WO2010058707A1 - アフィニティタグが結合した融合コラゲナーゼおよびその製造法 - Google Patents
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Definitions
- a fusion collagenase having a collagen binding site is selectively collected by purifying a culture obtained by culturing the host cell according to ⁇ 15> or ⁇ 16> by affinity chromatography corresponding to an affinity tag.
- a method for producing a fusion collagenase characterized by the above.
- a method of removing a collagenase in which a part or all of CBD is degraded from a culture solution obtained by culturing a host cell expressing the fusion collagenase, and selectively recovering a single fusion collagenase having CBD. Provided. According to the present invention, it has become possible to efficiently produce a fusion collagenase having CBD.
- DNA encoding an affinity tag can be amplified by PCR using a genomic DNA, cDNA, plasmid or the like containing a gene encoding the affinity tag as a template.
- DNA encoding a histidine tag it can be amplified by PCR using a commercially available vector pET-24a (+) as a template.
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Abstract
Description
(i)配列番号:1または2に記載の-110番から1008番までのアミノ酸配列の全部もしくは一部を含んでなるコラゲナーゼ;
(ii)配列番号:1または2に記載の-110番から1008番までのアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなるコラゲナーゼ;
(iii)配列番号:1または2に記載の-110番から1008番までのアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるコラゲナーゼ;
(iv)(i)から(iii)に記載のコラゲナーゼから、配列番号:1または2に記載の-1番から-110番までのアミノ酸配列の全部もしくは一部が除去されたコラゲナーゼ。
(i)配列番号:5または6に記載の-40番から981番までのアミノ酸配列の全部もしくは一部を含んでなるコラゲナーゼ;
(ii)配列番号:5または6に記載の-40番から981番までのアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなるコラゲナーゼ;
(iii)配列番号:5または6に記載の-40番から981番までのアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるコラゲナーゼ;
(iv)(i)から(iii)に記載のコラゲナーゼから、配列番号:5または6に記載の-1番から-40番までのアミノ酸配列の全部もしくは一部が除去されたコラゲナーゼ。
本発明において融合コラゲナーゼとは、コラゲナーゼに直接もしくは間接してアフィニティタグが結合したタンパク質であって、宿主内で発現させた該融合コラゲナーゼが該宿主の作用により分解された場合に、該融合コラゲナーゼにおけるコラゲナーゼ活性を有する断片とアフィニティタグとが分離するように、コラゲナーゼとアフィニティタグとが結合している融合コラゲナーゼを指す。このようなコラゲナーゼのアフィニティタグへの結合様式は、好ましくは、コラゲナーゼのCBDへの結合であり、最も好ましくは、CBDのカルボキシ末端(即ち、コラゲナーゼのカルボキシル末端)への結合である。本発明において「CBD」とは、コラゲナーゼGにおけるセグメント3a及び3bの領域(配列番号:1及び2の776位~カルボキシ末端)、及びコラゲナーゼHにおけるセグメント3の領域(配列番号:5の864位~カルボキシ末端)を意味する(非特許文献2)。
本発明において、融合コラゲナーゼをコードするDNAは、上記の融合コラゲナーゼのアミノ配列をコードするものであれば、如何なる塩基配列からなるDNAであっても構わない。
本発明においては、前記の融合コラゲナーゼのアミノ酸配列をコードするDNAを、宿主細胞内で複製可能で、かつ、そのDNA配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベクターが提供される。本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明においては、融合コラゲナーゼを発現する宿主細胞を適当な培地で培養し、その培養物から融合コラゲナーゼを得ることができる。融合コラゲナーゼを発現する宿主細胞の培養及びその条件は、使用する宿主細胞についてのそれと本質的に同等であってよい。
大腸菌などで組換えコラゲナーゼを発現させた場合に、そのCBDの一部又は全部が分解されるという本発明者らの知見から、組換えコラゲナーゼにおけるCBDに結合する抗体を利用して、分解されたコラゲナーゼを排除し、分解されていない組換えコラゲナーゼを特異的にアフィニティ精製することも可能である。この場合、組換えコラゲナーゼにアフィニティタグを融合する必要がない点で有利である。即ち、本発明は、組換えコラゲナーゼを発現させた宿主細胞を培養し得られる培養物を、該組換えコラゲナーゼのCBDに結合する抗体で精製することにより、CBDを有するコラゲナーゼを選択的に採取することを特徴とするコラゲナーゼの製造方法をも提供する。さらに、CBDとコラーゲンとはアフィニティを有するため、上記抗体に代えて、コラーゲンを利用して、組換えコラゲナーゼを特異的にアフィニティ精製することも可能である。即ち、本発明は、組換えコラゲナーゼを発現させた宿主細胞を培養し得られる培養物を、コラーゲンで精製することにより、CBDを有するコラゲナーゼを選択的に採取することを特徴とするコラゲナーゼの製造方法をも提供する。
(1-1)コラゲナーゼG遺伝子断片の調製
クロストリディウム・ヒストリティカム由来のコラゲナーゼG遺伝子の5’側末端から3’側末端までを、クロストリディウム・ヒストリティカム由来のゲノムDNAを鋳型にしたPCRにより増幅した。この際、増幅されたコラゲナーゼG遺伝子の3’側末端がXbaI認識配列となり、さらに、本遺伝子のストップコドンに続いてBamHI認識配列が付加されるプライマーを設計した。その結果、非特許文献1に記載の天然のコラゲナーゼGのカルボキシル末端アミノ酸配列の2箇所に変異(配列番号:1の1007番目と1008番目のアミノ酸)が導入され、配列番号:2に記載のアミノ酸配列に改変された。
colG-F:
ATGAAAAAAAATATTTTAAAGATTC(配列番号:9)
colG-R:
CCGGATCCTATCTAGATACCCTTAACT(配列番号:10)
増幅されたコラゲナーゼG遺伝子断片は、BamHIにより消化した。
6個の連続したヒスチジン残基からなるヒスチジンタグをコードするDNAを調製するために、市販のベクターであるpET-24a(+)を鋳型としたPCRを実施し、ヒスチジンタグをコードするDNAを増幅した。また、本DNA断片には、ヒスチジンタグをコードするDNAに加えて本ベクターに由来するマルチクローニングサイト、T7ターミネーターに対応する遺伝子断片も含まれるようにした。本増幅DNA断片の5’側末端にXbaI及び3’側末端にBamHI認識配列を含む形でプライマーを設計した。
His-F:
GCTCTAGAAAGCTTGCGGCCGCACTCGA(配列番号:11)
His-R:
CGGGATCCGGATATAGTTCCTCCT(配列番号:12)
増幅されたヒスチジンタグをコードする領域を含んだDNA断片は、XbaI及びBamHIにより二重消化した。
融合コラゲナーゼを発現させるためのプロモーターとして、lacZプロモーターを調製した。本DNA断片は、pUC19を鋳型としたPCRに増幅した。この際、増幅DNA断片の5’側末端にHindIII認識配列を含む形でプライマーを設計した。
lac-F:
CCGGCAAGCTTGCCCAATACGCAAACCG(配列番号:13)
lac-R:
AGCTGTTTCCTGTGTGAA(配列番号:14)
増幅されたlacZプロモーター断片は、HindIIIにて消化した。
前記の方法で調製した3種のDNA断片を、5’側末端より、lacZプロモーター、コラゲナーゼG遺伝子、ヒスチジンタグを含んだDNA断片の順に連結されるように、市販のベクターであるpBR322に挿入した。まず、lacZプロモーター、コラゲナーゼG遺伝子をpBR322に挿入した。つまり、前記のように調製したlacZプロモーター領域、及びコラゲナーゼG遺伝子断片をリン酸化した後、HindIII及びBamHIにて二重消化したpBR322へ挿入し、pColG(図1)を構築した。なお、lacZ遺伝子プロモーター領域(PlacZ)とcolG遺伝子の連結は平滑末端にて行なった。続いて、XbaI及びBamHIにて二重消化したpColGに、前記の方法で調製したヒスチジンタグをコードするDNAを挿入し、pColG-His(図2)を構築した。最終的にpBR322に挿入されたDNAは、配列表:4に記載の1番から3396番までの塩基配列を持つDNAとなった。
常法に従ってpColG-Hisを大腸菌Escherichia coli χ1776株に形質転換し、20μg/mlのジアミノピメリン酸、100μg/mlチミジン、50μg/mlアンピシリンを添加したLB寒天培地で37℃、一昼夜培養し、融合コラゲナーゼG発現大腸菌を造出した。
(2-1)融合コラゲナーゼG発現大腸菌の培養
実施例1で得た融合コラゲナーゼG発現大腸菌を、100mlの培地を加えた250mlの三角フラスコに植菌し、200rpmにて28℃、16時間、撹拌培養した。本培養に使用した培地は、100μg/mlのジアミノピメリン酸、20μg/mlチミジン、50μg/mlアンピシリン、0.1mMのIPTGを添加したTB培地(1.2%トリプトン、2.4%イーストエクストラクト、0.94%リン酸水素二カリウム、0.22%リン酸二水素カリウム、0.8%グリセロール)とした。
(2-1)で得られた培養終了液を遠心分離することにより菌体を回収し、回収された菌体を10mlのPOPculture Regent(メルク社製)にて溶菌させ、菌体内のタンパク質を抽出した。溶菌液の遠心分離により得られる上清を、遺伝子組換え体を除去するために0.2μmの膜にてろ過し、融合コラゲナーゼG発現大腸菌の抽出液とした。
(2-2)で得られた融合コラゲナーゼG発現大腸菌の抽出液から分解コラゲナーゼを除去するために、ヒスチジンタグに対するアフィニティクロマトグラフィであるニッケルキレートカラムによる分画を行った。前記の方法で調製した融合コラゲナーゼG発現大腸菌の抽出液10mlに、60mlのニッケルキレートカラム結合用緩衝液(0.5MのNaCl、20mMイミダゾールを添加した20mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5))を添加し、ニッケルキレートカラム結合用緩衝液で平衡化した100mlのニッケルキレートカラムに通液した。その後、適当量のニッケルキレートカラム結合用緩衝液でカラム洗浄し、ニッケルキレートカラムに吸着できない分解コラゲナーゼを除去した後に、500mMのイミダゾールを添加したニッケルキレートカラム結合用緩衝液100mlを通液し、CBDを有する融合コラゲナーゼGを回収した。
融合コラゲナーゼG抽出液からの分解コラゲナーゼの除去を確認するために、融合コラゲナーゼG発現大腸菌の抽出液およびアフィニティクロマトグラフィに供した融合コラゲナーゼG溶液について、活性染色を実施した。(2-2)で得られた融合コラゲナーゼG発現大腸菌の抽出液0.25μlおよび(2-3)で得られたアフィニティクロマトグラフィに供した融合コラゲナーゼG溶液2.5μlをZymogram-PAGE mini(テフコ社製)に供し、活性染色を実施した。その結果、融合コラゲナーゼG発現大腸菌の抽出液には、プロテーゼ活性を示す5本のバンドが観察された(図3)。一方、アフィニティクロマトグラフィに供した融合コラゲナーゼG溶液は、前記の5本のバンドの内、最大の分子量を示す1本のバンドが主要なバンドとして観察された(図4)。これらのバンドの比較と分析から、大腸菌で融合コラゲナーゼGを発現させた場合、CBDの一部又は全部が分解されることが判明した。以上の結果から、融合コラゲナーゼG発現大腸菌の抽出液をアフィニティクロマトグラフィにより精製することにより、CBDの一部又は全部が分解されたコラゲナーゼを除去し、CBDを有する融合コラゲナーゼを選択的に回収できることが示された。
(3-1)コラゲナーゼH遺伝子断片の調製
クロストリディウム・ヒストリティカム由来のコラゲナーゼH遺伝子の5’側末端から3’側末端までを、クロストリディウム・ヒストリティカム由来のゲノムDNAを鋳型にしたPCRにより増幅した。この際、増幅されたコラゲナーゼH遺伝子の3’側末端がXbaI認識配列となり、さらに、本遺伝子のストップコドンに続いてBamHI認識配列が付加されるプライマーを設計した。その結果、非特許文献2に記載の天然のコラゲナーゼHのアミノ酸配列のカルボキシル末端アミノ酸配列1箇所に変異(配列番号:5の980番目のアミノ酸)が導入され、配列番号:6に記載のアミノ酸配列に改変された。
colH-F:
ATGAAAAGGAAATGTTTATC(配列番号:15)
colH-R:
CCGGATCCTATCTAGATACTGAACCTT(配列番号:16)
増幅されたコラゲナーゼH遺伝子断片は、BamHIにより消化した。
ヒスチジンタグをコードする領域を含んだDNA断片は、実施例1と同様の方法により調製した。
lacZプロモーター断片は、実施例1と同様の方法により調製した。
前記の方法で調製した3種のDNA断片を、5’側末端より、lacZプロモーター、コラゲナーゼH遺伝子、ヒスチジンタグを含んだDNA断片の順に連結されるように、市販のベクターであるpBR322に挿入した。まず、lacZプロモーター、コラゲナーゼH遺伝子をpBR322に挿入するために、前記のように調製したlacZプロモーター領域、及びコラゲナーゼH遺伝子断片をリン酸化した後、HindIII及びBamHIにて二重消化したpBR322に挿入しpColH(図5)を構築した。なお、lacZ遺伝子プロモーター領域とコラゲナーゼH遺伝子の連結は平滑末端にて行なった。続いて、XbaI及びBamHIにて二重消化したpColHに、前記の方法で調製したヒスチジンタグをコードするDNAを含んだDNA断片を挿入しpColH-His(図6)を構築した。最終的にpBR322に挿入されたDNAは、配列表:8に記載の1番から3105番までの塩基配列を持つDNAとなった。
融合コラゲナーゼH発現大腸菌は実施例1と同様の方法で造出された。
(4-1)融合コラゲナーゼH発現大腸菌の培養
実施例3で得た融合コラゲナーゼH発現大腸菌を、実施例2に記載の方法で培養し、培養液を得た。
(4-1)で得られた培養終了液から、実施例2に記載の方法で、融合コラゲナーゼH発現大腸菌の抽出液を得た。
(4-2)で得られた融合コラゲナーゼH発現大腸菌の抽出液を、実施例2に記載の方法でアフィニティクロマトグラフィに供し、CBDを有する融合コラゲナーゼHを回収した。
融合コラゲナーゼHからの分解コラゲナーゼの除去の程度を確認するために、実施例2に記載の方法で、電気泳動の後に活性染色を実施した。その結果、融合コラゲナーゼH発現大腸菌の抽出液には、プロテーゼ活性を示す4本のバンドが観察された(図7)。一方、アフィニティクロマトグラフィに供した融合コラゲナーゼH溶液は、前記の4本のバンドの内、最大の分子量を示す1本のバンドが主要なバンドとして観察された(図8)。こられのバンドの比較と分析から、大腸菌で発現させた融合コラゲナーゼHにおけるCBDの一部又は全部が分解されたことが判明した。以上の結果から、融合コラゲナーゼH発現大腸菌の抽出液をアフィニティクロマトグラフィにより精製することにより、CBDの一部又は全部が分解されたコラゲナーゼを除去し、CBDを有する融合コラゲナーゼHが選択的に回収できることが示された。
Claims (18)
- コラゲナーゼに直接または間接してアフィニティタグが結合した融合コラゲナーゼであって、宿主内で発現させた該融合コラゲナーゼが該宿主の作用により分解された場合に、コラゲナーゼ活性を有する断片とアフィニティタグとが分離するように、コラゲナーゼとアフィニティタグとが結合している融合コラゲナーゼ。
- コラゲナーゼのカルボキシル末端に直接または間接してアフィニティタグが結合した、請求項1に記載の融合コラゲナーゼ。
- アフィニティタグが2つ以上の連続するヒスチジン残基である、請求項2に記載の融合コラゲナーゼ。
- コラゲナーゼがクロストリディウム・ヒストリティカムに由来する、請求項1に記載の融合コラゲナーゼ。
- コラゲナーゼのアミノ酸配列が以下の(i)、(ii)、(iii)および(iv)から選択される、請求項1に記載の融合コラゲナーゼ:
(i)配列番号:1または2に記載の-110番から1008番までのアミノ酸配列の全部もしくは一部を含んでなるコラゲナーゼ;
(ii)配列番号:1または2に記載の-110番から1008番までのアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなるコラゲナーゼ;
(iii)配列番号:1または2に記載の-110番から1008番までのアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるコラゲナーゼ;
(iv)(i)から(iii)に記載のコラゲナーゼから、配列番号:1または2に記載の-1番から-110番までのアミノ酸配列の全部もしくは一部が除去されたコラゲナーゼ。 - 配列番号:3に記載の-110番から1021番までのアミノ酸配列の全部もしくは一部からなる請求項5に記載の融合コラゲナーゼ。
- 配列番号:3に記載の-1番から-110番までのアミノ酸配列の全部もしくは一部が除去された請求項6に記載の融合コラゲナーゼ。
- コラゲナーゼのアミノ酸配列が以下の(i)、(ii)、(iii)および(iv)から選択される、請求項1に記載の融合コラゲナーゼ:
(i)配列番号:5または6に記載の-40番から981番までのアミノ酸配列の全部もしくは一部を含んでなるコラゲナーゼ;
(ii)配列番号:5または6に記載の-40番から981番までのアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなるコラゲナーゼ;
(iii)配列番号:5または6に記載の-40番から981番までのアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるコラゲナーゼ;
(iv)(i)から(iii)に記載のコラゲナーゼから、配列番号:5または6に記載の-1番から-40番までのアミノ酸配列の全部もしくは一部が除去されたコラゲナーゼ。 - 配列番号:7に記載の-40番から994番までのアミノ酸配列の全部もしく一部からなる請求項8に記載の融合コラゲナーゼ。
- 配列番号:7に記載の-1から-40番までのアミノ酸配列の全部もしくは一部が除去された請求項9に記載の融合コラゲナーゼ。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載の融合コラゲナーゼをコードするDNA。
- 配列番号:4に記載の1番から3396番までの塩基配列からなるDNA。
- 配列番号:8に記載の1番から3105番までの塩基配列からなるDNA。
- 請求項11から13のいずれか一項に記載のDNAを含んでなる発現ベクター。
- 請求項11から13のいずれか一項に記載のDNA、もしくは請求項14に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 宿主細胞が大腸菌である請求項15に記載の宿主細胞。
- 請求項15または16に記載の宿主細胞を培養し得られる培養物を、アフィニティタグに対応したアフィニティクロマトグラフィで精製することにより、コラーゲン結合部位を有する融合コラゲナーゼを選択的に採取することを特徴とする融合コラゲナーゼの製造方法。
- 請求項17に記載の方法により製造された融合コラゲナーゼ。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012124338A1 (ja) * | 2011-03-16 | 2012-09-20 | 国立大学法人東北大学 | 生体組織分析用プローブ及びその利用法 |
WO2014119334A1 (ja) * | 2013-02-01 | 2014-08-07 | 国立大学法人東北大学 | 生体組織からの細胞の分離方法 |
JP2015506176A (ja) * | 2012-01-12 | 2015-03-02 | オーキシリウム インターナショナル ホールディングス,インコーポレイテッド | クロストリジウム・ヒストリチクム(clostridiumhistolyticum)酵素およびその使用のための方法 |
WO2019187691A1 (ja) * | 2018-03-26 | 2019-10-03 | 株式会社カネカ | コラゲナーゼ活性を有するポリペプチド及びその製造方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PT107276B (pt) * | 2013-11-07 | 2018-06-07 | Univ Aveiro | Método para produção de colagenase recombinante para digestão de colagénios |
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003284553A (ja) * | 2002-03-28 | 2003-10-07 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 生理活性タンパク質 |
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---|---|---|---|---|
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003284553A (ja) * | 2002-03-28 | 2003-10-07 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 生理活性タンパク質 |
WO2008124166A2 (en) * | 2007-04-09 | 2008-10-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Fusion proteins of collagen-binding domain and parathyroid hormone |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
MATSUSHITA 0 ET AL.: "Gene duplication and multiplicity of collagenases in Clostridium histolyticum.", J BACTERIOL., vol. 181, no. 3, 1999, pages 923 - 33, XP001147203 * |
TAMAI E ET AL.: "High-level expression of his- tagged clostridial collagenase in Clostridium perfringens.", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL., vol. 80, no. 4, September 2008 (2008-09-01), pages 627 - 35, XP019623735 * |
YOSHIHARA K ET AL.: "Cloning and nucleotide sequence analysis of the colH gene from Clostridium histolyticum encoding a collagenase and a gelatinase.", J BACTERIOL., vol. 176, no. 21, 1994, pages 6489 - 96, XP008150460 * |
YOSHITOMO OKA: "Tokushu/Saibo Baiyo Saibo Baiyo wa dokomade Kano ka, 2) Suito Saibo", BYOTAI SEIRI, vol. 6, no. 11, 1987, pages 852 - 856, XP008150462 * |
Cited By (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5997131B2 (ja) * | 2011-03-16 | 2016-09-28 | 国立大学法人東北大学 | 生体組織分析用プローブ及びその利用法 |
CN103562719A (zh) * | 2011-03-16 | 2014-02-05 | 国立大学法人东北大学 | 生物体组织分析用探针及其使用方法 |
JPWO2012124338A1 (ja) * | 2011-03-16 | 2014-07-17 | 国立大学法人東北大学 | 生体組織分析用プローブ及びその利用法 |
KR101921353B1 (ko) * | 2011-03-16 | 2018-11-23 | 도호쿠 다이가쿠 | 생체 조직 분석용 프로브 및 그 이용법 |
WO2012124338A1 (ja) * | 2011-03-16 | 2012-09-20 | 国立大学法人東北大学 | 生体組織分析用プローブ及びその利用法 |
US9354240B2 (en) | 2011-03-16 | 2016-05-31 | Tohoku University | Probe for analyzing biological tissue and method for utilizing same |
JP2018075011A (ja) * | 2012-01-12 | 2018-05-17 | オーキシリウム インターナショナル ホールディングス,インコーポレイテッド | クロストリジウム・ヒストリチクム(clostridium histolyticum)酵素およびその使用のための方法 |
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WO2014119334A1 (ja) * | 2013-02-01 | 2014-08-07 | 国立大学法人東北大学 | 生体組織からの細胞の分離方法 |
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