행하였다.
8. SOD1-RMAD1 항산화를 통한 SOD1-RMAD1 TNF-α 억제 평가
RAW 264.7 대식세포에서 RAMD1의 항염증 효능을 평가하기 위해 12시간 전 24웰 플레이트에 5 x 104 양의 RAW264.7 세포를 부착하였다. 이후 세포를 무혈청 배지에서 1시간 배양한 다음 0.5, 1, 2.5 uM으로 각 웰에 2시간 동안 처리하였다. 그 다음, 각 웰에 LPS를 500 ng/ml씩 16시간 동안 처리하였다. 이후, 배지를 회수하여 1,000 X g에서 10분간 원심분리하고 TNF-α를 검출하였다.
9. 동종 마우스 종양 모델 및 종양 측정
TC-1 세포를 혈청 및 G418이 첨가된 RPMI에서 유지시켰으며 트립신으로 세포를 떨어뜨린 후 중화 및 세척을 진행하였다. 이후 1 x 105 세포를 6주령 C57BL/6 마우스 우측에 피하 주사하였으며, 6일과 13일에 마우스 왼쪽에 E7, E7-AD, E7-TAT를 8.8 nmol로 피하 주사하였으며 MPLA 군에는 25 ug을 추가로 섞어서 주사하였다. 디지털 캘리퍼스로 측정을 하였으며 (0.52 X 길이 X 폭2)에 따라 계산을 진행하였다. 종양이 1,000 mm3 이상이 되면 마우스를 안락사 시켰다.
10. 비장 및 혈액 면역 세포 분석
TC-1을 C57BL/6 마우스에 주입한 이후 위와 같은 스케쥴로 각 항원과 MPLA (Monophosphoryl-Lipid A)를 주입하였으며 19일에 마우스를 희생시켰다. 이후 비장 세포는 2% FBS 및 1% 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 배지를 이용하여 해리시켰다. 적혈구 용해 용액 (BD, 555899)을 통해 비장 및 혈액 세포에서 적혈구를 용해시켰으며 각 세포를 CD8, CD3, IFN-γ, E7 (H-2Db-HPV16) tetramer 항체로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 세포 내 염색의 경우 고정/투과성 용액 키트 (BD, 555028)를 이용하였다. 이 경우, 비장 세포에 16시간 동안 E749-57(RAHYNIVTF) 펩타이드를 처리하여 재자극하였으며 이후 FACS를 통해 CD8+ T세포의 세포 내 IFN-γ를 검출하였다.
결과 1: RMAD1 펩타이드 2차 구조 예측도
RMAD1의 펩타이드 구조 예측을 하기 위하여 PEP-FOLD3 De novo peptide structure prediction 프로그램을 이용하였다. RMAD1의 아미노산 서열을 기입하여 프로그램으로 예측된 모델을 PyMOL 2.4 프로그램으로 2차원 예측 구조를 이미지화 하였다 [도 1의 A]. 2차 구조 예측 분석을 위해 사용된 예측 프로파일을 빨강은 나선형, 녹색은 확장, 그리고 파란색은 코일을 나타내며 이를 통해 2차 예측 모델이 도출되었다 [도 1의 B].
결과 2: RMAD1 - FITC 합성 펩타이드 세포 투과 효율
형광 발광하는 성질의 FITC를 부착한 합성 펩타이드를 이용하여 세포주 3T3, B16F10와 HACAT을 이용하여 RMAD1 및 그 변이체와 결합한 형광 단백질 FITC의 세포 투과 효율을 확인하였다. FITC가 부착되지 않은 세포의 경우 펩타이드의 투과성을 확인하기 어렵기 때문에 형광을 내는 FITC를 부착하여 세포 투과성을 확인하였다. FITC 부착 펩타이드인 RMAD-FITC, TAT-FITC 펩타이드를 이용하여 동일한 농도인 2.5 uM으로 각 세포주에 2시간 동안 처리하였다. 그 결과, 두 세포주에서 대조군인 TAT-FITC 펩타이드에 비해 RMAD1-FITC 합성 펩타이드가 월등히 높은 세포 투과 수준을 보였으며 [도 2의 A, B], 아미노산 치환, 제거, 그리고 추가를 통해서도 HACAT 세포에서 TAT보다 우수한 투과 효능이 유지됨을 확인하였다 [도 2의 C].
결과 3: EGFP - RMAD1 융합단백질의 모식도 및 정제
인간 유래의 세포 침투성 펩타이드와 EGFP를 포함하는 융합단백질을 제작하기 위하여 RMAD1 폴리펩타이드를 코딩하는 서열 (tgc aag tcc aag agg agg agg agg cgg agg tcc aag cgg aaa gat; 서열번호 12)을 pET-28a 플라스미드의 Hind III와 Xho I 부위에 클로닝하였으며 RMAD1 코딩 DNA와 EGFP cDNA를 재조합하여 BamH I 그리고 Hind III 부위를 절단하여 pET-28a 플라스미드에 EGFP-RMAD1를 클로닝하였다 [도 3의 A]. 대조군으로 쓰일 EGFP와 EGFP-TAT 역시 같은 벡터인 pET-28a 플라스미드에 위와 같은 방법으로 클로닝하였으며 his-tag을 포함하는 융합단백질의 경우 Ni-NTA 컬럼에 결합된 이후 낮은 농도의 15 mM의 이미다졸 용액으로 세척한 다음 300 mM의 이미다졸 용액으로 용출하였다. 용출된 융합단백질 산물의 경우 SDS-PAGE를 이용하여 총 10 ug의 단백질을 로딩하였으며 이후 coomassie blue 염색시약을 통해서 정제된 융합단백질의 분자량을 확인하였다 [도 3의 B]. 또한, 염색된 융합단백질이 his-tag를 포함하는 EGFP-RMAD1 단백질 발현 확인을 위하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였으며 his-항체를 통해 his-tag를 포함하는 융합단백질의 분자량이 coomassie blue 염색 결과와 일치함을 확인하였다 [도 3의 B, C].
결과 4: HaCaT 세포 내로의 RMAD1 융합단백질 도입
RMAD1 융합단백질의 세포 투과 효율을 확인하기 위해서 인간 피부세포의 세포주인 HaCaT에 융합단백질을 도입하면서 그 효율을 확인하였다. 재조합 단백질인 EGFP, EGFP-TAT, EGFP-RMAD1은 동일한 농도인 1 uM으로 HaCaT 세포에 2시간 동안 처리하였다. 그 결과, EGFP-RMAD1 융합단백질이 월등히 높은 세포 투과 수준을 보였으며 두번째로 세포 투과 펩타이드로 기존에 잘 알려진 TAT을 포함하는 EGFP-TAT 융합단백질이 EGFP-RMAD1보다 약 60% 낮은 수준의 세포 투과율을 보임을 확인하였다. 또한, EGFP 단백질 자체만으로는 세포로 투과가 되지 않음을 확인하였다 [도 3의 D].
RMAD1 융합단백질의 세포 효능을 다른 실험 기법으로 분석, 농도에 따른 효율, 그리고 시간에 따른 효율을 확인하기 위하여 유세포분석기로 세포 내 형광을 측정하였다. 구체적으로는 농도에 따른 도입 효율을 분석하기 위해 0.1 uM 에서 12.5 uM 농도까지 5배 비율로 총 4 농도의 융합 단백질을 2시간 동안 처리하였다. 그 결과, 농도 의존적으로 HaCaT 세포에 RMAD1 융합 단백질이 전달되었음을 확인하였으며 위의 웨스턴 블롯팅 결과와 마찬가지로 TAT 융합 단백질에 비해 현저히 높은 세포 투과율을 확인할 수 있었다 [도 4의 A, B, C]. 또한, 처리 시간에 따른 도입 효율을 분석하기 위해 2.5 uM 농도의 융합단백질을 30분에서 4시간까지 배양하여 FACS 분석을 진행하였다. 그 결과, RMAD1 융합단백질은 시간 의존적으로 HaCaT 세포에 전달됨을 확인하였으며 2시간까지 꾸준히 투과하는 단백질 양이 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 잘 알려진 세포 투과 도메인인 TAT 보다 효율적으로 단백질을 전달함을 다시 한번 확인하였다 [도 4의 D].
세포로 도입된 EGFP-RMAD1 융합단백질의 위치를 확인하여 실제로 세포 안으로 도입이 되었는지 확인하고, 세포 투과 효능을 다시 한 번 확인하기 위해 HaCaT 세포에 EGFP-RMAD1 융합 단백질을 처리한 후 형광현미경 및 공초점 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 대조군인 EGFP 단백질의 경우 형광 신호를 관찰하지 못하였으나 EGFP-TAT 그리고 EGFP-RMAD1의 경우 공초점 현미경 관찰 결과, 세포질에서 주로 검출됨을 확인할 수 있었다 [도 5a]. 또한, EGFP-RMAD1의 경우 EGFP-TAT 융합단백질에 비해 월등히 높은 형광 신호가 관찰되었으며 이는 위의 웨스턴 블롯팅 및 FACS 결과와 일치하였다. 형광현미경에서도 역시 같은 결과를 얻었으며 대부분의 도입된 EGFP-RMAD1경우 라이소좀 또는 미토콘드리아 위치를 나타내는 lysotracker, mitotracker와 대부분 같은 위치에 있지 않음을 관찰하였으며 이를 통해 도입된 융합단백질이 세포질에 위치함을 재확인하였다 [도 5b].
결과 5: SOD1-RMAD1 융합단백질의 모식도 및 정제
인간 유래의 세포 침투성 펩타이드와 SOD1를 포함하는 융합단백질을 제작하기 위하여 RMAD1 폴리펩타이드를 코딩하는 서열 (tgc aag tcc aag agg agg agg agg cgg agg tcc aag cgg aaa gat; 서열번호 12)을 pET-29a 플라스미드의 Hind III와 Xho I 부위에 클로닝하였으며 RMAD1 코딩 DNA와 SOD1 cDNA를 재조합하여 Nde I 그리고 Hind III 부위를 절단하여 pET-29a 플라스미드에 SOD1-RMAD1를 클로닝하였다 [도 6 의 A]. 대조군으로 쓰일 SOD1 역시 같은 벡터인 pET-29a 플라스미드에 위와 같은 방법으로 클로닝하였으며 his-tag을 포함하는 융합단백질의 경우 Ni-NTA 컬럼에 결합된 이후 낮은 농도의 15 mM의 이미다졸 용액으로 세척한 다음 300 mM의 이미다졸 용액으로 용출하였다. 용출된 융합단백질 산물의 경우 SDS-PAGE를 이용하 여 총 10 ug의 단백질을 로딩하였으며 이후 coomassie blue 염색시약을 통해서 정제된 융합단백질의 분자량을 확인하였다 [도 6의 B].
결과 6: RAW264.7 세포 내로의 융합단백질 도입 및 항산화 효능 개선 평가
항산화 효소로 널리 알려진 SOD1을 이용하여 세포 침투성 펩타이드와 융합하여 세포 투과능 및 활성 유지 여부를 RAW264.7 세포를 이용하여 평가하였다. 재조합 단백질인 SOD1, SOD1-TAT, SOD1-RMAD1은 동일한 농도인 0.5 uM으로 RAW264.7 세포에 2시간 동안 처리하였으며 그 결과, SOD1-RMAD1 융합단백질이 월등히 높은 세포 투과 수준을 보이는 것을 확인하였다. 기존에 잘 알려진 세포 침투성 펩타이드인 TAT을 포함하는 SOD1-TAT 융합단백질이 SOD1-RMAD1보다 낮은 수준의 세포 투과율을 보임을 확인하였으며, SOD1 자체의 경우 세포 투과가 되지 않음을 확인하였다 [도 6의 C].
세포에 도입된 융합단백질이 실제로 세포 내에서 활성을 갖는지 확인하기 위해 항산화 및 항염 효능을 평가하였다. 항산화 효능을 평가하기 위해 활성산소종 (Reactive Oxygen Species; ROS) 제거 능력을 확인하였다. 구체적으로는 RAW264.7 세포에 SOD1-RMAD1 융합단백질을 각 0.5, 1, 2.5 uM 농도로 2시간 동안 처리한 후 활성산소종을 유도하는 LPS를 총 16시간 처리하였다. 이후 CM-H2DCFDA를 이용하여 FACS 분석을 통해 활성산소종의 양을 평가한 결과, SOD1-RMAD1 융합단백질이 효과적으로 세포 내 활성산소 생성을 저해함을 확인할 수 있었다 [도 6의 D]. 또한, 항염 효능을 평가하기 위해 위의 항산화 효능 실험과 같이 융합단백질 및 LPS를 처리하였으며 이후 배지에서 염증인자인 TNF-α 검출을 통해 융합단백질이 SOD1 대비 효과적으로 항염 효능을 개선시킴을 확인하였다 [도 6의 E].
결과 7: 펩타이드 항원과 RMAD1 융합 펩타이드를 이용한 항암 백신 효능 평가
세포 내 투과성을 빠르게 올림으로써 생체 내에서의 펩타이드 항원 분해를 방지하며 선천면역세포에 항원을 인식시켜 항원 특이적 T세포를 효과적으로 만들 것이라 예상되어 RMAD-1와 펩타이드 항원을 융합하여 항암 백신 효능을 확인하였다. HPV-16/18 유래 E7이 과발현된 TC-1 세포와 RMAD1이 결합된 E7 펩타이드를 이용하여 항원 특이적 T 세포를 평가하였으며 추가적으로 면역보조제이자 TLR4 작용제로 잘 알려진 MPLA (Monophosphoryl lipid A)를 사용하여 종양 크기의 감소를 확인하였다. 그 결과, E7 단독에 비해 E7AD가 높은 항암 능력을 갖음을 확인하였으며 MPLA이 추가된 E7AD + MPLA그룹에서도 E7 + MPLA 대비 유의미한 종양 감소를 확인하였다 [도 7A, B]. 또한, 비장에서 면역세포를 분석한 결과 RMAD1이 포함된 E7AD 그리고 E7AD + MPLA 그룹에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 수가 증가함을 확인하였으며 IFN-γ의 발현 증가 확인을 통해 CD8+ T 세포의 활성화를 확인하였다 [도 7C, D]. 마지막으로 기존 세포투과 펩타이드인 E7-TAT과의 비교를 혈액의 면역세포를 이용하여 분석한 결과 RMAD1가 포함된 그룹에서 효과적으로 항원 특이적 CD8 + T 세포를 증가시킴을 확인하였다 [도 7E].
아래 표 1은 본 발명의 화물분자 수송 도메인 중 구체적인 예시인 11종의 아미노산 서열이며, 표의 순서대로 각각 서열번호 1 내지 서열번호 11이 된다.
아래 표 2는 본 발명의 화물분자 수송 도메인 중 구체적인 예시인 11종을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이며, 표의 순서대로 각각 서열번호 12 내지 서열번호 22가 된다.
Name amino acid sequence characteristics Seq.ID
RMAD1 CKSKRRRRRRSKRKD - 1
RMAD1-1 CRSKRRRRRRSRRRD K12R, K14R 치환 2
RMAD1-2 CKSKKKKKKKSKRKD 5~10의 6R > 5~10의 6K로 치환 3
RMAD1-3 CKSKRRRRRRS C 말단 KRKD 결실 4
RMAD1-4 CKSKRRRRSKR 5~10 중 RR 결실, C 말단 KD 결실 5
RMAD1-5 SKRRRRSKRKD N 말단 CK 결실, 5~10 중 RR 결실 6
RMAD1-6 YKSKRRRRRRSKRKD C1Y 치환 7
RMAD1-7 KCKSKRRRRRRSKRKDKV N 말단 K 부가, C 말단 KV 부가 8
RMAD1-8 KCKSKRRRRRRSKRKDKVS N 말단 K 부가, C 말단 KVS 부가 9
RMAD1-9 LKCKSKRRRRRRSKRKDKV N 말단 LK 부가, C 말단 KV 부가 10
RMAD1-10 LKCKSKRRRRRRSKRKDKVS N 말단 LK 부가, C 말단 KVS 부가 11
Name polynucleotide sequence Seq.ID
RMAD1 tgc aag tcc aag agg agg agg agg cgg agg tcc aag cgg aaa gat 12
RMAD1-1 tgc agg tcc aag agg agg agg agg cgg agg tcc agg cgg agg gat 13
RMAD1-2 tgc aag tcc aag aag aag aag aag aag aag tcc aag cgg aaa gat 14
RMAD1-3 tgc aag tcc aag agg agg agg agg cgg agg tcc 15
RMAD1-4 tgc aag tcc aag agg agg cgg agg tcc aag cgg 16
RMAD1-5 tcc aag agg agg cgg agg tcc aag cgg aaa gat 17
RMAD1-6 tat aag tcc aag agg agg agg agg cgg agg tcc aag cgg aaa gat 18
RMAD1-7 aaa tgc aag tcc aag agg agg agg agg cgg agg tcc aag cgg aaa gat aaa gta 19
RMAD1-8 aaa tgc aag tcc aag agg agg agg agg cgg agg tcc aag cgg aaa gat aaa gta agc 20
RMAD1-9 ctc aaa tgc aag tcc aag agg agg agg agg cgg agg tcc aag cgg aaa gat aaa gta 21
RMAD1-10 ctc aaa tgc aag tcc aag agg agg agg agg cgg agg tcc aag cgg aaa gat aaa gta agc 22
<110> Remedi Co., Ltd. <120> Cargo molecule transport domain RMAD1, variant thereof, recombinant cargo molecule and cargo molecule transport method using the same <130> Remedi-RMAD1 <150> KR 2021/0062397 <151> 2021-05-14 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Cys Lys Ser Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Lys Arg Lys Asp 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cargo molecule transport domain RMAD1-1 <400> 2 Cys Arg Ser Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Arg Arg Arg Asp 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cargo molecule transport domain RMAD1-2 <400> 3 Cys Lys Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys Arg Lys Asp 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cargo molecule transport domain RMAD1-3 <400> 4 Cys Lys Ser Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cargo molecule transport domain RMAD1-4 <400> 5 Cys Lys Ser Lys Arg Arg Arg Arg Ser Lys Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cargo molecule transport domain RMAD1-6 <400> 6 Ser Lys Arg Arg Arg Arg Ser Lys Arg Lys Asp 1 5 10 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cargo molecule transport domain RMAD1-6 <400> 7 Tyr Lys Ser Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Lys Arg Lys Asp 1 5 10 15 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cargo molecule transport domain RMAD1-7 <400> 8 Lys Cys Lys Ser Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Lys Arg Lys Asp 1 5 10 15 Lys Val <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cargo molecule transport domain RMAD1-8 <400> 9 Lys Cys Lys Ser Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Lys Arg Lys Asp 1 5 10 15 Lys Val Ser <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cargo molecule transport domain RMAD1-9 <400> 10 Leu Lys Cys Lys Ser Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Lys Arg Lys 1 5 10 15 Asp Lys Val <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cargo molecule transport domain RMAD1-10 <400> 11 Leu Lys Cys Lys Ser Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Lys Arg Lys 1 5 10 15 Asp Lys Val Ser 20 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 tgcaagtcca agaggaggag gaggcggagg tccaagcgga aagat 45 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding cargo molecule transport domain RMAD1-1 <400> 13 tgcaggtcca agaggaggag gaggcggagg tccaggcgga gggat 45 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding cargo molecule transport domain RMAD1-2 <400> 14 tgcaagtcca agaagaagaa gaagaagaag tccaagcgga aagat 45 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding cargo molecule transport domain RMAD1-3 <400> 15 tgcaagtcca agaggaggag gaggcggagg tcc 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding cargo molecule transport domain RMAD1-4 <400> 16 tgcaagtcca agaggaggcg gaggtccaag cgg 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding cargo molecule transport domain RMAD1-5 <400> 17 tccaagagga ggcggaggtc caagcggaaa gat 33 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding cargo molecule transport domain RMAD1-6 <400> 18 tataagtcca agaggaggag gaggcggagg tccaagcgga aagat 45 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding cargo molecule transport domain RMAD1-7 <400> 19 aaatgcaagt ccaagaggag gaggaggcgg aggtccaagc ggaaagataa agta 54 <210> 20 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding cargo molecule transport domain RMAD1-8 <400> 20 aaatgcaagt ccaagaggag gaggaggcgg aggtccaagc ggaaagataa agtaagc 57 <210> 21 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding cargo molecule transport domain RMAD1-9 <400> 21 ctcaaatgca agtccaagag gaggaggagg cggaggtcca agcggaaaga taaagta 57 <210> 22 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding cargo molecule transport domain RMAD1-10 <400> 22 ctcaaatgca agtccaagag gaggaggagg cggaggtcca agcggaaaga taaagtaagc 60 60 <210> 23 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 agctttgcaa gtccaagagg aggaggaggc ggaggtccaa gcggaaagat c 51 <210> 24 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tcgagatctt tccgcttgga cctccgcctc ctcctcctct tggacttgca a 51

Claims (18)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 11 중 선택된 하나의 서열로 이루어진 펩타이드로서, 화물분자와 결합하여 포유류의 세포 내 또는 조직 내로 화물분자를 수송하는 화물분자 수송 도메인.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 화물분자; 및
    상기 화물분자의 N-말단 및 C-말단 중 어느 한 곳 이상에 청구항 1의 화물분자 수송 도메인이 융합된, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 화물분자는 펩타이드, 단백질, 또는 핵산인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 화물분자는 치료용 단백질, 항원성 단백질 또는 에피토프 펩타이드인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 화물분자는 항산화 단백질인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자.
  11. 삭제
  12. 청구항 7의 재조합 화물분자를 포함하는 화장료.
  13. 청구항 1의 화물분자 수송 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  14. 청구항 13의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자 단백질 발현용 발현 벡터.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 벡터는 화물분자 수송 도메인과 화물분자 단백질이 융합된 재조합 화물분자 단백질이 발현될 수 있도록, 화물분자 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자 단백질 발현용 발현 벡터.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
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